CN111378738B

CN111378738B - Htt和jph3基因的检测引物、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111378738B
Application number: CN201811641051.7A
Authority: CN
Inventors: 贺希文; 高玉梅; 郎娜; 梁帆; 王洋; 汪德鹏
Original assignee: Grandomics Biosciences Co ltd
Current assignee: Grandomics Biosciences Co ltd
Priority date: 2018-12-29
Filing date: 2018-12-29
Publication date: 2022-07-01
Anticipated expiration: 2038-12-29
Also published as: CN111378738A

Abstract

本发明涉及生物医学检测诊断领域，具体而言，涉及一种HTT和JPH3基因的检测引物、试剂盒及方法。本发明所提供的引物、试剂盒结合三代测序方法，可有效对Huntingtin、Junctophilin‑3基因的重复序列动态突变和/或中断重复进行检测。

Description

HTT和JPH3基因的检测引物、试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物医学检测诊断领域，具体而言，涉及一种HTT和JPH3基因的检测引物、试剂盒及方法。

背景技术

亨廷顿舞蹈病(Huntington disease,HD)是一种迟发型常染色体显性遗传的神经元变性疾病。主要病理改变为纹状体和大脑皮质选择性神经元缺失。该病一般于中年发病(30-40岁)，发病后平均生存期约为15年^[1]。临床上常分为成人型(adultonset HD)和幼年型(juvenile HD)两种。幼年型小于20岁发病仅占10％，幼年型病程进展快，生存周期短，一般为8-10年^[2]。而成人型HD主要表现为不随意舞蹈样动作、性格改变和痴呆。幼年型主要以运动徐缓、强直、肌张力异常和癫痫样发作较为常见。亨廷顿舞蹈病在全世界的发病率约为4-10/10万^[3]。该病由HTT基因上CAG重复序列异常扩增编码产生一种异常致病蛋白所致，该基因位于第4号染色体，为常染色体显性遗传。研究表明，家族性舞蹈病常被误认为是亨廷顿舞蹈病。特别是临床上与之相似的疾病，如类亨廷顿病综合征2型(Huntington diseaselike 2,HDL2)。类亨廷顿病综合征2型在临床上也可表现出不自主的舞蹈样动作^[6]，该病由JPH3基因上CTG重复序列异常导致。当缺乏典型临床病症及影像学改变时，亨廷顿舞蹈病与类亨廷顿病综合征2型很难区分与鉴定。

研究表明基因的重复扩张现象增加将直接导致突变基因的致病性进一步增强，且上述CAG重复数目扩张的现象多见于父系传递，且倾向于大幅度的扩张，而母系传递时CAG重复既可增多亦可减少，但变动的幅度较小，多为1～3个^[7]。目前对这一现象的机制尚不完全清楚，可能与精子发生过程中CAG重复序列的不稳定性有关。这种现象也可以解释为何青少年发病的HD多见于父系传递^[8]。散发病例的出现可能与新的HD基因突变有关。在不到1％的亲子代传递过程中正常重复序列的长度会发生一定的改变，当重复序列长度介于中等范围(约27-35个)时这种改变更为明显^[9-10]。尽管CAG重复数目是决定发病年龄最主要的因素，但并不是影响发病年龄的唯一因素。HTT基因CAG重复次数只能解释临床发病年龄变异的50％-70％^[11]。

总体而言，检测HTT基因(CAG)n与JPH3基因(CTG)n重复数已成为对HD与HDL2进行确诊的主要手段。对于该病的基因诊断仍为扩增后进行毛细管电泳法进行判断。本实验方法可以对亨廷顿舞蹈病患者HTT或类亨廷顿病综合征2型JPH3基因的重复数做出检测，并将两者进行区分，明确HTT/JPH3基因CAG/CTG的重复数及重复范围对疾病的诊断及分型具有重大意义，同时，对其家系高风险成员进行筛查，对产前胎儿进行产前诊断，指导其优生优育，为国内开展亨廷顿舞蹈病基因诊断及发病机制的研究奠定基础。

有鉴于此，特提出本发明。

附：参考文献

[1]Vonsattel J P,Myers RH,stevens TJ,et al.Neuropathologicalclassification of Huntington’s disease[J].J Neurol Exp Neuropathol,1985,44:549.

[2]Sieradzan KA,Mann DM.The selective vulnerability of nerve cells inHuntington’s disease[J].Neuropathol Appl Neurobiol,2001,27(1):1-22 1.

[3]王维治.神经病学[M].北京:人民卫生出版社,2006:1103-1105.

[4]Farrer LA,Conneally PM,Yu PL.The natural history of Huntingtondisease:possible role of“aging genes”[J].J Am Med Genet,1984,18:115-123.

[5]van Dijk,van der Velde,Roos R.et al.J uvenile Huntington disease[J].Hum Genet,1986,73:235-239.

[6]林芳,陈志欣,刘春风,等.亨廷顿舞蹈病一家系四例[J].中华医学遗传学杂志,2006,23:486.

[7]Zoghbi HY,Orr HT.Glutamine repeats and neurodegeneration[J].AnnuRev Neurosci,2000,23:217–247.

[8]Underwood BR,Rubinsztein DC.Spinocerebellar ataxias caused bypolyglutamine expansions:A review of therapeutic strategies[J].Cerebellum2008；7:215–221.

[9]Li J-L,HaydenM,Almqvist EW,et al.A genome scan formodifiers of ageat onset in Huntington’s disease:the HD MAPS Study[J].Am J Hum.Genet,2003,73(6):682.

[10]Mosserir R,Finkelstein Y,Monselize Y,et al.Large T celllymphomaina 13-year-old girl with hyperim munoglobulinemia syndrome[J].Pediatr AllergyImmunol,2002,13(2):143-146.

[11]Tang YP,Wang Y,Yang P,Liu Y,Wang B,Podolsky R,etal.Intergeneration CAG expansion and contraction in a Chinese HD family[J].AmJ Med Genet B Neuropsychiatr Genet 2006,141:242-244.

发明内容

本发明涉及一种引物对组合产品，其选自引物对SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4中一对或两对。

本发明所提供的引物对组合产品，可以直观的分析三碱基的重复数及碱基重复类型。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的引物对组合产品。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测HTT和/或JPH3基因重复序列动态突变和/或中断重复的方法，包括：

a)获得如上所述的组合物；

b)对所述组合物中的扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序；

所述方法包括诊断及非诊断用途。

毛细管电泳及一代测序是检测三碱基的重复数及碱基重复类型的常用方法，均需要通过PCR扩增技术，对受检样本进行PCR扩增。其中，毛细管电泳方法的扩增引物为携带荧光的侧翼引物序列。后续需要对扩增产物进行毛细管电泳，依据荧光信号读取数值，再根据信号值的大小进行重复数的计算。而一代测序则是利用荧光进行碱基的判读，后续仍然需要毛细管电泳，但受限于技术的局限易产生移码突变/双峰。无法得出重复碱基的类别及重复被中断的次数及类型，仅可得出重复碱基的重复次数。毛细管电泳的读长有限，只有两种即500bp和1200bp。当重复数大于一定的上限时，则毛细管无法进行试验乃至得出有效的结果，Sanger测序技术更是如此。

本发明所提供的方法采用三代测序，读长绝对满足三/五碱基重复扩展类型且无GC偏好性。测序序列结果不仅可以明确观察出三碱基的重复数及中断碱基类型，且对大量样品的检测显得特别高效，即高通量测序不仅可以同时分析上百个样品，而且还可同时高效分析2种不同基因型重复。准确度/灵敏度/可靠性方面相比毛细管电泳、克隆及二代测序都高。

根据本发明的一方面，本发明还涉及如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒在制备亨廷顿舞蹈症的诊断剂中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明一个实施例中一个DNA样品的2对引物PCR扩增结果；

图2为本发明一个实施例中各PCR产物混样后凝胶电泳鉴定结果；

图3为本发明一个实施例中应用Agilent 2100Bioanalyzer对文库进行质检所得到的检测峰图。

具体实施方式

上述引物对依次用于扩增Huntingtin(HTT)、Junctophilin-3(JPH3-F)基因，并用于检测重复序列动态突变和/或中断重复。

动态突变又称为不稳定三核苷酸重复序列，即在基因的编码区、3’或5’-UTR、启动子区、内含子区出现的三核苷酸重复，及其他长短不等的小卫星、微卫星序列的重复拷贝，其会在减数分裂或体细胞的有丝分裂过程中发生扩增从而造成遗传物质的不稳定状态。

中断重复：某种三碱基重复的中间任意位置被另一种三碱基所中断，如CAGCAGCAGCAGCTGCAGCAGCAGCAG，CAG重复被CTG中断分为两个/多个CAG重复区。

在一些实施方式中，其中的部分或全部引物连接有barcode序列，以在扩增时用于区分不同样品。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括基因组DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述水为无核酸酶的水，例如双蒸水或去离子水。

在一些实施方式中，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括末端修复酶、末端修复缓冲液、扩增或连接接头、接头链接缓冲液、DNA连接酶中的一种或多种。

所述引物对组合产品和试剂盒可以与三代测序联用以达到更好的技术效果。

根据本发明的一方面，本发明还涉及一种组合物，其含有使用如上所述的引物对组合产品、或如上所述的试剂盒扩增人DNA模板所得到的扩增子。

所述组合物通常以溶液的形式存在，溶剂可选用水或者常见的缓冲试剂。

在一些实施方式中，所述人DNA模板来自人的血液、血浆、细胞培养上清、唾液、精液、组织(例如羊水或绒毛)、组织裂解液、骨骼或毛发。

本文使用的"组织裂解物"、"细胞裂解物"、"裂解物"、"裂解的样品"、"组织提取物"或"细胞提取物"表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语"裂解"包括。

在一些实施方式中，所述DNA模板通过饱和苯酚-氯仿法、树脂提取法或磁珠提取法提取。

在一些实施方式中，所述DNA模板为含有DNA的血滤纸片、唾液卡片或FTA卡。

本发明所述方法能够直接以血滤纸片、唾液卡片、FTA卡等为DNA模板进行扩增，不需要对DNA进行提取，极大缩短获得最终分型结果所需要的时间。

a)制备如上所述的组合物；以及

b)用三代测序平台对扩增产物进行检测；

在一些实施方式中，在进行三代测序时，对所述组合物中的扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序；

所述方法为诊断或非诊断用途。

所述方法可用于亨廷顿舞蹈症的诊断。

在一些实施方式中，将三代测序的文库模型进行纯化后再上机测序。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例一DNA提取及PCR扩增一、DNA提取实验方法

使用试剂盒从血液中提取基因组DNA，例如使用TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒(DP348)，操作按照试剂盒说明书进行：

1.于血样中加入Buffer CL，混匀后离心；

2.弃上清，将入Buffer GS，混匀后离心；

3.加入Buffer GB和Proteinase K，混匀，温育；

4.室温静置，将入Buffer BD，混匀；

5.过吸附柱CG2，室温静置，离心，弃滤液；

6.向吸附柱CG2中加入Buffer BD，离心，弃滤液；

7.向吸附柱CG2中加入Buffer PW，离心，弃滤液；

8.重复步骤7；

9.离心，晾干吸附柱CG2；

10.向吸附柱CG2中加入Buffer TB，室温静置，离心。将滤液再次加入吸附柱CG2，室温静置，离心，收集滤液。滤液内含人全基因组DNA。

二、PCR扩增

用primer3在线设计2对引物。

引物名称及序列参见下表：

表1引物名称及序列

10个样品合成对应barcode引物进行扩增，引物与barcode序列参见下表，其中小写字母所示序列为barcode序列：

PCR体系见下表：

PCR条件见下表：

PCR结果鉴定：

用1％的琼脂糖凝胶在120V条件下，电泳15min。将电泳后的胶块放置于凝胶电泳系统进行照相，结果如图1所示。

三、PCR产物纯化及混样

产物纯化：对引物PCR产物进行0.9×AmpXP磁珠纯化，测定每对引物纯化后产物浓度。

混样：根据上述浓度确定2对引物产物的混样比，其他样品按照这个比例进行混样后，整体进行一次纯化。

实施例二使用PacBio sequal进行三代测序

一、使用建库试剂盒进行建库

1将混好的文库进行修复

修复溶液配制：

混匀，离心，放入PCR热循环仪中，进行修复反应，具体条件如下：

2接头连接

连接溶液体系如下：

混匀，离心，于PCR热循环仪中进行连接反应，具体条件如下：

3纯化

使用AMPure XP磁珠进行纯化，最后使用双蒸水洗脱磁珠，-20℃冰箱保存。

二、测序

三、测序数据生物信息学分析

1.call ccs reads：应用pacbio平台Smrtlink5-1分析流程进行ccs readscalling。

2.barcode拆分：将barcode序列和引物序列相应连接作为新的barcode reads，应用软件lima进行barcode拆分。

3.样品覆盖度确定：计算每个样品每个基因覆盖度的多少，对于深度低于阈值的扩增子进行加测，确认数据量符合下游分析的要求。

4.三碱基重复数的判断：采用RepeatHMM软件对各样品的三碱基重复数进行判断。

实施例三使用Oxford Nanopore Technology的PromethION平台进行三代测序一、使用建库试剂盒建库

1文库准备

1.1末端修复及A尾连接

取DNA，置于冰上，加入NEB末端修复及A尾连接试剂，混匀。20℃孵育40分钟，65℃孵育20分钟。

1.2磁珠纯化

将1×AMPure beads加入DNA中，室温孵育15min，室温磁力架吸附5min，吸弃上清。

加入80％乙醇，磁力架吸附，弃上清，重复一次。室温晾干。

添加Ultra Pure Water，37℃下吹打洗脱。

磁力架上静置5min，吸取上清，即为纯化后的DNA。

1.3连接测序接头

加入NEB T4DNA快速连接buffer、NEB T4DNA快速连接酶和接头，混匀，20℃孵育20min。

1.4磁珠纯化，同步骤1.2

二、上样及测序三、生信分析

1.basecalling及barcode拆分

2.样品覆盖度确定：计算每个样品每个基因覆盖度的多少，对于深度低于阈值的扩增子进行加测，确认数据量符合下游分析的要求。

3.三碱基重复数的判断：采用RepeatHMM软件对各样品的三碱基重复数进行判断。

实施例四

一、三代测序结果及其准确性共收集10个样本，编号依次为A至J，其中样本A、J为正常人，其余8个样本均在临床上出现亨廷顿舞蹈症或类亨廷顿病综合征2型的典型症状。且使用如背景技术所述PCR技术结合毛细管电泳，对这10个样本进行了确诊，即A、J为正常人；B、C、E、H为亨廷顿舞蹈症；D、F、G、I为类亨廷顿病综合征2型。

对上述的10个样本使用如实施例一、二、三所述的方法和步骤进行检测和分析。该过程中，实验人员、数据分析人员均不知道样本的基因型及表现型，以确保结果的可信性。分析结果如下表所示，其中：sample代表样品名称；表中数字表示三碱基重复个数；例如，“20/20”代表A样品的HTT基因对应的三碱基重复数是纯合的，有20个；又如，“13/22”代表A样品的JPH3基因对应的三碱基重复数是杂合的，有13个和22个两种三碱基重复数。结果显示，除样本A和J之外，其余样品均存在异常重复，且能够将两者进行区分，结果与临床表型、毛细管电泳结果一致，说明本发明所述方法的准确性。

注：表中存在异常的重复数使用斜体、下划线形式突出显示

二、对中断重复的检测

HTT基因存在中断重复是指，某种三碱基重复的中间位置被另一种三碱基所中断，如CAGCAGCAGCAGCAACAGCAGCAGCAG，CAG重复被CAA中断分为两个CAG重复区。JPH3基因也存在中断重复。中断重复对重复片段的长度不会造成影响，因此基于长度检测原理的检测方法都无法对此突变类型进行鉴定。

使用本发明所述方法，可以实现对中断重复突变类型的检测。如SEQ ID NO:5所述的序列，为检测到的HTT基因中断重复突变类型。第1137位至第1205位，为三碱基重复区域。在重复区域中，一共有3处中断重复突变，均为CAG被CAA中断，分别为第1152位、第1155位、第1200位。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京希望组生物科技有限公司

<120> HTT和JPH3基因的检测引物、试剂盒及方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggctgtccgg gtgagtatgg 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccatcagcaa cgtgttggtt t 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagcttcgct tctggtgttc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tgtgatgcaa gaacgagggg 20

<210> 5

<211> 1898

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

cttggggtcc tcaggtcgtg ccgaccacgc gcattctctg cgctctgcgc aggagctcgc 60

ccaccctctc cccgtgcaga gagccccgca gctggctccc cgcagggctg tccgggtgag 120

tatggctctg gccacgggcc agtgtggcgg gagggcaaac cccaaggcca cctcggctca 180

gagtccacgg ccggctgtcg ccccgctcca ggcgtcggcg ggggatcctt tccgcatggg 240

cctgcgcccg cgctcggcgc cccctccacg gccccgcccc gtccatggcc ccgtccttca 300

tgggcgagcc cctccatggc cctgcccctc cgcgccccac ccctccctcg ccccacctct 360

caccttcctg ccccgccccc agcctcccca cccctcaccg gccagtcccc tcccctatcc 420

cgctccgccc ctcagccgcc ccgcccctca gccggcctgc ctaatgtccc cgtccccagc 480

atcgccccgc cccgcccccg tctcgccccg cccctcaggc ggcctccctg ctgtgccccg 540

ccccggcctc gccacgcccc tacctcacca cgccccccgc atcgccacgc cccccgcatc 600

gccacgcctc ccttaccatg cagtcccgcc ccgtcccttc ctcgtcccgc ctcgccgcga 660

cacttcacac acagcttcgc ctcaccccat tacagtctca ccacgccccg tcccctctcc 720

gttgagcccc gcgccttcgc ccgggtgggg cgctgcgctg tcagcggcct tgctgtgtga 780

ggcagaacct gcgggggcag gggcgggctg gttccctggc cagccattgg cagagtccgc 840

aggctagggc tgtcaatcat gctggccggc gtggccccgc ctccgccggc gcggccccgc 900

ctccgccggc gcagcgtctg ggacgcaagg cgccgtgggg gctgccggga cgggtccaag 960

atggacggcc gctcaggttc tgcttttacc tgcggcccag agccccattc attgccccgg 1020

tgctgagcgg cgccgcgagt cggcccgagg cctccgggga ctgccgtgcc gggcgggaga 1080

ccgccatggc gaccctggaa aagctgatga aggccttcga gtccctcaag tccttccagc 1140

agcagcagca gcaacaacag cagcagcagc agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 1200

aacagccgcc accgccgccg ccgccgccgc cgcctcctca gcttcctcag ccgccgccgc 1260

aggcacagcc gctgctgcct cagccgcagc cgcccccgcc gccgcccccg ccgccacccg 1320

gcccggctgt ggctgaggag ccgctgcacc gaccgtgagt ttgggcccgc tgcagctccc 1380

tgtcccggcg ggtcccaggc tacggcgggg atggcggtaa ccctgcagcc tgcgggccgg 1440

cgacacgaac ccccggcccc gcagagacag agtgacccag caacccagag cccatgaggg 1500

acacccgccc cctcctgggg cgaggccttc ccccacttca gccccgctcc ctcacttggg 1560

tcttcccttg tcctctcgcg aggggaggca gagccttgtt ggggcctgtc ctgaattcac 1620

cgaggggagt cacggcctca gccctctcgc ccttcgcagg atgcgaagag ttggggcgag 1680

aacttgtttc tttttatttg cgagaaacca gggcgggggt tcttttaact gcgttgtgaa 1740

gagaacttgg aggagccgag atttgctcag tgccacttcc ctcttctagt ctgagaggga 1800

agagggctgg gggcgcggga cacttcgaga ggaggcgggg tttggagctg gagagatgtg 1860

ggggcagtgg atgacataat ggctttagga cggctcgg 1898

Claims

1.一种引物对组合产品，其选自引物对SEQ ID NO：1和2、SEQ ID NO：3和4中一对或两对。

2.根据权利要求1所述的引物对组合产品，其中的部分或全部引物连接有barcode序列，以在扩增时用于区分不同样品。

3.一种试剂盒，其包含权利要求1或2所述的引物对组合产品。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括基因组DNA提取体系、PCR反应缓冲液、无核酸酶的水、DNA聚合酶、分子量marker中的一种或多种。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶选自Taq、Bst、Vent、Phi29、Pfu、Tru、Tth、Tl1、Tac、Tne、Tma、Tih、Tf1、Pwo、Kod、Sac、Sso、Poc、Pab、Mth、Pho、ES4DNA聚合酶、Klenow片段中的任一种。

6.根据权利要求3-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括末端修复酶、末端修复缓冲液、扩增或连接接头、接头链接缓冲液、DNA连接酶中的一种或多种。

7.一种检测HTT和/或JPH3基因重复序列动态突变和/或中断重复的非诊断目的方法，其特征在于，包括：

a）使用权利要求1或2所述的引物对组合产品、或权利要求3~6任一项所述的试剂盒扩增人DNA模板得到扩增子；以及

b）用三代测序平台对扩增产物进行检测；

在进行三代测序时，对所述扩增子的两端进行末端修复，再向经过末端修复的DNA两端连接扩增接头以构建三代测序的文库模型并上机测序。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将三代测序的文库模型进行纯化后再上机测序。

9.权利要求1或2所述的引物对组合产品、或权利要求3~6任一项所述的试剂盒在制备亨廷顿舞蹈症和/或类亨廷顿病综合征2型的诊断剂中的应用。