CN103145996A - 一种聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料的合成方法及其应用 - Google Patents
一种聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料的合成方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+的纳米材料的合成和应用。首先,将石墨烯分散到含多巴胺的水溶液中,在磁力搅拌的条件下将三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液快速加入石墨烯分散均匀的多巴胺水溶液中,在室温下磁力搅拌10小时,水洗并离心分离得到在水中分散性好的表面由聚多巴胺修饰的石墨烯纳米材料。然后将该材料分散到100mmol/L的Ti(SO4)2溶液中,室温下磁力搅拌2小时,水洗并离心分离得到聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+的纳米材料。该材料具有如下优点:固定Ti4+方法非常简单;表面修饰一层聚多巴胺,使该材料具有优秀的环境稳定性和生物相容性,并且在水中分散性好;该材料可以固定大量的Ti4+;合成方法简单、成本低,可在MALDI-TOFMS富集磷酸化肽。
Description
技术领域
本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域,具体涉及一种MALDI-TOF MS富集磷酸化肽聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法及其运用。
背景技术
蛋白质的可逆磷酸化是一种非常重要的翻译后修饰,它调节着如细胞信号传导、细胞分化、细胞生长、细胞凋亡等几乎所有的生命活动,也被形象地描述为细胞生理活动的分子开关。因此,对蛋白质磷酸化的研究有助于全面理解蛋白质的各项功能及其机理。现今,蛋白质磷酸化的研究方法是先将蛋白质酶解,而后利用生物质谱对磷酸化肽段的氨基酸序列和磷酸化位点进行准确地鉴定。但磷酸化蛋白质的含量较低,磷酸化肽段的离子化效率较差,且非磷酸化肽段的存在将严重抑制磷酸化肽段的质谱信号,这些原因导致利用质谱直接对磷酸化肽段进行准确分析面临很大困难。因此在质谱分析前需对磷酸化肽段进行选择性富集,而发展新型的富集技术成为当前蛋白组学研究的热点。
为了解决这些问题,很多材料和富集技术被用来富集磷酸化肽。其中固定金属离子吸附色谱 (IMAC) 得到了广泛应用。IMAC是通过亚氨基二乙酸、磷酸基或氨三乙酸的酸螯合配位将金属离子如Ti4+、Fe3+ 等固定在不同的底物如聚合物、介孔材料或纳米材料上。然而进样和洗涤过程中相对较弱的相互作用导致的金属离子损失和严重的非特异性吸附酸性肽大大减少了他们富集磷酸化肽的特异性。为了发现具有生物学意义的磷酸化蛋白或磷酸化肽,发展一种更高选择性和更高灵敏度的富集方法进行磷酸化蛋白质组学的深入分析是很有必要的。磷酸聚合物表明,螯合配体在IMAC性能方面扮演者非常重要的角色,因此,发展IMAC新的螯合配体,对于磷酸化蛋白质组学具有特殊的意义。
多巴胺是3,4-二羟基-L-苯丙氨酸的类似物,它可以粘附在许多无机和有机材料包括贵金属、金属、金属氧化物、云母、石英、陶瓷甚至聚合物上并自组装聚合成聚多巴胺。这种聚多巴胺具有优良的环境稳定性、 良好的生物相容性和特别是在水中的优良分散性。
本发明人之前研究过一种聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+ 的磁性纳米材料的合成和应用,是否可以找到另一种比磁球吸附效果好的材料,成了本发明人对这一领域的更深一步的研究。
从2004年被发现以来,石墨烯引起了广泛的兴趣并成为了许多研究的焦点。它具有特殊的性能如高的比表面积、高热导性和生物相容性,因此,石墨烯具有潜在的应用作为一个单分子传感器、弹道晶体管、透明导电电机和多巴胺的选择性检测。
因此,发展一种以聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料来富集磷酸化肽是一种新的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种表面由聚多巴胺修饰的石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料的合成方法及其在磷酸化蛋白质组学的应用。
本发明提供了一种表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+的合成方法,具体步骤如下:除去产物表面的杂质与多巴胺单体;
(1) 将石墨烯分散到浓硝酸中,50-70 ℃下充分搅拌, 水洗至中性,干燥;
(2) 将步骤 (1)所得的酸化石墨烯分散至多巴胺水溶液中,并使其分散均匀;其中:酸化石墨烯与多巴胺的质量比为1:4。
(3) 在持续磁力搅拌下,在步骤 (2) 所得的产物中快速加入三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液;
(4) 将步骤 (3) 所得溶液在室温下充分搅拌;
(5) 将步骤 (4) 所得的产物用去离子水充分洗涤;
(6) 将步骤 (5) 中所得产物分散到Ti (SO4)2溶液中,室温下磁力搅拌2-3小时;
(7) 将步骤 (6) 所得的产物用去离子水充分洗涤, 并干燥,即得所述纳米材料。
本发明中,步骤 (3) 中所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的浓度为10 mmol/L,pH为8.0-9.0。
本发明中,步骤 (6) 中所述的Ti (SO4)2溶液浓度为100 mmol/L。
本发明在质谱检测中的应用,具体步骤为:将纳米材料分散到200 μL含有磷酸化肽、0.1%体积比三氟乙酸和50%体积比乙腈的离心管中,37 ℃富集30 min,之后用0.1% 体积比三氟乙酸和50%体积比乙腈的缓冲液充分洗涤,并离心分离;然后用5 μL、 0.4 M 氨水洗脱10 min,取0.5 μL洗脱液点靶,进行质谱分析。
本发明中,表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+纳米材料对磷酸化肽段选择性富集的应用。
本发明中,因为石墨烯比表面积很大(比磁球大),这样表面就容易上更多的聚多巴胺,也就可以上更多的Ti4+, Ti4+ 量的多少跟富集磷酸化肽的能力有很大关系,Ti4+ 量越大,富集能力越好。聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+材料富集混合蛋白(β-casein:BSA)比例可以做到1:500,检测限可以做到2fmol。而聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+材料富集混合蛋白(β-casein:BSA)比例可以做到1:1000,检测限可以做到1fmol,聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+材料富集磷酸化肽段的效果更佳。
本发明的有益效果在于:所提供的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料的合成方法简单,处理后的材料具有良好的生物相容性、热稳定性、高敏感度以及在水中的“溶解”性,可选择性富集磷酸化肽。该材料Ti4+ 固定方式简单,具有优秀的环境稳定性和生物相容性,在水中分散性好。其合成方法简单、成本低,在磷酸化蛋白质组学MALDI分析中具有灵敏度高、信噪比高等特点。
附图说明
图1为实施例1的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 扫描电子显微镜照片;
图2为实施例1的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 透射电子显微镜照片;
图3为实施例1的石墨烯 (a) 和聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料 (b) 在水中分散性的照片说明;
图4为实施例2的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料富集β-casein中的磷酸化肽的质谱图;
图5为实施例3的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料富集混合蛋白 (非磷酸化蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein = 1000:1) 中的磷酸化肽的质谱图;
图6为实施例2的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料富集磷酸化肽段检测限 (1 fmol)的质谱图;
图7为实施例4的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料富集人血清中磷酸化肽段的质谱图,其中,*代表磷酸化肽。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明,而不是限制本发明的范围。
实施例1
聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料的合成:
(1) 将石墨烯分散到浓硝酸中,60 ℃搅拌7h, 水洗至中性,并在真空干燥箱中干燥;
(2) 将10 mg酸化石墨烯分散至浓度为1mg/mL的40 mL多巴胺水溶液中,并使其分散均匀;
(3) 在持续磁力搅拌的条件下,在步骤 (2) 所得的产物中快速加入10 mL浓度为10 mmol/L (pH为8.5) 的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液;
(4) 将步骤 (3) 所得溶液在室温下磁力搅拌反应16小时;
(5) 将步骤 (4) 所得的产物用去离子水洗涤三次,除去产物表面的杂质与多巴胺单体;
(6) 将步骤 (5) 中所得产物分散到100 mmol/L的Ti (SO4)2溶液中,室温下磁力搅拌3小时
(7) 将步骤 (6) 所得的产物用去离子水洗涤三次, 并在真空干燥器中干燥,即得所需产品。
所得的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料的扫描电子显微镜照片 (20 KV,飞利浦 XL30电子显微镜,荷兰) 如图1所示,透射电子显微镜照片 (200KV,日本株式会社2011显微镜,日本) 如图2所示,石墨烯 (左) 和聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料 (右) 在水中分散性的照片说明如图3所示(左为石墨烯,右为聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料)。从图3可以看出,本发明合成的的聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料在水中的“溶解性”和分散性好。
实施例2
聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料在富集β-casein中的磷酸化肽的应用:
(1) 试样的准备:β-casein 在25mmol/L NH4HCO3溶液中37 oC酶解16 h。
(2) 富集:10 μL, 2 mg/mL 纳米材料分散到200 μL含有步骤(1)的磷酸化肽的0.1% 体积比TFA50%体积比 ACN离心管中,37℃富集30 min;用0.1% 体积比TFA 和50% 体积比ACN的缓冲液洗涤并磁性分离3次; 5 μL 0.4 M 氨水洗脱10 min。
(3) 质谱分析:取0.5 μL 步骤(2)所得的洗脱液点靶,进行质谱分析,质谱图如图4所示,图6是聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料富集β-casein中的磷酸化肽段检测限 (1 fmol) 。
实施例3
聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料在富集混合蛋白中的磷酸化肽的应用
(1) 试样的准备:牛血清白蛋白 (BSA) 先用二硫苏糖醇和碘乙酰胺还原烷基化,然后在37 oC酶解16 h。β-casein 在25mM NH4HCO3溶液中37 oC酶解16 h。将牛血清白蛋白 (BSA)和β-casein 以摩尔比1000:1加到含有0.1% TFA 50% ACN离心管中。
(2) 富集:10 μL, 2 mg/mL 实施例1所得的纳米材料分散到200 μL含有步骤 (1) 的磷酸化肽的0.1% 体积比TFA 50% 体积比ACN离心管中,37℃富集30min;用0.1% 体积比TFA 和50% 体积比ACN的缓冲液洗涤并磁性分离3次; 5 μL 0.4 M 氨水洗脱10 min。
(3) 质谱分析:取0.5 μL 步骤(2)所得的洗脱液点靶,进行质谱分析,图5是聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料富集混合蛋白 (非磷酸蛋白BSA:磷酸化蛋白β-casein = 1000:1) 中的磷酸化肽的质谱图。
从实施例2和3可以看出,因为石墨烯比表面积很大(比磁球大),这样表面就容易上更多的聚多巴胺,也就可以上更多的Ti4+, Ti4+ 量的多少跟富集磷酸化肽的能力有很大关系,Ti4+ 量越大,富集能力越好。聚多巴胺修饰磁球并在表面固定Ti4+材料富集混合蛋白(β-casein:BSA)比例可以做到1:500,检测限可以做到2fmol。而聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+材料富集混合蛋白(β-casein:BSA)比例可以做到1:1000,检测限可以做到1fmol,聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+材料富集磷酸化肽段的效果更佳。
实施例4
聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料在富集人血清中的磷酸化肽的应用
(1) 试样的准备:人血清用去离子水稀释10倍。
(2) 富集:10 μL, 2 mg/mL 纳米材料分散到200 μL含有步骤(1)的磷酸化肽的0.1% 体积比TFA50% 体积比ACN离心管中,37℃富集30min;用0.1% 体积比TFA 和50% 体积比ACN的缓冲液洗涤并离心分离3次; 5 μL 0.4 M 氨水洗脱10 min。
(3) 质谱分析:取0.5 μL 步骤(2)所得的洗脱液点靶,进行质谱分析,质谱图如图7所示。
实施例5
聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料的合成:
(1) 将石墨烯分散到浓硝酸中,50 ℃搅拌9h, 水洗至中性,并在真空干燥箱中干燥;
(2) 将20 mg酸化石墨烯分散至浓度为2mg/mL的40 mL多巴胺水溶液中,并使其分散均匀;
(3) 在持续磁力搅拌的条件下,在步骤 (2) 所得的产物中快速加入20 mL浓度为10 mmol/L (pH为9) 的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液;
(4) 将步骤 (3) 所得溶液在室温下磁力搅拌反应10小时;
(5) 将步骤 (4) 所得的产物用去离子水洗涤三次,除去产物表面的杂质与多巴胺单体;
(6) 将步骤 (5) 中所得产物分散到100 mmol/L的Ti (SO4)2溶液中,室温下磁力搅拌2小时
(7) 将步骤 (6) 所得的产物用去离子水洗涤6次, 并在真空干燥器中干燥,即得所需产品。
实施例6
聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 的纳米材料的合成:
(1) 将石墨烯分散到浓硝酸中,70 ℃搅拌5h, 水洗至中性,并在真空干燥箱中干燥;
(2) 将30 mg酸化石墨烯分散至浓度为3mg/mL的40 mL多巴胺水溶液中,并使其分散均匀;
(3) 在持续磁力搅拌的条件下,在步骤 (2) 所得的产物中快速加入150mL浓度为10 mmol/L (pH为8) 的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液;
(4) 将步骤 (3) 所得溶液在室温下磁力搅拌反应13小时;
(5) 将步骤 (4) 所得的产物用去离子水洗涤三次,除去产物表面的杂质与多巴胺单体;
(6) 将步骤 (5) 中所得产物分散到100 mmol/L的Ti (SO4)2溶液中,室温下磁力搅拌4小时
(7) 将步骤 (6) 所得的产物用去离子水洗涤10次, 并在真空干燥器中干燥,即得所需产品。
Claims (5)
1.一种表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料的合成方法,其特征在于具体步骤如下:
(1) 将石墨烯分散到浓硝酸中,50-70 ℃下充分搅拌, 水洗至中性,干燥;
(2) 将步骤(1)所得的酸化石墨烯分散至多巴胺水溶液中,并使其分散均匀;其中:酸化石墨烯与多巴胺的质量比为1:4;
(3) 在持续磁力搅拌下,在步骤 (2) 所得的产物中快速加入三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液;
(4) 将步骤 (3) 所得溶液在室温下充分搅拌;
(5) 将步骤 (4) 所得的产物用去离子水充分洗涤;
(6) 将步骤 (5) 中所得产物分散到Ti (SO4)2溶液中,室温下充分搅拌;
(7) 将步骤 (6) 所得的产物用去离子水充分洗涤,干燥,即得所述纳米材料。
2.根据权利要求1所述的一种表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法,其特征在于步骤 (3) 中所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液的浓度为10 mmol/L,pH为8.0-9.0。
3.根据权利要求1所述的一种表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+纳米材料的合成方法,其特征在于步骤 (6) 中所述的Ti (SO4)2溶液浓度为100 mmol/L。
4.一种如权利要求1所述合成方法得到的表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料在质谱检测中的应用,其特征在于具体步骤为:将纳米材料分散到200 μL含有磷酸化肽、0.1%体积比三氟乙酸和50%体积比乙腈的离心管中,37 ℃富集30 min,之后用0.1% 体积比三氟乙酸和50%体积比乙腈的缓冲液充分洗涤,并离心分离;然后用5 μL、 0.4 M 氨水洗脱10 min,取0.5 μL洗脱液点靶,进行质谱分析。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述表面由聚多巴胺修饰石墨烯并在表面固定Ti4+ 纳米材料对磷酸化肽段选择性富集的应用。
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