CN111378653A

CN111378653A - Sca基因突变检测的引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111378653A
Application number: CN201811641191.4A
Authority: CN
Inventors: 高玉梅; 贺希文; 郎娜; 梁帆; 王洋; 汪德鹏
Original assignee: Grandomics Biosciences Co ltd
Current assignee: Grandomics Biosciences Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2020-07-07

Abstract

本发明涉及脊髓小脑共济失调基因测序诊断领域，具体而言，涉及一种SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法。本发明所提供的引物、试剂盒结合三代测序方法，可有效对SCA 1、2、3、6、7、8、12、17型基因的重复序列动态突变和/或中断重复进行检测。

Description

SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及脊髓小脑共济失调基因测序诊断领域，具体而言，涉及一种SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法。

背景技术

脊髓小脑性共济失调(spinocerebellar ataxia，SCA)是一种最常见的神经系统遗传病，约占神经系统遗传性疾病的10％-15％^[1]，发病率约为3/10万。在临床医学各科室的遗传病中，以神经系统遗传病的病种最多，病因最复杂、异质性也最高，约占所有遗传病的60％以上。该系统的神经系统疾病是由三核苷酸或五核苷酸动态突变扩展引起的，多呈常染色体显性遗传，其病理改变主要是脊髓、小脑和脑干的神经元变性脱失与胶质增生^[2-3]，临床表现为小脑共济失调伴构音障碍、意向性震颤、锥体系及锥体外系症状等，具有极强的遗传异质性和基因多效性，还可累及脊神经、颅神经、交感神经、大脑皮质等^[4]。

根据该疾病的临床特点及其基因定位可分为SCA1-30，共30多种亚型，且大部分致病基因已得到克隆。其中SCA1/2/3/6/7/8/12/17亚型为常见的致病基因类型，多为其编码区CAG三核苷酸重复序列扩增突变异常增多导致^[5]。各亚型间具有高度临床异质性，临床表现复杂，易与其他神经系统疾病混淆，各亚型之间SCA的临床表现重叠，只依据临床表现较难对其做出明确诊断及分型。目前可通过PCR技术结合毛细管电泳或测序进行基因突变检测来明确诊断，如内中日友好医院、华西医科大学等均是通过PCR技术结合毛细管电泳或测序证实脊髓小脑共济失调的亚型。目前，国内外基因诊断技术日趋成熟，特别是毛细管电泳片段长度分析检测方便、经济，亦可较准确地检测计算出CAG重复数，不仅可以为动态突变的遗传性疾病提供可靠的基因诊断^[6]，而且也可用于大批量标本的检测。

据报道脊髓小脑共济失调病例中，SCA3是最常见的亚型，其次为SCA1/2/6/7/8/12/17。SCA各个亚型的发病率在不同国家不同地区甚至是不同人群的发病率亦有差别^[5,7]，我国目前报道的SCA病例中，SCA3亚型最为常见，占54.6-72.5％，其次为SCA2(5.7-6.7％)，SCA1(5.9％)，SCA6(1.6-3.3％)，SCA7(0.8-4.8％)^[8]。

总体而言，SCA3、SCA2及SCA1为我国常见亚型。目前，诊断该病主要依据基因检测，明确致病基因CAG三碱基的重复数来确诊，因此界定SCA相关基因CAG的重复数/范围对疾病的诊断及分型具有重大意义。

有鉴于此，特提出本发明。

附：参考文献

[1]蔡美英,兰风华.遗传性共济失调的分子病理学研究进展[J].解放军医学杂志,2008(05):624-625.

[2]Martindale J E.Diagnosis of Spinocerebellar Ataxias Caused byTrinucleotide Repeat Expansions[J].Curr Protoc Hum Genet,2017,92:9-30.

[3]Orr H T,Zoghbi H Y.Trinucleotide repeat disorders[J].Annu RevNeurosci,2007,30:575-621.

[4]Brusco A,Gellera C,Cagnoli C,et al.Molecular genetics ofhereditary spinocerebellar ataxia:mutation analysis of spinocerebellar ataxiagenes and CAG/CTG repeat expansion detection in 225 Italian families[J].ArchNeurol,2004,61(5):727-733.

[5]Krysa W,Sulek A,Rakowicz M,et al.High relative frequency of SCA1inPoland reflecting a potential founder effect[J].Neurol Sci,2016,37(8):1319-1325.

[6]Orr H T,Zoghbi H Y.Trinucleotide repeat disorders[J].Annu RevNeurosci,2007,30:575-621.

[7]Suzuki K,Sato T,Yamada M,et al.DRPLA:recent advances in researchusing transgenic mouse models[J].Methods Mol Biol,2013,1010:277-292.

[8]Orr H T,Chung M Y,Banfi S,et al.Expansion of an unstabletrinucleotide CAG repeat in spinocerebellar ataxia type 1[J].Nat Genet,1993,4(3):221-226.

发明内容

本发明涉及一种引物对组合产品，其选自下列引物对中的至少一对：

SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ IDNO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16。

本发明所提供的引物对组合产品，可以直观的分析三碱基的重复数及碱基重复类型。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对组合产品。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测SCA基因重复序列动态突变和/或中断重复的方法，包括：

a)获得如上所述的组合物；

b)对所述组合物中的扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序；

所述方法包括诊断及非诊断用途。

毛细管电泳及一代测序是检测三碱基的重复数及碱基重复类型的常用方法，均需要通过PCR扩增技术，对受检样本进行PCR扩增。其中，毛细管电泳方法的扩增引物为携带荧光的侧翼引物序列。后续需要对扩增产物进行毛细管电泳，依据荧光信号读取数值，再根据信号值的大小进行重复数的计算。而一代测序则是利用荧光进行碱基的判读，后续仍然需要毛细管电泳，但受限于技术的局限易产生移码突变/双峰。无法得出重复碱基的类别及重复被中断的次数及类型，仅可得出重复碱基的重复次数。毛细管电泳的读长有限，只有两种即500bp和1200bp。当重复数大于一定的上限时，则毛细管无法进行试验乃至得出有效的结果，Sanger测序技术更是如此。

本发明所提供的方法采用三代测序，读长绝对满足三/五碱基重复扩展类型且无GC偏好性。测序序列结果不仅可以明确观察出三碱基的重复数及中断碱基类型，且对大量样品的检测显得特别高效，即高通量测序不仅可以同时分析上百个样品，而且还可高效分析同一样本的8种不同基因型重复。准确度/灵敏度/可靠性方面相比毛细管电泳、克隆及二代测序都高。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒在制备脊髓小脑性共济失调的诊断剂中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中一个DNA样品的8对引物PCR扩增结果；

图2为本发明一个实施例中各PCR产物混样后凝胶电泳鉴定；

图3为本发明一个实施例中应用Agilent 2100 Bioanalyzer对文库进行质检所得到的检测峰图。

具体实施方式

上述引物对依次用于扩增脊髓小脑共济失调SCA1、2、3、6、7、8、12、17型基因，检测重复序列动态突变和/或中断重复。

动态突变又称为不稳定三核苷酸重复序列，即在基因的编码区、3’或5’-UTR、启动子区、内含子区出现的三核苷酸重复，及其他长短不等的小卫星、微卫星序列的重复拷贝，其会在减数分裂或体细胞的有丝分裂过程中发生扩增从而造成遗传物质的不稳定状态。

中断重复：某种三碱基重复的中间任意位置被另一种三碱基所中断，如CAGCAGCAGCAGCTGCAGCAGCAGCAG，CAG重复被CTG中断分为两个/多个CAG重复区。

在一些实施方式中，其中的部分或全部引物连接有barcode序列，以在扩增时用于区分不同样品。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括基因组DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述水为无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括末端修复酶、末端修复缓冲液、扩增或连接接头、接头链接缓冲液、DNA连接酶中的一种或多种。

所述引物对组合产品和试剂盒可以与三代测序联用以达到更好的技术效果。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种组合物，其含有使用如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒扩增人DNA模板所得到的扩增子。

所述组合物通常以溶液的形式存在，溶剂可选用水或者常见的缓冲试剂。

在一些实施方式中，所述人DNA模板来自人的血液、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织(例如羊水或绒毛)、组织裂解液、骨骼或毛发。

本文使用的"组织裂解物"、"细胞裂解物"、"裂解物"、"裂解的样品"、"组织提取物"或"细胞提取物"表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语"裂解"包括。

在一些实施方式中，所述DNA模板通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

在一些实施方式中，所述DNA模板为含有DNA的血滤纸片、唾液卡片或FTA卡。

本发明所述方法能够直接以血滤纸片、唾液卡片、FTA卡等为DNA模板进行扩增，不需要对DNA进行提取，极大缩短获得最终分型结果所需要的时间。

a)制备如上所述的组合物；以及

b)用三代测序平台对扩增产物进行检测；

在一些实施方式中，在进行三代测序时，对所述组合物中的扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序；

所述方法为诊断或非诊断用途。

所述方法可用于脊髓小脑性共济失调的诊断。

在一些实施方式中，将三代测序的文库模型进行纯化后再上机测序。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例一DNA提取及PCR扩增

一、DNA提取实验方法

使用试剂盒从血液中提取基因组DNA，例如使用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)，操作按照试剂盒说明书进行：

1.于血样中加入Buffer CL，混匀后离心；

2.弃上清，将入Buffer GS，混匀后离心；

3.加入Buffer GB和Proteinase K，混匀，温育；

4.室温静置，将入Buffer BD，混匀；

5.过吸附柱CG2，室温静置，离心，弃滤液；

6.向吸附柱CG2中加入Buffer BD，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CG2中加入Buffer PW，离心，弃滤液；

8.重复步骤7；

9.离心，晾干吸附柱CG2；

10.向吸附柱CG2中加入Buffer TB，室温静置，离心。将滤液再次加入吸附柱CG2，室温静置，离心，收集滤液。滤液内含人全基因组DNA。

二、PCR扩增

用primer3在线设计8对引物。

引物名称及序列参见下表：

15个样品合成对应barcode引物进行扩增，引物与barcode序列参见下表，

其中小写字母所示序列为barcode序列：

PCR体系见下表：

PCR条件见下表：

PCR结果鉴定：

用1％的琼脂糖凝胶在150V条件下，电泳25min。将电泳后的胶块放置于凝胶电泳系统进行照相，结果如图1所示，胶图表明，扩增产物大小符合预期，特异性好。

三、PCR产物纯化及混样

产物纯化：对引物PCR产物进行0.9×AmpXP磁珠纯化，测定每对引物纯化后产物浓度。

混样：根据上述浓度确定8对引物产物的混样比，其他样品按照这个比例进行混样后，整体进行一次纯化。

实施例二使用PacBio sequal进行三代测序

一、使用建库试剂盒进行建库

1将混好的文库进行修复

修复溶液配制：

混匀，离心，放入PCR热循环仪中，进行修复反应，具体条件如下：

2接头连接

连接溶液体系如下：

混匀，离心，于PCR热循环仪中进行连接反应，具体条件如下：

3纯化

使用AMPure XP磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

二、测序

三、测序数据生物信息学分析

1.call ccs reads：应用pacbio平台Smrtlink5-1分析流程进行ccs readscalling。

2.barcode拆分：将barcode序列和引物序列相应连接作为新的barcode reads，应用软件lima进行barcode拆分。

3.样品覆盖度确定：计算每个样品每个基因覆盖度的多少，对于深度低于阈值的扩增子进行加测，确认数据量符合下游分析的要求。

4.三碱基重复数的判断：采用RepeatHMM软件对各样品的三碱基重复数进行判断。

实施例三使用Oxford Nanopore Technology的PromethION平台进行三代测序

一、使用建库试剂盒建库

1文库准备

1.1末端修复及A尾连接

取DNA，置于冰上，加入NEB末端修复及A尾连接试剂，混匀。20℃孵育40分钟，65℃孵育20分钟。

1.2磁珠纯化

将1x AMPure beads加入DNA中，室温孵育15min，室温磁力架吸附5min，吸弃上清。

加入80％乙醇，磁力架吸附，弃上清，重复一次。室温晾干。

添加Ultra Pure Water，37℃下吹打洗脱。

磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的DNA。

1.3连接测序接头

加入NEB T4DNA快速连接buffer、NEB T4DNA快速连接酶和接头，混匀，20℃孵育20min。

1.4磁珠纯化，同步骤1.2

二、上样及测序

三、生信分析

1.basecalling及barcode拆分

2.样品覆盖度确定：计算每个样品每个基因覆盖度的多少，对于深度低于阈值的扩增子进行加测，确认数据量符合下游分析的要求。

3.三碱基重复数的判断：采用RepeatHMM软件对各样品的三碱基重复数进行判断。

实施例四

一、三代测序结果及其准确性

共收集15个样本，编号依次为A至O，其中样本A、G、K、O为正常人，其余11个样本均在临床上出现脊髓小脑共济失调典型症状。使用如背景技术所述PCR技术结合毛细管电泳，对这11个样本进行了确诊。

对上述的15个样本使用如实施例一、二、三所述的方法和步骤进行检测和分析。该过程中，实验人员、数据分析人员均不知道样本的基因型及表现型，以确保结果的可信性。分析结果如下表所示，其中：sample代表样品名称；表中数字表示三碱基重复个数；例如，“28/28”代表A样品的SCA1基因对应的三碱基重复数是纯合的，有28个；又如，“13/22”代表A样品的SCA2基因对应的三碱基重复数是杂合的，有13个和22个两种三碱基重复数。结果显示，除样本A、G、K、O外，其余样品均存在异常重复，与临床表型、毛细管电泳结果一致，说明本发明所述方法的准确性。

注：表中存在异常的重复数使用斜体、下划线形式突出显示

二、对中断重复的检测

SCA基因存在中断重复，是指，某种三碱基重复的中间位置被另一种三碱基所中断，如CAGCAGCAGCAGCTGCAGCAGCAGCAG，CAG重复被CTG中断分为两个CAG重复区。中断重复对重复片段的长度不会造成影响，因此基于长度检测原理的检测方法都无法对此突变类型进行鉴定。

使用本发明所述方法，可以实现对中断重复突变类型的检测。如SEQ ID NO:17所述的序列，为检测到的SCA17基因中断重复突变类型。第1434位至第1541位，为三碱基重复区域。在重复区域中，一共有6处中断重复突变，均为CAG被CAA中断，分别为第1443位、第1446位、第1449位、第1479位、第1485位、第1536位。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京希望组生物科技有限公司

<120> SCA基因突变检测的引物、试剂盒及方法

<160> 17

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctaacgttac ctgggctcgg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctgttggcgg attgtaccca 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agttagccgg gacaacactg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccctccgact tccggtaaag 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacctgaaag taactctgca tc 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agaggagctt aatgcaatca gtatt 25

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

attcacagtc ccaagcccac 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cttgctcctc ggttgtggat 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atccctaggg tctcgtcctg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggtatggtg ggctgatgtt 20

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gatctgccac cctaccagc 19

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggcccacaaa gaccagttca 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

aagctgggag agagggagag 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gggcccatct agctaaactt gt 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

cagcccatgg atcaaggagt 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

agctttgctt ccctttccca 20

<210> 17

<211> 1917

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 17

cagggaggga catatgctgt agctgccata gatagtgatt cctctgatga atctgggcaa 60

agtgaattga aaaccttctg aaaaagattc accattctag atgccattaa gaatgttcat 120

gattcatggg aggagggtga aatatcaaca tgaataagag tttggaagag gttgattcca 180

accctcgtgg atgactttga gaggttctag acttcagtgc tggaagttac tgcaggtgta 240

gtggaaatag caagtgaact agaattagaa gtgaacctga agatgtgact gaattgctgc 300

aattttttga taaaacctga acagatgagg agttgcttct tgtgagtaag caaagaaagt 360

ggtttcttga gatagaattg actcctggtg aagaactgat gactttagaa tattacataa 420

acttagttga taaagcagca gcagggtttg agaggattga ctccaatttt gaaataagtt 480

ctagtgtggg taaaatgctg tcaaatagta tcatatgcta cagagacatc ttcagtgaaa 540

ggaagagtca gtcagtgtgg caaacttcgt cagtcttatt ttaagaaatt gccacagcta 600

ccaccctgat cagtcagcag ccatcaacat cgaggcaaga tcctctgtca gcaaaaagat 660

tatgatttgc tgcaggctca catgattgtt agcattttta gcaataaagc atttttaaat 720

taagttatat acatattatt agacataatg ctattgcaca cttaatagac tttagtgcta 780

acataacttt tgtaggcact gggaaaccaa aaaattcatg ccgcttgctt tattgagatg 840

gtctggaacc taacctgtag tatctccgag gtatgcctgt atcttcattt gtaatatgtc 900

cttcacatct tttgcccttt tttattattt tatttgttga tcttctttta tggagttgtc 960

agagctcttt attattctgt ttaccagtcc tttctcagat gtatgtatta taggtatttt 1020

tttcccagtc tggcctgcct tttaattttc tcaatggtgt ctttcaaaga acagaagttt 1080

ttaatttttc cgaagttcag tttatccatt tttcttcatg tttatccact gtgtggtatt 1140

aaagaagaaa gcaatgtgta taagaatagc tggttcttcc gtaattaatg tttaataacc 1200

ccattattct ccgaaggcat ctgtctttgc acacctgacc tgctgttcca ccaagaaagt 1260

tccacaaaca cttagcagca gccagcctaa cctgtttttc tccttgcttt ccacagggtg 1320

ccatgactcc cggaatccct atctttagtc caatgatgcc ttatggcact ggactgaccc 1380

cacagcctat tcagaacacc aatagtctgt ctattttgga agagcaacaa aggcagcagc 1440

agcaacaaca acagcagcag cagcagcagc agcagcagca acagcaacag cagcagcagc 1500

agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc agcagcaaca ggcagtggca gctgcagccg 1560

ttcagcagtc aacgtcccag caggcaacac agggaacctc aggccaggca ccacagctct 1620

tccactcaca gactctcaca actgcaccct tgccgggcac cactccactg tatccctccc 1680

ccatgactcc catgaccccc atcactcctg ccacgccagc ttcggagagt tctgggattg 1740

taccgcagct gcagtgagta cttcgtgttt tatgtttcct cccacttagg agtccctttg 1800

agttatgttc ctgctctgtt ttcagatgga tccttttatt aagggaggga gtggcactaa 1860

cggtaattgt gtatcaaaat ttgctttatc tcacatttgg gaaagggaag caaagct 1917

Claims

1.一种引物对组合产品，其选自下列引物对中的至少一对：

SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4、SEQ ID NO：5和6、SEQ ID NO：7和8、SEQ ID NO：9和10、SEQ ID NO：11和12、SEQ ID NO：13和14、SEQ ID NO：15和16。

2.根据权利要求1所述的引物对组合产品，其中的部分或全部引物连接有barcode序列，以在扩增时用于区分不同样品。

3.一种试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物对组合产品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因组DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker中的一种或多种；

优选的，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4 DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

5.根据权利要求3或4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括末端修复酶、末端修复缓冲液、扩增或连接接头、接头链接缓冲液、DNA连接酶中的一种或多种。

6.组合物，其含有使用权利要求1或2所述的引物对组合产品、或权利要求3～5任一项所述的试剂盒扩增人DNA模板所得到的扩增子。

7.根据权利要求6所述的组合物，所述人DNA模板来自人的血液、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织(例如羊水或绒毛)、组织裂解液、骨骼或毛发。

8.一种检测SCA基因重复序列动态突变和/或中断重复的非诊断目的方法，其特征在于，包括：

a)制备权利要求6或7所述的组合物；以及

b)用三代测序平台对扩增产物进行检测；

优选的，在进行三代测序时，对所述组合物中的扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将三代测序的文库模型进行纯化后再上机测序。

10.权利要求1或2所述的引物对组合产品、或权利要求3～5所述的试剂盒在制备脊髓小脑性共济失调的诊断剂中的应用。