CN1675739A - 制备生物或其它分子阵列的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
分离混合物中的样品的方法和系统，其是通过转化成气相离子，基于质量/电荷比和/或迁移率进行分离，并收集分离的离子。所述系统(18)包括多元电喷雾离子源(19)用于产生电离的样品流(23)，将其导入线性离子阱(24)用于分离。分离的样品通过聚焦透镜(29)以沉积在底物的点上(14)。
Description
相关申请的交叉参考
本申请根据35U.S.C.119(e)要求2002年6月7日提交的美国临时申请60/387,241的优先权和利益。
技术领域
本发明总体涉及从蛋白或其它分子的混合物中制备分离的生物或其它分子阵列的系统和方法。
背景技术
已知微阵列(Micro arrays)具有带位置限定的试剂靶点的基质，用于进行化学实验。已知的试剂通过本领域已知的打点技术(spotting techniques)沉积。在分析样品的过程中，所述样品与所述阵列反应，并利用各位点上的试剂进行分离化学实验。
各种类型的质谱仪已经用于通过质量(mass)分析鉴定包括蛋白在内的分子。所述分子被电离，随后导入质谱仪中进行质量分析。最近，生化学家已经将质谱仪用于鉴定包括蛋白在内的小分子和大分子，并用于测定包括蛋白在内的分子的分子结构。
在对生物化合物的混合物成分进行质量分析前，通常通过层析技术对所述混合物进行分离。在一些情况下，层析分离的混合物各成分用于产生芯片或阵列。
在蛋白组(proteomics)分析中，目标是定量全套蛋白质(complete proteincomplement)，即蛋白组在细胞中任何给定时间的表达水平。所述蛋白组是独特的，依赖于环境和时间，并具有巨大的动态浓度范围。通过二维电泳或电泳并在阵列上产生多个点不仅麻烦而且较慢。现代分析法例如质谱用于全套蛋白质(protein complement)的分离组分的最后分析。
将离子软着陆(soft-landing)到表面是1977[4]提议的，并在二十年后成功证明[5]。完整的多原子离子在质谱仪中通过质量选择选出，并以低动能(通常为5-10eV)沉积在表面上。SIMS分析用于确定氟化的SAM表面上软着陆样品C3H10Si2O35Cl+的存在。证据显示，具有较大体积的基团的离子比小离子的沉积效率好[6]。有机阳离子[7]和16聚物双链DNA[8](质量大约10kDa)也作为金属团完整的软着陆到表面上[9]。一些情况下，有证据表明表面的分子实体是离子，另一些情况下，表面分子实体是相应的中性分子。甚至还有证据[11]表明完整的病毒可被电离，在真空通过质谱仪并被收集且保持活力。
在阵列中需要不同的分离方法与分子包括蛋白质的储存相结合。
发明内容
在本系统和方法中，样品分子位于蛋白质或其它生化分子中的样品分子被电离，在气相分离形成不同质量的离子，并沉积或软着陆在底物上(用于储存所述离子用于随后的加工或分析中)。更具体地，生物化合物的分子，包括蛋白质和寡核苷酸通过例如电喷雾电离(electrospray ionization)，基质辅助激光解析电离，或其它电离方法而被电离。混合物的电离的分子根据质量，电荷，和迁移率或者这些参数的组合而作为离子或相应的中性物质被分离，然后在底物上分离的位点软着陆以形成阵列。在各位点收集的生物分子随后通过以下技术鉴定并分析：亲合结合或者其它特异性生化方法，以及通过激光辅助技术例如，表面增强拉曼光谱(surface enhanced ramanspectroscopy)(SERS)，荧光，或者基质辅助激光解析/电离(Matrix AssistedLaser Desorption/Ionization)(MALDI)，或其它用于分析的质谱学方法。
本发明的目的是提供改良的系统和方法，用于分离并储存蛋白或其它生化分子离子，作为分离蛋白质或其它生化分子的阵列，所述阵列的模式使得其可被鉴定或进一步反应或接受其它处理。
本发明另一目的是提供一种系统和方法，其中生化化合物的分子被电离，根据其质量和/或迁移率进行分离，并保存为特定分离蛋白质或其它生物分子的微阵列的点以用于随后的分析。具有特定生物活性的点可随后鉴定或分析或用作试剂。
本发明的目的还涉及从已知或未知的化合物制造分子阵列以作为阵列底物。
附图简述
与附图结合，本发明将从以下叙述更清楚地理解：
图1是流程图，显示实现本发明的一个实施方案的各步骤。
图2是实现本发明的质量分析系统的图示。
图3是用于使蛋白质混合物的组分软着陆的质谱仪。
图4使细胞色素c，溶菌酶，以及脱辅基肌红蛋白(apomyoglobin)的混合物的质谱，显示各种带电状态的离子；菱形表示沉积。
图5显示了来自暴露于细胞色素c+9.(图5A)；溶菌酶+11(图5B)和脱辅基肌红蛋白+15(图5C)的表面区域的润洗液的光谱。
图6A和6B显示了含有六-N-乙酰几丁己糖(hexa-N-acetyl chitohexaose)的光谱，以及使用软着陆的溶菌酶对六-N-乙酰几丁己糖进行消化的产物的光谱。
图7A和7B显示用于接收软着陆的离子的转盘(rotable disk)以及驱动机。
图8A显示MALDI-TOF在携带软着陆的溶菌酶的表面上检测到的软着陆的六-N乙酰几丁己糖(hex-N-acetyl chitohexaose)(NAG6)及其裂解产物，四-N乙酰几丁四糖(tetra-N acetyl-chitotetraose)的光谱。
图8B显示MALDI-TOF检测到的表面上的软着陆的溶菌酶的光谱。
图9显示在带有软着陆的胰蛋白酶(trypsim)的表面上检测到的细胞色素C的特征性胰蛋白酶(tryphic)片段的光谱。
图10图示了另一种包含线性离子阱(trap)的装置。
图11A-D图示了利用线性离子阱进行的多源电离(multi-sourceionization)。
图12显示了通过过滤具有特定质量/电荷比的离子进行分离。
图13显示了在时间上分离，其中不同质量/电荷比的离子都通过分析仪。
图14A和14B显示了聚集和随后通过选择性发射进行的分离。
图15A-C显示了聚集和随后通过软着陆进行的分离。
图16显示了聚集和选择性发射以及软着陆的同时操作。
图17显示了基于迁移率分离离子。
图18图示了一种仪器，显示表面上收集的样品通过激光电离，且释放的离子被注入回到质谱仪中用于分析。
图19显示一种仪器，其中蛋白质/肽被捕获，分离，并随后被发射以软着陆到表面，并且在短暂的延迟后，可将它们注入回到该仪器中用于质量分析。
优选实施例
利用生物分子阵列制备微芯片在图1中说明。第一步是对样品混合物溶液10(在其它情况下，可以是固体物质)中所含的蛋白质或生物分子的电离11。所述分子可以通过电喷雾电离(ESI)，基质辅助激光解析电离(MALDI)或其它已知的电离方法进行电离。所述离子随后基于其质量/电荷比和/或其迁移率而被分离12。例如，所述离子可聚集在离子储存装置例如四极离子阱(quadrupole ion trap)(Paul阱，包括已知的变异形式圆柱式离子阱(cylindrical ion trap)[2]和线性离子阱[3])或离子回旋共振(ICR)阱(ioncyclotron resonance(ICR)trap)。在该装置中或使用分离的质量分析仪(例如四极柱式滤质器(quadrupole mass filter)或磁性部分或飞行时间)，储存的离子可基于质量/电荷比分离。其它分离可基于迁移率利用离子漂移装置(iondrift device)或结合两种方法进行。根据其质量/电荷比或其迁移率，分离的离子随后沉积于微芯片或底物13上的各分离点上或位置14上以形成微阵列。为实现此目的，对微芯片或底物以x-y方向16和17进行移动或扫描，并在各点位置停止一段预定的时间，以使得足够数量的生物分子在此定位以形成具有预定密度的点。可选地，气相离子可根据电学性质或磁性定位于固定芯片或底物表面上的不同点。所述分子优选定位于表面并保持其结构，即它们是软着陆的。两个事实表明很可能避免着陆时的解离或变性。首先，大离子与小离子相比较不可能解离或发生异构化(变性)，这是由于它们速度较低且具有更大数量级的自由度，且第二，已有证据表明，可实现轻柔沉积(gentle deposition)(Feng，B，et al.，J.Am.Cllem.Soc.121(1999)8961-8962)。适宜软着陆的表面是化学惰性表面，其有效地去除着陆过程中的震动能量，但可进行光谱鉴定。促进中和，再水合，或具有其它特殊特性的表面也可用于蛋白质的软着陆。
如上简述，质谱仪可用于根据离子的质量/电荷比分离样品离子。根据本发明的系统18在图2中显示。将所述样品加样于多元电喷雾离子源19[1]。离开纳流喷雾喷嘴(nanospray nozzles)21的生物分子通过加在纳流喷雾喷嘴和部件22之间的电压而被电离。电离的生物分子流23进入单高离子容量的线性离子阱24。所述离子阱包括间隔棒(rod)26，以及末端电极(endelectrode)27和28。已知，可操作离子阱使得离子在阱内聚集，且随后对其进行选择性激发使得它们根据其质量/电荷比离开所述阱。聚集扁平体系统(focusing lens assembly)29将发出的生物分子离子集中到微芯片13上的点14。扁平体系统可控制离子速度，并从而控制软着陆的着陆能量。如本文详述，其它类型的质谱仪或分析仪可用于分离并将生物分子离子沉积在微芯片上。多元电离喷雾缩短了使足量的离子聚集以形成具有理想质量的点所需的时间。
一个实施例中，蛋白质和生物分子用线性四极柱式滤质器软着陆。商品Thermo Finnigan(San Jose，CA)SSQ 710C(图3)，通过加入电喷雾电离(ESI)源进行修饰。所述电离源包含注射器31，其将蛋白质混合物导入毛细管32。将高电压(HV)加在毛细管32和电离小室(未显示)之间用于进行电喷雾电离。各种小室(未显示)和装置的元件以及其压力在图3中显示并确定。在最后一个真空小室中，装备了微阵列板13用于进行x-y方向的运动。x-y微阵列板驱动器未显示，这是由于其结构是本领域熟练技术人员已知的。在一个实施例中，在整个试验中采用的流速为0.5μl/min。离子着陆的表面位于检测仪系统后。在离子检测模式中，转换打拿极(conversion dynode)33和倍增器(multiplier)34上的高电压被打开并检测离子，使得可检测整体光谱质量，信号-噪音比以及总质量范围的质量分解能(mass resolution)。在离子着陆模式中，转换打拿极和倍增器上的高电压被关闭，且离子通过检测系统的孔以到达板13的金表面。所述表面接地线，且离子源和表面之间的电压差为0伏特。
为显示使用质谱仪进行的预备分离，对三种蛋白质(细胞色素c，溶菌酶和脱辅基肌红蛋白)进行电喷雾电离(ESI)。使用SSQ-710C(ThermoFinnigan，San Jose，CA)质谱仪分离各离子。纯蛋白质通过离子软着陆收集。在每种情况下，质量选择窗是5质量/电荷单位；质量电荷比单位使用Thomson(Th)报告，其中1Th＝1质量单位/单位电荷[10]。着陆的蛋白通过用甲醇：H2O(v/v)溶液进行润洗进行再溶解。润洗溶液用LCQ Classic(Thermo Finnigan，San Jose，CA)质谱仪检测。
溶液通过混合100uL 0.02mg/mL的细胞色素c(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(1∶1的甲醇l∶H2O(v/v)中)，和200μl0.01mg/mL的溶菌酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(1∶1的甲醇l∶H2O(v/v)中)，和200μl 0.05mg/mL的脱辅基肌红蛋白(Signma-Aldrich，St.Louis，MO)(H2O中)制备。
金底物(20mmx50mm，International Wafer Service)用于离子的软着陆。该底物由具有5mm的铬粘着层和200nm的多晶蒸气沉积金的Si片组成。将其用于离子着陆前，所述底物用2∶1的H2SO4和H2O2清洗，以去离子水和纯乙醇彻底洗涤，然后在150℃干燥。24mm×71mm特氟隆覆层(Teflonmask)(中心具有直径8mm的孔)，用于覆盖金表面使得金表面只有直径8mm的圆形区域暴露于离子流用于各基于质量选择的离子流进行离子软着陆。所述特氟隆覆层也用1∶1MeOH∶H2O(v/v)的清洗，并在用前用在较高的温度干燥。所述表面和覆层固定在支持物上，且暴露的表面与离子光轴的中心对齐。
对于每种蛋白质，使用90分钟的离子软着陆期。在各离子着陆之间，对所述装置进行通风，并移动特氟隆覆层以暴露新鲜表面区域，且将表面支持物重新定位使其与离子光轴的靶区域在一条线上(align)。注射器重新充满蛋白质混合物溶液，并在离子着陆前通过监测检测模式中的光谱质量调节ESI条件。加在注射器尖端的电压可变：-7kV用于细胞色素C，-4.9kV用于溶菌酶，且-5.2kV用于脱辅基肌红蛋白。
图4显示细胞色素c，溶菌酶，和脱辅基肌红蛋白的混合物的ESI质谱。+9电荷状态的细胞色素c的离子(1360Th；化学平均质量)，+11电荷状态的溶菌酶离子(1301Th)，以及+15电荷状态的脱辅基肌红蛋白离子(1131Th)被单独选用于离子软着陆。使用集中在分离离子的质量-电荷比的5Th的质量分离窗。在SSQ 710C(Thermo Finnigan，San Jose，CA)上选择用于三种蛋白质的质量范围如下：1360-1365Th用于细胞色素c；1300.5-1305.5Th用于溶菌酶；和1135-1140Th用于脱辅基肌红蛋白。
软着陆后，所述特氟隆覆层从表面移开，且三个暴露的区域用1∶1甲醇l/H2O(v/v)溶液润洗。各区域用50μl的溶液润洗两次。润洗液用LCQClassic通过回路注射(loop injection)(5ul)进行分析。所述脱辅基肌红蛋白溶液在分析前被酸化。
图5显示了对润洗溶液进行分析的光谱记录。从获自润洗暴露于细胞色素c+9的表面区域的溶液中，观察到对应细胞色素c带电状态+7到+12的离子(图5a)；对应溶菌酶带电状态+8到+10的离子见于用于暴露于溶菌酶+11的表面区域的润洗溶液中(图5b)；且对应脱辅基肌红蛋白带电状态+9到+18的离子5见于用于暴露于脱辅基肌红蛋白+15的表面区域的润洗溶液中(图5c)。
从该实验可得出四个结论：1.通过离子软着陆利用质量选择的离子可可在表面收集蛋白；2.每种润洗溶液只含有被选并着陆于表面的蛋白质，表明所述离子在气相从其它离子或中性样品中很好地分离；3.在润洗溶液中仅观察到分子离子，这表明离子软着陆可保持完整的蛋白分子结构；和4.质谱显示带电状态的分布而不仅是软着陆的具体状态的事实，表明蛋白质在表面着陆时或再溶解(re-solvation)后被中和。
着陆的溶菌酶的生物活性通过使用六-N-乙酰几丁己糖酶作为底物进行测定。使用上述实验条件将[溶菌酶+8H]8+在Au靶上着陆4小时。所述表面用1μM六-N-乙酰几丁己糖溶液(含2mM Na+，pH为7.8)润洗。所述溶液在+38°保温2.5小时并用LCQ装置在阳离子ESI模式分析。原始溶液和消化产物的光谱显示于图6A和6B。
虽然原底物溶液的光谱仅显示存在六-N-乙酰几丁己糖，消化产物的光谱显示四-N-乙酰-几丁四糖和其它N-乙酰-葡糖胺寡聚物(其是来自底物酶消化的裂解产物)的大量sodiated分子离子。从这些实验可得出四个结论：1)通过质量分析仪选出的蛋白离子物质已经通过离子软着陆到所述表面被收集；2)每种润洗溶液仅含有对应所选在表面着陆的离子的蛋白质，表明所述离子在气相从其它离子或中性样品中很好分离；3)在润洗溶液中仅观察到完整分子，表明离子软着陆能保持蛋白分子结构；和4)软着陆的溶菌酶能裂解六-N-乙酰几丁己糖产生四-N-乙酰-几丁四糖，表明该蛋白具有正常酶活性。
为提供软着陆的蛋白保持生物活性的进一步实验证据，两种酶即胰蛋白酶和溶菌酶的混合物，在SSQ-710C(Thermo Finnigan，San Jose，CA)质谱仪中分离，且通过离子软着陆收集纯蛋白。两种空白(blank)样品通过以200Th到210 Th的质量/电荷范围内对离子进行着陆产生，该范围不包含蛋白质离子。所用装置参数与上述实验中的相同。混合溶液通过混合200μL 0.1mg/mL的溶菌酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)(1∶1的MeOH∶H2O(v/v)中)和0.01mg/mL的胰蛋白酶(含1％AcOH的1∶1的MeOH∶H2O中)而制备。
四个10mm×5mm的钢板36安装在可旋转的钢盘37上，所述钢盘具有与步进电机(step motor)39相连的开口38，如图7A和7B所示。检测仪33，34装置于所述盘后并检测通过开口38的离子。
[溶菌酶+8H]8+，[胰蛋白酶+12H]12+离子和两个空白通过改变质量窗并在着陆期间转动所述盘而着陆于四个分离的钢板上。每部分进行3小时。所述装置在沉积之间不通风。着陆的溶菌酶的生物活性通过吸出含有2mMNa+的10μl 1μM的六-N-乙酰几丁己糖溶液，pH7.8加入带有着陆的溶菌酶的板上以及空白板之一上测定。所述系统在37℃保温4小时。持续补充蒸发的溶剂。4小时后，加入2μl 3％的2，5-二羟基苯甲酸(MeOH∶H2O 1∶2中)并蒸发溶剂进行干燥。所述板被转移到Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱仪中，并在低质量范围内将MALDI数据收集在反射场模式(图8A)中，并在高质量范围内将MALDI数据收集在线性模式中(图8B)。低质量MALDI光谱显示底物及其裂解产物的sodiated分子离子。高质量MALDI光谱显示完整酶和酶底物复合物的一价和二价带电离子。
着陆的胰蛋白酶的生物活性通过将10μl 1μM的细胞色素C溶液(10mM的NH4CO3水溶液中)吸出置于带有着陆的胰蛋白酶的板和空白板上进行测定。所述系统在37℃保温4小时。持续补充蒸发的溶剂。4小时后，加入2μl饱和的α-氰基-3-羟基-肉桂酸(含0.1％TFA的ACN∶H2O 1∶2中)并蒸发溶剂进行干燥。所述板被转移到Bruker Reflex III MALDI-TOF质谱仪中，并将MALDI数据收集在反射场模式(图9)中。检测到典型的细胞色素C片段。
在另一实施方案中，线性离子阱可用作软着陆装置的部件。图10显示了软着陆装置。所述装置包括大气压下的离子源例如ESI源。离子通过加热的毛细管通过真空度渐增(inoreasing vacuum)的小室内的离子向导44，46进入第二小室。通过将适当的电压加在电极47和48上并将RF和DC电压加在离子阱棒49的各节段上，在线性离子阱中捕获离子。储存的离子可以放射状发射出用于检测。可选地，可操作离子阱使得将所选质量的离子发射出，并通过离子向导53，经过板54到达微阵列板13。所述板可通过机械闸门系统(mechanical gate valve system)(未显示)插入而无需通风整个装置。
线性四极离子阱与标准Paul离子阱相比，其优点包括增加的离子储存容量，以及轴向和放射状地发射离子的能力。线性离子阱的单位分解能为至少2000 Thomspon(Th)，并具有分离单质量/电荷比的离子并随后进行激发和解离以记录产物离子MS/MS光谱的能力。质量分析使用共振波形法(resonant waveform method)进行。线性阱的质量范围(2000Th或4000Th但可调节到20,000Th)使得能够对大多数目的生物分子进行质量分析和软着陆。
在上述软着陆装置中，离子以轴向导入滤质器rod或离子阱rod。图2显示了适宜的轴向多元电喷雾离子源。所述离子也可反射状地导入线性离子阱。
图11A，11B，11C和11D显示了多元那诺(nano)电喷雾离子源，其具有的各尖端以放射状指向单高离子容量的线性离子阱。选择这种布局是由于那诺喷雾电离非常有效，比更高流速的微电喷雾法(micro-electrospraymethod)有效的多。这些图显示了两种源/分析仪排列，其中在图11A中，所述离子源仅仅是线性离子阱分析仪(离子注入其中)的一部分。在图11B中，所述离子源是分离的装置，但其使用和分析仪相同的rf离子捕获电压进行操作，且其dc势能的设置能够进行轴向捕获。还显示了两种导入离子的方法，一种(图11D)涉及切割电极产生裂缝，并通过所述裂缝喷出电子，而另一种(图11C)涉及在电极之间喷出离子。
描述了对在微阵列不同点的不同质量的软着陆离子操作上述软着陆装置和其他类型的质量分析仪的方法。参考图12(其显示例如图2和3中作为滤质器的装置的棒)的图示。蛋白质混合物的离子56被导入滤质器57。具有选定的质量-电荷比的离子将经过质量过滤并在底物58上软着陆一段时间。随后扫描和加速(stepped)所述滤质设备以及底物位置中的相应运动以使得离子沉积在底物58的限定位置。
离子56随后在时间上被分离，使得离子在不同时间到达并在表面着陆。当进行这一步时，所述底物被移动使得分离的离子沉积于不同位置。可应用旋转盘(spinning disk)，尤其是旋转时间与装置的工作循环匹配时。所述可用装置包括图13所示的飞行时间(time-of-flight)和线性离子迁移率漂流管(linear ion mobility drift tube)59。所述离子也可通过电场或磁场导入固定表面的不同点。
另一实施方案中，即图14，离子56可用单一设备61(其同时作为离子储存装置和质量分析仪)聚集并分离。可用的装置是离子阱(Paul，圆柱离子阱，线性阱，或ICR)。所述离子发生聚集并随后选择性发射离子以进行软着陆，分别显示于图14A和14B。所述离子56可聚集，分离为选定的质量-电荷比的离子，并随后软着陆于底物58上。该过程显示于图15A，15B和15C。离子可同时聚集并着陆。在另一实施例中，如图16所示，各种质量-电荷比的离子持续聚集在离子阱中，同时选定的质量-电荷比的离子可使用SWIFT发射并在底物58上软着陆。
在软着陆装置的另一实施方案中，离子迁移率用作额外的(或可选的)分离参数。如以前，离子通过适宜的电离源例如ESI或MALDI源产生。所述离子随后用横向气流和电场进行气选分离(pneumatic separation)。软着陆装置显示于图17。所述离子以气流62和所加电场63的力的联合力所产生的方向通过气体。离子在时间和空间分离。具有较高迁移率的离子较早到达表面64，而迁移率较低的离子到达表面或表面上的位置较晚。
所述装置可包含所述用于在不同位置分离不同质量的离子并进行软着陆的装置的组合。两种这样的组合包括离子储存(离子阱)加在时间上进行分离(TOF或离子迁移率漂移管)以及离子储存(离子阱)加在空间上进行分离(象限仪(sectors)或离子迁移率分离器)。
理想地，蛋白质的构象和生物活性被保持。可采用组合的方法。一个是保持低沉积能量以避免生物离子在着陆时的解离或转化。这需要在最小化点体积的同时进行。两个事实使得很可能在着陆时避免发生解离：首先，大离子与小离子相比较不可能解离或发生异构化(例如，蛋白质变性)，这是由于其速率较低且具有更高数量级的自由度(能量可分配到其中)；且其次，以前的证据表明可实现轻柔的沉积。另一策略是对使电离的生物分子的不完全去溶剂化形式进行质量选择和软着陆。广泛的水化对于气相生物分子保持其溶液相特性而言是不必要的。水合生物分子离子可通过电喷雾形成并分离，而仍在软着陆时是“湿的”。所述底物表面可以是蛋白质软着陆的“湿”表面，这包括小到单层水分子的表面。可选地，所述表面可以是例如葡聚糖，其中蛋白质通过羟基功能基团稳定。另一策略是在质量分离后和软着陆前立即水化蛋白质。几种类型的质谱仪，包括线性离子阱，使得离子/分子反应包括水合反应得以进行。可能控制水合的水分子数目。更进一步的策略是在分离后但在软着陆前，利用离子/分子或离子/离子反应对质量选择后的离子进行去质子化，以避免不良离子/表面反应或对牺牲衍生基团(随后缺失)进行去质子化。
不同表面很可能较适合或较不适合进行成功的软着陆。例如，可有效消除着陆过程中的振动能的化学惰性表面是适合的。所述表面的形式也决定了何种原位光谱鉴定是可能的。蛋白离子可直接软着陆于适合MALDI的底物上。类似地，在SERS活性表面上软着陆是可能的。原位MALDI和二级离子质谱可使用双向质量分析仪例如线性阱作为离子沉积步骤和沉积物质分析步骤中的质量分析仪来进行。这在图18中举例为图10的软着陆装置。底物上软着陆蛋白的阵列通过激光71激发，并回到线性离子阱72中进行分析。所述装置可用于具有很少修饰的蛋白SID，如图19所述。所述蛋白/肽被捕获，分离，并随后发射出去与表面发生碰撞。短暂的延迟后(如在TOF-表面-TOF装置中)，所述片段被再次注入线性阱进行质量分析。
总之，在本发明的系统和方法中，所述蛋白混合物中的样品分子或其它分子被电离，在气相时作为不同质量的离子分离，并沉积或软着陆于底物上，并储存在那里用于以后的加工或分析。它们可通过其m/z(Th)和/或其迁移率而被收集为带电或中性的，纯的或不纯的样品。在气相分离过程中，待分离的样品可以是分子或分子团的形式。所述样品可软着陆或收集为带电或中性样品(保持或不保持以前的生物活性)。所述分离的样品可收集于离散点的阵列或连续迹线(trace)的表面。它们可以是可移动或固定在表面上的。所述分离样品也可收集于液体中。可采用各种分离机制(其中一些已经描述过)。这些包括过滤(四极质谱仪(quadruple mass spectrometer)，对于其它仪器为选择离子监控模式)，在时间上分离(TOF，Ion trap，IMS，ICR，等)和在空间上分离(sector，IMS，TOF，等)。可分离所述样品并随后进行收集，或者在分离同时收集。本系统和方法也可用于进行小规模的反应：软着陆于小区域内，并随后将第二样品着陆于其上方，或者软着陆于小区域的化学活性表面或软着陆后将试剂加入点阵中的部分或所有收集的物质。
这是一种使用质谱仪而不是层析来进行预备级分离(preparative scaleseparation)的独特方法。其也是可选的方法，其中通过喷射微液滴法(jetmicro-drop)或相关方法人工合成地构建阵列，所述方法中将使得特定化合物(通常是寡核苷酸)沉积于阵列中特定点的试剂混合。软着陆装置的许多潜在重要应用应当显示出来。这些应用包括无需分离纯蛋白甚或无需知晓其结构，而从复合生物混合物创建蛋白(和其它化合物)的微阵列。阵列上这些分离的蛋白可使用标准亲合结合以及其它生物活性或药物活性检测法进行检测。
通常，软着陆提供测定(interrogating)和识别纯化形式的生物分子的新方法，且可能进行储存并随后再进行检测。这些实验利用基于表面的光谱方法(包括拉曼光谱)将导致高度敏感的检测/鉴定，例如活性测定。已知通过质谱学从复合物混合物(例如血清，血浆)分离蛋白与其它方法互不相关，并很可能在分离紧密相关的化合物组(例如糖基化形式的蛋白)的情况下是有利的。软着陆的优点扩展到混合物的较小蛋白组分，尤其是与例如毛细管泳层析(CEC)的层析方法联用时。可预见对重组物和翻译后修饰的蛋白以及的相关物质分析以及高通量实验，包括药物受体扫描。
其它可能的用途包括：a：具有亲合力的非常纯的蛋白与其它试剂的反应可进行，包括酶/底物以及受体/配体反应；b.结合实验：配体/受体鉴定，小分子药物/靶配对鉴定；c.多重修饰形式的蛋白的解析；d.活检物质的有效分析；和e.确定翻译后修饰对蛋白功能的影响。
应用的具体范围和相关方法描述：
制作蛋白芯片的其它方法需要大量高纯度的蛋白并且集中在非常特定的应用上。传统的纯化技术效率较低。具有催化活性蛋白(激酶)的芯片利用标记的结合，其由于个别的表达和纯化步骤很耗时。
目前方法使得用可能的药物对细胞中蛋白的具体相互作用进行鉴定耗时，昂贵，并且困难。软着陆可用来将来自细胞的蛋白单个地沉积在表面上，用药物候选物与表面一同保温，并随后分析各点以确定那种蛋白与可能的药物反应。
软着陆可用于分离大量质量非常相似的蛋白(例如，从氧化的胰岛素中分离胰岛素的糖化形式)，这在传统的层析中是不允许的。作为分离方法，软着陆以质谱学为基础并因此与层析分离不相关(“orthogonal”)。
软着陆可用于制备整个细胞蛋白组的蛋白芯片阵列，并用于在一个实验中同时检验低丰度和高丰度的蛋白。可调节条件(沉积时间)以制备低细胞丰度蛋白的点，所述蛋白来自具有与其细胞丰度类似物等量的细胞(标准化)。
目前的情况是蛋白可纯化到仅约90％纯；问题是，所述90％纯化形式的活性是来自蛋白本身还是其中的污染物。软着陆可用于制备非常纯的蛋白，所述蛋白可用于随后检测活性。
酶可以通过质量选择分离，并固定在阵列表面，使得活性位点可接近。这种阵列可再次用于生物实验。
可能通过软着陆将分析物和试剂同时递送到局限的区域，促进超小范围的反应。实例包括激酶及其底物，RNA配对等的研究。
本发明提供了一种系统和方法，其中蛋白和其它生化分子混合物中的样品分子被电离，在气相时作为不同质量的离子而分离，并沉积或软着陆于底物上，并储存在那里用于以后的加工和分析。更具体地，生物化合物的分子，包括蛋白和寡核苷酸，通过例如电离电喷雾，基质辅助的激光解析电离或其它电离方法而被电离。混合物的电离分子通过质量分析仪根据质量和/或迁移率进行分离，然后软着陆于底物的分离位置上以形成阵列。在各点收集的生物分子可随后被鉴定，并通过以下方法进行分析：亲合力结合或其它生化特异性方法，以及基于激光的技术例如表面强化拉曼光谱(SERS)，荧光，或基质辅助的激光解析/电离(MALDI)分析。它们可能是已知的化合物(例如作为通过质谱分析的结果)，并可在随后的生化实验中用作试剂。
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Claims (29)
1.分离物质样品混合物并收集各样品的方法，包括以下步骤：
将混合物转化为混合物各样品的气相离子，
基于带电样品的质量/电荷比或迁移率分离混合物中各样品，和
收集分离的样品。
2.权利要求1的方法，其中所述样品选自分子或分子簇或原子。
3.权利要求1的方法，其中所述样品作为带电样品收集。
4.权利要求2的方法，其中所述样品作为中性样品收集。
5.权利要求3或4的方法，其中所述收集的样品具有生物活性。
6.权利要求3或4的方法，其中所述收集的样品无生物活性。
7.权利要求1或2的方法，其中所述样品作为离散点的阵列收集在表面上。
8.权利要求1或2的方法，其中所述样品收集为连续的迹线。
9.权利要求2的方法，其中所述收集的样品是可移动的。
10.权利要求2的方法，其中所述收集的样品是固定的。
11.权利要求1或2的方法，其中所述样品收集在液体中。
12.从分子混合物中收集分子的方法，包括以下步骤：
将混合物中的分子转化成气相离子，
根据所述气相离子的质量/电荷比和/或迁移率对其进行分离，和
收集分离的离子。
13.从分子混合物制备分子阵列的方法，包括以下步骤：
将所述混合物转化成气相分子离子，
分离所述分子离子，和
将所述分子离子沉积在表面的不同位置上。
14权利要求13的方法，其中所述不同位置是点。
15.权利要求13的方法，其中所述不同位置沿着迹线。
16.权利要求13的方法，其中所述离子根据其质量/电荷比分离。
17.权利要求13的方法，其中所述分子离子被聚集并随后根据其质量/电荷比分离。
18.权利要求13的方法，其中所述分子离子在分离时聚集。
19.权利要求13的方法，其中所述分子离子根据其迁移率分离。
20.从分子混合物形成分子阵列的系统，其包含：
用于将所述混合物转化成混合物中的分子的气相离子的电离装置，
用于根据其质量/电荷比或迁移率分离所述离子的分离装置，
与所述分离装置有协作关系的表面，和
用于将分离的分子从分离装置导入表面上的装置。
21.权利要求20的系统，其中所述电离装置选自电喷雾电离，基质辅助的激光解析电离，或大气压化学电离。
22.权利要求20的系统，其中所述分离装置选自滤质仪，四极离子阱，线性离子阱，圆柱式离子阱，离子回旋共振阱，飞行时间质谱仪，扇形磁场式质谱仪。
23.权利要求20的系统，其中所述分离装置在时间上分离所述离子。
24.权利要求20的系统，其中所述分离装置在空间上分离所述离子。
25.权利要求20的系统，其中所述分离装置在收集所述离子前分离它们。
26.权利要求20的系统，其中所述分离装置在收集所述离子时分离它们。
27.分离样品混合物，并将所述样品与沉积的样品进行化学反应的方法，包括以下步骤：
将所述混合物中的样品转化成气相离子，
基于其质量/电荷比或离子迁移率分离所述样品，并
将所述样品软着陆于化学活性表面的小区域内。
28.将第一混合物的样品与第二混合物的样品进行配对的方法，其包括以下步骤：
将第一混合物的样品转化成气相离子，
根据预定的质量/电荷比或离子迁移率分离第一混合物的离子，
将所述预定的样品软着陆在表面的分离位置上；
将第二混合物的样品转化成气相离子，
根据预定的质量/电荷比或离子迁移率分离第二混合物的离子，和
将第二混合物的预定样品软着陆在第一混合物的离子的预定位置上。
29.分离生化化合物的分子的方法，包括以下步骤：
将所述化合物转化成该化合物样品的离子，
基于带电离子的质量/电荷比或迁移率分离所述化合物样品，和
如权利要求28的方法将所述样品收集在分离的位置上，其中所述生化化合物是蛋白质。
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2008
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