CN105536748A - 一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，将纳米复合材料配置成为分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入50%乙腈/0.1%三氟乙酸缓冲液中混合，在酶解仪中孵育；通过离心分离纳米复合材料，结合MALDI-TOF？MS质谱分析。该纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，被富集肽段信噪比放大倍数高，具有较好的选择性和高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的内源性磷酸化肽的检测。

Description

一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法
技术领域
本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，特别是涉及一种石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料结合MALDI-TOFMS用于磷酸化肽富集与检测的方法。?
技术背景
蛋白质或多肽的磷酸化是生命过程中最为普遍的翻译后修饰之一。它与细胞分裂、增殖、分化、迁移和细胞间信号传递等许多重要的复杂生物过程息息相关。内源性的磷酸化肽段指的是生物样品中天然含有的那些经过磷酸化修饰的肽段。一些研究表明，内源性的磷酸化肽段的表达水平与很多疾病关系密切，尤其是癌症等人类重大疾病。所以对内源性磷酸化肽的研究对疾病的早期诊断有着重要的意义。质谱分析是目前多肽组学所采用的主要分析手段。但内源性磷酸化肽的丰度往往非常低，并且内源性磷酸化肽段的质谱响应会受到非磷酸化肽和蛋白质的压制，样品中的盐分和表面活性剂同样也会对其质谱行为产生干扰，使得内源性磷酸化肽的电离效率非常低，质谱检测相对较为困难。因此在使用质谱方法分析复杂生物样品中的内源性磷酸化肽段之前，对样品中的内源性磷酸化肽段进行选择性富集是十分必要的。
随着近年来研究的不断深入，许多方法都被用来选择性分离富集磷酸化蛋白和多肽，比如免疫沉淀法、固相萃取法、超滤法、强阳离子交换色谱法、固定金属离子亲和层析法（IMAC）、金属氧化物亲和层析法（MOAC）等等。其中MOAC方法应用最为广泛，效果也较好。通过金属氧化物中金属中心与磷酸化多肽上的磷酸基团间发生配位相互作用，从而起到富集磷酸化多肽的效果。传统的MOAC方法操作简便、快速、成本低廉，并且相比于IMAC方法，选择性好、非磷酸化肽段干扰少。因此，许多MOAC材料被制备出来，广泛应用于磷酸化肽段的富集中。但是传统MOAC方法由于在富集前需要先对生物样品进行酶解，将所有蛋白质酶切为肽段后再进行富集和质谱分析。这个步骤不但会影响内源性磷酸化肽和非内源性磷酸化肽段的磷酸化水平，更会极大的增加数据分析的难度，使后续的数据处理步骤变得繁琐而困难。
介孔材料由于有着狭窄而有序的孔道、非常高的比表面积、连续可调的孔径等优点而被人们广泛关注，近年来发展迅速。由于介孔材料具有狭窄且十分有序的孔道，可以使体积较小的肽段钻入孔道，而将体积较大的蛋白质阻挡在材料外部，来实现对肽段的富集。这可以避免酶切步骤，从而大大降低了因为样品前处理步骤所引入的对样品复杂程度的影响。本发明首次合成了结合传统MOAC材料和介孔材料优点的纳米复合材料，并应用于内源性磷酸化肽段的分离富集。由于介孔二氧化硅良好的体积排阻效应和石墨烯高的表面积以及二氧化钛与磷酸基团间的亲和作用，使得该纳米复合材料可以对复杂生物样品中的内源性磷酸化肽段进行选择性富集，大大提高了磷酸化肽段的质谱信号。对磷酸化肽段的检测限可达5amol/μL，对非磷酸化肽段的选择性达1:1000（质量比），与磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的体积排阻效应达1:500:500（质量比）。
本发明所涉及的具有介孔结构的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料，合成方法简单快速，二氧化钛微球对磷酸化肽具有高灵敏度和高选择性，石墨烯提高了有效表面，介孔二氧化硅层赋予了材料较好的体积排阻效应。此纳米复合材料可用于选择性地富集生物样品中的低丰度的磷酸化肽和内源性磷酸化肽，并用于MALDI-TOFMS检测。
发明内容
本发明目的在于提供一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法。
本发明提出的一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，具体步骤为：将纳米复合材料配置成为10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入到由体积比为50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液中混合，在酶解仪中孵育30分钟；通过离心分离纳米复合材料，用体积比50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液洗涤，随后用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液直接在MALDI-TOFMS进样靶板上点靶，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，进行质谱分析；
其中，所述的纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料。
本发明中，纳米复合材料的具体制备步骤如下：
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在60℃条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（2）配置三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液，溶剂为体积比为1：2的去离子水和乙醇，将步骤（1）所得的酸性石墨烯分散于缓冲液中，超声数分钟，加入多巴胺盐酸盐，在室温下机械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（3）在异丙醇中分散步骤（2）所得产物，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺和异丙醇钛，搅拌均匀，反应温度为180-220℃，反应时间为17-24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60℃下真空干燥，得到二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯；
（4）将步骤（3）所得产物在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物分散在十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）去离子水溶液中，超声数分钟后，加入氢氧化钠去离子水溶液和去离子水，超声数分钟，于60℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯（TEOS）与乙醇混合液，在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；
（5）步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时两次；
（6）步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥。
本发明中，步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（1-3）g：（30-70）ml，更进一步，步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为2g：50ml。
本发明中，步骤（2）中三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为8.5。
本发明中，步骤（2）中石墨烯和多巴胺盐酸盐的质量比为1：4。
本发明中，步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为（40-60）mg：（35-55）ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为（0.02-0.04）：（1.5-2），更进一步，步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为50mg：40ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为0.03：1.8。
本发明中，步骤（3）中反应温度为200℃，反应时间为24小时。
本发明中，步骤（4）中二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：10，乙醇与正硅酸乙酯的体积比为4：1。
本发明的有益效果在于：所提供的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料合成方法简单，比表面积较大，具有良好的体积排阻效应，可祛除大体积蛋白并使小分子肽段进入孔道，孔道底部的二氧化钛可同磷酸化肽段上带负电的磷酸基团发生配位作用，特异性富集内源性磷酸化肽段，对磷酸化肽段和内源性磷酸化肽具有较高的选择性、灵敏度和吸附作用，可用作磷酸化肽的固相微萃取吸附富集分离介质。本发明所提供的材料对磷酸化肽段的检测限达到5amol/μL，对非磷酸化肽段的选择性达1:1000（质量比），对磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白的体积排阻效应达1:500:500（质量比）。本方法操作简单，成本低廉，灵敏迅速，可结合MALDI-TOFMS对富集物进行质谱鉴定。被富集肽段信噪比放大倍数高，具有较好的选择性和高灵敏度，十分适用于复杂生物样品中的内源性磷酸化肽的检测。
附图说明
图1为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的透射电子显微镜照片，其中a)为100nm的照片，b）为50nm的照片；
图2为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的扫描电子显微镜照片,其中a)为10μm的照片，b）为10μm的照片；
图3为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的能量色散X射线光谱；
图4为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的X射线衍射图样；
图5为实施例1的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的氮吸附曲线；右边的小图：孔径分布曲线；
图6为实施例2中2mg/mL的β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料a)为富集前原液的质谱图，b)为富集后洗脱液的质谱图；
图7为实施例2中β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后质谱图，a)为0.1fmol/μLβ-Casein酶解液富集后的质谱图;b)为0.01fmol/μLβ-Casein酶解液富集后的质谱图;c)为5amol/μLβ-Casein酶解液富集后的质谱图；
图8为实施例3中质量比为1:1000的β-Casein和BSA酶解液的混合溶液a)富集前的质谱图；b)经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后质谱图；
图9为实施例4中质量比为1:500:500的β-Casein酶解液和磷酸化蛋白α-Casein和非磷酸化蛋白BSA混合溶液，a)为原液质谱图;b)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后上清液质谱图;c)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后洗脱液质谱图，附图为蛋白情况；
图10为实施例5中未经过酶解处理的健康人血清a)为原液质谱图，b)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后上清液质谱图，c)为经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后洗脱液质谱图。
具体实施方式
下面的实施实例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：一种石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的合成。
（1）用浓硝酸对石墨烯进行酸化，1g石墨烯分散于40mL浓硝酸中，在60℃条件下反应7小时；随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（2）配置三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液（溶剂为去离子水和乙醇，体积比1:2，pH=8.5），将步骤（1）所获酸化石墨烯10mg分散于30mL缓冲液中，超声10分钟，加入15mL溶解有40mg多巴胺盐酸盐的水溶液，在室温下机械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（3）在40mL异丙醇中分散步骤（2）所得产物50mg，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺0.03mL和异丙醇钛1.8mL，搅拌均匀，200℃加热24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60℃下真空干燥；
（4）将步骤（3）所得产品在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物50mg分散在50mL含有500mg十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的溶液中（溶剂为去离子水），超声30分钟后，加入50mL0.01M的氢氧化钠溶液（溶剂为去离子水）和400mL去离子水，再超声10分钟，于60℃水浴条件下，加入2.5mL的正硅酸乙酯（TEOS）与乙醇混合液（体积比为1:4），继续在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；
（5）步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时，回流两次；
（6）步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥。
图1为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的透射电子显微镜照片；透射电镜型号为JEM-2100F(J0EL)，将纯化后的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的乙醇分散液滴在覆有碳膜的铜网上，干燥后进行透射电子显微镜观察并拍照。其中a)为100nm的照片，b）为50nm的照片，证明材料表面成功包覆了介孔二氧化硅层。
图2为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的扫描电子显微镜照片；扫描电镜型号为PhilipsXL30，将纯化后的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料均匀涂抹在导电胶上，喷金后进行SEM表征。其中a)为10μm的照片，b）为10μm的照片，表征了材料形貌，证明二氧化钛微球成功地修饰在了聚多巴胺包覆的石墨烯表面。
图3为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的能量色散X射线光谱。
表1石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料元素分布表
原子序数 元素符号 元素名称 质量浓度 误差
22 Ti 钛 46.7 0.1
14 Si 硅 13.9 0.0
6 C 碳 4.1 1.0
8 O 氧 31.1 0.5
7 N 氮 4.2 0.5
证明了材料中含有C、N、O、Si和Ti元素。
图4为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的X射线衍射图样；X射线衍射仪型号为BrukerD4X-raydiffractometer。证明了合成步骤可以保持石墨烯和二氧化钛微球的晶型与形态。
图5为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的氮吸附曲线；右边的小图：孔径分布曲线。证明了材料存在介孔结构，孔径约为3.01nm。
实施例2：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于低浓度β-Casein酶解液的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取2mgβ-Casein标准蛋白，用25mM碳酸氢铵溶液配成浓度为2mg/mL的标准蛋白溶液，pH大约为8.0，煮沸十分钟。按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可得到2mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液。在0.6mL的离心管内加入1μL的2mg/mL的β-Casein酶解液和179μL的体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液，混匀后加入20μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10μL的0.4mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的磷酸化肽并与富集前的原液质谱图作对比。
浓度为417fmol/μL的β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，质谱图中出现了六条归属于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1031.44，m/z=1279.04，m/z=1562.14，m/z=2061.81，m/z=2556.05，m/z=3122.18），四条去磷酸化峰（m/z=1963.88，m/z=2458.01，m/s=2927.29，m/z=3024.24）以及一条来源于α-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1466.59）。当浓度为5amol/μL的β-Casein酶解液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，质谱图中出现了三条归属于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=2061.98，m/z=2556.22，m/z=3122.37）以及一条去磷酸化峰（m/z=2465.18）。
实施例3：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于β-Casein酶解液和牛血清白蛋白（BSA）酶解液的混合溶液的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取2mg标准蛋白β-Casein和5mg标准蛋白BSA，用25mM碳酸氢铵溶液配成浓度为2mg/mL和5mg/mL的标准蛋白溶液，pH大约为8.0，煮沸10分钟。按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可得到2mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液和5mg/mL的BSA酶解液。
（2）样品的富集：先加入1μL的2mg/mL的β-Casein酶解液后，分别按照β-Casein和BSA的质量比为1:100、1:500和1:1000加入BSA酶解液，随后加入相应体积的体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液使体系配成总体积为180μL的体系，然后用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液，在上述体系中分别加入20μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10μL的0.4mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的磷酸化肽并与富集前的原液质谱图作对比。
质量比为1:1000的β-Casein和BSA的酶解液混合液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，从质谱图中可以清楚地看到五条来源于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1279.06，m/z=1562.17，m/z=2061.93，m/z=2556.29，m/z=3122.61），四条去磷酸化峰（m/z=1952.04，m/z=2433.23，m/s=2927.61，m/z=3024.61）。
实施例4：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于β-Casein酶解液、α-Casein蛋白和牛血清白蛋白（BSA）的混合溶液的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取2mg的β-Casein标准蛋白，用25mM碳酸氢铵溶液配成浓度为2mg/mL的标准蛋白溶液，pH大约为8.0，煮沸十分钟。按照质量比为1:40的胰蛋白酶与标准蛋白的比例，加入胰蛋白酶(trypsin)，37°C孵育15小时，可得到2mg/mL的β-Casein胰蛋白酶解液。
（2）样品的富集：用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液。用高纯水配制5mg/mL的α-Casein和BSA蛋白溶液。在0.6mL的离心管内加入1μL的2mg/mL的β-Casein酶解液，按照β-Casein、α-Casein和BSA的质量比为1:100:100、1:300:300和1:500:500的比例加入相应的α-Casein和BSA溶液，并用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液补全体积到180μL，混匀后加入20μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10μL的0.4mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的磷酸化肽并与富集前的原液和富集后的上清液的质谱图作对比。
质量比为1:500:500的β-Casein、α-Casein和BSA的混合液经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，从质谱图中可以清楚地看到四条来源于β-Casein的磷酸化肽段的峰（m/z=1035.55，m/z=2061.93，m/z=2556.29，m/z=3122.61），三条去磷酸化峰（m/z=1962.21，m/s=2927.61，m/z=3025.53）。
实施例5：将实施例1得到的石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质用于健康人血清样品中内源性磷酸化肽的富集与MALDI-TOFMS检测。
（1）样品准备：用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液稀释健康人血清样品十倍。用体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液配制10mg/mL石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料的溶液。
（2）样品的富集：在0.6mL的离心管内加入10μL的稀释过的健康人血清，加入170μL的体积分数为50%乙腈和0.1%TFA的水溶液，混匀后加入20μL的材料溶液，在37°C下震荡富集30分钟；离心分离材料，吸去上清液，用50%乙腈0.1%TFA溶液洗涤材料三遍，然后加入10μL的0.4mol/L的氨水，37℃震荡洗脱30分钟，离心分离材料,吸出洗脱液备后用。
（3）点靶：取1μL步骤（2）所述的洗脱液点到MALDI-TOFMS进样靶板上，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸（DHB）溶液于该液滴上，形成基质结晶，干燥后再进行质谱分析。
（4）质谱分析以石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料作为固相微萃取吸附分离介质富集得到的内源性磷酸化肽并与富集前的原液和富集后的上清液的质谱图作对比。
健康人血清富集前，由于受到严重的烦扰，无法看到内源性磷酸化肽的质谱峰，而经过石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料富集后，质谱图中可以看到四条健康人血清中的内源性磷酸化肽的峰（m/z=1389.41，m/z=1460.55，m/z=1545.52，m/z=1616.56）。

Claims (10)

1.一种纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于具体步骤为：将纳米复合材料配置成为10mg/mL的分散液，溶剂为超纯水，将该分散液与磷酸化肽段溶液加入到由体积比为50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液中混合，在酶解仪中孵育30分钟；通过离心分离纳米复合材料，用体积比50%乙腈和0.1%三氟乙酸缓冲液组成的混合液洗涤，随后用0.4M氨水洗脱；取1μL洗脱液直接在MALDI-TOFMS进样靶板上点靶，干燥后再点加1μL浓度为20mg/mL的2，5-二羟基苯甲酸溶液于该液滴上，形成基质结晶，进行质谱分析；
其中，所述的纳米复合材料为石墨烯表面包覆聚多巴胺和二氧化钛微球以及介孔二氧化硅的纳米复合材料。
2.根据权利要求1所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于所述的纳米复合材料具体制备步骤如下：
（１）、用浓硝酸对石墨烯进行酸化，在60℃条件下反应7小时得到酸化石墨烯，随后用去离子水充分洗涤酸化石墨烯，到洗液呈中性为止，在40-60℃下真空干燥；
（２）、配置三羟甲基氨基甲烷缓冲液，溶剂采用体积比为1：2的去离子水和乙醇，将步骤（1）所得的酸化石墨烯分散于缓冲液中，超声10分钟，加入多巴胺盐酸盐，在室温下机械搅拌反应6-20小时，制得聚多巴胺包覆的石墨烯；离心分离产物，用去离子水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥；
（３）、在异丙醇中分散步骤（2）所得产物，超声20分钟，充分分散；加入二乙胺和异丙醇钛，搅拌均匀，反应温度为180-220℃，反应时间为17-24小时，反应结束后，离心分离产物，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤所得产物，在40-60℃下真空干燥，得到二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯；
（４）、将步骤（3）所得产物在400℃下煅烧2小时，随后将煅烧产物分散在十六烷基三甲基溴化铵去离子水溶液中，超声30分钟后，加入氢氧化钠去离子水溶液和去离子水，超声10分钟，于60℃水浴条件下，加入正硅酸乙酯与乙醇混合液，在60℃水浴条件下机械搅拌反应12小时；
（５）、步骤（4）所得产物离心分离后用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，随后用丙酮回流24小时，回流两次；
（６）、步骤（5）所得产物离心分离后，用蒸馏水和无水乙醇充分洗涤，在40-60℃下真空干燥。
3.根据权利要求2所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为（1-3）g：（30-70）ml。
4.根据权利要求３所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（1）中石墨烯和浓硝酸的比为2g：50ml。
5.根据权利要求2所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（2）中三羟甲基氨基甲烷缓冲液的pH值为8.5。
6.根据权利要求2所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（2）中石墨烯和多巴胺盐酸盐的质量比为1：4。
7.根据权利要求2所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为（40-60）mg：（35-55）ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为（0.02-0.04）：（1.5-2）。
8.根据权利要求７所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（3）中聚多巴胺包覆的石墨烯和异丙醇的比为50mg：40ml，二乙胺和异丙醇钛的体积比为0.03：1.8。
9.根据权利要求７所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（3）中所述反应温度为200℃，反应时间为24小时。
10.根据权利要求2所述的纳米复合材料结合质谱鉴定磷酸化肽段的方法，其特征在于步骤（4）中二氧化钛修饰的聚多巴胺包覆的石墨烯与十六烷基三甲基溴化铵的质量比为1：10，乙醇与正硅酸乙酯的体积比为4：1。
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