CN108020669B

CN108020669B - 尿液骨桥蛋白及其多肽片段在肺腺癌中的应用

Info

Publication number: CN108020669B
Application number: CN201610952043.9A
Authority: CN
Inventors: 张曼; 王珊珊; 王巍伟; 雷婷
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2020-06-30
Anticipated expiration: 2036-11-02
Also published as: CN108020669A

Abstract

本发明提供一种尿液骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)及其多肽片段的应用，具体为尿液骨桥蛋白及其多肽片段在制备用于检测和辅助诊断肺腺癌制剂中的应用。本发明通过研究证实与正常对照和肺腺癌患者组相比，骨桥蛋白在肺腺癌患者的尿液中低表达，能够用于肺腺癌的检测和辅助诊断。本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测骨桥蛋白及其多肽片段。

Description

尿液骨桥蛋白及其多肽片段在肺腺癌中的应用

技术领域

本发明涉及尿液骨桥蛋白及其多肽的新用途，具体涉及尿液骨桥蛋白及其多肽片段在肺腺癌诊治中的应用。

背景技术

肺癌是全球范围内发病率及死亡率最高的肿瘤之一。WHO最新统计显示全球每年由159万患者死于肺癌。肺癌按病理类型可以分为小细胞肺癌（small lung cancer, SCLC）和非小细胞肺癌（non-small lung cancer, NSCLC），其中NSCLC又分为鳞癌、腺癌、大细胞癌、肉瘤样癌等。随着对肺癌研究的不断深入，根据驱动基因存在情况，又把NSCLC分为鳞癌和非鳞非小细胞肺癌，而非鳞非小细胞肺癌主要就是指肺腺癌。肺腺癌的预后较差，5年生存率仅15％，这主要是由于晚期诊断和对转移性疾病有限的治疗手段有关。目前对于肺腺癌的早期检测受到如下几个因素的阻碍：第一，在疾病的早期没有特定的临床症状；第二，肺腺癌患者的年龄较大，侵略性治疗干预受限，患者接受度差；第三，低剂量螺旋CT假阳性率高并且昂贵，不适合广泛的筛查。此外，辐射暴露可能增加肺癌风险。目前尚缺乏灵敏度和特异度均满意的用于肺腺癌诊治相关的生物标志物。

OPN是一种具有生物学活性的分泌型糖蛋白，能促进肿瘤细胞的趋化、迁移和黏附，参与骨的吸收和形成，同时还与肿瘤细胞的浸润和转移有着密切关系。OPN能够上调VEGF活性，引起微血管外渗，激活凝血酶原，促进血管的形成。OPN能够整合素受体，促进细胞之间的黏附和迁移，并刺激分泌产生抗凋亡信号，从而导致细胞的无限生长；OPN与整合素受体结合后会激活一系列信号通路，引起肿瘤细胞分泌产生降解细胞外基质的基质金属蛋白酶，基质金属蛋白酶能够促使肿瘤细胞突破周围结缔组织，加速肿瘤细胞的转移。CD44v6是与肿瘤细胞转移有关的蛋白，肝癌、胃癌等肿瘤转移过程中存在CD44v6高表达。OPN可与CD44v6结合，控制细胞骨架重塑、细胞存活、增生和浸润转移能力。Bmldrini等研究发现，OPN高表达的非小细胞肺癌患者肿瘤发生转移早且预后差，反之，低表达OPN患者预后良好。总之，OPN在细胞的趋化、黏附、迁移以及浸润、转移等等多个过程起着重要的作用，OPN的表达为评估肿瘤的恶性度和预后提供重要依据。

尿液作为人体代谢的终产物之一，留取具有大量性、无创性、大规模重复取样性、保存方便等独特的优势。尿液的组成、数量与性状的变化可反映机体的整体代谢状态，为研究脏器功能、评价机体状态、代谢情况、动态监测疾病进展和判断疗效等方面提供了各种信息。如果能建立一种对肺腺癌患者进行早期检测的无创性检查方法，对其筛查、诊断、预防及治疗均具有极其重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种尿液骨桥（Osteopontin，OPN）蛋白及其多肽片段在制备用于检测或辅助诊断肺腺癌的制剂中的应用。

优选地，所述尿液骨桥蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示（MRIAVICFCLLGITCAIPVK QADSGSSEEK QLYNKYPDAV ATWLNPDPSQ KQNLLAPQNA VSSEETNDFK QETLPSKSNESHDHMDDMDD EDDDDHVDSQ DSIDSNDSDD VDDTDDSHQS DESHHSDESD ELVTDFPTDL PATEVFTPVVPTVDTYDGRG DSVVYGLRSK SKKFRRPDIQ YPDATDEDIT SHMESEELNG AYKAIPVAQD LNAPSDWDSRGKDSYETSQL DDQSAETHSH KQSRLYKRKA NDESNEHSDV IDSQELSKVS REFHSHEFHS HEDMLVVDPKSKEEDKHLKF RISHELDSAS SEVN）。

优选地，所述OPN蛋白及其多肽片段来自于尿液。

优选地，所述制剂为肺腺癌患者OPN蛋白及其多肽片段检测试剂盒。所述试剂盒包括盒体以及设置在盒体内的固相结合物和试剂。

优选地，所述固相结合物为微孔板或磁微粒，包被抗人OPN蛋白及其多肽片段抗体。

优选地，所述试剂包括OPN蛋白及其多肽片段标准品溶液、酶标二抗、显色液、终止液、稀释液和清洗液。

发明人首先收集了肺腺癌和正常对照的随机尿液标本，离心后取上清，利用弱阳离子交换磁珠纯化和分离尿液标本。将 1μl标本与10μl基质（0.3 %的α-氰基-4-羟基肉桂酸，HCCA）混匀后，取1μl点在 Anchorchip（Autoflex MALDI TOF，Bruker-Dalton）靶板上，标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱多肽图。应用ClinProTools2.1分析软件对肺腺癌组和正常对照组的所有质谱图进行分析，筛选差异性多肽。然后发明人对具有统计学意义的差异性多肽进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-assisted laser desorption ionization timeof flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）鉴定，在International Protein Index（IPI human v3.45 fasta with 71983 entries）数据库检索得到肺腺癌组与正常对照间差异表达的OPN蛋白，并且与正常对照组相比，OPN蛋白在肺腺癌患者的尿液中低表达。

本发明通过研究证实与正常对照组相比，OPN蛋白在肺腺癌组患者的尿液中低表达，从而提出检测尿液OPN蛋白及其多肽片段可用于肺腺癌的诊治。

本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测OPN蛋白及其多肽片段。

为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。

附图说明

图1是OPN蛋白在肺腺癌组和正常对照组的所有标本中表达的散点图。

图2是OPN蛋白在肺腺癌组和正常对照组的峰面积分布图。

图3是尿液OPN蛋白在肺腺癌组表达的ROC曲线。

图4是免疫组织化学检测OPN蛋白在肺腺癌和癌旁对照组织中的差异表达。

具体实施方式

实施例1 尿液标本的收集与处理

收集肺腺癌患者34例（首都医科大学附属北京世纪坛医院呼吸科门诊）随机清洁中段尿液标本，2h内离心（1500rpm，5min），保留上清。分装后-80℃冰箱冻存。正常对照组为36例（首都医科大学附属北京世纪坛医院体检中心）。具体请参照下表1：

表1. 2组的临床资料

实施例2 磁珠纯化和分离尿液标本中的多肽

从-80℃冰箱取出尿液标本，4℃复融，离心（3000rpm，10min）后取上清备用。室温下平衡弱阳离子磁珠（MB-WCX），并手动混匀磁珠悬浮液。在样品管中加入10ul MB-WCX和10ul磁珠结合缓冲液，加样枪上下吹打混匀，避免起泡。向样品管中加入5ul尿液上清，充分混匀后磁力架上静置1分钟，磁珠与悬浮的液体分离。用加样枪除去悬浮的清澈液体，枪头应避免接触到磁珠，避免吸走磁珠。在样品管中加入100ul磁珠清洗缓冲液，充分混匀后将样品管在磁力架上静置1分钟，磁珠贴壁，与悬浮的液体分离，用加样枪除去悬浮的液体。重复3次，弃去悬浮液。在样品管中加入5ul磁珠洗脱缓冲液，反复吸打10次以上，使磁珠和洗脱缓冲液混匀，避免起泡。将样品管放置于磁力架上，静置 2min，使磁珠与悬浮液充分分离，将上清液（洗脱液）移入已标记的新的0.5ml 样品管。加入 5ul稳定缓冲液，加样枪小心吹打混匀。

实施例3 尿液标本的点靶与多肽谱图的生成

用标准品校正仪器后，将1μl洗脱液与10μl基质（0.3 %的α-氰基-4-羟基肉桂酸，HCCA）混匀，取1μl点在 Anchorchip（Autoflex MALDI TOF，Bruker-Dalton）靶板上，室温干燥。通过氮激光器照射使标本离子化后进行质谱分析，采集1000-10000Da范围内的数据，获得由不同质荷比的蛋白峰构成的质谱图。对于每一个MALDI结晶点来说，共照射400次激光（每个结晶点的8个不同的位置各照射50次），平均值代表一个标本，从而得到所有样本的多肽图谱。应用ClinProTools2.1分析软件对正常对照组和肺腺癌组的质谱图进行分析，筛选差异性多肽。筛选条件：质量范围1000-10000Da，信噪比（S/N）大于5，质量飘移不超过0.1%，所有质谱图根据总离子流进行归一化。OPN蛋白的2个多肽片段在正常人和肺腺癌患者的尿液中均能检测出，并且证实OPN蛋白在肺腺癌患者尿液中低表达。峰面积作为定量的标准，Anderson-Darling检验分析数据的正态性，t检验用于分析正态分布的连续数据，Wilcoxon检验用于分析非正态分布的连续数据。p＜0.05认为具有统计学差异。

实施例4 差异多肽的鉴定

将样品管中磁珠洗脱液旋转蒸干，加入20ul流动相A（5%乙腈，0.1%甲酸的水溶液）溶解，转移至进样瓶中。进样体积18ul，首先以15μl/min的速度进入捕集柱脱盐，捕集时间3min。然后以400nl/min的流速进入分析柱进行梯度洗脱，洗脱梯度为5%B-50%B-80%B-80%B-50%B-5%B（流动相B：95%乙腈，0.1%甲酸的水溶液，见表2）。分析时间60min，色谱柱温度35℃，所有洗脱成分进入质谱仪分析。Nano离子源，喷雾电压1.8kV；质谱模式为数据依赖及动态排除，扫描范围400-2000m/z；一级扫描（MS）使用Obitrap，分辨率设定为100000；CID及二级扫描使用LTQ；在MS谱图中选取强度最强的10个离子的单一同位素作为母离子进行MS/MS（单电荷排除，不作为母离子）。质谱扫描时间60min。应用数据分析软件BioworksBrowser3.3.1 SP1进行Sequest^TM检索。检索数据库为International Protein Index（IPI humanv3.45 fasta with 71983 entries）。母离子误差设定为100ppm，碎片离子误差设为1Da，酶切方式为非酶切，可变修饰为甲硫氨酸氧化。检索结果参数设定为deltacn≥0.10，两电荷Xcorr 2.6，三电荷Xcorr 3.1，三电荷以上Xcorr 3.5。在数据库中检索得到肺腺癌组和正常对照组差异表达的OPN蛋白，并且与正常对照组相比，OPN蛋白在肺腺癌患者的尿液中低表达。

表2 分析柱梯度洗脱的程序

时间（min）	流速（nl/min）	流动相A（%）	流动相B（%）
				0.00	400	95.0	5.0
40.00	400	55.0	45.0
				41.00	400	20.0	80.0
45.00	400	20.0	80.0
				45.50	400	95.0	5.0
60.00	400	95.0	5.0

实施例5 OPN蛋白在正常对照和肺腺癌患者组织中的免疫组化验证

将石蜡包埋肺腺癌和癌旁对照组织样品切成4-mm切片，载玻片用二甲苯脱蜡20min，100％，100％，95％和75％乙醇梯度脱水，2min/次。磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗10min后进行抗原修复，3％H₂O₂孵育15min，PBS漂洗10min，加入小鼠抗人α1抗胰蛋白酶单克隆抗体孵育，PBS洗涤，加入辣根过氧化物酶标记的二抗37℃孵育20min， PBS洗涤15min。色原体3,3'-二氨基联苯胺溶液染色5min，苏木精复染2min，75％，95％，100％，100％的乙醇梯度脱水，二甲苯清洗并用天然树胶封片，显微镜下观察结果，具体结果请详见图4。从图中明显看出，OPN蛋白在肺腺癌患者的组织中表达显著上调。

实施例6 测量肺腺癌患者尿液中的OPN蛋白含量

将抗人OPN融合蛋白抗体用包被缓冲液进行稀释，将其加入到固相结合物上，4℃包被过夜。倒去未包被的液体，用PBST洗涤3遍，加入200ul阻滞液阻止非特异性结合位点，37℃孵育1小时，PBST洗脱3次。放入4℃保存备用。

取肺腺癌患者（首都医科大学附属北京世纪坛医院）待测清洁中段随机尿30-50ml，装入清洁的尿管，女性留取尿标本时应避开经期，应防止阴道分泌物混入尿液中，常温下1500rpm离心5分钟，取上清待检。

纯化定量的OPN基因重组蛋白作为标准品，将待测标本加入到已包被好的固相结合物中，37℃孵育1小时，用洗板液PBST 洗去未结合的抗原，吸干残余液体。加入酶标二抗，37℃孵育30分钟，PBST洗涤4次，吸干残余液体。加入显色液，室温放置10分钟，利用计算机读取样本中OPN 蛋白的含量。

通过该方法，发明人检测了50例糖尿病合并冠心病的患者随机尿中OPN蛋白的含量，并描绘ROC曲线，反应该蛋白的灵敏度和特异度均较好。

虽然本发明已以较佳实施例披露如上，然其并非用以限定本发明，任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的更动与改进，因此本发明的保护范围当视权利要求所界定者为准。

Claims

1.尿液骨桥蛋白（OPN）及其多肽片段在制备用于检测和辅助诊断肺腺癌制剂中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，尿液OPN蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述制剂为肺腺癌患者尿液OPN蛋白及其多肽片段检测试剂盒。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括盒体以及设置在盒体内的固相结合物和试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固相结合物为微孔板或磁微粒。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，微孔板或磁微粒上包被抗人OPN蛋白及其多肽片段抗体。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述试剂包括OPN蛋白及其多肽片段标准品溶液、酶标二抗、显色液、终止液、稀释液和清洗液。