CN106636388A

CN106636388A - 用于亨廷顿病诊断的基因及其应用以及由其编码的蛋白和蛋白的应用

Info

Publication number: CN106636388A
Application number: CN201611162748.7A
Authority: CN
Inventors: 吕道远; 张沛玲; 赖小龙; 栗冀长; 吴东颖
Original assignee: Hunan Zhong Jing Jing Wei Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Hunan Zhong Jing Jing Wei Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2016-12-15
Filing date: 2016-12-15
Publication date: 2017-05-10

Abstract

本发明公开了一种用于亨廷顿病诊断的基因及其应用以及由其编码的蛋白和蛋白的应用，其中用于亨廷顿病诊断的基因为Pebp1基因，Pebp1基因的编码序列为SEQ ID No.1所示的DNA序列；用于亨廷顿病诊断的基因编码的蛋白为PEBP1蛋白，PEBP1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。本发明根据Pebp1基因或PEBP1蛋白的表达量可应用于制备亨廷顿病的检测试剂盒或芯片，同时设计抑制Pebp1基因或PEBP1蛋白表达的抑制剂或抗体可用于制备治疗亨廷顿病的药物。本发明使用基因标志物来诊断亨廷顿病(HD)具有及时性、特异性和灵敏性等优势。

Description

用于亨廷顿病诊断的基因及其应用以及由其编码的蛋白和蛋白的应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种用于亨廷顿病诊断的基因及其应用以及由其编码的蛋白和蛋白的应用。

背景技术

亨廷顿病(Huntington's disease,HD)为一种迟发性神经退行性遗传病，以舞蹈样症状为典型表现的进行性加重的运动障碍、认知功能衰退及精神疾病症状为临床特征，本病呈世界性分布，发生于所有的种族，人群患病率约为5/10万，发病年龄一般为30～50岁，发病后15～20年死亡。该病主要侵害基底神经节和大脑皮质，具有高度的区域选择性。基底神经节运动通路受损引发运动过度，即产生亨廷顿病的主要临床症状—舞蹈样动作；同时大脑皮层受损导致患者认知功能障碍，晚期亨廷顿病症多见痴呆。

目前，亨廷顿病的治疗方法以经验性对症支持治疗为主，对舞蹈样症状的控制可采用丁苯那嗪或奥氮平等第2代抗精神病药物；抑郁等精神症状的改善多借助抗抑郁药；认知功能障碍则以心理疗法加以干预。然而上述方法仅对善患者生活质量有一定作用，并不能延缓病程进展，许多大样本系统性回顾研究也显示，目前应用于临床的各种药物对亨廷顿病的治疗效果并不明确。

因此，如何另辟蹊径，寻找更为有效并能从根本上阻遏疾病进展的治疗方法，成为诸多研究探索的焦点。1993年，HD协作研究小组找到了HD基因，将其定位于4p16.3，并且揭示it15基因的不稳定突变是HD的遗传学基础。HD发病是it15基因外显子1的CAG三核苷酸重复序列的异常扩增，引发其编码的亨廷顿蛋白(Huntington's Htt)内多聚谷氨酰胺序列(Poly Q)延长产生。健康人的两个等位基因可含有6～25个CAG三联体，而在HD患者中，突变的等位基因中却含有36～120个CAG三联体。It15基因CAG系列重复导致正常的野生型亨廷顿蛋白(Wild Huntingtin,wHtt)缺失和异常的突变型亨廷顿蛋白(Mutant Huntingtin,mHtt)的产生。迄今，HD研究取得令人瞩目的成就，但发病机制仍然不清，尚无有效疗法。

因为亨廷顿病(HD)是一种单基因常染色体显性遗传性神经系统变性疾病，其致病基因是位于染色体4p16.3的it15基因，因此该病的基因诊断方法是运用PCR方法检测ITl5基因中的CAG重复序列数，作为对HD进行确定诊断的主要根据，当其拷贝数目>40次时即具备完全外显率。

临床上，亨廷顿病(HD)诊断的主要根据是：该病多在中年起病，具有三大临床特征即舞蹈样动作、精神异常、痴呆，阳性家族史，病情进行性发展。PET和MRI、fMRI检查结果可助诊。头颅CT或MRI检查可发现部分患者的尾状核头部、壳核以及大脑皮质萎缩，脑室扩大，尾状核萎缩程度与疾病的严重程度有关。PET检查发现患者脑内局部葡萄糖代谢率(localcerebral metabolic rate of Glucose，LCMRGlu)在基底节明显减少。也有研究提示，HD在临床作出诊断的前几年已出现基底节代谢异常。应用fMRI检测能较早发现异常。

然而，由于近来发现HD突变的不稳定性、对HD缺乏有效的治疗、中年起病、不同病因所致的相似表现等均使HD的临床诊断复杂化。近年来，血清蛋白质组学理论与技术的出现为寻找包括神经退行性疾病在内的多种疾病有效的临床生物学标志物提供了全新的方法。其中，同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation,iTRAQ)技术为解决低丰度蛋白的定性、定量研究提供了有效方法。。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可用于亨廷顿病(HD)诊断的分子标志物基因Pebp1。相比传统的亨廷顿病(HD)的诊断方法，使用基因标志物来诊断亨廷顿病(HD)具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施，可应用于亨廷顿病的诊断和治疗。本发明还提供了以后总用于亨廷顿病(HD)诊断的蛋白PEBP1蛋白，利用蛋白的表达水平来诊断亨廷顿病(HD)具有及时性、特异性和灵敏性。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于亨廷顿病诊断的基因，所述用于亨廷顿病诊断的基因为Pebp1基因，所述Pebp1基因的编码序列为以下a、b、c中的任意一种：

a、SEQ ID No.1所示的DNA序列；

b、在严格条件下与所述a限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

c、与所述a或b限定的序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

进一步优选的，与所述a或b限定的序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA分子。

在本发明的上下文中，“Pebp1基因”包括人Pebp1基因以及与人基因的任何功能等同的多核苷酸。Pebp1基因包括与目前国际公共核酸序列数据库中Pebp1基因(NCBIGenebank accession No.NM_002567.3)DNA序列具有70％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种权利要求1所述的用于亨廷顿病诊断的基因在制备亨廷顿病的检测试剂盒或芯片中的应用。

上述的应用，优选的，所述检测试剂盒包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为SEQ ID NO.3所示的序列，所述反向引物的序列为SEQ ID NO.4所示的序列。

上述的应用，优选的，所述芯片包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为用于检测Pebp1基因转录水平的寡核苷酸探针。所述寡核苷酸探针的序列为SEQ ID NO.7所示的序列，具体为：5’TGAGCCTGCAAGAAGTGGACGAGC3’。

上述的应用，优选的，包括检测试剂盒包括为通过RT﹣PCR、实时定量PCR、免疫检测、核酸杂交或芯片检测Pebp1基因的表达水平以诊断亨廷顿病的产品。

进一步，所述用RT﹣PCR诊断亨廷顿病的产品至少包括一对特异扩增Pebp1基因的引物；所述用实时定量PCR诊断亨廷顿病的产品至少包括一对特异扩增Pebp1基因的引物；所述用免疫检测诊断亨廷顿病的产品包括：与PEBP1蛋白特异性结合的抗体；所述用核酸杂交诊断亨廷顿病的产品包括：与Pebp1基因的核酸序列杂交的探针；所述用芯片诊断亨廷顿病的产品包括：蛋白质芯片和基因芯片；其中，蛋白质芯片包括与PEBP1蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与Pebp1基因的核酸序列杂交的探针。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的用于亨廷顿病诊断的基因在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。所述的药物包括含有Pebp1基因表达产物的抑制剂。进一步，所述抑制剂为抑制Pebp1基因表达产物活性的物质。

上述的药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括但并不限于稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂，如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯毗咯烷酮；湿润剂，如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铰化合物；表面活性剂，如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的用于亨廷顿病诊断的基因编码的蛋白，所述蛋白为PEBP1蛋白，所述PEBP1蛋白的氨基酸序列为以下A、B、C中的任意一种：

A、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

B、将SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过1～50个氨基酸残基的取代和/或缺失和或添加且与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID No.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质；

C、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性。更优选地，与SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列至少约90至95％的同源性，常为96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列构成的多肽。

在本发明的上下文中，Pebp1基因表达产物包括人PEBP1蛋白以及人PEBP1蛋白的部分肽。所述蛋白的部分肽含有与亨廷顿病(HD)相关的功能域。

“PEBP1蛋白”包括人PEBP1蛋白以及人PEBP1蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括人PEBP1蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严谨条件下能与人Pebp1基因的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。

通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰，其中氨基酸的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。

通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是PEBP1蛋白的融合蛋白。对于与PEBP1蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留PEBP1蛋白的生物学活性即可。

本发明的蛋白也包括对SEQ ID No.2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留PEBP1蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如7个或者更少，例如3个或者更少。

一种上述的蛋白在制备检测亨廷顿病的检测试剂盒或芯片中的应用。

上述的应用，优选的，所述检测试剂盒包括与PEBP1蛋白特异性结合的抗体。

上述的应用，优选的，所述芯片包括固相载体和固定在固相载体上与PEBP1蛋白特异性结合的抗体。

进一步，所述抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述PEBP1蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰。例如，嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2等。只要所述片段能够保留与PEBP1蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备是本领域技术人员公知的，并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。

作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的用于亨廷顿病诊断的基因编码的蛋白在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。

上述的应用，优选的，所述药物为针对PEBP1蛋白的单克隆抗体。

上述的应用，优选的，所述药物为基于PEBP1抗原蛋白的疫苗。

检测样本可以是病人的血液样本或者其他体液样本。其中体液样本包括脑脊液。

在本发明的上下文中，“诊断亨廷顿病(HD)”既包括判断受试者是否已经患有亨廷顿病、也包括判断受试者是否存在患有亨廷顿病(HD)的风险。

在本发明的上下文中，“治疗亨廷顿病(HD)”从疾病的状态变化来分，可以包括疾病的缓解、疾病的完全治愈。从药物发挥的作用不同，可以包括抑制mHtt聚合物的形成、保护线粒体功能、抑制乙酰胆碱降解、拮抗多巴胺受体或降低多巴胺活性以及增加脑内GABA含量和抑制谷氨酰胺释放。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明首次发现了Pebp1基因的表达水平与亨廷顿病(HD)相关，通过检测受试者血液/脑脊液中的Pebp1基因的表达情况，可以判断受试者是否患有亨廷顿病(HD)、或者判断受试者是否存在患有亨廷顿病(HD)的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

(2)本发明提供了一种由Pebp1基因编码的PEBP1蛋白，通过检测受试者血液/脑脊液中的PEBP1蛋白的表达情况，可以判断受试者是否患有亨廷顿病(HD)、或者判断受试者是否存在患有亨廷顿病(HD)的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。

(3)本发明发现了一种新的分子标记物基因，相比传统的检测手段，蛋白质组学技术检测更及时、更特异、更灵敏，能够实现亨廷顿病(HD)的早期诊断，从而降低亨廷顿病(HD)的死亡率。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例2中利用实时定量PCR检测Pebp1基因在亨廷顿病(HD)患者血液中的表达情况。

图2为本发明实施例3中为利用免疫印迹检测验证PEBP1蛋白分别在亨廷顿病(HD)患者和正常人血液中的表达情况。

图3为本发明实施例3中为利用免疫印迹检测验证PEBP1蛋白分别在亨廷顿病(HD)患者和正常人血液中的蛋白表达量的平均值。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例1：基于iTRAQ技术的蛋白质组学方法筛选与亨廷顿病相关的蛋白标志物

(1)样品收集和分组

1.1分别收集10例正常人血液和10例亨廷顿病患者血液样本，于﹣80℃冰箱中储存，上述所有标本的取得均通过伦理委员会的同意。

1.2血清样品的采集和分组

取出10对受试者的血清样品，4℃放置30min后12000g离心5min，取离心后的上清液于EP管仲。每EP管100μL分装，﹣20℃保存。分别将10名亨廷顿病例组血清样品混合和10名匹配正常人血清样品混合，最终获得1份亨廷顿病例组混合血清样品和1份匹配正常人混合血清样品。

(2)白蛋白/Ig G球蛋白去除。

2.1取亨廷顿病例组混合血清样品和正常人混合血清样品各60μL，以结合缓冲液(Binding Buffer)10倍稀释得到预处理样本。

2.2分离柱准备：

2.2.1除去柱子上的盖子，以纸吸去贮存缓冲液。

2.2.2除去柱底部的尖咀，放入大小适合的收集管。

2.2.3加入850μL结合缓冲液，让其靠重力流过柱体。

2.2.4将柱子放入一个新的大小适合的收集管中。

2.3白蛋白/Ig G去除：

2.3.1加入2.1中预处理样本，让其靠重力流过分离柱。

2.3.2以600μL结合缓冲液清洗分离柱。

2.3.3再次以600μL结合缓冲液清洗分离柱，收集三次结合缓冲液过柱的洗脱组分，即为去除白蛋白/Ig G后的蛋白样本。

(3)丙酮沉淀：

3.1取100μg去除白蛋白/Ig G后的蛋白样本，按照体积比1∶4的比例缓慢加入预冷的丙酮溶液(丙酮的温度为﹣20℃)，混匀后在﹣20℃静置过夜。

3.2在4℃，12000g离心30min，弃上清；沉淀用80％丙酮(﹣20℃)洗涤3次，12000g离心10min，弃上清，收集沉淀。

3.3将沉淀真空离心干燥，置﹣80℃备用。

(4)Bradford法测定蛋白质浓度

4.1以牛血清蛋白为标准品，配制1mg/ml标准蛋白溶液。

4.2分别取0μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL标准蛋白溶液用PBS(p H7.2)溶液定容至150μL得到溶液1、2、3、4、5、6、7。将溶液1～7加入到2850μL考马斯亮蓝G250溶液中，以考马斯亮蓝G250染色液为空白参比，595nm处测定吸光度A值，用A595为横坐标，以标准蛋白浓度为纵坐标，绘制标准曲线。

4.3测定样品蛋白时，取5μL待测蛋白溶液(待测蛋白溶液的制备方法：以含6M尿素和2M硫脲的蛋白裂解液溶液3.3的沉淀，混合得到待测蛋白溶液)加入到2995μL G250溶液中，于595nm处测定吸光度值，根据测定的标准曲线计算蛋白浓度。

(5)蛋白样品酶解和标记

5.1向100μg步骤3.3的沉淀(即蛋白样品)加入20μL溶解液(DissolutionBuffer)，1μL 变性剂(SDS)，2μL还原剂(iTRAQ试剂盒自带)，混匀，60℃孵育1小时。

5.2加入1μL methanethiosulfonates(MMTs，iTRAQ试剂盒自带)，进行半胱氨酸封闭，混匀后室温孵育10分钟。

5.3加入2μg胰蛋白酶(蛋白∶胰酶＝50∶1)，混匀，37℃孵育12小时。

5.4将5.3步骤孵育后的蛋白组分于﹣20℃低温冷冻干中冻干，并用iTRAQ试剂盒中自带的30μL 0.5M TEAB(triethylammoniumrnonate)缓冲液充分溶解肽段样品。

5.5样品标记：从﹣20℃分别取出iTRAQ同位素标记标签，每个蛋白样品对应一个试剂标签。向其中分别加入70μL乙醇(iTRAQ试剂盒自带)充分混匀加入各自对应的肽段样品中，轻柔混匀并室温孵育1小时。

5.6标记反应结束后，将各组标记好的肽段样品等量混合，加入10倍体积强阳离子交换Buffer A(10m M KH₂PO₄，25％ACN，PH 3.0)，并加入2μL甲酸调节体系pH＝3.0，于4℃，15000g离心5min，以除去不溶物得到上清液。

(6)在线二维nano液相色谱分离混合蛋白酶解液：将步骤5.6得到的上清液(即肽段样品)于室温解冻后，震荡混匀，并于4℃，15000g离心5分钟，取适量上清于微量进样瓶，自动进样器进样。

第一维分离采用强阳离子交换柱(ZORBAX BIO﹣SCX II 3.5μm,35×0.3mm，美国Agilent公司)；用NH₄Cl进行洗脱，采用8个盐梯度(分别为10m M、40m M、80m M、100m M、200m M、300m M、500m M、1000m M)。

第二维采用C18(ZORBAX 300SB﹣C18 3.5μm,150mm×75μm，Agilent)柱进行反相洗脱，流动相：A相为5％ACN/H₂O混合体系(含0.1％FA)；B相为95％ACN/H₂O混合体系(含0.1％FA)；反相分离梯度洗脱程序见下表1。

表1：nano﹣HPLC流动相梯度

编号	时间(min)	B相(％)	流速(nL/min)
				1	0	0	300
2	5	0	300
				3	15	10	300
4	85	35	300
				5	90	80	300
6	98	90	300
				7	101	0	300
8	120	0	300

(7)质谱鉴定

7.1采用纳升电喷雾离子源(Nano ESI)，质谱参数设定如下：喷雾电压1500V；离子源温度150℃；干燥气为高纯氮气(纯度大于99.999％)，流量2L/min；质谱采集范围70m/z﹣2500m/z，在350m/z﹣1200m/z范围内选择丰度最高的5个母离子做二级碎片扫描，采用动态排除，动态排除时间0.2min。

7.2质谱数据采集：在Data Analysis(Data Analysis 4.0版本，美国Agilent公司)中打开每个盐梯度对应的数据文件，选择protein analysis功能，将质谱数据以mgf文件格式导出；对所有的梯度进行分析，将所得的各个mgf文件合并为一个mgf文件。

(8)蛋白质组学的生物学平行设置

本实施例分别设置了双份血清生物样品的平行重复和仪器检测的平行重复以保证亨廷顿病蛋白质组学实验的稳定性。生物学平行样品为将取实验方法中1.1.血清样品的采集和分组步骤获得的亨廷顿病例组混合血清样品和配对照组混合血清样品各分为2个样品，在1.5蛋白样品酶解和标记步骤中分别将2份亨廷顿病例组混合血清蛋白样品利用iTRAQ标记试剂盒标记为116，117标记，两份对照组混合血清蛋白样品标记为114，115标记，建立血清蛋白样品的生物学平行重复。仪器检测的平行重复为对前处理完成后的样品进行仪器检测中，每份样品检测3次。

(9)蛋白质组学数据检索和差异蛋白的筛选

质谱数据检索使用mascot搜索引擎进行数据库搜索，采用MS/MS方式，导入mgf数据文件，选择相应数据库及搜索参数，进行搜索；选择数据库选择Swiss Prot(非冗余)数据库；参数选择肽片段分子质量容许误差±0.1Da，二级质谱肽片段分子质量容许误差±0.05Da，电荷数+2，+3，+4，酶解片段不完全。固定修饰，脲甲基半胱氨酸。可变修饰，氧化；数据以Excel形式导出进行后续分析。通过将116，117标签标记的亨廷顿病例组样本及114，115标签标记的正常样本进行两两比较，整理3组仪器平行重复结果和2份生物样品平行重复结果。后续分析差异蛋白的入选标准：(1)在重复实验任意一组中具有定量信息；(2)以三组数据蛋白质表达水平比值差异大于等于1.2倍或小于等于0.8倍(即Ratio>＝1.5或Ratio<＝0.8)的蛋白质为差异表达蛋白质。

表2为基于iTRAQ技术的质谱分析检测亨廷顿病(HD)患者与正常人血液中蛋白质差异表达情况，分析的部分在亨廷顿病人血清中表达升高的蛋白质。

表2：在亨廷顿病人血清中表达升高的蛋白质统计表：

经筛选分析发现，PEBP1蛋白(Ratio＝1.735)为差异表达蛋白。

PEBP1蛋白的核苷酸序列为(SEQ ID NO.1)：

MPVDLSKWSGPLSLQEVDEQPQHPLHVTYAGAAVDELGKV

LTPTQVKNRPTSISWDGLDSGKLYTLVLTDPDAPSRKDPKYREWHHFLVVNMKGNDISSGTVLSDYVGSGPPKGTGLHRYVWLVYEQDRPLKCDEPILSNRSGDHRGKFKVASFRKKYELRAPVAGTCYQAEWDDYVPKLYEQLSGK。

与其对应的Pebp1基因的序列为(SEQ ID NO.2)：

实施例2：

一种实施例1的用于亨廷顿病诊断的基因(Pebp1基因)在制备亨廷顿病的检测试剂盒中的应用，根据蛋白质组学技术的检测结果选择Pebp1基因进行大样本验证。具体应用方法包括以下步骤：

(1)样本选择：按照实施例1中的样本收集方式选择亨廷顿病患者血液和正常人血液各80例样品的制备及质量分析。

(2)样品的制备：使用Invitrogen公司的提取试剂盒提取。具体步骤如下：

2.1取收集在肝素或处理过的试管中的全血，放进无菌离心管中。

2.2收集血细胞离心，小心地从样品顶部吸走上清。

2.3加1mL血细胞裂解液，小心吸放4次(4～5次均可实施)，重悬沉淀物。

2.4 3000rpm离心5min。

2.5重复步骤2.3、2.4两次。

2.6避开细胞沉淀物，小心吸走几乎所有上清，只保留上100μL清液确认BME已经加到RNA裂解液中，然后加175μL裂解液到细胞中，吸放重悬并裂解细胞。

2.7加350μL RNA稀释液，颠倒混合3次(3～4次均可实施)。

2.8置于70℃水浴中3min。

2.9室温下13000g离心10min。

2.10取离心后的清亮裂解物上清转移到一支无菌离心管中；

2.11向澄清裂解液中加入200μL95％乙醇，用移液枪吸放3次(3～4次均可)以混合得到混合物。将此混合物转移到离心柱装配体中，13000rpm离心1min。

2.12从离心柱装配体上拿下离心柱，弃去收集管中的液体，将离心柱装回到收集管上，确认一下RNA wash solution已用乙醇稀释，加600μLRNA洗涤液于离心柱装配体，13000rpm离心1min，弃去收集管中的液体。

2.13将离心柱装回到收集管上，将新鲜制备的50μL DNase孵育混合物直接加到离心柱内的膜上，室温下孵育15min，向离心柱中加入DNA酶终止缓冲液(确认已加入乙醇)，13000rpm离心1min。

2.14加入600μLRNA洗涤液(已加入乙醇)，13000rpm离心1min。

2.15清空收集管，向离心柱内加入250μLRNA洗涤液(已加入乙醇)，高速离心2min。

2.16将离心柱从收集管上转移到洗脱管上，向膜上加100μL无核酸酶水，将离心柱装配体放进离心机并使洗脱管的盖子朝外，13000rpm离心1min，丢弃离心柱，盖好盛有RNA的洗脱管，存于﹣70℃。

(3)RNA样品的质量分析(Nanodrop2000分光光度计)

使用分光光度计(Nanodrop2000分光光度计)检测经步骤(2)处理后的样品，测定得80位亨廷顿病患者RNA样品的OD260/OD280为1.8～2.2。正常人RNA样品的OD260/OD280为1.8～2.2。

将上述提取的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，检测样品质量，观察80位亨廷顿病患者和80位正常人的28SrRNA和18SrRNA其主带明显、无降解、完整性指数合格、浓度达到进行逆转录实验的要求。

(4)逆转录：使用Invitrogen公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：

4.1取总RNA 2μg进行逆转录，加入Oligo(dT)2μL，充分混匀；70℃水浴5min后立即冰浴2min(2～3min均可)。

4.2构建25μL反应体系，其中包括逆转录缓冲液5μL，dNTP(2.5mM)5μL，RNasin40U/μL，逆转录酶M﹣MLV 200U/μL，补无核酶水至25μL。

4.3 42℃水浴60min后，95℃水浴5min以灭活M﹣MLV。

4.4﹣20℃储存备用。

4.5实时定量PCR扩增

4.5.1扩增引物设计

根据Pebp1基因、GAPDH基因设计扩增引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：

Pebp1基因：

正向引物为5’CTACACCTTGGTCCTGACAGA 3’；

反向引物为5’GAGCCCACATAATCGGAGAGG 3’。

GAPDH基因(扩增反应的内参照基因)：

正向引物为5’CTCACCGGATGCACCAATGTT 3’；

反向引物为5’CGCGTTGCTCACAATGTTCAT 3’。

4.5.2按照表3配制反应体系

其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自QIAGEN公司。

表3：PCR反应体系

试剂	体积
		正向引物	1μL
反向引物	1μL
		2×SYBR Green Mix	12.5μL
体系模板	2μL
		去离子水	补足25μL

(Pebp1基因和GAPDH基因都是一样的反应体系)

4.5.3PCR反应条件

95℃10min，95℃15s，60℃60s×45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Bio﹣Rad CFX96荧光定量PCR仪上进行反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

(5)统计学方法

实验采用3次重复实验，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，使用SSPS11.5统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。

(6)结果

结果如图1所示，与80例正常人血液相比，Pebp1基因在80例亨廷顿病患者血液中的表达上调，差异具有统计学意义。证明通过检测Pebp1基因的相对表达量，可检测亨廷顿病。

实施例3：

免疫印迹检测验证PEBP1蛋白的差异表达，其应用方法包括以下步骤：

(1)根据蛋白质组学技术的检测结果选择PEBP1蛋白进行大样本验证。按照实施例1中的样本收集方式选择亨廷顿病患者血液和正常人血液各80例样品的制备及质量分析。

(2)免疫印迹样品的制备

每例标本中各取100μL血清，加入PBS溶液等比例稀释，混匀后分别加入同等量的PMSF、PIC和DTT三种蛋白酶抑制剂，与25μL SDS﹣PAGE蛋白上样缓冲液(5×)混合后，于沸水中煮5min，至蛋白变性后﹣80℃存储得到蛋白样品。

(3)血清总蛋白含量测定

3.1标准曲线的制作：

3.1.1低温冰箱中取出BSA溶液，正常融化后稀释成1mg/ml的溶液。

3.1.2配制0.15mol/L Na Cl溶液和PBS﹣Tween20(PBST)，备用。

3.1.3取33支离心管(1.5ml)，3支一组，分别标记为0g/ml、0.5g/ml、1g/ml、2g/ml、4g/ml、8g/ml、16g/ml、24g/ml、32g/ml、48g/ml、64g/ml。

3.1.4按照下表4中各组的浓度配制加入相应试剂。

表4：标准曲线制作各组成分表

3.4各离心管混匀后，25℃静置5min，在752型分光光度仪上比色分析，记录测试结果，制作分光光度值﹣浓度曲线。

(4)检测各组血清样本的总蛋白含量

4.1选取11支容积足量的离心管，分别加入900μL的G250考马斯亮蓝溶液，25℃放置20min后用于蛋白测定。

4.2先取出其中1管，加入100μL l 0.15mol/L的NaCl溶液，均匀混合后放置5min，用做空白对照，在完成标准曲线程序下加入空白管，选择blank按键测量空白样品光度值。

4.3取另一支管加入0.15mol/L NaCl溶液92μL和步骤2中的蛋白样品8μL，均匀混合后放置5min，选择sample按键测量待检血清样品。

4.4依据标准曲线和检测的分光光度值，计算两组间蛋白的相对含量，确定各组的上样体积(各组间蛋白含量一定，体积不一样)。

4.5十二烷基硫酸钠﹣聚丙烯酰胺凝胶(SDS﹣PAGE)电泳

4.5.1凝胶制备：两块玻璃板清洗干净，自然晾干，竖直夹紧于电泳架上。按照凝胶配制试剂盒要求配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，分离胶加入TEMED后即刻混匀并灌入玻璃板间，上层缓慢均匀加入无水乙醇，等待10min左右，待乙醇与胶之间出现明显折线，提示分离胶已凝固。

4.5.2弃去上层乙醇，浓缩胶加入TEMED并混匀后，立即即灌入玻璃板上层，垂直插入电泳梳子，置于37℃烘箱中20min左右，待凝胶完全凝固。

4.5.3凝胶后垂直拔出梳子，将玻璃板垂直安放于电泳槽中，加入足够电泳液，准备上样。

(5)蛋白上样

根据上述蛋白定量结果，调整样本蛋白浓度，以确定各组样本的上样体积。

对照组(Control)和亨廷顿病人(HD)样品组分别设置相邻的两个重复泳道，依次加入相应的蛋白标本，同时预留最初或者最后的一个泳道作为蛋白质分子量标准的上样泳道。

(6)蛋白电泳

电泳时间2h，均为恒压电泳，浓缩胶选择80V，分离胶选择100V，待溴酚蓝刚好泳出分离胶，即停止电泳。

(7)半干法转膜

7.1电泳完毕后缓慢撬开两块玻璃板，取出聚丙烯酰胺凝胶，参照彩色蛋白分子量标准和泳道宽度切取适当的凝胶宽度，准备转膜。

7.2根据凝胶大小，切取两块合适的超厚滤纸和一块PVDF膜，其中确保滤纸长宽度大于凝胶，而小于PVDF膜，将滤纸和膜置于甲醇中浸泡湿润。

7.3半干法转膜，上自下而上分别加入：超厚滤纸，PVDF膜，PAGE胶，超厚滤纸，进行恒压转膜，转膜条件为：15V，50min。

7.4转膜完毕后，采用1×丽春红染色液染膜2～3min，相机拍下丽春红染膜照片，以备上样均一性的控制；而后去离子水冲去PVDF膜上染液，剪去膜边缘多余部分，准备孵育抗体。

(8)封闭

量取40ml的免疫印迹封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST溶液)，置于小培养皿中，将PVDF膜加入其中，25℃封闭90min。

(9)抗体孵育

9.1用透明塑料薄膜封装PVDF膜，留一侧开口，以备加入抗体溶液。

9.2采用免疫印迹—抗稀释液配制兔源性抗人PEBP1蛋白抗体以1∶1000体积比稀释于抗体孵育溶液(含1％BSA的TBST溶液)，加进塑料薄膜小袋中，并小心排出溶液中气泡，封住开口，置于4℃震荡过夜。

9.3剪开塑料袋，取出PVDF膜，用PBST溶液洗涤3次，每次10min。

9.4用上述同样方法再次封装PVDF膜。

9.5采用免疫印迹二抗稀释液配制辣根过氧化物酶标记山羊抗兔Ig G二抗，稀释1000倍后加进塑料薄膜小袋中，小心排出气泡，封住开口，置37℃震荡60min。

9.6依照上述方法洗膜3次，每次10min。

(10)免疫印迹条带化学发光检测将免疫印迹发光ECL增强液的A、B液等体积混合，避光暂存。暗室中将PVDF膜置于免疫印迹电化学发光成像仪(linx Science Instruments)槽内合适位置，加入足量的A、B混合液，关闭发光槽，开始发光。发光成像仪获得的图片通过数据线导入电脑，利用Quantity One软件分析免疫印迹蛋白条带进行计算分析和统计处理。

图2为免疫印迹实验验证PEBP1蛋白在亨廷顿病人和正常人血液样品中表达水平的结果，图3为80例PEBP1蛋白的表达量统计结果，从图中可知：亨廷顿病人(HD)血液样品中PEBP1蛋白水平显著高于正常人样品。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南中能荆卫生物科技有限公司

<120> 用于亨廷顿病诊断的基因及其应用以及由其编码的蛋白和蛋白的应用

<130> 无

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1688

<212> DNA

<213> Human

<400> 1

gcgcccttca ttttcatttc ttgaaacaac agccttgcag gccgagccgc tgttcccgag 60

aactcggcag ccacagggag caggttgcat ggacccagga gcgcgagagg ccctgctctg 120

ccagcttcgg ccaatcagag gccagggagc ggtgggcgtg acgtggggcg gtgcgcgggg 180

ctgggcggcg gctgaggcgc gtgctctcgc gtggtcgctg ggtctgcgtc ttcccgagcc 240

agtgtgctga gctctccgcg tcgcctctgt cgcccgcgcc tggcctaccg cggcactccc 300

ggctgcacgc tctgcttggc ctcgccatgc cggtggacct cagcaagtgg tccgggccct 360

tgagcctgca agaagtggac gagcagccgc agcacccgct gcatgtcacc tacgccgggg 420

cggcggtgga cgagctgggc aaagtgctga cgcccaccca ggttaagaat agacccacca 480

gcatttcgtg ggatggtctt gattcaggga agctctacac cttggtcctg acagacccgg 540

atgctcccag caggaaggat cccaaataca gagaatggca tcatttcctg gtggtcaaca 600

tgaagggcaa tgacatcagc agtggcacag tcctctccga ttatgtgggc tcggggcctc 660

ccaagggcac aggcctccac cgctatgtct ggctggttta cgagcaggac aggccgctaa 720

agtgtgacga gcccatcctc agcaaccgat ctggagacca ccgtggcaaa ttcaaggtgg 780

cgtccttccg taaaaagtat gagctcaggg ccccggtggc tggcacgtgt taccaggccg 840

agtgggatga ctatgtgccc aaactgtacg agcagctgtc tgggaagtag ggggttagct 900

tggggacctg aactgtcctg gaggccccaa gccatgttcc ccagttcagt gttgcatgta 960

taatagattt ctcctcttcc tgcccccctt ggcatgggtg agacctgacc agtcagatgg 1020

tagttgaggg tgacttttcc tgctgcctgg cctttataat tttactcact cactctgatt 1080

tatgttttga tcaaatttga acttcatttt ggggggtatt ttggtactgt gatggggtca 1140

tcaaattatt aatctgaaaa tagcaaccca gaatgtaaaa aagaaaaaac tggggggaaa 1200

aagaccaggt ctacagtgat agagcaaagc atcaaagaat ctttaaggga ggtttaaaaa 1260

aaaaaaaaaa aaaaaagatt ggttgcctct gcctttgtga tcctgagtcc agaatggtac 1320

acaatgtgat tttatggtga tgtcactcac ctagacaacc agaggctggc attgaggcta 1380

acctccaaca cagtgcatct cagatgcctc agtaggcatc agtatgtcac tctggtccct 1440

ttaaagagca atcctggaag aagcaggagg gagggtggct ttgctgttgt tgggacatgg 1500

caatctagac cggtagcagc gctcgctgac agcttgggag gaaacctgag atctgtgttt 1560

tttaaattga tcgttcttca tgggggtaag aaaagctggt ctggagttgc tgaatgttgc 1620

attaattgtg ctgtttgctt gtagttgaat aaaaatagaa acctgaatga aggaaaaaaa 1680

aaaaaaaa 1688

<210> 2

<211> 187

<212> PRT

<213> Human

<400> 2

Met Pro Val Asp Leu Ser Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu Gln Glu

1 5 10 15

Val Asp Glu Gln Pro Gln His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gln Val Lys Asn

35 40 45

Arg Pro Thr Ser Ile Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys Leu Tyr

50 55 60

Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys

65 70 75 80

Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp

85 90 95

Ile Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro

100 105 110

Lys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gln Asp

115 120 125

Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ser Gly Asp

130 135 140

His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu

145 150 155 160

Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gln Ala Glu Trp Asp Asp Tyr

165 170 175

Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gln Leu Ser Gly Lys

180 185

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，做为Pebp1基因的正向引物。

<400> 3

ctacaccttg gtcctgacag a 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，做为Pebp1基因的反向引物。

<400> 4

gagcccacat aatcggagag g 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，做为GAPDH基因的正向引物。

<400> 5

ctcaccggat gcaccaatgt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(21)

<223> 根据实验要求而设计，做为GAPDH基因的反向引物。

<400> 6

cgcgttgctc acaatgttca t 21

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(24)

<223> 根据实验要求而设计，做为用于检测Pebp1基因转录水平的寡核苷酸探针。

<400> 7

tgagcctgca agaagtggac gagc 24

Claims

1.一种用于亨廷顿病诊断的基因，其特征在于，所述用于亨廷顿病诊断的基因为Pebp1基因，所述Pebp1基因的编码序列为以下a、b、c中的任意一种：

a、SEQ ID No.1所示的DNA序列；

2.一种权利要求1所述的用于亨廷顿病诊断的基因在制备亨廷顿病的检测试剂盒或芯片中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括正向引物和反向引物，所述正向引物的序列为SEQ ID NO.3所示的序列，所述反向引物的序列为SEQ ID NO.4所示的序列。

4.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述芯片包括固相载体及固定在固相载体上的寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针为用于检测Pebp1基因转录水平的寡核苷酸探针。

5.一种权利要求1所述的用于亨廷顿病诊断的基因在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。

6.一种权利要求1所述的用于亨廷顿病诊断的基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白为PEBP1蛋白，所述PEBP1蛋白的氨基酸序列为以下A、B、C中的任意一种：

A、SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

C、与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列具有至少80％同源性。

7.一种权利要求6所述的蛋白在制备检测亨廷顿病的检测试剂盒或芯片中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述检测试剂盒包括与PEBP1蛋白特异性结合的抗体；所述芯片包括固相载体和固定在固相载体上与PEBP1蛋白特异性结合的抗体。

9.一种权利要求6所述的用于亨廷顿病诊断的基因编码的蛋白在制备治疗亨廷顿病药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为针对PEBP1蛋白的单克隆抗体或基于PEBP1抗原蛋白的疫苗。