CN108181418B - 一种烟草中磷酸化蛋白质组检测分析方法 - Google Patents

一种烟草中磷酸化蛋白质组检测分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于蛋白检测技术领域，具体涉及一种针对烟草中的磷酸化蛋白质组的检测分析方法。该方法包括：获得烟草中的磷酸化蛋白质组、富集所获得的磷酸化肽段、上样检测分析（Nano液相色谱和质谱检测分析）、分析评价等步骤。由于磷酸化蛋白质对于植物生长的特殊作用与意义，针对此问题，本申请针对烟草中的磷酸化蛋白质组，提供了一种检测分析方法，利用该方法可对烟草中蛋白质变化情况进行研究和分析，进而可为具体功能性蛋白的筛选和确定提供指导方向，同时也可为植物生理研究、植物品质改良奠定理论和应用基础。

Description

一种烟草中磷酸化蛋白质组检测分析方法
技术领域
本发明属于蛋白检测技术领域，具体涉及一种针对烟草中的磷酸化蛋白质组的检测分析方法。
背景技术
近年来基因组方面的研究已经取得了丰硕的成果，诸多模式植物、作物和人类基因组测序已经完成，许多高通量的表达分析技术如芯片技术的广泛应用，让人们更多地了解了细胞内基因的表达变化。然而，蛋白质作为生命活动的执行者，在蛋白质组学水平上揭示生命活动的本质和规律也是当前研究的热点和趋势。
与基因组不同的是，蛋白质的丰度、结构、稳定性、亚细胞定位及与其他生物大分子的相互作用时刻处于动态变化之中，而蛋白质的这些动态变化主要是通过翻译后修饰（Post-translational modification，PTM）来实现的。
蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰中最常见的一种共价修饰方式，是一种广泛的翻译后修饰，同时也是原核和真核生物中最重要的调控修饰形式。蛋白质的磷酸化和去磷酸化是一个可逆过程，受蛋白激酶和磷酸酶的协同作用控制，蛋白质在激酶的作用下将ATP的磷酸基团转移到蛋白质的特定位点，发生磷酸化修饰，又能在磷酸酶的作用下发生去磷酸化。在真核系统中，蛋白磷酸化主要发生在丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）残基上，且丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化的出现比酪氨酸更加频繁。由于蛋白质氨基酸侧链加入了一个带有强负电的磷酸基团，从而改变了蛋白质的构型、活性及与其他分子相互作用的能力。因此磷酸化蛋白质在许多生物效应中起着开/关的作用，是基因表达和蛋白质合成的重要调控者，几乎参与生命活动的所有过程，包括细胞的增殖、发育和分化、细胞凋亡、细胞骨架调控、肌肉收缩、神经活动、新陈代谢以及肿瘤发生等，尤其是在调节细胞信号转导过程中占据极其重要的地位。鉴于蛋白质的磷酸化修饰在生命活动中所具有的重要作用，探索和发现新的磷酸化蛋白、磷酸化位点以及对其功能的调控作用已成为研究人员所关注的热点。
磷酸化蛋白质组学( phosphoproteomics)，是指应用蛋白质组学技术和方法从整体水平观察细胞或组织内所有发生磷酸化修饰的蛋白及其动态变化的一门学科。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术，使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。检测蛋白质的磷酸化需要在两个层面上进行分析。首先是鉴定该蛋白质是磷酸化蛋白，然后确认其磷酸化位点和数目。
在植物中，已经发现蛋白磷酸化过程与组织感应光、病原入侵、激素、温度胁迫和营养缺乏等不同的内外部信号有关。因而就植物中磷酸化蛋白质加强研究，具有十分重要的理论和应用意义。烟草作为植物研究中的一种模式植物，关于烟草中的磷酸化蛋白质研究目前仍然较为缺乏，因而基于已有磷酸化蛋白质组研究方法，对烟草中磷酸化蛋白质进行检测分析，不仅对于烟草品种自身的培育、改良具有十分重要的应用意义，也可为其他植物的磷酸化蛋白质组研究提供较多的理论研究和学术应用的价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种针对烟草中磷酸化蛋白质组的检测分析方法，从而为烟草中蛋白功能解析奠定应用基础。
本申请的技术方案详述如下。
一种烟草中磷酸化蛋白质组检测分析方法，具体包括如下步骤：
（1）以烟草叶片为样品，获得烟草中的磷酸化蛋白质组，可采用TCA-丙酮沉淀法提取磷酸化蛋白质组，具体提取步骤可参考如下操作：
（1.1）将1g烟叶样品在液氮中研磨粉碎后，加入预冷的15% TCA-丙酮和0.2% DDT混合液4mL，-20℃冰箱放置沉淀2h或者沉淀过夜；
（1.2）20000g 离心10min，弃上清，沉淀用用80%丙酮清洗一次（用丙酮清洗时可重复一次确保清洗效果）；
（1.3）将步骤（1.2）中清洗后沉淀物晾干后，加入8mL混合液（其中：4mL tris 饱和酚、4mL SDS抽提液+蛋白酶与磷酸化抑制酶各一片），震荡混匀后温育5min；
（1.4）将步骤（1.3）中体系20000g 离心后，转移上层液体至新的离心管中，加入5倍体积预冷的含100 mM醋酸铵的甲醇溶液，-20℃放置4小时或者过夜；
（1.5）对步骤（1.4）中体系20000g离心 10 分钟，弃上清，沉淀用甲醇清洗一次，再用80%丙酮清洗一次，自然挥干后，用3~4 mL重溶液（蛋白质裂解液，8 M尿素、50 mM碳酸氢铵）震荡重溶；最后20000 r /min、4℃ 离心10 min，取上清液（即蛋白液）-80℃保存备用；
部分试剂的具体配方如下：
SDS抽提液（50mL）：15g蔗糖、1g SDS（十二烷基硫酸钠）、0.771g DDT （二硫苏糖醇）、100 mM tris-HCl；
（2）富集步骤（1）中所获得的磷酸化肽段，具体地：采用Ti4+-MAC法对磷酸化肽段进行富集，富集比例为1:5~20；具体操作可参考如下：
样品用Loading buffer把蛋白样溶解上样吸附30 分钟，离心后用Washingbuffer 1洗三遍，Washing buffer 2洗两遍；离心后取沉淀用Elution buffer 洗脱后，取上清，冻干后即可进行后续的上样分析；
具体地，各buffer配方（各百分数均为质量分数）为：
Loading buffer：80%乙腈，6% 三氟乙酸；
Washing buffer 1：50%乙腈，6%三氟乙酸，200 mM 氯化钠；
Washing buffer 2：30%乙腈，0.1%三氟乙酸；
Elution buffer：10% NH3·H2O；
（3）对步骤（2）中的富集后蛋白质组进行上样检测分析，具体参考过程为：
首先进行Nano液相色谱分离，具体分析参数可参考如下：
上样：3µL，流速：300 nL/min，A相：水（0.1% 甲酸），B相：乙腈（0.1% 甲酸）；
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
其次进行质谱检测分析，具体分析参数可参考如下：
CUR，30.000；GS1，8.000；GS2，0.000；IHT，100.000；ISVF ，2400.000；
质量参数范围：50.0~1500.0；
（4）对步骤（3）中的测定数据进行分析评价，具体为：
根据步骤（3）中所得检测结果，将所得数据在Protein Pilot 软件中进行搜库定性 （磷酸化修饰），取置信度95%，FDR 1% ，与烟草基因组数据库进行比对；即可确定样品中具体的磷酸化蛋白质组信息，并可进行进一步分析。
现有技术中，对于植物生长过程中的蛋白质进行分析时，虽然有一些研究方法，但更多是对于具体蛋白质进行的分析，对于整体蛋白组的研究分析相对较为缺乏。由于磷酸化蛋白质对于植物生长的特殊作用与意义，现有技术中更是缺乏一种较为便捷的研究分析方法的。本申请中，针对烟草中的磷酸化蛋白质组，提供了一种检测分析方法，利用该方法可对烟草中蛋白质变化情况进行研究和分析，进而可为具体功能性蛋白的筛选和确定提供指导方向，同时也可为植物生理研究、植物品质改良奠定理论和应用基础。
附图说明
图1为烟草K326烟叶样品磷酸化蛋白质的 GO 分析图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中涉及部分实验材料、实验试剂及实验设备等情况简要介绍如下。
实验材料：
以烟草K326为实验材料，将烟叶样品剪下后迅速液氮冷冻，-80℃冰箱保存备用；
实验试剂：
蛋白酶抑制剂，磷酸化酶抑制剂（罗氏，美国）
实验设备：
质谱系统 AB SCIEX 5600+ ，美国。
实施例1
本实施例所提供的烟草中磷酸化蛋白质组检测方法，具体包括如下步骤：
（1）以烟草叶片为样品，获得烟草中的磷酸化蛋白质组，具体步骤为：
（1.1）将1g烟叶样品在液氮中研磨粉碎后，加入预冷的15% TCA-丙酮和0.2% DDT混合液4mL，-20℃冰箱放置沉淀2h；
（1.2）20000g、4℃离心10min，弃上清，沉淀用80%丙酮清洗一次（用丙酮清洗时可重复一次确保清洗效果）；
（1.3）将步骤（1.2）中清洗后沉淀物晾干后，加入8mL混合液（其中：4mL tris 饱和酚、4mL SDS抽提液+蛋白酶与磷酸化抑制酶各一片），震荡混匀后37℃温育5min；
（1.4）将步骤（1.3）中体系20000g、4℃离心10 min后，转移上层苯酚相至新的离心管中，加入5倍体积预冷的含100 mM醋酸铵的甲醇溶液，-20℃放置4小时；
（1.5）对步骤（1.4）中体系20000g、4℃离心 10 分钟，弃上清，沉淀用甲醇清洗一次，再用80%丙酮清洗一次，自然挥干后，用4 mL蛋白质裂解液（8 M尿素、50 mM碳酸氢铵）震荡20 min重溶；最后2 0000 r /min、4℃ 离心10 min，取上清液（即蛋白液）-80℃保存备用；进一步地，可使用BCA蛋白质定量试剂盒对所制备蛋白液进行定量。
部分试剂的具体配方如下：
SDS抽提液（50mL）：15g蔗糖、1g SDS（十二烷基硫酸钠）、0.771g DDT （二硫苏糖醇）、100 mM tris-HCl。
（2）富集步骤（1）中所获得的磷酸化肽段，具体地：采用Ti4+-MAC 方法对磷酸化肽段进行富集，富集比例为1:10；具体过程参考如下：
样品用Loading buffer把蛋白样溶解上样吸附30 分钟，离心后用Washingbuffer 1洗三遍，Washing buffer 2洗两遍；离心后取沉淀用Elution buffer 洗脱后，取上清，冻干后即可进行后续的上样分析；
具体地，各buffer配方（各百分数均为质量分数）为：
Loading buffer：80%乙腈，6% TFA；
Washing buffer 1：50%乙腈，6% TFA，200 mM NaCl；
Washing buffer 2：30%乙腈，0.1% TFA；
Elution buffer：10% NH3·H2O。
（3）对步骤（2）中的富集后蛋白质组进行上样检测分析，具体操作可参考如下：
首先进行Nano液相分离，操作参数参考如下：
上样：3µL，流速：300 nL/min，A相：水（0.1%甲酸），B相：乙腈（0.1%甲酸）；
Figure 689308DEST_PATH_IMAGE001
其次进行质谱检测，具体参数参考如下：
CUR，30.000；GS1，8.000；GS2，0.000；IHT，100.000；ISVF ，2400.000；
Mass Range Parameters：50.0 ~1500.0。
（4）对步骤（3）中的测定数据进行分析，具体为：
将质谱数据在Protein Pilot 软件中进行搜库定性 （磷酸化修饰），取置信度95%，FDR 1%，与烟草基因组数据库比对；将搜库后的比对结果文件导入Peakview 软件进行肽段的鉴定、积分；将鉴定出的肽段及积分结果导入Markview 软件峰面积归一化后进行统计学分析。
分析结果表明：在烟草样品K326中共鉴定出7167条磷酸化修饰肽段，其对应2296个蛋白质。图1 即为对这2296个蛋白质的GO分析结果。
进一步统计分析表明：7167条磷酸化肽段中共有7734个磷酸化位点，其中丝氨酸（S）修饰位点有6288个，苏氨酸（T）修饰位点有973个，赖氨酸（K）修饰位点有32个，不同氨基酸残基磷酸化修饰的具体情况列表如下表1所示。
表1，不同氨基酸残基磷酸化修饰情况
Figure 859258DEST_PATH_IMAGE002
。
对7167条磷酸化肽段中磷酸化位点统计结果表明：含4个磷酸化位点的肽段有11条；含3个磷酸化位点的肽段有164条；含2个磷酸化位点的肽段有1035条；含1个磷酸化位点的肽段有5957条。

Claims (1)

1.一种烟草中磷酸化蛋白质组检测分析方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）以烟草叶片为样品，获得烟草中的磷酸化蛋白质组；
（2）富集步骤（1）中所获得的磷酸化肽段，具体地：采用Ti4+-MAC法对磷酸化肽段进行富集，富集比例为1:5~20；
（3）对步骤（2）中的富集后蛋白质组进行上样检测分析，具体地：依次进行Nano液相色谱和质谱检测分析；
（4）对步骤（3）中的测定数据进行分析评价，具体为：
根据步骤（3）中所得检测结果，将结果数据在Protein Pilot 软件中进行搜库定性，确定磷酸化修饰的蛋白，并与烟草基因组数据库进行比对；
步骤（1）中磷酸化蛋白质组的获得，采用TCA-丙酮沉淀法提取，具体提取步骤如下：
（1.1）将1g烟叶样品在液氮中研磨粉碎后，加入预冷的15% TCA-丙酮和0.2% DDT混合液4mL，-20℃冰箱放置沉淀2h或者沉淀过夜；
（1.2）20000g 离心10min，弃上清，沉淀用80%丙酮清洗一次；
（1.3）将步骤（1.2）中清洗后沉淀物晾干后，加入8mL混合液，震荡混匀后温育5min；
（1.4）将步骤（1.3）中体系20000g 离心后，转移上层液体至新的离心管中，加入5倍体积预冷的含100 mM醋酸铵的甲醇溶液，-20℃放置4小时或者过夜；
（1.5）对步骤（1.4）中体系20000g离心 10 分钟，弃上清，沉淀用甲醇清洗一次，再用80%丙酮清洗一次，自然挥干后，用3~4 mL重溶液震荡重溶备用；
步骤（2）中，具体操作步骤为：
将样品用Loading buffer把蛋白样溶解上样吸附30 分钟，离心后用Washing buffer1洗三遍，Washing buffer 2洗两遍；离心后取沉淀用Elution buffer 洗脱后，取上清，冻干；
各buffer配方为：
Loading buffer：80%乙腈，6% 三氟乙酸；
Washing buffer 1：50%乙腈，6%三氟乙酸，200 mM 氯化钠；
Washing buffer 2：30%乙腈，0.1%三氟乙酸；
Elution buffer：10% NH3·H2O；
上述百分数均为体积分数；
步骤（3）中，Nano液相色谱时，具体分析参数为：
上样：3µL，流速：300 nL/min，A相：含0.1%甲酸的水，B相：含0.1%甲酸的乙腈；
Figure DEST_PATH_IMAGE001
质谱检测分析时，具体分析参数如下：
CUR，30.000；GS1，8.000；GS2，0.000；IHT，100.000；ISVF ，2400.000；
质量参数范围：50.0~1500.0。
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