CN106884156A - 一种靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体为一种靶上修饰二氧化钛纳米薄膜的制备方法及其应用。本发明运用了原子层沉积技术，在不锈钢MALDI靶板上修饰上一层二氧化钛纳米薄膜，该层膜与靶板结合相当牢固。随后，修饰后的靶板被应用于靶上磷酸化肽的纯化和MALDI分析，本发明中的靶板显示出了优异的纯化性能，具有良好的重复性，在纯化磷酸化肽领域具有广阔的应用前景。

Description

一种靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法及其应用
技术领域
本发明属于先进纳米材料与纳米技术领域，具体涉及一种用于富集磷酸化肽的修饰了二氧化钛薄膜的MALDI靶板的制作方法及其应用。
背景技术
蛋白质磷酸化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，参与了许多细胞的生命进程，比如细胞的增殖、分化、凋亡和其他细胞活动。由于异常的磷酸化将导致各种各样的疾病和癌症，因此为了给这些疾病的临床病理学和诊断提供更多的信息，生命系统的磷酸化蛋白质组学已经被人们广泛深入地研究。如今，由于质谱检测的高通量和快速性，大多数磷酸化蛋白质组学的研究都是基于质谱策略而进行的，尤其是MALDI-TOF质谱（全称为基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱）。由于磷酸化肽的低丰度和低的离子化效率，在直接质谱检测时，它们的质谱信号常常会被其它高丰度的非磷酸化蛋白大大抑制。因此，为了增强磷酸化肽的信号强度，许多质谱分析前的磷酸化肽富集策略得到了迅速的发展，主要包括固定金属离子亲和色谱法（IMAC）和金属氧化物亲和色谱法（MOAC）。
MOAC法因其良好的富集选择性应用很广，其中最常用的金属氧化物是二氧化钛，各种形式的二氧化钛和修饰有二氧化钛的材料被合成出来，用于脱靶的磷酸化肽富集。不过这些用材料进行富集后再洗脱进行MALDI分析的方法人工操作繁琐，而且多次的样品转移会导致不可避免的样品损失，使检测限不能达到很低；同时材料与材料间的差异以及多次人工操作带来的误差不利于批量富集分析的重复性，使得高通量富集分析受到限制。为了解决这些问题，许多靶上富集的方法应运而生，其中靶板的修饰方法以在MALDI靶板上修饰二氧化钛材料最为普遍，目前大多数在靶板上固定二氧化钛的方法是采用先将二氧化钛纳米颗粒悬浊液点靶，然后进行烧结的方式等。这些方法的缺点是不能保证每个点的二氧化钛厚度的一致性，即点与点间重复性，且富集材料与靶板结合的牢固程度有限，导致在MALDI的激光解析过程中，材料（尤其当材料有磁性时）可能会随着待测样品同时被激光解析，对离子源造成一定程度的污染。
近年来，原子层沉积技术在表面修饰等领域备受关注，由于自限性的表面化学反应，使其能够制备出厚度精确控制的非常均匀的外层。
本发明中，运用了原子层沉积技术，在不锈钢MALDI靶板上修饰上一层二氧化钛纳米薄膜，该层膜与靶板结合相当牢固。随后，修饰后的靶板被应用于靶上磷酸化肽的富集和MALDI分析，获得了很好的富集效果。
发明内容
本发明的目的在于，运用原子层沉积技术在不锈钢靶板表面修饰上一层结合牢固的二氧化钛纳米薄膜，并将修饰靶板应用于高通量的磷酸化肽的靶上富集和MALDI分析。
本发明提出的一种靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法，包括以下步骤：
（1）将待修饰的靶板清洗干净，自然晾干；
（2）将步骤（1）所得的靶板放入原子层沉积系统，以四（二甲氨基）钛为钛源，去离子水为氧化源，钛源控制在35-50℃的蒸发温度，将靶板交替暴露于四（二甲氨基）钛和去离子水，用高纯氩气作为载气和吹扫气，沉积过程中一次循环包括0.2秒的钛源脉冲，10秒的清洗，0.2秒的去离子水脉冲，10秒的清洗，循环多次，直至在靶板表面镀上厚度40-60nm的二氧化钛纳米薄膜，所得靶板在空气中以室温为起始温度，升温速率1℃／min，升温到400℃后煅烧1h；
（3）用乙醇和水充分清洗步骤（2）所得的靶板；
（4）将步骤（3）所得的靶板自然晾干。
本发明中，步骤（１）中所述的待修饰的靶板为不锈钢靶板。
本发明中，步骤（2）中所镀二氧化钛纳米薄膜的厚度为50nm。
本发明中，步骤（2）中钛源的蒸发温度为40℃。
本发明的靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的应用，包括以下步骤：
（1）将靶板用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液的富集缓冲液冲洗浸渍3-5分钟后晾干；
（2）将目标检测物用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液的富集缓冲液稀释到合适的浓度后，用移液枪移取0.6-0.8 μL点在步骤（1）所得的靶板上；
（3）将步骤（2）所得的靶板置于润湿的有盖盒子中静置孵育10-30分钟；
（4）将步骤（3）所得的靶板用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液的富集缓冲液快速充分淋洗；
（5）将步骤（4）所得的靶板晾干后，点上0.4 μL基质DHB，晾干后用MALDI质谱分析。
本发明中，步骤（5）中的基质DHB为浓度为20 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸含50%乙腈和1%磷酸溶液。
本发明的有益效果在于，用原子层沉积技术制备的二氧化钛纳米薄膜与靶板间的结合非常牢固，不易脱落，可存放时间久，且靶板上点与点之间的重复性好；富集过程简单省时，易于高通量批量处理多个富集过程；样品损失少，富集检测β-casein酶解液的检测限可达到4 fmol/μL。
附图说明
图1为靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法和用于纯化磷酸化肽的流程示意图；
图2为修饰了二氧化钛纳米薄膜的硅片表面的扫描电镜图（A）表面的扫描电镜图；（B）从侧向看薄膜表面的场发射扫描电镜图；
图3为实施例2中不同浓度的β-casein酶解液经过靶板纯化磷酸化肽后得到的MALDI谱图，其中（A）为未经过纯化的β-casein酶解液（400 fmol/μL）直接进行分析的MALDI-TOF质谱图；（B）为经过修饰靶纯化后的β-casein酶解液（400 fmol/μL）的MALDI-TOF质谱图；(C)为经过修饰靶纯化后的β-casein酶解液（4 fmol/μL）的MALDI-TOF质谱图；
图4 为实施例3中摩尔比为1：200的β-casein和BSA蛋白酶解液混合溶液（A）未经过纯化的MALDI-TOF质谱图；（B）经过靶板纯化后的MALDI-TOF质谱图；
图5为实施例4中2 μL人唾液（A）纯化前的MALDI-TOF质谱图；（B）经过靶板纯化后的MALDI-TOF质谱图。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。
实施例1：修饰二氧化钛纳米薄膜的靶板的制备。
（1）将待修饰的MALDI靶板先用无尘纸蘸适量洗洁精初步擦拭干净，然后分别用1%甲酸溶液、乙醇溶液和去离子水超声清洗各10分钟后，用去离子水再次冲洗后晾干；
（2）将步骤（1）所得的靶板放入原子层沉积系统，以四（二甲氨基）钛（TDMAT）和去离子水分别作为钛源和氧化源。在反应腔中，将MALDI靶板交替暴露于TDMAT和去离子水，用高纯氩气作为载气和吹扫气。对于所有的样品，沉积过程中一次循环包括0.2s的TDMAT脉冲，10s的清洗，0.2s的去离子水脉冲，再10s的清洗。通过改变循环次数来获得所需的薄膜厚度。在原子层沉积过程中，TDMAT源控制在40°的蒸发温度。最终在靶板表面镀上一层厚度约50 nm的二氧化钛薄膜，得到的靶板在空气中以室温为起始温度，升温速率1℃／min，升温到400℃后煅烧1h。
（3）用乙醇和水清洗掉步骤（2）所得的靶板上可能带有的杂质，自然晾干靶板，备用。
图1展示了靶板制备和应用的示意图。为了方便表征，用相同的步骤在硅片基底上修饰了二氧化钛薄膜，图2为修饰上二氧化钛纳米薄膜的硅片表面的扫描电镜图。扫描电镜型号为Phenom ProX(荷兰)，将修饰后的硅片粘在导电胶上不喷金，直接进行扫描拍摄。场发射扫描电镜型号为Nova NanoSem 450（FEI公司）。
实施例2：二氧化钛修饰靶板在靶上纯化β-casein酶解液中磷酸化肽的应用。
（1）标准蛋白酶解液的制备：准确称取标准蛋白β-casein和BSA分别溶于25 mM碳酸氢铵缓冲液中，使蛋白浓度为1 mg/mL，煮沸10分钟，冷却后，按照酶与蛋白质量比1：40加入适量的胰蛋白酶（trypsin），37℃下酶解16小时。
（2）靶上纯化磷酸化肽和MALDI分析：将修饰好的靶板用富集缓冲液（含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液）冲洗浸渍1分钟进行活化后晾干。然后将β-casein酶解液用富集缓冲液稀释到合适的浓度后，用移液枪移取0.8 μL点在修饰靶板上。随后将靶板置于润湿的有盖盒子中进行静置孵育过程，时间约10-30分钟。之后用富集缓冲液将靶板快速充分淋洗几遍，冲洗掉未被吸附到靶板上的非磷酸化肽。无需洗脱，靶板晾干后，点上0.4 μL基质DHB（20 mg/mL DHB 于50% 乙腈和1%磷酸），晾干后用MALDI质谱分析。
图3是不同浓度的β-casein酶解液经过靶板纯化磷酸化肽后得到的MALDI谱图。其中标星号（*）的是磷酸化肽峰，标井号（#）的代表去磷酸化片段。纯化前磷酸化肽的信号被大大掩盖，而纯化后磷酸化肽的信号大幅增强，而且检测限能够达到4 fmol。
实施例3：靶上纯化磷酸化肽选择性的考察。
（1）混合蛋白酶解液的配制：配制摩尔比1：200的β-casein和BSA酶解液混合液,用富集缓冲液稀释到合适的浓度后（使β-casein浓度为400 fmol/uL），用于考察靶板纯化磷酸化肽的选择性。
（2）靶上纯化磷酸化肽选择性的考察：将修饰好的靶板用富集缓冲液（含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液）冲洗浸渍1分钟进行活化后晾干。用移液枪移取1 μL混合液点在修饰靶板上，随后将靶板置于润湿的有盖盒子中进行静置孵育过程，时间约10-30分钟。之后用富集缓冲液将靶板快速充分淋洗几遍，冲洗掉未被吸附到靶板上的非磷酸化肽。无需洗脱，靶板晾干后，点上0.4 μL基质DHB（20 mg/mL DHB 于50% 乙腈和1%磷酸），晾干后用MALDI质谱分析。
图4为β-casein和BSA酶解液摩尔比为1：200的样品在纯化前后的MALDI分析谱图。可以看到，尽管在纯化前看不到任何磷酸化肽信号，但是纯化后，磷酸化肽的信号大大增强，在谱图中处于主导地位。
实施例4：修饰靶板应用于人唾液当中内源性磷酸化肽的纯化。
（1）唾液样品的制备：上午9：00-11：00间，饭后1h后，志愿者充分漱口后，采集其唾液约5 mL，置于冰箱-20℃保存。
（2）靶上纯化唾液中的内源性磷酸化肽和MALDI分析：将修饰好的靶板用富集缓冲液（含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液）冲洗浸渍1分钟进行活化后晾干。然后用移液枪移取1 μL唾液样品点在修饰靶板上，干燥后再点1 μL唾液样品于靶板上，以增加上样量。接着将靶板置于润湿的有盖盒子中进行静置孵育过程，时间约10-30分钟。之后用富集缓冲液将靶板快速充分淋洗几遍，冲洗掉未被吸附到靶板上的非磷酸化肽。无需洗脱，靶板晾干后，点上0.4 μL基质DHB（20 mg/mL DHB 于50% 乙腈和1%磷酸），晾干后用MALDI质谱分析。
图5为唾液样品在纯化前后的MALDI分析谱图，纯化前谱图中有大量杂峰，而纯化后非磷酸肽基本都被洗掉了，11条磷酸化肽的峰被成功鉴定到。

Claims (6)

1.一种靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将待修饰的靶板清洗干净，自然晾干；
（2）将步骤（1）所得的靶板放入原子层沉积系统，以四（二甲氨基）钛为钛源，去离子水为氧化源，钛源控制在35-50℃的蒸发温度，将靶板交替暴露于四（二甲氨基）钛和去离子水，用高纯氩气作为载气和吹扫气，沉积过程中一次循环包括0.2秒的钛源脉冲，10秒的清洗，0.2秒的去离子水脉冲，10秒的清洗，循环多次，直至在靶板表面镀上厚度40-60nm的二氧化钛纳米薄膜，所得镀有二氧化钛纳米薄膜的靶板在空气中以室温为起始温度，升温速率1℃／min，升温到400℃后煅烧1h；
（3）用乙醇和水充分清洗步骤（2）所得的靶板；
（4）将步骤（3）所得的靶板自然晾干。
2.根据权利要求1所述的靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法，其特征在于步骤（１）所述的待修饰的靶板为不锈钢靶板。
3.根据权利要求1所述的靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法，其特征在于步骤（2）中所镀二氧化钛纳米薄膜的厚度为50nm。
4.根据权利要求1所述的靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的方法，其特征在于步骤（2）中钛源的蒸发温度为40℃。
5.一种如权利要求1所述制备方法得到的靶板上修饰二氧化钛纳米薄膜的应用，其特征在于包括以下步骤：
（1）将靶板用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液的富集缓冲液冲洗浸渍1-3分钟后晾干；
（2）将目标检测物用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液的富集缓冲液稀释到合适的浓度后，用移液枪移取0.6-0.8 μL点在步骤（1）所得的靶板上；
（3）将步骤（2）所得的靶板置于润湿的有盖盒子中静置孵育10-30分钟；
（4）将步骤（3）所得的靶板用含0.1%三氟乙酸的50%乙腈水溶液的富集缓冲液快速充分淋洗；
（5）将步骤（4）所得的靶板晾干后，点上0.4 μL基质DHB，晾干后用MALDI质谱分析。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于步骤（5）中的基质DHB为浓度为20 mg/mL的2,5-二羟基苯甲酸含50%乙腈和1%磷酸溶液。
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