CN103570826A

CN103570826A - 新一代宫颈癌特异预警血浆蛋白

Info

Publication number: CN103570826A
Application number: CN201310389347.5A
Authority: CN
Inventors: 郭霞; 阿布力孜·阿布杜拉; 郝轶; 刘开江; 伊力努尔·沙比提; 玛依拉·卡米力江; 阿娜古丽·阿巴白克里; 古扎丽努尔·阿不力孜; 迪丽米娜·伊拉木; 阿仙姑·哈斯木; 武贵臻; 希尔扎提江·苏来曼; 热孜宛古丽·约麦尔; 穆耶赛尔·伊敏; 吾尼且木·吐拉克
Original assignee: Xinjiang Medical University
Current assignee: Xinjiang Medical University
Priority date: 2013-08-30
Filing date: 2013-08-30
Publication date: 2014-02-12

Abstract

本发明公开了一类新的宫颈癌特异预警血浆蛋白，所述蛋白选自下述中的一种或多种联用：apoAI、apoE、ATIII、CLU、VIL1、mTOR。本发明公开的宫颈癌特异预警血浆蛋白以及联用对宫颈癌的早期预警具有较高的特异性、灵敏度、准确度，是宫颈癌肿瘤早期预警和早期诊断的优异指标。

Description

新一代宫颈癌特异预警血浆蛋白

技术领域

本发明涉及某种疾病的几种特异预警血浆蛋白及其应用，属于医学领域。

背景技术

宫颈癌是妇科恶性肿瘤，在发展中国家妇女最为常见，且致死率高。我国宫颈癌的平均发病水平在全球虽处于低发状态，但在局部地区发病率和死亡率却一直居高不下。由于我国人口众多，每年新发病例约13万，占世界发病人数的28％，严重威胁着广大妇女的身心健康。由于宫颈癌的患者主要以农牧民为主，约80.0％～90.0％的病例在中晚期被诊断，在住院时，多数患者已失去治疗良机。早期诊断是有效治疗宫颈癌或癌前病变的重要前提，可以大大降低宫颈癌的发生率和死亡率，宫颈癌的诊断方式是否快速、准确就成为很重要的瓶颈问题。目前，宫颈癌的诊断方式包括传统的宫颈细胞涂片、阴道镜检查和液基细胞学检查。由于宫颈癌发生具有多中心性，采用阴道镜指导下的多点活检，依然可能造成宫颈癌的漏诊。

与上述方法相比，肿瘤生物标志物(tumor biomarker)是一类生物活性物质，不仅直接来自肿瘤组织或细胞，也可以由肿瘤形成相关的宿主体内新生物反应而产生，可能融入血液或其他体液循环，其含量与正常参考值存在显著差异，表现为血浆蛋白质或代谢标志物，对肿瘤诊治具有重大意义。

血浆蛋白质标志物是癌蛋白质组学(oncoproteomics)研究的重要内容和切入点，与肿瘤组织特异性标志物一起，形成肿瘤标志物体系，用于肿瘤诊断的鳞状上皮癌相关抗原(squamous cell carcinoma associated antigern，SCC-Ag)在宫颈癌的辅助诊断、复发监测和预后判断手段中发挥重要作用，应用越来越广泛，但是已有的标志物在诊断宫颈癌病情上灵敏度和特异性并不高。因此，本领域尚需开展宫颈癌的基础和临床治疗研究，利用蛋白质组学、基因组学等高通量分析手段系统筛查肿瘤标志物，建立特异、灵敏的早期诊断方法，是宫颈癌防治水平的关键。

发明内容

针对现有技术的缺陷，本申请发明人通过大量的实验研究，采用二维液相色谱系统以等电聚焦作为样品的预分离模式，通过在线的二维反相色谱分离进行偶联，实现对复杂血清样品的分离，从而建立宫颈病变各组患者之间的血浆蛋白质组差异表达谱，筛选出差异表达组分；平行地运用二维凝胶荧光电泳进行分离，得到差异蛋白位点，通过高分辨质谱技术鉴定其差异蛋白组分或者差异蛋白位点的蛋白成分，得到差异蛋白质名单，运用在线生物信息学软件IPA(IngenuityPathway Analysis)系统和MetaCore^TM对差异蛋白进行功能注释与富集、调控网络分析、生物功能分析以及生物标志物筛查，验证分析确定了宫颈癌特异性血浆差异表达蛋白，对于提高宫颈癌的早期检测、病情检测、防治水平具有重要意义。

一种宫颈癌特异预警血浆蛋白，所述蛋白选白下述蛋白中的一种或多种的联用：apoA I(载脂蛋白A-I)、apoE(载脂蛋白E)、AT III(抗凝血酶III蛋白)、CLU(人凝聚素簇集蛋白)、VIL1(绒毛蛋白1)、mTOR(雷帕霉素靶蛋白)。

申请人对宫颈癌患者及癌前病变患者血浆，通过蛋白质组学分离与鉴定技术和生物信息学方法分析以及单一候选蛋白的验证，得到了上述在宫颈癌患者血浆中具有特异性表达的血浆蛋白，对宫颈癌的诊断和检测具有指标性价值。

为了更好的确诊宫颈癌病情，本申请发明人还研究了将上述表达蛋白联合使用用来检测宫颈癌，优选的，下述几个组合具有较好的灵敏度、准确度、特异度，所述蛋白选白mTOR和ATIII组合，或apoA I+mTOR组合，或mTOR、ATIII、apoAI组合，或ATIII+apoA I组合，最优选的，所述蛋白选白mTOR和ATIII组合。

申请人进行的实验显示上述的血浆蛋白可以用来早期诊断和预警宫颈癌的发生，并且评估宫颈癌的发展进程，对宫颈癌的治疗疗效也有辅助评估作用。因此，相应的本发明提供了上述宫颈癌特异预警血浆蛋白作为宫颈癌早期预警标记物的应用。

相应的，基于上述应用，本发明还公开了一种用于评估患者是否患有宫颈癌的方法，包括下述步骤：(1)检测患者样本中宫颈癌特异预警血浆蛋白的表达水平；(2)检测正常对照组中宫颈癌特异预警血浆蛋白的表达水平；其中所用的标记物选白下述蛋白：apoA I、apoE、AT III、CLU、VIL1、mTOR中的一种或多种的组合；在患者和正常对照组之间标记物蛋白表达水平的差异表明患者患有宫颈癌的危险性。

由于上述的宫颈癌特异预警血浆蛋白在宫颈癌患者中特异表达，因此通过检测患者与正常对照组的预警血浆蛋白表达水平差异或者联合检测水平即可评估患者是否患有宫颈癌或者患有宫颈癌的危险性。

由于宫颈癌的发生发展和病情演化进程会影响上述血浆蛋白的表达水平，因此通过检测同一患者中这些血浆蛋白的表达水平变化或者联合水平变化即可确定宫颈病变的进程和宫颈癌发生的危险性。

在本发明中，宫颈癌进程是指宫颈癌从早期的宫颈炎到宫颈上皮内瘤变II-III级到宫颈癌早期到宫颈癌晚期的整个病情的变化过程。

具体的，包括下述步骤：(1)在第一时间点检测患者样本中宫颈癌标记物蛋白的表达水平；(2)在随后的时间点重复步骤(1)；(3)比较步骤(1)和(2)中所检测的宫颈癌早期预警标记物蛋白表达水平；其中apoA I、ATIII蛋白含量降低，或apoE、CLU、VIL1、mTOR含量增高提示患者宫颈病变恶化、患有宫颈癌的危险性增加或者已经患有宫颈癌。

申请人通过实验验证了上述宫颈癌特异预警血浆蛋白与宫颈病变进程的相关性，因此可通过检测不同时间的差异蛋白表达水平对宫颈癌的发生起到预警作用。

为了实现准确检测，所述宫颈癌标记物蛋白检测白外周血血浆标本。

进一步的，在上述基础上，本发明提供了用于筛选得到宫颈癌特异预警血浆蛋白的方法，包括下述步骤：

(1)分为三组，构建宫颈癌患者、CIN II／Ⅲ患者与慢性宫颈炎患者的血浆蛋白样品；

(2)将血浆蛋白样品进行蛋白质二维液相色谱分离与分析，得到宫颈癌患者的差异蛋白组分；

(3)将差异蛋白组分经胰蛋白酶处理后进行液质联用质谱分析得到候选分子标志物差异蛋白；

(4)同时将血浆蛋白样品运用差异荧光电泳联合质谱技术，筛选出差异表达蛋白；

(5)将候选分子标志物差异蛋白进行IPA生物信息学分析，生成候选生物标记物列表；

(6)结合步骤(3)、(4)和(5)的结果，确定核心差异蛋白，将核心差异蛋白名单采用MetaCore数据库进行分析，得到宫颈癌特异预警血浆蛋白。

为了进一步确证所筛选出的表达蛋白的活性，所述方法进一步还包括将所宫颈癌特异预警血浆蛋白进行ELISA法检测确定含量变化。

本专利以宫颈癌高发人群新疆维吾尔族妇女宫颈病变患者血浆为对象，联合运用多种蛋白质组学筛查技术和策略(2D-HPLC和2D DIGE)，旨在建立蛋白质组差异表达谱基础上，筛选出宫颈癌及癌前病变特异性的血浆蛋白指标，丰富宫颈癌早期筛查与预警体系。利用系统生物学分支学科——生物信息学方法(IPA、MetaCore^TM)，针对血浆蛋白指标进行功能注释与富集，构建功能网络，寻找主要调控通路或途径，进一步揭示宫颈病变的发生与发展的生物学本质，预测出一系列肿瘤及癌前病变特异性血浆蛋白标志物，从而最终得到能够对宫颈癌具有指标性意义的特异血浆预警蛋白，为宫颈癌的预防和早期诊疗提供科学依据。

申请人进行的临床检测实验结果显示，本发明所公开的宫颈癌特异预警血浆蛋白的表达水平与宫颈病变具有极好的相关性，用来检测宫颈病变，尤其是宫颈癌的发生发展、病情程度具有很好的灵敏度、特异度和准确度。

附图说明

图1-图6显示了apoA I蛋白表达含量、apoE蛋白表达含量、CLU蛋白表达含量、AT III蛋白表达含量、VIL1蛋白表达含量、mTOR蛋白表达含量与宫颈病变进程之间的关系；

图7-图12显示了apoA I蛋白、apoE蛋白、CLU蛋白、AT III蛋白、VIL1蛋白、mTOR蛋白的ROC曲线图。

具体实施方式

在下述实施例中，申请人提供了本发明筛选过程的详细操作，仅用于说明本发明技术方案如何更好地实现和得到本发明所属宫颈癌特异预警血浆蛋白的研究过程，并非限制本发明的保护范围，不采用下述方式而采用其它研究方法得到本发明的宫颈癌特异预警血浆蛋白依旧属于本发明的保护范围。任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

以下是本发明宫颈癌特异预警血浆蛋白的筛选过程：

1.血浆蛋白组样品的构建

取每一个患者血浆样品取70μl，将同一组患者血浆等体积混合，构建代表一组患者群体的血浆样品，经三组患者群体的3次重复，制备9份样品。

1.1基于蛋白质富集柱技术制备低丰度蛋白组样品

利用低丰度蛋白富集试剂盒(ProteoMiner Protein Enrichment Kit)，运用六肽配体亲和层析柱，特异性吸附，并制备血浆低丰度蛋白组(low abundantproteome)待测样品。通过使用低丰度蛋白富集试剂盒，低丰度蛋白质相对得到了富集与浓缩。

1.2蛋白质富集柱子的预处理

富集层析柱装在一个层析管中，有一个顶盖和底盖，在随后的实验过程中，这些盖子被反复使用，不可弃去，其中底盖倒置时，可以当塞子用，旋转后，固定在层析柱的底部。首先，卸掉层析柱的顶盖和底盖，将层析柱置于一个无盖的收集管，离心(1000rcf，2min，室温)，弃去层析柱内的液体(保护液)。再加上底盖，往柱子内加入1ml去离子水，加上顶盖；将层析柱上下颠倒混匀5min。卸掉底盖，置于一个无盖的收集管中，离心(同上)弃去液体。然后，以1ml washbuffer代替去离子水，重复以上洗涤步骤。最后，经离心(同上)排除层析柱内的残留wash buffer。加上底盖后，可以用蛋白质样品的预处理。

1.3层析柱与血浆蛋白质样品的结合

血浆样品中存在各种残留物(细胞残留或沉积物)，经离心(20000rpm，4℃，15min)弃去沉淀，将1ml血浆样品加入至层析柱，在室温条件下，动态混匀柱子2h。

1.4层析柱子(含血浆蛋白质)的洗涤处理

混匀后，卸掉底盖，将层析柱(含血浆蛋白)置于一个无盖的收集管，离心(1000rcf，2min，室温)弃去离心后的液体，重复该离心步骤，弃去残留液体。加上底盖厚，加入1ml wash buffer，在加上顶盖，上下颠倒混匀柱子5min。卸掉底盖，经离心(同上)弃去收集液，以同样的操作流程，反复使用wash buffer洗涤层析柱子(含血浆蛋白)两次。

1.5血浆低丰度蛋白质组分的洗脱(制备)

采用wash buffer一样的步骤，使用1ml去离子水洗涤层析柱子(含血浆蛋白)，再离心一次，排除液体残留。然后，加入100μl水化洗脱液(rehydrated elutionreagent，加上顶盖，并轻轻旋转混匀5sec，在室温下孵育15min，期间轻轻旋转几次。层析柱子(含血浆蛋白)置于戴盖的收集管上，标记样品名称或编号，经离心(同上)保留被洗脱下来的血浆蛋白质样品。重复以上样品洗脱步骤两次，每一次使用100μl水化洗脱液，共收集约300μl血浆蛋白质样品，即低丰度蛋白质组样品，可以在-20℃保存，或长期保存在-80℃，以备检测。

1.6蛋白质浓度测定

采用BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)蛋白质定量方法(Novagen)，采用2500次微型测定(25μl蛋白样品加上200μl反应试剂，可以在96孔板中进行高通量定量)。试剂盒包括：BCA反应液(0.1MNaOH缓冲的二喹啉甲酸，碳酸钠，酒石酸钠，碳酸氢钠，pH11.25)500ml、4％Cupric Sulfate(硫酸铜)15ml和2mg／ml的BSA(牛血清白蛋白)标准品3×1ml。此方法的原理基于双缩脲反应，在碱性环境下蛋白质分子中的肽键结构能和Cu²⁺结合形成络合物，同时将Cu²⁺还原成为Cu⁺⁺。而BCA试剂可特异地与Cu⁺结合形成稳定的紫色复合物，在562nm处有高的光吸收值。吸光度值与蛋白质的浓度成正比，可根据吸光度值的大小来计算总蛋白含量，并求得三次测定的平均值。Novagen的BCA试剂盒具体步骤如下：

(1)BSA浓度标准曲线的制备：

下表是制备各稀释梯度的BSA标准液的方法。每个标准液都需要使用一个新的试管，采用与蛋白样品一样的缓冲液来稀释、配制BSA标准液。如果缓冲液中有干扰BCA法的成分，用去离子水替代样品的缓冲液，用以配制BSA浓度梯度标准液做标准曲线。具体方法见下表：

附表1BCA蛋白质定量的标准曲线浓度梯度及试剂配制

(2)BCA工作液(BCA working reagent)的准备：将BCA反应液与4％硫酸铜以50：1的比例(体积比)混合成BCA工作液。

(3)依次在96孔板的各孔中加入25ul的六个标样以及待测样品。

(4)取200μl事先配制好的BCA工作液加入至每孔中，轻微混匀30sec以至充分混匀。

(5)将微孔板的密封盖盖好，放置电热恒温培养箱，37℃孵育30min，或室温放置2-16h。

(6)以双蒸水为对照，用酶标仪在562nm处检测其吸光度，读取和记录吸光度值(OD值)。

(7)按照校正的吸光值等于将各标样和试样的读数减去空白样吸光值计算出没孔的校正的吸光值。根据标准品的浓度与吸光度，绘制BSA浓度标准曲线，通过回归方程计算出样品的蛋白质浓度。

(8)根据样品体积和稀释度计算出每管样品实际浓度。

2.蛋白质二维液相色谱分离与分析

采用ProteomeLab^TMPF-2D(Beckman Coulter)基于二维液相色谱技术的高通量目标蛋白快速分离系统，包括一维等点聚焦分析系统和二维反向色谱分析系统，一维通过蛋白质等电聚焦原理，蛋白质根据等电点分离并收集蛋白组分，二维通过反向色谱原理，并且对一维分离出来的蛋白组分，蛋白质根据疏水性进行进一步的分离收集。

2.1第一维等电聚焦(isoelectric focusing)分离与分析

一维等电聚焦蛋白质分离法利用色谱柱中pH值不同的两种缓冲液和一个带正电的柱子产生的pH梯度。该方法开始使用高pH值(8.5)，即ProteomeLab起始缓冲液，然后再转而使用较低的pH值(4.0)，即ProteomeLab洗脱缓冲液。随着运行，柱中形成pH梯度，并且蛋白质从柱中洗脱。蛋白质依据从它们在梯度中所呈现的电荷极性在柱中移动。带负电荷的蛋白质吸附到柱上、带正电荷的蛋白质被柱子排斥、中性物质则以pH梯度形成的速率移动。样品中的蛋白质基于其pI的差异而得到分离。当柱子的pH值高于蛋白质的pI时，蛋白质中的净电荷为负，因此蛋白质吸附在柱上。当柱子的pH值与蛋白质的pI相等时，蛋白质中的净电荷为零，因此蛋白质既不会吸附到柱上，也不被其排斥。当柱子的pH值低于蛋白质的pI时，蛋白质中的净电荷为正，因此该蛋白被柱子排斥。

一维等点聚焦分析系统的硬件包括：手动进样器Injector、HPCF(high-performance chromatofocusing)色谱柱、pH检测器、紫外(UV)检测器和FC／I(fraction collector／injector，蛋白组分收集器／进样器，对一维而言是蛋白组分收集器)。其中FC／I模块是一维和二维的连接器，对样品进行自动地收集和进样。。按照仪器的标准参数，通过预实验选择出最佳实验条件，进行如下的操作规程：

(1)HPCF模块的准备：将四个溶剂瓶按照预先设置的程序分别置于各自的位置，即A1：起始缓冲液(SB)；A2：洗脱缓冲液(EB)；A3：高盐洗液(1MNaCI)；A4：色谱纯水。

(2)排HPCF模块的气泡：设置HPCF的流速为零，用10ml针筒依次对A1-A4进行排气，吸出1-2管溶液直至无气泡。

(3)HPCF模块的冲洗：打开排气阀，用溶剂A4以1ml／min的流速进行冲洗。

(4)将HPCF色谱柱安装至一维HPCF模块，在Direct Control中设置为A4位置，流速设为0.2ml／min，冲洗45min。

(5)pH电极的校正：在25℃条件下，将电极分别放入三种pH(4.00、7.00和10.01标准液中，依次进行校正。系统pH计在线监测流动相的pH值。

(6)FC／I模块的准备：将干净的96孔深孔板放入FC／I模块的盘内(A行在后，H行在前)，设置托盘保持低温状态。

(7)HPCF色谱柱的平衡：用30CV(柱体积)的起始缓冲液SB平衡，流速设为0.2ml／min，平衡130min。

(8)平衡结束30min前打开一维的紫外(UV)灯，设置其检测波长为280nm。手动进样器Injector置于INJECT位置，用平端针头的塑料针筒进行进样，取血浆低丰度蛋白质组样品1.0mg进样(宫颈鳞癌早期、CINII／III以及慢性宫颈炎的上样体积分别为225.17、225.41和206.09μl)，再取初始缓冲液至1ml，用2ml样品环注入一维分析系统。

(9)程序设置为SB洗脱20min之后再用EB洗脱55min，致使pH值由8.5下降至4.0，每间隔0.3个pH单元收集1份样品。当流出液的pH为4.0±0.1时，用10CV(柱体积)的1mol／L NaCl和色谱水依次洗脱。

(10)用每孔容量为2ml96孔深孔板收集，收集的样品立即进入二维分析系统。

2.2第二维反向色谱分析

在反相色谱法中，固定相没有极性，而流动相带有极性。蛋白质分离的流动相包含离子抑制剂即三氟乙酸(TFA)水溶液，接着利用含TFA和浓度不断提高的有机溶剂(如乙腈)对蛋白质进行洗脱。蛋白质疏水性的程度是蛋白质移动的基础。疏水性程度由非极性氨基酸(包括缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸)的百分含量决定。该分离法的基础是不同浓度的有机溶剂中，不同蛋白质在固定相的吸附-解吸附作用。在低浓度有机溶剂中，蛋白质将吸附到固定相。随着有机溶剂浓度的升高，在临界浓度的有机溶剂中，蛋白质将从柱上进行解吸附。蛋白质疏水性程度越高，则从柱中解吸附所需的有机溶剂浓度也就越大。

二维反向色谱分析系统的硬件包括：FC／I(蛋白组分收集器／进样器，对二维而言是进样器)、HPRP(high-performance reversed-phase)色谱柱、柱温箱和紫外(UV)检测器。对一维分离的不同PI组分分别进行二维分析，运用ProteomeLab PF-2D白带Proteo Vue软件自动保存每一个样品的UV光密度值数据，同时自动收集相应的样品洗脱组分。按照仪器的标准参数，通过预实验选择出最佳实验条件，进行如下的操作规程：

(1)HPRP模块的准备：将两个溶剂瓶按照预先设置的程序分别置于各自的位置，即A1：0.10％TFA的水溶液；B1：0.08％TFA的乙腈溶液

(2)排HPRP模块的气泡：设置HPRP模块的流速设置为零，分别用10ml针筒吸出1-2管直至无气泡，A泵在下，B泵在上。

(3)HPRP模块的冲洗：打开排气阀，设置流速为1ml／min，先用B1溶剂进行冲洗，再用A1溶液进行冲洗。

(4)将HPRP色谱柱安装至二维反向层析系统，设置Direct Control置B1位置，输入B1为100％，流速设为0.75ml／min，直到有液体流出。

(5)HPRP色谱柱的平衡：首先用5CV100％的流动相B1缓冲液平衡柱子，流速设为0.75ml／min，平衡至少5min。之后用10CV100％的流动相A1缓冲液平衡柱子，流速设为0.75ml／min，平衡至少10min。

(6)打开二维的紫外(UV)灯，设置检测波长为214nm。

(7)将HPRP色谱柱放入柱温箱，并打开柱温箱开关，保证二维反向色谱在50℃恒温运行。一维完成后二维自动触发运行。

2.3二维液相色谱数据的综合分析

使用二维液相色谱ProteomeLab PF2D提供的ProteoVue软件自动保存每份样品的色谱数据并可将其转换成模拟pI／UV胶图。应用DeltaVue软件对不同血浆样品蛋白质组谱的模拟pI／UV胶图数据比较，绘出基于差异组分的蛋白质双向电泳模拟图，将差异峰以条带的直观图像形式进行显示。按照高通量分析常规的量化标准和ProteomeLab PF2D系统的默认，将峰值2倍及以上差异作为初步的定量差异标准，选择2倍以上的含量差异的蛋白组分，确定为宫颈癌早期和CINII／III与宫颈炎的差异组分，并且再次运行二维程序并且触发FC204(fractioncollector)馏分收集仪收集样品，作为下一步质谱分析的目标蛋白组分。

2.4差异蛋白组分的收集

根据宫颈癌早期患者、CINII／III患者分别与慢性宫颈炎患者血浆低丰度蛋白质组比较分析的差异谱和差异组分的分布特征表，确定有明显差异的蛋白组分，运用全自动化的收集仪器FC204(fraction collector)馏分收集仪进行分离收集。

具体操作如下：

(1)正确放置96深孔板：将8个96深孔板按照前后两排，各排放置4个的原则放入FC204馏分收集板上进行收集。由于96深孔板有A-H的8个横列和1-12的12个纵列，因此放置方向尤为重要，即靠前一排的A1靠后、靠右放置，那么该板的H12的位置为靠前、靠左。靠后一排A1靠前、靠左放置，那么该板的H12的位置为靠后、靠右。这样的放置方式才能保证目标蛋白组分准确无误的收集。

(2)96深孔板位置正确放置后，启动程序：1min／孔。

(3)收集完成后，根据差异蛋白组分的洗脱时间点(Retention Time，RT)来确定96深孔板中目标蛋白组分的位置，并将其移至新管中，标记好放置冰箱冻存以备下一步的质谱鉴定使用。

3液质联用质谱分析

3.1差异蛋白质组分的胰蛋白酶处理

(1)溶液用冻干机冻干至蛋白粉末，向蛋白质粉末中加25ul50mM NH₄HCO₃、8M尿素溶液。

(2)加入DTT，终浓度100mM，37°水浴4h。加入碘乙酰胺，终浓度500mM，室温避光1h。

(3)加入10倍体积50mM NH₄HCO₃溶液，将8M尿素稀释成小于1M。

(4)按照酶：蛋白质量比=1：50的比例加胰蛋白酶至蛋白溶液中，37℃孵育过夜16h以上。

(5)冻干成10ul左右的体积，用Millipore C18柱子除盐洗脱后冻干，用Millipore货号为ZTC18S096的C18微量层析柱子，除盐洗脱后，冻干，待上质谱。

3.2蛋白质组分的LTQ-MS鉴定

运用离子阱液质联用系统，型号：LTQ(linear trap quadrupole)线性离子阱质谱(ThermoFinnigan，USA)，配有自动化在线液相系统(Eksigent nano-LCsystem)，蛋白质多肽样品的分离由Eksigent nano-LC系统进行，具体操作步骤如下：

(1)取A液(2％ACN／98％H₂O／0.1％TFA)30ul溶解酶切干粉，20000g离心30分钟，取上清采用Eksigent液相-LTQ-MS质谱仪鉴定蛋白质。

(2)色谱条件：色谱柱：Dionex C18PePMap300，5um，

ID75um，length15cm。

(3)流动相：A流动相，2％ACN+98％H₂O+0.1％FA；B流动相，80％ACN+20％H₂O+0.1％FA。流速：0.3ul／min。

(4)洗脱条件：

附表2LTQ-MS分析过程的洗脱条件

(5)LTQ-MS质谱鉴定

从反相液相色谱洗脱出的蛋白质肽段用LTQ Linear ion trap离子阱质谱进行串联质谱分析。设定参数如下：数据采集时间：130min，ESI源喷雾电压(sprayvoltage)：2.2kv，压力(真空度)：10^-5torr，毛细管温度(caplillarytemperature)：200℃，毛细管电压：46.0v，管路透镜电压：130.0v。碰撞气体为氦气(传入的压力：40psi)。母离子与子离子选择采用正离子模式。产生的数据包括质谱仪获得的全谱扫描和线性离子阱得到的MSn串级扫描数据。实验从全质谱扫描开始，设置质量范围为350-1600Da，接下来将扫描获得的谱图中最强的5个质谱峰进行(collision induced disasSOCiation，CID)MS2扫描，分离宽度为2Da，碰撞能量为35％，在MS2扫描中得到的最强峰(不包括母离子)被选中以同样的参数进行MS3扫描。

3.3目的蛋白的在线数据库检索与分析

用Xcalibur Qual Browser2.0软件以ICIS峰值检测算法计算肽段的峰值目录，将所得的串联质谱数据用BioWorks3.3.1软件组套(Thermo F1ectron，Inc.，Waltham，MA USA)中的SEQUEST3.2搜索引擎在人类InternationalProtein Index蛋白质数据库(ipi.HUMAN.v3.62.fasta)(http：／／WWW.ebi.ac.uk／IPI／IPIhuman.html)中查询蛋白质种类，置信度95％。

4候选分子标志物的IPA生物信息学分析

分别将质谱鉴定出的103个宫颈癌患者和31个CINII／Ⅲ患者血浆中的差异蛋白，上传到IPA分析的核心知识库

Knowledge Base中进行分析。

5.基于双向荧光差异电泳-质谱技术的宫颈病变患者血浆蛋白质组学研究

5.1血浆低丰度蛋白组样品的制备

采用与开始步骤1一样的方法消除个体差异性采用同组混合血浆样品，利用低丰度蛋白富集试剂盒(多肽配体亲和层析柱)，特异性吸附并制备血浆低丰度蛋白样品定量后再行2D-DIGE分析。

5.2Bradford法测定蛋白质浓度

(1)标准品BSA的稀释：

按附表3所示稀释标准品BSA，共计6个浓度标准品，确保每管稀释后的总体积均为50ul。

附表3蛋白质定量的标准曲线浓度梯度及试剂配制

(2)按附表4所示进行样品稀释，确保每管样品稀释后总体积至50ul。

附表4蛋白质定量的标准曲线浓度梯度及试剂配制

(3)浓盐酸的稀释：将10ul浓盐酸加入至1ml色谱纯水中。

(4)标准蛋白浓度C=(4*3.5)／50=0.28

(5)将20ul稀释好的盐酸分别加入至5ul稀释好的样品或标准品中，使最后体积共计25ul，充分混匀。

(6)将染液按照染液：水=3ml：12ml进行稀释，并且在每管中加入875ul稀释染液，充分混匀，放置5min。

(7)以稀盐酸为对照，用酶标仪检测标准品和待测样品在595nm处吸光度，读取并且记录吸光度值(OD值)。

(8)按照校正的吸光值等于将各标样和试样的读数减去空白样吸光值计算出没孔的校正的吸光值。根据标准品的浓度与吸光度，绘制BSA浓度标准曲线，通过回归方程计算出样品的蛋白质浓度。

(9)根据样品体积和稀释度计算出每管样品实际浓度。

5.32D-DIGE实验

5.3.1蛋白质样品的荧光染料标记

每个样品取400ug(pool浓度5ug／ul)用1％NaOH和50％盐酸调pH值在8.0～9.0之间。宫颈炎、CINII／Ⅲ、和宫颈癌组各取50ug分别放入3个离心管中，分别用以Cy3(1ul)Cy5(1ul)做相应荧光标记；再从三组样品中取各25ug样品放入一个离心管中，用4ulCy2混合标记，制成内标，如附表5所示进行分组。放置冰箱中4℃避光，冰浴30min。再加入0.5ul10mmol赖氨酸溶液，涡旋混匀30s，4℃避光10min，以终止反应。实验重复三次。

附表5样品组成与内标构成

注：9个样品，每个样品重复1次，共5块

5.3.2第一向等点聚焦(isoelectrie focusing，IEF)

(1)按照附表6所示，分别将胶1～5中3种荧光标记好的样品混合在一起，加入适量水化液，使各胶上样液的总体积最终为450ul。

(2)将24cm固相IPG预制胶条从冰箱取出，室温放置10分钟。

(3)在聚焦盘中进行连续、线性加样。注意槽两端各空1cm。

(4)去除IPG预制胶条的保护层。放入聚焦盘，注意正反，使胶面与样品完全接触，同时注意正负极不能放反。室温放置30～60分钟。

(5)在胶条背面均匀、连续覆盖矿物油。

(6)按照附表2-5设置等电聚焦程序。

附表6等电聚焦程序

(7)聚焦结束后，根据时间可以直接进行第二向SDS电泳前的平衡，或者将聚焦盘和胶条转到-20℃冰箱冷藏。

5.3.3第二向SDS电泳

(1)配置SDS凝胶(注意不带梳子)。用电泳液或色谱纯水冲洗，之后用滤纸吸干。

(2)将IPG胶条取出，用色谱纯水冲洗掉大部分的矿物油，再把胶条有塑料板的一面放在滤纸上吸干。然后放入平衡缓冲液I中，平衡10～15分钟。

(3)取出胶条，用色谱纯水冲洗掉大部分的矿物油，再把胶条有塑料板的一面放在滤纸上吸干。然后放入平衡缓冲液II中，平衡10～15分钟。

(4)剪两个空白的小滤纸条。一个空白滤纸条放在凝胶板边缘紧贴SDS凝胶，另一个空白滤纸条点上Marker样本。

(5)取出IPG胶条，用色谱纯水冲洗，用滤纸吸干，将胶条上塑料板一面紧贴放置在SDS凝胶的长玻璃板上，短玻璃板向上。

(6)准备熔解好的低熔点琼脂糖封胶液，将其快速的倒在SDS胶的封口处，迅速地将IPG胶条插入未凝固上的琼脂糖封胶液中，注意避免和排除气泡。

(7)待琼脂糖封胶液凝固后，取出空白滤纸条，换成有Marker样本的滤纸条。再用琼脂糖封胶液把空隙处补满。

(8)待凝固，放入SDS凝胶电泳槽中，短玻璃板面朝里。倒上电泳液，接好电泳仪的正负极。

(9)设置电泳仪程序，用低电流(5mA／gel／)或低电压(50-75v／gel)，待样品完全走出IPG胶条，浓缩成一条线后，再加大电流或电压至10-15mA／gel(150-200v／gel)，待溴酚蓝指示剂达到底部边缘时即可停止电泳。

5.3.4图像扫描与分析

运用Typhoon9410扫描仪对荧光标记的凝胶分别在488／520nm，532／580nm，633／670nm波长处，分别对Cy2、Cy3、Cy5荧光染料标记的图像进行扫描。扫描要求：扫描值在60000-90000之间。用DeCyder v.5.02图像分析软件对DIGE图像进行分析和寻找差异蛋白位点，之后分别用DIA和BVA软件进行分析。其中滤掉一部分背景及去除水平和垂直条纹，得到了斑点大小、形状、位置与肉眼观察到的斑点较为接近的数字化的图谱。获取双向电泳凝胶图像并以tiff格式保存。采用ImageMaster2D Platinum version5.0图像分析软件系统对DIGE图像进行分析。

5.4差异蛋白位点的质谱鉴定

5.4.1胶内酶切

(1)采用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，用解剖刀将胶带切成1-2mm²大小的胶片放入小管中。

(2)在放入胶片的小管中加入100ul脱色液进行浸泡，振荡20min，弃去溶液。重复1-2次直至蓝色褪尽，再加入100ul乙腈洗涤，弃去废液。

(3)至冰冻干燥仪冰冻干燥20min。

(4)加入0.01ug／ul胰蛋白酶液15-20ul，置于4℃冰箱放置30min，待胰蛋白酶液完全被吸收，补充25mM NH₄HCO₃溶解的酶解缓冲液15-20ul，使胶完全浸没，37℃保温15h以上或过夜。

(5)加入100ul提取液I(5％TFA)，40℃加热水浴1h，30min时，超声3min左右。

(6)将提取液I吸到另一干净的管中，冰冻干燥；向胶块中加入提取II(50％乙腈，2.5％TFA)100ul，30℃保温1h，超声3min左右。

(7)将两种提取液合并，用氮气吹干乙腈后，冰冻干燥。

(8)加入5ul左右的0.1％TFA溶液混匀，质谱分析。

5.4.2质谱分析

质谱仪：美国ABI-4800型反射式基质辅助激光解吸附飞行时间串联质谱仪；扫描方式：反射式；扫描范围：700-4000Da；激光能量：MS5000，MSMS55。

5.4.3数据库检索

检索参数：GPS软件检索：误差MS0.2Da；MSMS0.3Da；数据库：IPI-HUMAN数据库。数据取舍标准；取蛋白质打分大于61分，置信水平在95％以上。

6.宫颈癌及癌前病变特异性候选血浆蛋白标志物的生物信息学MetaCore^TM分析

6.1生物信息学分析研究对象

在前两部分研究中，经二维液相色谱(2-D HPLC)和液质联用质谱技术(LTQ-MS／MS)，筛选出宫颈癌特异性候选血浆差异蛋白质指标103种，经差异荧光电泳(2D-DIGE)联合质谱技术(MALDI-TOF／TOF MS)，筛选出16种差异表达的蛋白。又整合IPA^＠生物信息学分析结果，最终确定43种核心差异蛋白(表3-1)。为了寻找到宫颈癌特异、灵敏的预警蛋白，将这43种核心差异蛋白名单上传至MetaCore数据库，应用MetaCore^TM专业软件进行蛋白质功能注释与富集分析、信号调控网络的构建分析进行分析。

表3-1MetaCore^TM分析的43种核心差异蛋白名单

6.2实验方法

将43种核心蛋白名单(表3-1)上传至MetaCore数据库中，运用MetaCore^TM软件的多种分析功能，在蛋白质功能注释和富集分析、信号调控网络的构建分析以及生物标志物评估这三个方面展开分析。

6.2.1蛋白质功能注释与富集分析(Protein functional annotation andenrichment analysis)

基于基因本体论(Gene Ontology)、京都基因与基因组百科全书(KyotoEncyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和在线人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，对差异蛋白进行功能注释(Protein functional annotation)、细胞内组成(cellular component)以及在机体中所负责的生物学加工进程(biologicai process)进行富集分析(enrichment analysis)，理解差异蛋白质在已知的研究成熟的通路里其相互作用关系，鉴别对细胞和疾病表型有显著影响的蛋白，并了解蛋白是如何影响表型的，以及这些蛋白是否增强或减弱某个生物过程。提供了一个快速的解决方案，以迅速评估感兴趣的数据集影响最大的信号调控网络、代谢通路、分子作用网络及生理过程。

6.2.2信号调控网络的构建分析(Network construction and analysis)

根据所提供差异蛋白名单(IPI accession numbers)，上传至MetaCore(GeneGo，Inc.)，根据软件提供的网络分析算法(analyze network algorithm、shortestpaths algorithm)设置网络大小参数和关联参数来优化对该网络的可视化及生物相关背景分析，创建差异蛋白质的相互作用及调控网络，以便可以洞察与推测蛋白的分子作用机制。

软件中所运用的自动扩张算法(auto expand algorithm)，直至创建出公平、稠密的功能网络，以便能够直观地观察邻近蛋白与蛋白之间的相互作用关系。为了提高计算的效率，目标网络的数量默认设置为50。最短路径算法(shortest pathsalgorithm)能够计算出差异蛋白之间最直接、最短的路径，试图运用额外的直接路径联系最初的蛋白。为了提高计算的效率，路径算法步骤的最大值默认为2。

6.2.3生物标志物预测与评估(Biomarker assessment)

生物标志物预测与评估流程是鉴于MetaCore^TM数据库的信息，应用GeneGo疾病本体论(GeneGo diseases ontology)，通过使用“子宫颈疾病”进行过滤，基于那些与研究发现最相关的生物特征，进行有计划地优化与已知疾病相匹配的蛋白质组学数据，找到与实验数据最相关及最有可能的候选生物标记。所有的在MetaCore^TM数据库的信息都是通过GeneGo的专家人工检查校正其准确性和详细程度的，而且整个过程必须遵循严格的质量控制步骤。

7.宫颈癌及癌前病变特异性候选血浆蛋白标志物的单一指标验证分析

7.1数据采集

采集新疆医科大学第三附属肿瘤医院在2008年1月至2009年9月期间收治的维吾尔族妇女血浆标本共82例，包括慢性宫颈炎患者22例，高度宫颈鳞状上皮内瘤样变(CINⅡ／Ⅲ)20例，临床分期为I-ⅡaA期的宫颈癌早期患者20例，临床分期为ⅡaA之后的的宫颈癌晚期患者20例。其患者年龄分布为25-65岁，平均年龄为53±6.78岁。

7.1.2具体实施细则

同第一部分1.1，在整体研究计划中，建立了所有患者的病例资料和生物标本信息档案，在启动蛋白质组学鉴定工作之前，均获得了组织病理学确诊信息。在选择患者及取样时，患者均未接受过肿瘤手术切除或直接放化疗治疗，没有子宫切除或骨盆放射治疗、其他恶性肿瘤以及呼吸系统、心血管和代谢性疾病等各种病史。正常对照标本为慢性宫颈炎患者活检组织或全子宫切除(子宫肌瘤)患者的宫颈组织和血液。CIN II／III组织取自确诊为CINII或III(或视为原位癌)患者。宫颈癌临床分期均参照2000年国际妇产科联盟(Internat ional Federat ion ofGynecology and Obstertrics，FIGO)修订的诊断标准，其中临床分期I-IIa视为肿瘤早期患者，包括病灶局限在宫颈，包括累及宫体(临床分期为I)至病灶已超出宫颈，但未达盆壁或癌累及阴道，但未达阴道下1／3以及无宫旁侵润(IIa)的患者；临床分期为I-IIaA的可以手术治疗的肿瘤视为早期患者，临床分期为IIaA之后的不能采取手术治疗的肿瘤视为晚期患者均由病理医师确诊。所有宫颈病变诊断均行细胞学、阴道镜或宫颈活组织病理学检查，如CIN II／III和宫颈癌患者接受手术，其组织病理检查视为病例确诊信息。

7.1.3临床血浆标本的收集

同第一部分1.2。

7.2ELISA验证分析的候选标记蛋白

根据第一、二和三部分的结果，筛选出预计进行ELISA验证的蛋白指标，纳入标准为，在2D HPLC、2D DIGE、IPA分析和MetaCore^TM分析的结果中，至少在两种或者两种以上的筛查结果中出现的蛋白，共有7种如附表4-1所示。

附表4-1ELISA验证分析的候选标记蛋白

7.3血浆蛋白质含量的ELISA法检测

根据候选标记蛋白(apoA I、apoE、CLU、AT III、VIL1、mTOR)，由于目前尚没有找到市场供应的IGK(immunoglobul in kappa locus免疫球蛋白)的抗体与ELISA试剂盒，未进行IGK免疫球蛋白的检测。将ELISA的方法分成两个部分，选择筛选出的其中5个蛋白，人的apoA I、apoE、CLU、ATIII和VIL1的ELISA试剂盒，其中包含采用特异性抗体包被96孔酶标板。检测最后，反应结果置酶标仪(Bio-Rad，Model680)于450nm处读取A值。具体操作步骤严格参照试剂盒说明书，以下为apoA I、apoE、CLU、AT III和VIL1等5个蛋白的检测方法。

7.3.1ELISA法专用试剂的准备

7.3.1.1标准品的准备

使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温(18-25℃)，试剂不能直接在37℃溶解。标准品(冻干品)：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒／搓动以助溶解，其浓度为8μg／mL。准备7个稀释标准品的EP管，每个EP管中加入500μL的标准品稀释液，如图所示依次倍比稀释成8μg／mL，4μg／mL，2μg／mL，1μg／mL，0.5μg／mL，0.25μg／mL，0.125μg／mL，标准品稀释液(0μg／mL)直接作为空白孔。

7.3.1.2专用缓冲液的配制

用6mL蒸馏水或去离子水将6mL浓检测液A及B稀释至12mL，进行2倍稀释，稀释后的工作液不宜进行冷冻保存。检测溶液A及检测溶液B：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A或B1：100稀释(如：10μL检测溶液A／990μL检测稀释液A)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μL／孔)，实际配制时应多配制0.1-0.2mL。浓洗涤液：用580mL蒸馏水或去离子水将20mL浓洗涤液稀释至600mL，进行30倍稀释。底物溶液：用灭菌的移液器吸头吸取所需体积的底物溶液至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢弃，不要倒回底物溶液瓶中。

7.3.2血浆样品的预处理

血浆标本(5个蛋白指标)严格按照试剂盒说明在实验前进行稀释，如：稀释1,000倍，首先取20μL血清或血浆样本加入180μL PBS溶液，做10倍稀释，然后再取10倍稀释后的样本10μL加入990μL PBS即可，稀释的每一步都需混匀。标本使用0.02mol／L的PBS溶液稀释(pH＝7.0-7.2)。

7.3.3血浆蛋白质含量鉴定

第一步(加样)：分别设标准孔、待测样品孔、空白孔。设标准孔7孔，依次加入100μL不同浓度的标准品(见专用试剂准备1)。空白孔加100μL(见专用试剂准备第二步最后一管)，余孔加待测样品100μL，酶标板加上覆膜，37℃温育2小时。第二步：弃去液体，甩干，不用洗涤。第三步：每孔加检测溶液A工作液100μL(临用前配制)，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。第四步：弃去孔内液体，每孔用350μL的洗涤液洗涤，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在试验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次(也可轻拍将孔内液体拍干)，重复洗板3次。最后一次洗涤后，要把孔内的洗涤液完全甩干。第五步：每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100μL，盖上覆膜，37℃温育30分钟。第六步：弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤4。第七步：每孔加底物溶液90μL，酶标板加上覆膜，37℃避光显色(反应时间控制在10-15分钟。当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。第八步：每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色(终止液的加入顺序应与底物溶液加入顺序相同)如出现颜色不均一，轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。第九步：在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450波长测量各孔的光密度(OD值)。

7.3.4血浆mTOR(酶)活性的ELISA法检测

首先，将所需96孔酶标板取出，其余所需试剂暂存放在4℃冰箱。96孔酶标板每孔加mTOR底物溶液100μL，室温孵育1小时。如要进行抑制剂测试，将50μLmTOR置于冰上预温育20分钟，方法同上一步，或渥曼青霉素(Wortmannin)测试抑制剂(例如：50μL mTOR标准溶液加1μL渥曼青霉素，50×)。此种预培养在上一步操作时完成。其次，弃去孔内液体，每孔加200μLTBS洗涤溶液洗涤，准备吸水纸，酶标板朝下轻敲清空孔内的液体，重复洗板3次。利用缓冲液(不含磷酸)或水稀释mTOR Standard或mTOR Sample后，分别与2×Kinase AssayBuffer WS等比例混合，配制用于测定标准品或待测样品的酶活性检测液，然后取该溶液iOOμL，加入每一个检测孔(标准品或样品)。酶标板盖上覆膜，30℃温育30分钟。之后每孔加终止溶液10μL，终止反应。弃去反应液，以200μL(1X)洗涤液清洗。轻轻晃动酶标板5分钟。之后，将孔内的洗涤液完全甩干，酶标板朝下轻敲，清空孔内的液体。不能晃动板，洗板2次以上。下一步是每孔添加100μL抗-p70S6K-T389，盖上覆膜，室温孵育1小时。洗板4次，方法同步骤8，不能晃动酶标板。之后每孔加100μL HRP标记抗体，加上覆膜，室温孵育1小时。同上一步的步骤方法，洗板。后每孔加入100μL TMB底物溶液，加上覆膜，室温孵育5-20分钟。每孔加入100μL ELISA终止溶液，并在450nm处读取吸光度，参考波长最好设置为540或595nm。

7.3.5数据处理

各标准品及样品OD值扣除空白孔OD值后作图(七点图)，以标准品的浓度为纵坐标(或对数坐标)，OD值为横坐标(或对数坐标)，绘出标准曲线(最佳方程式应依回归方程计算的R²值来定，以R²值越趋近于1为好)。用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

7.4统计学分析

运用SPSS17.0软件进行数据录入和统计分析，血浆载脂蛋白水平实验数据采用单因素方差分析；两变量之间关系采用相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义，r值小于0.4为低度相关，0.4～0.7为中度相关，大于0.7为高度相关。灵敏度、特异度和准确度的计算公式为：

灵敏度＝真阳性／(真阳性+假阴性)×100％＝a／a+c×100％

特异度＝真阴性／(真阴性+假阳性人数)×100％＝d／b+d×100％

准确度＝真阳性+真阴性／总例数×100％＝a+d／N×100％。

在上述基础上，申请人进行了候选血浆蛋白作用效果研究。

1.宫颈病变进程与六种候选血浆蛋白质含量变化的关系研究

综合二维液相色谱-质谱和双向荧光差异电泳-质谱等双重蛋白质组学研究结果，以及生物信息学(IPA软件和Meta Core)分析，选取了至少在两种或者两种以上筛查中，反复确认的6种候选血浆蛋白质，有血浆apoA I、apoE、ATIII、CLU、mTOR和VIL1。

以上述为基础，利用82例宫颈病变(宫颈炎、CINII-III、宫颈癌早期和宫颈癌晚期)患者的外周血血浆标本，对候选血浆蛋白质的含量或活性进行ELISA法定量检测和统计分析，探讨了宫颈病变进程与候选血浆蛋白质含量变化动态的关系。如表1-1，-2，-3，-4，-5和1-6所示，不同蛋白质的血浆浓度有不同的数量级，其中VIL1为ng级，apoA I、ATIII、apoE和CLU为μg级，而mTOR检测值为酶活性。运用SPSS17.0软件的制图功能，将数据用直方图表示(图1，2，3，4，5和6)，发现伴随宫颈病变进程的发展，血浆apoA I、ATIII蛋白含量逐渐降低，而血浆apoE、CLU、VIL1、mTOR含量逐渐增高。

1.1宫颈病变进程与血浆apoA I含量动态变化的关系

如表1-1所示，apoA I蛋白表达含量随着宫颈病变进程的加重而逐渐降低，以慢性宫颈炎组作为对照，分别与CINII-III组、宫颈癌早期和宫颈癌晚期组进行比较，慢性宫颈炎与宫颈癌早、晚期组有显著差异(P＜0.01)、而与CINII-III组比较无统计学意义(P＞0.05)。再以CINII-III组作为对照，与慢性宫颈炎组进行比较也无统计学意义(P＞0.05)而与其他两组(宫颈癌早期和宫颈癌晚期组)比较有统计学差异(P＜0.05)。

表1-1宫颈病变与血浆apoA I含量动态变化的关系(ELISA鉴定)(X±S)

*：宫颈炎(对照组)与宫颈癌早、晚期组比较有显著差异(P＜0.01)

宫颈炎与CINII-III组比较无统计学意义(P＞0.05)

1.2宫颈病变进程与血浆apoE含量动态变化的关系

从表1-2可知，apoE(载脂蛋白E)蛋白表达含量随着宫颈病变进程恶化而逐渐升高，以对照组(宫颈炎)与其他三组比较均有显著差异(P＜0.05)，而以CINII-III作为对照组，与宫颈癌早期、晚期相比较无统计学意义(P＞0.05)，且宫颈癌早期与宫颈癌晚期相比也没有水平差异(P＞0.05)。

表1-2.宫颈病变与血浆apoE含量动态变化的关系(ELISA鉴定)(X±S)

*：宫颈炎组与其他三组相比均为P＜0.05，有统计学意义

CINII-III组与宫颈癌早、晚期组比较无统计学意义(P＞0.05)

1.3宫颈病变进程与血浆CLU含量动态变化的关系

如表1-3所示，CLU(簇蛋白)其表达含量随着宫颈病变进程逐渐增高，而在宫颈癌晚期又稍有降低，以宫颈炎组(对照组)与CINII-III组、宫颈癌早期组相比有显著的统计学意义(P＜0.01)。宫颈炎组与宫颈癌晚期表达差异无显著性(P＞0.05)；以CINII-III组作为对照，与宫颈癌早、晚期比较无统计学差异(P＞0.05)，以宫颈癌早期组作为对照与宫颈癌晚期相比均无差异(P＞0.05)。

表1-3.宫颈病变与血CLU含量动态变化的关系(ELISA鉴定)(X±S)

*：宫颈炎组与CINII-III、宫颈癌早期两组比较有统计学意义(P＜0.05)

宫颈炎与宫颈癌晚期组比较无统计学意义(P＞0.05)

1.4宫颈病变进程与血浆AT III含量动态变化的关系

从表1-4中，我们可以了解AT III(抗凝血酶III蛋白)其表达含量随着宫颈病变进程加重而减少，以宫颈炎组作为对照组，与CINII-III组比较有统计学差异(P＜0.05)，且与宫颈癌早期及晚期组比较差异显著(P＜0.01)；以CINII-III组作为对照与宫颈癌早期组差异无显著性(P＞0.05)，而CINII-III组与宫颈癌晚期组有显著差异(P＜0.01)；以宫颈癌早期组为对照，与宫颈癌晚期组比较也有统计学意义(P＜0.05)

表1-4宫颈病变与血浆ATIII含量动态变化的关系(ELISA鉴定)(X±S)

*：宫颈炎与CINII-III组比较有统计学意义(P＜0.05)；

**：宫颈炎组与宫颈癌早、晚期两组比较差异显著(P＜0.01)

1.5宫颈病变进程与血浆VIL1含量动态变化的关系

绒毛蛋白VIL1所测82例血浆样品中，其含量表达水平是随着宫颈病变的进程逐渐升高的。宫颈病变临床分期越晚，其表达水平也随之增高，其水平变化与宫颈病变进程呈正相关。以宫颈炎组作为对照，与CINII-III、宫颈癌早期、晚期组比较有明显统计学意义(P＜0.01)；而CINII-III作为对照，与宫颈癌早期、晚期组，及宫颈癌早期组与宫颈癌晚期组相比均无差异(P＞0.05)(见表1-5)。

表1-5宫颈病变与血浆VIL1含量动态变化的关系(ELISA鉴定)(X±S)

*：宫颈炎组与CINII-III组比较有统计学差异(P＜0.05)

**：宫颈炎组与宫颈癌早、晚期两组比较有显著差异(P＜0.01)

1.6宫颈病变进程与血浆mTOR活性动态变化的关系

mTOR(雷帕霉素靶蛋白)蛋白其表达含量随着宫颈病变加重呈逐渐增高趋势。CINII-III组、宫颈癌早期组及晚期组与宫颈炎组(对照组)比较其差异显著(P＜0.01)。以CINII-III组作为对照与宫颈癌早期组比较无显著性(P＞0.05)、而与宫颈癌晚期比较有显著差异(P＜0.01)。宫颈癌早期作为对照组与晚期组比较也无统计学意义(P＞0.05)(见表1-6)

表1-6.宫颈病变与血浆mTOR活性动态变化的关系(ELISA鉴定)(X±S)

*：宫颈炎组与其他三组比较均有显著差异(P＜0.01)

2宫颈癌特异性候选血浆蛋白质指标的相关性分析结果

肿瘤的发生往往涉及到多个蛋白的联合作用，为了对宫颈癌及宫颈其他病变的鉴别诊断寻找特异性联合检测分子指标，为了明确每一个具有显著统计学差异的蛋白之间是否有关联性，对不同蛋白之间进行相关性分析(表2-1)，将两个蛋白相关系数接近1，且P＜0.01视为两点之间相关性较为显著，可见相互之间有密切关联性。mTOR与apoA I(r＝-0.226；P＝0.04)，r＜0.4，P＜0.05；mTOR相对含量与apoA I呈低度负相关，提示mTOR表达含量水平增加可能与apoA I蛋白含量减少受到同一种外在因素影响。mTOR和VIL1(r＝0.233、P＝0.040)、mTOR和ATIII(r＝0.354，P＝0.001)，均显著呈低度正相关，提示mTOR含量增加可能与VIL1、ATIII两种蛋白含量的增加有关，尤其是mTOR和ATIII呈显著低度正相关。

表2-1.伴随着宫颈病变的候选血浆蛋白质含量变化的相关性分析

3宫颈癌特异性候选血浆蛋白质指标的灵敏度、特异度和准确度分析结果

候选肿瘤标志物一般需要符合两个基本要求，即具有较高的特异性和灵敏度，才能成为肿瘤早期诊断指标。从表3-1可见，血浆apoA I、apoE、AT III、CLU、VIL1、mTOR等6种血浆蛋白指标在灵敏度、特异度、准确度(％)方面的检测比较结果。从这6种蛋白的灵敏度、特异度和准确度比较中可以看出，mTOR蛋白的灵敏度、特异度和准确度普遍最高(94.0％、60％、80.0％)，而CLU最低(60.0％、59％、59％)，总体比较由高至低的顺序为mTOR、ATIII、apoA I、apoE、VIL1、CLU蛋白。

对灵敏度、特异度和准确度较高的宫颈病变高表达蛋白进行联合检测(表3-2)发现，mTOR和ATIII联合检测的灵敏度、特异度和准确度分别为83.5％、66.0％和76.5％，属于较高组合其次为apoA I+mTOR组；之后为mTOR、ATIII、apoA I三种蛋白联合检测组；而ATIII+apoA I组最低。通过(上述结果2中)我们也已发现mTOR与ATIII存在显著差异的低度正相关，可以认为基本符合理想的肿瘤标志物的基本要求；提示运用mTOR和ATIII联合检测，可能对于宫颈癌诊断和鉴别有很大的临床意义和价值。

表3-16种血浆蛋白质含量检测对宫颈癌预警的灵敏度、特异度、准确度分析

表3-2 3种候选血浆蛋白质指标的联合检测对宫颈癌预警的的特异性、灵敏度和准确度分析

通过SPSS软件，制作出每个蛋白指标的ROC曲线图(图7-12)，以灵敏度为纵坐标，以1-特异性为横坐标。

apoA I中选择宫颈炎为1组，而CINII-III、宫颈癌早期及宫颈癌晚期1组的两大组，选择其最大切点为临界点，曲线下面积为0.728，曲线下面积与Az＝0.5比较，差异有统计学意义，确定血浆中含量≥36.93ug/ml，为ROC曲线上的最佳临界点，对应的灵敏度为70.1％，特异度为60.0％。分为此两组时曲线下面积最大，说明以此为分界点是诊断性最好。

apoE中取截断点为3(慢性宫颈炎、CINII-III及宫颈癌早期为1组，宫颈癌晚期为1组的两大组)，此时的曲线下的面积最大(0.603)。

CLU蛋白选择截断点为2(宫颈炎、CINII-III为1组；宫颈癌早期和宫颈癌晚期为1组)，此时的曲线下面积最大为0.634。

ATIII蛋白选择的截断点是1(宫颈炎为1组；CINII-III、宫颈癌早期和宫颈癌晚期为1组)。此时曲线下的最大面积为0.762。

VIL1蛋白选择的截断点为3(宫颈炎组、CINII-III组及宫颈癌早期为1组，而宫颈癌晚期为1组的两大组)，曲线下的最大面积为0.571。

mTOR选择的最佳临界值为4(宫颈炎、CINII-III、宫颈癌早期和宫颈癌晚期)，此时的最大面积为0.843。

Claims

1.新一类宫颈癌特异预警血浆蛋白，其特征在于所述蛋白选自下述蛋白中的一种或多种联用：apoA I、apoE、AT III、CLU、VIL1、mTOR。

2.根据权利要求1所述的宫颈癌特异预警血浆蛋白，其特征在于所述蛋白选自mTOR和ATIII组合，或apoA I+mTOR组合，或mTOR、ATIII、apoA I组合，或ATIII+apoA I组合。

3.权利要求1所述的宫颈癌特异预警血浆蛋白作为宫颈癌早期预警标记物的应用。

4.一种用于评估患者是否患有宫颈癌或者患有宫颈癌危险性的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)检测患者样本中宫颈癌特异预警血浆蛋白的表达水平；(2)检测正常对照组中宫颈癌特异预警血浆蛋白的表达水平；其中所用的标记物选自下述蛋白：apoA I、apoE、AT III、CLU、VIL1、mTOR中的一种或多种的组合；在患者和正常对照组之间标记物蛋白表达水平的差异表明患者患有宫颈癌或者患有宫颈癌的危险性。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述宫颈癌早期预警标记物蛋白检测自外周血血浆标本。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)在第一时间点检测患者样本中宫颈癌特异预警血浆蛋白的表达水平；(2)在随后的时间点重复步骤(1)；(3)比较步骤(1)和(2)中所检测的宫颈癌特异预警血浆蛋白表达水平；其中apoA I、ATIII蛋白含量降低，或apoE、CLU、VIL1、mTOR含量增高提示患有宫颈癌的危险性增高或者代表宫颈癌患者病变进程加速、病情恶化。

7.用于筛选宫颈癌特异预警血浆蛋白的方法，其特征在于包括下述步骤：(1)分为三组，构建宫颈癌患者、CIN II/III患者与慢性宫颈炎患者的血浆蛋白样品；(2)将血浆蛋白样品进行蛋白质二维液相色谱分离与分析，得到宫颈癌患者的差异蛋白组分；(3)将差异蛋白组分经胰蛋白酶处理后进行液质联用质谱分析得到候选分子标志物差异蛋白；(4)同时将血浆蛋白样品运用差异荧光电泳联合质谱技术，筛选出差异表达蛋白；(5)将候选分子标志物差异蛋白进行IPA生物信息学分析，生成候选生物标记物列表；(6)结合步骤(3)、(4)和(5)的结果，确定核心差异蛋白，将核心差异蛋白名单采用MetaCore^TM数据库进行分析，得到宫颈癌特异预警血浆蛋白。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于进一步还包括将所得宫颈癌特异预警血浆蛋白进行ELISA法检测确定含量变化，进行验证。