CN106198769B - 肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用。通过iTRAQ蛋白标记技术和TiO₂磷酸化肽段富集技术，结合液相串联质谱分析，对肝脏癌变细胞和癌旁组织细胞中的差异蛋白和磷酸化蛋白质进行研究，对差异的磷酸化蛋白的种类、数量、磷酸化位点和功能进行分析，全方位多角度的分析了肝脏癌变组织细胞相对于癌旁组织细胞中差异蛋白和磷酸化蛋白组，该检测结果可以作为诊断原发性肝癌患者的中间结果数据，并为原发性肝癌患者的治疗及发病机理研究提供理论基础和技术支持，并有望成为肝癌病情诊断和监测的重要生物标记物。

Description

肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种疾病研究领域，尤其是涉及一种肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用。

背景技术

原发性肝癌(primary liver cancer，PLC，以下简称肝癌)是一种发源于肝脏，能引起极高死亡率的癌症。肝癌和肺癌及胃癌并称世界上的三大癌症。肝癌严重影响人们的生活质量和威胁着人类的健康。肝癌的发病也有一定的特点，不同的地区，不同的人种以及不同的性别的肝癌发生率都不相同。据国际卫生组织2012年数据统计，全球每年肝癌发病人数约为748300例，其中男性522400例，女性225900例。全球每年因肝癌死亡的人数高达695900人，而且现在还呈上升的趋势，其中欠发达地区的情况更为糟糕，大部分的发病都集中在亚洲。肝癌的发病原因较为复杂，是由遗传因素和环境因素等多种因素综合作用的结果。其中，环境因素有慢性乙型肝炎、丙型肝炎病毒感染、黄曲霉素的大量摄入、亚硝胺类、氯仿等致癌物质的食入、饮水污染、寄生虫、长期大量的吸烟饮酒等。肝癌的病情具有恶性程度高、易转移和复发及治疗的预后较差等几个特点。目前针对肝癌的治疗方法有手术切除、肝移植手术、全身化学疗法、放射疗法、经动脉化学栓塞、超声或CT引导下瘤内注射无水乙醇/乙酸、高强度聚焦超声、综合疗法等。手术切除和肝移植手术被认为是根治肝癌的最好方法，但也存在着很多的问题，比如很多的肝癌患者就诊时就已经属于肝癌的中晚期，而且多数患者有肝硬化和伴有其它的肝功能异常，难以进行手术根除，即使进行手术，术后仍然会面临比较高的复发和转移的风险。

蛋白质磷酸化修饰是蛋白质翻译后修饰的一种最重要的方式，是一种可逆的、动态变化的蛋白质翻译后修饰过程。磷酸化修饰在生命的活动过程中起着非常重要的调控作用，贯穿了生命的多种活动，包括细胞的增殖、分化和发育、信号转换、细胞凋亡等。对肝脏癌变组织细胞进行磷酸化蛋白质组学的研究有助于更深入的了解蛋白磷酸化对组织细胞的影响，找出肝癌的特异性标记物以及作用靶标，进一步阐明其疾病发生的分子作用机制，为该疾病的治疗提供新的策略和提供良好的理论基础。但由于蛋白质的磷酸化是一个动态的过程，而且磷酸化蛋白在细胞内的含量低，比较难于检测，且由于磷酸化蛋白质拥有比较复杂的结构，且带有负电，这使得磷酸化蛋白质在富集和纯化以及检测方面具有一定的困难。

发明内容

基于此，有必要提供一种能够用于肝癌的磷酸化蛋白质分析研究的肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用。

一种肝癌磷蛋白组学模型的构建方法，包括如下步骤：

步骤S1，分别提取肝脏癌变组织细胞和相应的癌旁组织细胞的总蛋白，得到两组蛋白样本；

步骤S2，分别对所述两组蛋白样本进行还原烷基化处理，得到两组蛋白样本溶液；

步骤S3，分别向两组蛋白样本溶液中加入胰蛋白酶进行酶解处理，得到两组肽段样本；

步骤S4，将每组肽段样本分成两份，得到两份样本，对其中一份的含有肝脏癌变组织细胞的肽段样本和相应的癌旁组织细胞的肽段样本分别使用不同的标记试剂进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的两组肽段样本混合；对其中另一份的含有肝脏癌变组织细胞的肽段样本和相应的癌旁组织细胞的肽段样本分别富集磷酸化的肽段后，再使用不同的标记试剂进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的两组肽段样本混合；

步骤S5，分别对两份混合后的样本进行强阳离子交换分离处理；

步骤S6，分别对强阳离子交换分离处理后的两份样本进行液相色谱分离，再将液相色谱分离得到的肽段进行串联质谱分析；

步骤S7，使用蛋白质鉴定软件对质谱分析结果进行蛋白质鉴定，根据蛋白质丰度水平，分析得到肝脏癌变组织细胞和相应的癌旁组织细胞的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型。

在其中一个实施例中，所述步骤S2中，采用四乙基溴化铵对提取的两组蛋白样本的沉淀进行还原烷基化处理，得到相应的蛋白样本溶液。

在其中一个实施例中，所述步骤S5中，所述强阳离子交换分离处理使用岛津LC-20AB液相系统，分离柱为4.6×250mm型号的Ultremex SCX柱。

在其中一个实施例中，所述步骤S6中，进行液相色谱分离时使用岛津LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行标准分离；

所述进行串联质谱分析使用串联ESI质谱仪，设置质谱分辨率依次为：一级70000，二级17500，挑选出电荷为2+～5+，峰强度在20000以上的母离子十五个进入二级分析，对肽段使用能量为27+12％的HCD模式进行破碎，碎片在Orbi中检测。

在其中一个实施例中，所述步骤S7中，所述蛋白质鉴定软件为Mascot，分析过程中，以IPI human v3.87为数据库进行搜索。

在其中一个实施例中，所述步骤S7中，在根据蛋白质丰度水平进行分析的过程中，当差异倍数达到1.2倍以上，且经统计假定值p-value小于0.05时，为差异表达蛋白。

一种上述任一实施例所述的肝癌磷蛋白组学模型的构建方法得到差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型。

在其中一个实施例中，所述差异表达蛋白包括在肝脏癌变细胞中表达上调的trQ6ZNC2、spO60218AK1BA、trJ3KNB4及sp|Q2TB90|HKDC1。

在其中一个实施例中，所述差异磷酸化表达蛋白包括在肝脏癌变细胞中表达上调的Q7Z3D7、A8K5M4、J3QTA6及P51812。

上述任一实施例所述的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型在制备诊断肝癌的检测芯片或检测试剂中的应用。

本发明采用iTRAQ蛋白标记技术和TiO₂磷酸化肽段富集技术，结合液相串联质谱分析，对肝脏癌变细胞和癌旁组织细胞中的差异蛋白和磷酸化蛋白质进行研究，对差异的磷酸化蛋白的种类、数量、磷酸化位点和功能进行分析，全方位多角度的分析了肝脏癌变组织细胞相对于癌旁组织细胞中差异蛋白和磷酸化蛋白组。本发明只是对原发性肝癌患者的一个临床应用相关的初步研究，其检测结果可以作为诊断原发性肝癌患者的中间结果数据，届时再结合其他数据等特征判断为是否是原发性肝癌患者。本发明的检测结果，如该差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型可以为原发性肝癌患者的治疗及发病机理研究提供理论基础和技术支持，并有望成为肝癌病情诊断和监测的重要生物标记物，如可以对这些差异表达的蛋白或磷酸化蛋白设计检测探针或检测试剂，用于对原发性肝癌患者进行细胞蛋白组的检测，并结合其他诊断指标判断是否为原发性肝癌患者或者是否具有向肝癌发病的趋势。

附图说明

图1为差异蛋白信息分析流程示意图；

图2为差异磷酸化表达蛋白信息分析流程示意图；

图3为蛋白样品间的定量过程中所鉴定到的差异蛋白以及差异蛋白差异倍数的分布情况；

图4为差异蛋白分子功能GO分析；

图5为差异蛋白细胞组间GO分析；

图6为差异蛋白生物学过程GO分析；

图7为差异蛋白GO分析；

图8为肽段序列长度分布示意图；

图9为蛋白质相对分子质量分布示意图；

图10为Unique肽段分布示意图；

图11为蛋白序列覆盖度示意图；

图12为蛋白磷酸化位点示意图；

图13为磷酸化肽段位点个数分布示意图；

图14为磷酸化定量位点的丰度比分布示意图；

图15为差异磷酸化表达蛋白生物学过程GO分析；

图16差异磷酸化表达蛋白分析功能GO分析；

图17为差异磷酸化表达蛋白细胞组间GO分析；

图18为肽段匹配误差分布示意图。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对肝癌磷蛋白组学模型及其构建方法和应用作进一步详细的说明。

1.研究对象

肝脏癌变组织及癌旁组织的选取

本实施例所用的八例肝脏癌变组织及癌旁组织标本均来自于中国人民解放军第一八一医院，所有原发性肝癌患者在术前未进行放化疗等治疗手段，于解放军第一八一医院行肝脏移植手术，肝脏癌变组织取于移植后肝脏的癌变部位的组织，癌旁组织取于移植后肝脏癌变组织2cm的旁组织。标本收集时间为2012年12月～2013年8月。本实施例的研究通过得了中国人民解放军第一八一医院伦理委员会的讨论通过，并且取得了患者的同意。

可理解，在其他实施例中，该肝脏癌变组织及癌旁对照组织标本也可以取自一些癌症样本冻存库等机构或者癌症治疗机构。

2.实验主要仪器

表2-1实验主要仪器和试剂

3.实验步骤

3.1组织标本的处理

提取的肝脏癌变组织和癌旁组织立刻用0.9％的NaCl冲洗，之后放入冻存管中并置于-20℃冷冻，储存于-80℃冰箱备用。

注：所用试剂的百分比数据除特殊注明均为质量百分比数据，下同。

3.2蛋白质提取过程

1.取适量的组织样品，置于液氮中冷却，在事先置于-20℃冷却的干净研钵中碾磨至粉末状，碾磨过程中不断的加入液氮。

2.取出碾磨好的样本，加入适量蛋白裂解液溶解，至十倍体积使悬浮，依次加终入PMSF、浓度为1mM及2mM的EDTA，反应5分钟后，加入浓度为10mM的DTT。

3.进行15分钟超声处理，取出样品，放入4℃恒温离心机，以35，000r/min离心20分钟，取上清液。

4.上清液中加入事先置于-20℃环境中冷却的丙酮，静置于-20℃的环境下，沉淀2h，取出放入4℃恒温离心机，以30，000r/min离心20分钟，弃上清。

5.沉淀样品中加入十倍体积的蛋白裂解液溶解，依次加入终浓度为1mM的PMSF及2mM的EDTA，反应5分钟后，加入DTT使终浓度为10mM。

6.进行15分钟超声处理，取出样品，放入4℃恒温离心机，35，000r/min离心20分钟，取上清液。

7.在56℃的环境下往上清液中加入终浓度10mM DTT，反应1小时，充分打开二硫键。

8.反应时间结束后，再加入终浓度为55mM的IAM，静置于暗室中45分钟，进行半胱氨酸的烷基化封闭。

9.在样本液中加入事先置于-20℃环境中冷却的丙酮，静置于-20℃的环境下，沉淀2h。取出放入4℃恒温离心机，35，000r/min离心20分钟，弃上清。

10.将所得的沉淀置于200μl 0.5M TEAB(四乙基溴化铵)中，进行15分钟超声，充分溶解。之后取出放入4℃恒温离心机，35，000r/min离心20分钟后取上清液，用于定量。

3.3蛋白质浓度检测

Bradford定量，制作BSA标准曲线。

向十个样品管中依次加入浓度为0.2μg/μl的标准BSA样品，其量为0，2，4，6，8，10，12，14，16，18μl，再加入纯水，总体积为20μl。其中第一管中不含参照的蛋白，其余的管中所含有的蛋白量依次为0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.4、2.8、3.2、3.6μg。之后稀释到测量范围，之后每个样品取20μl，将180μl的protein assay reagent加入各个样品中，在室温下培育十分钟。利用酶标仪在595nm的光波下测量它们的吸光值，以第一管为参照，记录各个样品的吸光值，绘制标准曲线，依据标准曲线算出各样品的浓度。

3.4SDS电泳

制备浓度为12％的SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶，将各个样品分别与4×loadingbuffer混合，加热至95℃，持续5分钟。上样，样品量为30μg，同时Marker的量为10μg。在120V的恒定电压下电泳2小时。结束后用考染液进行染色2h，之后再用脱色液脱色3-5次，每次0.5h。

3.5蛋白质酶解

精确的取每个样品蛋白100μg，以酶比蛋白为1:20的比例加入Trypsin，置于37℃的水浴中充分酶解4小时。结束后按照同样的酶与蛋白比例再次加入Trypsin，置于37℃的水浴中继续充分酶解8小时。酶解结束后，用真空离心泵抽干肽段备用。

3.6蛋白组测试

加入0.5M TEAB使肽段复溶，之后按照iTRAQ试剂使用说明对肽段进行标记。确保不同的样品组用不同分子量的iTRAQ试剂进行标记，之后在室温下培养2小时。混合标记好的肽段组，准备SCX柱进行液相分离。

3.7磷酸化蛋白测试

使用TiO₂富集磷酸化肽段。

用C8膜、柱料、乙腈、Mlilli-Q水等材料制作柱子，用乙腈过柱2次平衡柱料，将100μg的磷酸化肽段用20μl Loading buffer进行复溶，进行两次上样，收集排出的样品。之后再用10μl的Loading buffer进行2次过柱，再用10μl/wash buffer进行过柱，达到清洗的目的。之后再分别用10μl elution buffer1和10μl elution buffer2各过柱一次，将两次收集的穿透液合并，进行冷冻抽干处理。

3.8SCX柱液相分离

用4mL bufferA(25mM NaH₂PO₄in 25％ACN，pH2.7)对iTRAQ标记好的混合肽段样品进行复溶，对样品进行液相分离。本实施例采用的液相系统型号为岛津LC-20AB，分离柱是ΜltremexSCX柱，型号为4.6×250mm。上样后进行梯度洗脱，首先用5％buffer B(25mMNaH₂PO₄，1M KCl in 25％CAN，pH2.7)进行7分钟的洗脱。用浓度为buffer B进行20分钟的直线梯度洗脱。最后在两分钟内让buffer B的浓度升高至100％，并维持一分钟。结束后再将buffer B浓度降低至5％，平衡十分钟。整个过程保持洗脱的速率为1mL/min，同时用214nm吸光度监测整个洗脱过程。经过筛选后得到不同的组分，分别用StrataX除盐柱对各个组分进行除盐处理，最后进行冷冻抽干。

3.9基于QE的液质联用分析

用buffer A(5％ACN，0.1％FA)分别将抽干的每个组分复溶至约0.5μg/μl的浓度，35000转离心10min，去掉不溶的物质。应用岛津公司LC-20AD型号的纳升液相色谱仪对样品进行分离，每个样品上样的量为5μl(约2.5μg蛋白)。实验中用到的柱有Trap柱和分析柱，主要的分离步骤为：五分钟内让样品以8μl/min的速度降到Trap柱上，以300nl/min的流速将样品流入分析柱进行分离，并传至质谱系统。具体操作为，先用5％bufferB(95％ACN，0.1％FA)对样品进行五分钟的洗脱，通过一个线性梯度，在0.5h内将bufferB的浓度由5％升至35％，之后的五分钟将浓度提高到60％，紧接着在两分钟内将浓度提升到80％并维持两分钟。最后在一分钟的时间内将bufferB下调至5％，并维持十分钟。

液相分离出来的肽段通过串联ESI质谱仪：Q-EXACTIVE(ThermoFisherScientific，San Jose，CA)进行分析。设置质谱分辨率依次为：一级70000，二级17500。挑选出电荷为2+～5+，峰强度在20000以上的母离子十五个进入二级分析。对肽段使用能量为27(±12％)的HCD模式进行破碎，对其进行Orbi检测。

4信息分析流程

4.1差异蛋白质信息分析流程

如图1所示，差异蛋白质信息分析包括对收集到的质谱原始文件做峰识别处理，得到峰列表；制作参考数据库，对肽段及蛋白进行鉴定；最后比较样品间蛋白差异情况，从而筛选出所需要进一步研究的差异蛋白。

4.2差异磷酸化表达蛋白信息分析流程

如图2所示，差异磷酸化表达蛋白信息分析流程包括利用蛋白质数据库搜索软件对样品中的蛋白质进行比对，依据质量分析得出可信的肽段和蛋白质，对筛选出的磷酸化蛋白质和肽段进行定量和功能分析，并进一步研究它们在生物体中所发挥的作用。

5.实验结果

5.1iTRAQ标记差异蛋白组分析

5.1.1蛋白质鉴定结果

本实施例使用iTRAQ技术对蛋白质进行相对定量，用的质谱仪器为Q-EXACTIVE。如表5-1所示，质谱实验共得到谱图342324张，经Mascot软件配合以IPI human v3.87为数据库进行搜索，进行数据分析后，匹配到81690张谱图，其中67339张为Unique谱图，此次实验共鉴定到蛋白4795个，肽段21788个，其中包括Unique肽段19771个。

表5-1蛋白质鉴定结果统计

注：鉴定基本信息统计，第一行为类别，第二行为数量，Total Spectra为二级谱图总数，Spectra为匹配到的谱图数量，Unique Spectra为匹配到特有肽段的谱图数量，Peptide为鉴定到的肽段的数量，Unique Peptide为鉴定到特有肽段序列的数量，Protein为鉴定到的蛋白质数量。

5.1.2蛋白的定量

比较肝脏癌变与癌旁组织蛋白丰度差异倍数，达到1.2倍以上的并且经统计学检验p-value值小于0.05时，被视为差异蛋白，结果如表5-2所示。

表5-2差异蛋白质统计

5.1.3蛋白质丰度比分布

在蛋白质相对定量过程中，当同一种蛋白质在两个样本间表达的量不存在明显差异，那么其蛋白分度比值近于1。如果表达的丰度比或差异的倍数超过1.2倍时，同时其统计检验的p-value值小于0.05，那么该蛋白可以视为样品间表达差异的蛋白，作为候选的差异表达蛋白进行进一步的研究和分析。

如图3所示，图3是蛋白样品间的定量过程中所鉴定到的差异蛋白以及差异蛋白差异倍数的分布情况。其中，横坐标表示经过以2为底数的对数转化后的差异倍数值，所有表达上调的蛋白表达差异倍数大于1.2，上图显示的值为大于0，用红色标记；所有表达下调的蛋白相对表达差异倍数同样大于1.2，上图显示的值为小于0，用绿色标记。图中红色和绿色标记的蛋白可能是候选的差异蛋白，其在生物体生命活动过程中所起到的作用需要进一步研究和验证。

5.1.4GO注释

GO是Gene Ontology的简称，是国际上标准的基因功能分类体系。用以系统描述生物体基因和其表达产物的属性，是一系列规范的动态更新的词汇表。GO分析包括三项内容，分别描述着基因在细胞内的位置、所执行的分子功能、参与的生物过程，结果如图4、图5、图6和图7所示。

5.2TiO₂富集磷酸化蛋白分析

5.2.1磷酸化蛋白质

蛋白质鉴定结果统计如表5-3所示。

表5-3蛋白质鉴定结果统计

注：“Identified Proteins”为鉴定的可信的蛋白质；“Identified Peptides”为鉴定的可信的肽段；“Identified Spectra”为对应到可信肽段的图谱。

5.2.2肽段序列长度分布

不同的质谱仪有着不同的测量范围，因此能识别的肽段长度也有一定的限制，过长或过短的肽段都无法被质谱仪识别。如果检测的结果中肽段长度普遍过高或者过低，那么有可能是所使用的酶选择不恰当。如图8所示，图中横坐标表示为肽段长度，纵坐标表示为对应肽段的数目，由图8可以看出检测到肽段的长度主要集中在9和23之间。

5.2.3蛋白质相对分子质量分布

蛋白质相对分子质量大小的检测可以反映蛋白质中所含氨基酸的个数。如图9所示，横坐标所表示为蛋白质的相对分子质量区段，纵坐标表示为对应质量区段蛋白质的个数和百分比，从图9可以发现，蛋白质的相对分子质量主要集中在1kDa和150kDa之间。

5.2.4Unique肽段分布

Unique肽段是指仅在特定蛋白质中存在的肽段，鉴定到这些肽段可以确定存在相应蛋的白质。如图10所示，图中横坐标代表肽段的数目，Unique肽段个数相对应的蛋白质的数目用纵坐标表示。从图10中分析可以得出，鉴定到的蛋白质中大部分只具有少量Unique肽段。

5.2.5蛋白序列覆盖度

一定程度上肽段序列覆盖度表明了蛋白质鉴定的可信程度。如图11所示，该图展示了不同覆盖度的蛋白比率，不同的颜色代表了不同的序列覆盖度范围，饼状图百分比表示了位于不同覆盖度范围的蛋白质数量占总蛋白质数量比率。

5.2.6磷酸化位点识别

结果如表5-4所示。

表5-4磷酸化位点鉴定结果统计

注：“Phospho-sites”表示识别的磷酸化位点总量；“Identified Phospho_S”表示丝氨酸鉴定位点数量；“Identified Phospho_T”表示苏氨酸鉴定位点数量；“IdentifiedPhospho_Y”表示酪氨酸鉴定位点数量。

如图12所示，该图表示不同概率的位点比例，不同颜色表示差异的可能性范围。图12中百分比表示了位于不同概率范围的位点数量占位点总数量的比率。

5.2.7磷酸化肽段位点个数分布

如图13所示，横坐标表示每个磷酸化肽段中具有的磷酸化位点个数，纵坐标表示相应磷酸化肽段数量占磷酸化肽段总数的百分比。从图13能够看出，高于60％的磷酸化肽段仅有一个磷酸化位点。

5.2.8磷酸化肽段和蛋白鉴定

结果如表5-5所示。

表5-5磷酸化信息统计表

注：“ALL-proteins”表示鉴定到的蛋白质数量；“Phos-proteins”表示发生磷酸化的蛋白质数量；“Ratio”表示磷酸化蛋白质的含量；“ALL-peotides”表示鉴定到的肽段数量；“Phos-peptides”表示磷酸化的肽段数量；“Ratio”表示磷酸化肽段的含量，这些数据从一定程度上反映富集效果的程度。

5.2.9磷酸化肽段(位点)定量

结果如表5-6所示。

表5-6磷酸化位点统计表

5.2.10磷酸化定量位点统计

如图14所示，该图表明所有被定量到的磷酸化位点的丰度比分布状况，其中，横坐标为以差异倍数底数为2的对数转化后的值，纵坐标表示磷酸化肽段的数量。横坐标表示高于0的点为上调磷酸化位点和低于0的点为下调磷酸化位点。

5.3磷酸化蛋白GO注释

GO是Gene Ontology的简称，是国际上标准的基因功能分类体系，用以系统描述生物体基因和其表达产物的属性，是一系列规范的动态更新的词汇表。GO分析包括三项内容，分别描述着基因在细胞内的位置、所执行的分子功能、参与的生物过程。本实施例的磷酸化蛋白GO注释结果如图15、图16和图17所示。

5.4鉴定质量评估

5.4.1肽段匹配误差分布

本实施例质谱仪使用的是Q-Exactive，该仪器具有高分辨能力和很高的质量精确度等优势，被广泛应用于小分子和大分子的分析和检测，特别适合对高度复杂的蛋白质组学样品进行研究。

Q-Exactive质谱仪的一级质谱和二级质谱都具有低于2ppm的质量精确度，但是为防止遗漏鉴定结果，因此对于数据库搜索策略的肽段匹配误差一般被控制在低于20ppm。图18表示所有匹配到的肽段的相对分子量的实际值与理论值的误差分布，其中，横坐标为匹配肽段的实际质量与理论质量的差异，纵坐标为搜索得分。图18表明所有匹配到的肽段的实际值与理论值之间的差异，该数据切合了质量精确度的要求。

5.4.2蛋白和肽段FDR控制

为了保证结果的可信度，使用FDR对鉴定结果进行控制。本次实验要求：蛋白水平FDR<0.01；肽段水平FDR<0.01；位点水平FDR<0.01。

6分析与讨论

原发性肝癌是一种死亡率极高的恶性癌症，在世界各地区的发病率极高，尽管近年来对肝癌的研究取得了一定的进展，但是肝癌的发现和治疗依旧面临着许多挑战，其主要受到肝癌前期的诊断准确率和肝癌手术后预后效果及肝脏供体紧张等因素的影响。另外，许多的肝癌患者被确诊为肝癌时，病情的发展已经到了中晚期，而且多数肝癌患者伴有肝硬化和其他的肝功能异常，已经很难进行手术根除，即使能手术切除，肝癌在一定的时间内复发和转移的几率也极高。目前，对于肝癌的诊断方法主要有血清甲胎蛋白的检测和医学影像检查，但是并非所有的肝癌患者血清中的甲胎蛋白水平都会升高，而且医学影像对于小于2cm的肝癌极难发现，这对于肝癌的早期诊断造成了很大的影响。因此研究者们也正在寻找验证其他的筛查指标。总的来说，肝癌的治疗面临着诊断难，手术预后效果不佳等多种因素的挑战。

组织细胞中蛋白质磷酸化与细胞的生命活动调控、信号转导等活动有着密切的关系，对其肝脏癌变与癌旁组织中蛋白磷酸化差异表达进行研究有可能为肝癌的确诊寻找新的标记物，为其治疗寻找新的靶标。

本实施例采用iTRAQ蛋白标记技术和TiO₂磷酸化肽段富集技术，结合液相串联质谱分析，对肝脏癌变细胞和癌旁组织细胞中的差异蛋白和磷酸化蛋白质进行研究，对差异的磷酸化蛋白的种类、数量、磷酸化位点和功能进行分析，全方位多角度的分析了肝脏癌变组织细胞相对于癌旁组织细胞中差异蛋白和磷酸化蛋白组。

采用iTRAQ蛋白标记技术结合液相串联质谱分析的实验结果中，共鉴定得到了21788条肽段，其中19771条特有的肽段，肽段的氨基酸残基个数主要集中在6-20；所鉴定到的蛋白质数量为4795个，蛋白质的分子质量主要集中在10-90kDa，经过分析统计得到肝脏癌变相对于癌旁组织表达存在明显差异的蛋白总共229个，其中上调的蛋白158个，下调的蛋白71个。经过GO分析，这些差异的蛋白大部分是细胞器的组成部分，且大多数都参与了细胞的生物调节、生物转化、新陈代谢和刺激等生物过程。其中的差异蛋白trQ6ZNC2、spO60218AK1BA、trJ3KNB4、sp|Q2TB90|HKDC1在肝脏癌变中表现为明显的升高，很有可能是肝癌相关诊断与病情监测的重要生物标记物。

同时通过应用TiO₂磷酸化肽段富集技术结合液相串联质谱分析共鉴定得到结果为：(1)肝脏癌变组织中鉴定到的蛋白个数807个，发生磷酸化的蛋白724个；鉴定到的总肽段1212条，发生磷酸化的肽段数为1059条，磷酸化位点总数为1359个，其中丝氨酸1223个，苏氨酸131个，酪氨酸5个；(2)癌旁组织中蛋白个数为772个，发生磷酸化的蛋白772个，鉴定得到的总肽段1143条，磷酸化的肽段1020条，磷酸化位点总数为1319个，其中丝氨酸1193个，苏氨酸123个，酪氨酸3个。通过对磷酸化肽段(位点)的统计分析得出：肝脏癌变相对于癌旁组织磷酸化肽段位点差异表达总共87个，其中上调的有56个，下调的有31个。经过GO分析得出，这些表达差异的磷酸化蛋白大部分都参与了细胞的生物调节、生物转化、新陈代谢和刺激等生物过程，可能会与疾病的发生有重要的关系。其中差异表达的磷酸化蛋白Q7Z3D7、A8K5M4、J3QTA6、P51812在肝脏癌变组织细胞中表达明显升高，同样有可能是参与肝癌发生过程的重要物质。

本实施例只是对原发性肝癌患者的一个临床应用相关的初步研究，其检测结果可以作为诊断原发性肝癌患者的中间结果数据，届时再结合其他数据等特征判断为是否是原发性肝癌患者。所检测到的表达上调蛋白和表达差异的磷酸化蛋白对于这部分患者的确切影响仍需进一步验证。此外，该检测结果可以为原发性肝癌患者的治疗及发病机理研究提供理论基础和技术支持，并有望成为肝癌病情诊断和监测的重要生物标记物，如可以对这些差异表达的蛋白或磷酸化蛋白设计检测探针或检测试剂，用于对原发性肝癌患者进行细胞蛋白组的检测，并结合其他诊断指标判断是否为原发性肝癌患者或者是否具有向肝癌发病的趋势。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (5)

1.一种肝癌磷蛋白组学模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤S1，分别提取肝脏癌变组织细胞和相应的癌旁组织细胞的总蛋白，得到两组蛋白样本；

步骤S2，分别对所述两组蛋白样本进行还原烷基化处理，得到两组蛋白样本溶液；所述步骤S2中，采用四乙基溴化铵对提取的两组蛋白样本的沉淀进行还原烷基化处理，得到相应的蛋白样本溶液；

步骤S3，分别向两组蛋白样本溶液中加入胰蛋白酶进行酶解处理，得到两组肽段样本；

步骤S4，将每组肽段样本分成两份，得到两份样本，对其中一份的含有肝脏癌变组织细胞的肽段样本和相应的癌旁组织细胞的肽段样本分别使用不同的标记试剂进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的两组肽段样本混合；对其中另一份的含有肝脏癌变组织细胞的肽段样本和相应的癌旁组织细胞的肽段样本分别富集磷酸化的肽段后，再使用不同的标记试剂进行iTRAQ标记处理，并将标记处理后的两组肽段样本混合；

步骤S5，分别对两份混合后的样本进行强阳离子交换分离处理；所述步骤S5中，所述强阳离子交换分离处理使用岛津LC-20AB液相系统，分离柱为4.6×250mm型号的UltremexSCX柱；

步骤S6，分别对强阳离子交换分离处理后的两份样本进行液相色谱分离，再将液相色谱分离得到的肽段进行串联质谱分析；

步骤S7，使用蛋白质鉴定软件对质谱分析结果进行蛋白质鉴定，根据蛋白质丰度水平，分析得到肝脏癌变组织细胞和相应的癌旁组织细胞的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型；所述步骤S7中，所述蛋白质鉴定软件为Mascot，分析过程中，以IPI human v3.87为数据库进行搜索；所述步骤S7中，在根据蛋白质丰度水平进行分析的过程中，当差异倍数达到1.2倍以上，且经统计假定值p-value小于0.05时，为差异表达蛋白；

所述步骤S6中，进行液相色谱分离时使用岛津LC-20AD型号的纳升液相色谱仪进行标准分离；所述进行串联质谱分析使用串联ESI质谱仪，设置质谱分辨率依次为：一级70000，二级17500，挑选出电荷为2+～5+，峰强度在20000以上的母离子十五个进入二级分析，对肽段使用能量为27+12％的HCD模式进行破碎，碎片在Orbi中检测。

2.如权利要求1所述的肝癌磷蛋白组学模型的构建方法得到差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型。

3.如权利要求2所述的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型，其特征在于，所述差异表达蛋白包括在肝脏癌变细胞中表达上调的trQ6ZNC2、spO60218AK1BA、trJ3KNB4及sp|Q2TB90|HKDC1。

4.如权利要求2所述的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型，其特征在于，所述差异磷酸化表达蛋白包括在肝脏癌变细胞中表达上调的Q7Z3D7、A8K5M4、J3QTA6及P51812。

5.如权利要求2～4所述的差异表达蛋白和差异磷酸化表达蛋白模型在制备诊断肝癌的检测芯片或检测试剂中的应用。