KR100956058B1 - 자기조립 단분자막의 무(無) 매트릭스 레이저 광탈착이온화 질량 분석 방법 - Google Patents

자기조립 단분자막의 무(無) 매트릭스 레이저 광탈착이온화 질량 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 매트릭스를 사용하지 않고, 기재 표면에 자기조립(Self-Assembly)된 자기조립단분자막(SAM; Self-Assembled Monolayer)을 포함하는 분석대상 시료를 레이저 광탈착 이온화하여 질량 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 무 매트릭스 질량 분석 방법은 고체 매트릭스를 사용하지 않고 양이온을 포함하는 용액으로 간단히 처리하는 것만으로 레이저 조사에 의해 분석대상 시료의 광탈착 이온화가 효과적으로 유도되는 장점이 있으며, 시료의 전처리 과정 중 발생할 수 있는 분석대상 물질의 생화학적, 생리적 변화를 최소화할 수 있으며, 양이온 용액을 이용한 처리가 시료의 전 영역에서 균질하므로 측정 결과의 재현성이 높아 정량적 분석에 적용 가능하고, 2차원 맵핑 분석이 가능한 장점이 있다.
질량 분석, 자기조립단분자막, 무 매트릭스, 레이저 광탈착 이온화

Description

자기조립 단분자막의 무(無) 매트릭스 레이저 광탈착 이온화 질량 분석 방법{Mass Spectrometric Method for Matrix-free Laser Desorption/Ionization of Self-assembled Monolayers}
본 발명은 매트릭스를 사용하지 않고, 자기조립 단분자막을 질량 분석 할 수 있는 방법에 관한 것으로, 상세하게는 양이온 용액을 첨가하여 자기조립단분자막의 레이저 광탈착 이온화를 유발하여 자기조립단분자막의 질량을 분석하는 방법에 관한 것이다.
바이오칩이란 DNA, 단백질, 항체, 당쇄 또는 세포 등의 생체물질들을 유리, 실리콘, 고분자 등의 고체기질 위에 고밀도로 집적화한 생체정보 감지소자를 말한다. 바이오칩은 극미량의 시료를 초고속으로 분석하는데 매우 적절한 기술로 유전자 발현양상, 유전자 결함, 단백질 분포 등의 생물학적 정보를 얻거나 질병의 진단, 생화학적 동정 및 반응속도 또는 정보처리 속도를 높이는 도구로 활용되고 있다. 일 예로, 단백질칩은 특정 단백질과 반응할 수 있는 단백질이나 리간드를 고체 표면에 부착시켜 마이크로어레이 형태로 만든 후, 이들과 특이적으로 결합하는 생 체 분자의 존재 또는 기능을 형광, SPR(Surface Plasmon Resonance) 또는 질량 분석 등의 분석 방법을 통하여 대량으로 신속하게 분석한다.
이러한 바이오칩, 특히 단백질 칩의 분석에 있어 질량분석법은 중요한 역할을 차지한다. 특히, 형광측정법의 경우에 요구되는 표지물질의 부착이 필요없는 무표지 검출 기술이며, 생화학물질의 상호작용을 고감도로 측정하는 SPR 등과는 달리 분자량 정보를 통해 상호작용하고 있는 분석 대상 생화학　물질 혹은　생화학적 반응에 대한 직접적인 정보를 얻을 수 있다는 강력한 장점이 있다.
이러한 질량분석법으로 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption /Ionization)법이 유용하게 사용되고 있다. MALDI법은 분자량이 큰 펩타이드 및 단백질 등의 물질을 매트릭스 분자와 함께 섞어놓은 결정에 UV 레이저 등을 순간적으로 조사하여 생화학 고분자 분석 물질을 기체상태의 이온으로 방출시켜 질량분석기로 분자량을 측정하거나 구조를 분석하는 방법이다. 즉, 생화학 고분자와 같이 비휘발성 시료를 자외선 흡수체인 매트릭스 분자와 분산 희석하여 결정을 만든 후, 강한 펄스형의 UV 레이저를 조사하여 결정으로부터 탈착 이온화를 유도하며, 이때 생성되어 진공 중으로 방출된 시료 분자 이온의 분자량을 측정하거나 탠덤질량분석 기술을 이용하여 구조를 분석하는 것이다. 이러한 질량분석기로는 비행시간 질량분석기(TOF MS; Time of Flight Mass Spectrometer)가 주로 사용된다. MALDI-TOF MS는 펨토몰에서 피코몰 수준의 분석이 가능하고, 기체 이온으로 만들기 어려운 고분자 생화학 물질을 이온화하는 강력한 장점을 지니고 있지만, 시료의 종류에 따라 적절한 매트릭스의 선정, 결정 조건의 최적화 등이 측정 결과에 큰 영향을 미치게 된다. 또한, 매트릭스 결정이 규칙적으로 형성되지 않기 때문에, 소위 핫 스팟(hot spot)에 레이저를 조사하는 경우 질량분석에 필요한 강한 세기의 이온 신호를 얻을 수 있지만, 시료 결정의 또 다른 위치에서는 이온이 잘 생성되지 않는 등 재현적인 측정을 기대하기 어려우며, 이로 인해 정량 분석이 힘들고, 케미칼 맵핑(chemical mapping)과 같은 질량 이미징을 구현하기 어렵다.
이러한 MALDI-TOF MS 방식에 기초를 둔 SELDI-TOF(Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization) 분석법이 단백질칩 분야에서 널리 사용되고 있다. 이 방법은 크로마토그래픽 표면 처리를 한 단백질 마이크로어레이 위에서 직접 시료 단백질의 정제과정을 거친 후, 어레이 표면위에 검출된 표적 단백질을 매트릭스 처리 후 레이저로 광탈착 이온화하여 비행시간 질량분석기(TOF MS)를 이용하여 질량을 분석하는 방식이다. SELDI-TOF MS는 생체 시료를 단백질 칩상에서 특별한 레이블 단계 필요없이 직접 분리, 검출, 분석이 가능한 장점이 있다. 이를 이용한 검출 범위는 1-250kDa, 검출한계는 1 펨토몰이며, 고속 분석이 가능하다.
또 다른 MALDI 질량분석법의 단백질 칩 등에의 적용은, 미국 시카고 대학교의 Mrksich 교수 그룹에 의해 개발된 SAMDI (Self-Assembled Monolayers for MALDI)법이다. 이 SAMDI 방법은 자기조립단분자막(SAMs;Self-Assembled Monolayers) 기술을 기반으로 하여, 자기조립단분자막에 일어나는 생화학적 물질 변화 및 특이적으로 결합된 단백질 등의 생화학적 물질을 MALDI-TOF MS를 이용하여 검출하는 방법이다.
그런데, 상술한 SAMDI-TOF, SELDI-TOF, MALDI-TOF에서의 MALDI법은 고분자 생화학물질을 질량분석하기 위해 매트릭스를 포함하는 용액을 처리하여 매트릭스 층을 만들어 주어야 하며, 검출하고자 하는 분석 대상에 따른 매트릭스 종류의 선별, 도포되는 용액의 조성, 농도 및 결정화 조건 등의 최적화와 같은 복잡한 과정이 수행되어야 한다. 또한, 도포된 매트릭스 용액은 용매의 증발 후 균질하지 않은 결정을 형성하므로, 분석에 필요한 적절한 세기의 이온 신호를 얻기 위해서는 핫 스팟(hot spot)을 찾는 노력이 필요하며, 결정의 불균질성으로 인해 분석 위치에 따라 다른 세기의 이온 신호를 얻게 되므로, 정량 분석이 어려우며, 재현성과 신뢰도 높은 측정 결과를 얻기 힘들며, 더 나아가 케미칼 맵핑(chemical mapping)과 같은 질량 이미징을 구현하기 어렵다.
또한, 이온화 효율이 높은 매트릭스 물질들은 대부분 산성의 성질을 가진다( pH 2.5~5). 이와 더불어 많은 경우, 매트릭스 용액을 만들기 위해 알코올, 아세토니트릴 등의 유기 용매를 함께 사용한다. 이러한 산성의 pH 및 유기용매의 사용은 생화학물질의 생리학적 또는 생화학적 상태에 영향을 미칠 수 있고, 생화학 물질들의 약한 상호작용을 방해할 수 있기 때문에, 결과적으로 적용 가능한 바이오 칩에의 응용을 제한하게 된다.
본 출원인은 수많은 실험과 각고의 노력 끝에 매트릭스를 사용하지 않으면서도, 양이온 용액의 처리만으로 자기조립 단분자막 및 자기조립 단분자막에 고정화된 고분자 유기물, 펩타이드, 탄수화물, 단백질, 핵산 등의 분석시료의 광탈착 이온화가 유도되어 질량 분석이 효과적으로 수행될 수 있음을 발견하여 본 특허를 출원하기에 이르렀다.
상술한 문제점들을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 매트릭스를 사용하지 않고도 자기조립 단분자막의 레이저 광탈착 이온화를 유발하여 자기조립 단분자막의 질량 분석을 가능하게 하는 질량 분석 방법을 제공하는 데 있다.
상세하게는 매트릭스를 사용하지 않고 유기물, 무기물, 생화학물질, 또는 이들의 복합물을 함유하는 자기조립단분자막을 질량 분석할 수 있으며, 광탈착 이온화를 유발하기 위한 시료 전처리가 간단하며, 전처리에 의한 시료의 생화학적 또는 생리적인 영향을 최대한 방지할 수 있으며, 분석대상물의 위치별 검출 강도의 오차가 최소화되어 위치별 검출결과가 균질하며, 정성 분석 및 정량 분석이 가능함과 동시에 2차원 화학적 맵핑 (Chemical Mapping)이 가능하고, 재현성 있는 결과를 얻을 수 있는 질량분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 무(無) 매트릭스 질량 분석방법은 기재 표면에 자기조립(Self-Assembly)된 자기조립 단분자막(SAM; Self-Assembled Monolayer)을 포함하는 분석대상시료에 양이온을 포함하는 양이온 용액을 첨가한 후, 레이저 광탈착 이온화법을 이용하여 상기 자기조립 단분자막의 질량 분석이 수행되는 특징이 있다.
상세하게는 분석대상시료에 첨가된 양이온 용액의 양이온과 자기조립 단분자막이 이온 착물을 형성하며, 자기조립 단분자막의 분자가 레이저광에 의해 광탈착 되어 상기의 자기조립 단분자막으로부터 방출된다. 이렇게 생성된 기체상의 레이저 광탈착 자기조립 단분자막 분자의 양이온 착물을 대상으로 질량 분석이 수행되게 된다. 따라서, 매트릭스를 사용하지 않고도 상기 분석대상시료에 양이온 용액을 첨가하는 단순 처리만으로 효과적인 레이저 광탈착 이온화가 유발되어 상기 분석대상시료에 함유된 자기조립단분자막에 대한 질량 분석이 수행될 수 있는 것이다.
상기 양이온 용액은 알칼리금속 양이온, 알칼리토금속 양이온, 유기 양이온 또는 이들의 혼합 양이온을 함유하는 용액인 특징이 있으며, 양이온 용액에 의한 분석대상시료의 생화학적 상태의 변화를 방지하기 위해, 상기 양이온 용액은 적절한 산도를 갖도록 조절될 수 있으며, 바람직하게 중성으로 조절된다.
상기 양이온 용액에 함유되는 양이온은 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 유기염 또는 이들의 혼합염이 용매에 용해되어 생성된 것이 바람직하다.
상기 양이온 용액에 함유되는 금속 양이온(알칼리금속 양이온, 알칼리토금속 양이온)은 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 또는 이들의 혼합염이 용매에 용해되어 생성된 것이 바람직하다. 상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은 유기금속염 및 무기금속염을 포함한다.
상기 알칼리금속염 또는 알칼리토금속염은 음이온이 요오드이온, 플루오르이온, 염소이온, 브롬이온, 수산화이온, 인산이온, 질산이온, 초산이온, 구연산이온, 타르타르산이온, 황산이온, 탄산이온 및 염소산이온군에서 선택된 염인 것이 바람직하며, 플루오르화염, 염화염, 브롬화염 또는 요오드화염인 것이 더욱 바람직하다.
상기 양이온 용액에 함유되는 유기 양이온은 옥소늄, 암모늄, 4급 암모늄, 아미디늄, 구아니디늄, 피리니디늄, 모르폴리늄, 피롤리도늄, 이미다졸륨, 이미다졸리늄, 트라아졸늄, 설포늄, 포스포늄, 요오도늄 및 카르보늄기로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것이 바람직하다.
효과적인 자기조립 단분자막의 광탈착 이온화 측면에서, 상기 양이온 용액은 금속(알칼리금속 또는 알칼리토금속)염의 음이온이 요오드이온, 플루오르이온, 염소이온, 브롬이온, 수산화이온, 인산이온, 질산이온, 초산이온, 구연산이온, 타르타르산이온, 황산이온, 탄산이온 및 염소산이온군에서 선택된 염이 용해된 것이 바람직하며, 요오드화나트륨, 요오드화칼륨, 요오드화리튬, 요오드화루비듐, 요오드화세슘, 요오드화베릴륨, 요오드화마그네슘, 요오드화칼슘, 요오드화스트론튬, 요오드화바륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화리튬, 염화루비듐, 염화세슘, 염화베릴륨, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화스트론튬, 염화바륨, 브롬화나트륨, 브롬화칼륨, 브롬화리튬, 브롬화루비듐, 브롬화세슘, 브롬화베릴륨, 브롬화마그네슘, 브롬화칼슘, 브롬화스트론튬, 브롬화바륨, 플루오르화나트륨, 플루오르화칼륨, 플루오르화리튬, 플루오르화루비듐, 플루오르화세슘, 플루오르화베릴륨, 플루오르화마그네슘, 플루오르화칼슘, 플루오르화스트론튬, 플루오르화바륨 또는 이들의 혼합물의 용해액인 것이 더욱 바람직하다.
상기 양이온 용액의 제조에 사용될 수 있는 용매는 상기 알칼리금속염, 상기 알칼리토금속염, 옥소늄, 암모늄, 4급 암모늄, 아미디늄, 구아니디늄, 피리니디늄, 모르폴리늄, 피롤리도늄, 이미다졸륨, 이미다졸리늄, 트라아졸늄, 설포늄, 포스포 늄, 요오도늄 및 카르보늄기로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 물질이 용해되는 액(용매)이면 모두 사용가능하나, 양이온 용액의 첨가 단계에서 분석대상시료에 미치는 영향을 최소화하기 위해 물을 용매로 사용하는 것이 바람직하다.
상기 양이온 용액은 함유하는 양이온의 몰농도가 0.0001 mM 내지 1 M인 것이 바람직하며, 0.001 mM 내지 400 mM인 것이 더욱 바람직하다. 양이온의 몰농도가 0.0001 mM 미만인 경우, 레이저 광의 조사시 양이온에 의한 자기조립 단분자막의 광탈착 이온화 정도가 감소될 수 있으며, 몰농도가 1 M을 초과하는 경우, 자기조립 단분자막 표면 위에 염의 석출로 말미암아 재현성 높은 측정에 영향을 줄 수 있는 단점이 있다.
상기 분석대상시료에 상기 양이온 용액을 첨가하는 단계는 상기 분석대상시료를 상기 양이온 용액에 침지하거나, 양이온 용액을 스프레이 등의 분무 방식으로 분석대상시료에 도포하거나, 상기 분석대상시료에 양이온 용액 액적을 떨어뜨려 수행되는 것이 바람직하다.
이때, 질량 분석이 수행되기 전, 질량 분석이 수행되는 장치에 따라 양이온 용액이 첨가된 시료의 건조가 선택적으로 수행될 수 있다. 일 예로, 진공 챔버를 이용하는 경우, 분석대상시료를 챔버 내에 위치시킨 후 챔버 내부를 통상의 진공도로 만드는 과정에서 건조가 동시에 수행되므로 따로 건조 단계가 독립적으로 수행될 필요가 없으나, 상온 상압의 챔버를 이용하는 경우, 질량 분석이 수행되기 전 분석대상시료내의 액상을 휘발시키는 건조 단계가 더 수행될 수 있다. 건조 단계가 수행될 경우, 액상(용매)의 제거는 상온 휘발에 의한 것이 바람직하다. 그러나 상 온 상압의 챔버를 이용하는 경우에도, 건조 단계를 수행하지 않고 습한 상태의 시료를 이용하여 질량 분석을 수행하여도 무방하다. 이때, 레이저 광원으로 펄스형 IR 레이저를 사용하는 것이 더욱 바람직하다.(2.5~3.5μm 또는 700~900 nm 파장 영역)
상기 분석대상시료에 상기 양이온 용액이 첨가된 후, 통상의 질량분석 장치 및 방법을 사용하여 질량 분석이 수행된다. 이는 본 발명의 특징적 장점중 하나로, 매트릭스를 사용하지 않고도 기존 MALDI용 질량분석 장치를 그대로 이용하여도 효과적으로 자기조립단분자막의 질량분석이 수행되게 된다. 상세하게 본 발명의 질량분석은 비행시간 질량분석장치(TOF-MS); MALDI 푸리에 변환 질량분석장치(MALDI FT-MS), MALDI q-TOF장치 및 AP-MALDI 장치를 포함하는 통상의 MALDI를 수행할 수 있는 질량분석장치;를 이용하여 수행되는 특징을 갖는다. 또한 상기 MALDI용 질량분석장치는 진공에서 수행되는 MALDI 질량분석장치 및 낮은 압력(및 대기압)에서 수행되는 MALDI 질량분석장치를 포함한다.
상기 자기조립단분자막이 형성되는 상기 기재는 자기조립단분자막이 형성 가능한 금속, 금속산화물, 반도체, 반도체 산화물, 부도체 또는 비정질 물질이며, 적층형(multilayer, coreshell 구조를 포함함) 또는 단층형일 수 있으며, 판형, 패턴을 갖는 형상, 나노선 또는 나노입자의 형태일 수 있다.
상세하게 기재의 표면을 구성하는 표면 원자와 자발적으로 결합하여 자기조립단분자막이 형성가능한 모든 물질이 사용가능하나 실질적으로 금속인 Au, Ag, Pd, Pt, Cu, Zn, Fe, In 및 이들 금속의 산화물과 Si, Fe2O3, SiO2 또는 ITO glass며, 가장 실질적으로는 Au이다.
레이저 광의 조사에 의해 상기 양이온과 상기 자기조립 단분자막의 이온착물을 효과적으로 생성하기 위해, 상기 자기조립 단분자막은 산소를 함유하는 모이어티(moiety)를 포함하여 구성되는 것이 바람직하다. 상기 산소를 함유하는 모이어티는 에틸렌글리콜 (-O-CH2-CH2-), 카복실산 (-COOH), 알코올 (-OH), 에테르 (-O-), 에스테르 (-COO-), 케톤 (-CO-), 알데히드 (-COH), 아미드 (-NH-CO-) 및 이들의 방향족 치환기 (예를 들어, 페놀,-C6H5-OH)군에서 선택된 것이 바람직하다.
상기 자기조립단분자막은 고분자 유기물, 유기금속화합물, 펩티드, 탄수화물, 단백질, 지질, 대사체, 항원, 항체, 효소, 아미노산, 압타머, 당 또는 핵산이 고정화(결합) 되어 있는 작용기를 포함하여 구성된 특징이 있으며, 이때 상기 작용기에 고정화된 유기금속화합물, 펩티드, 탄수화물, 단백질, 지질, 대사체, 항원, 항체, 효소, 아미노산, 압타머, 당 또는 핵산은 화학적 또는 생화학적 물질에 의한 특이적 반응처리 전의 상태 또는 후의 상태 일 수 있다.
상기 자기조립단분자막은 화학적 또는 생화학적 물질과 특이적으로 반응 또는 결합하는 작용기, 황 반응기, 알칸사슬기 및 에틸렌글리콜 모이어티(moiety)를 포함하여 구성된 특징이 있으며, 상술한 바와 같이 상기 작용기는 화학적 또는 생화학적 물질에 특이적으로 반응한 작용기일 수 있으며, 상기 화학적 또는 생화학적 물질과 특이적으로 결합한 작용기일 수 있다.
상기 자기조립단분자막의 작용기는 알칸기, 알코올기, 카르복실산기, 아민기 및 말레이미드기 군에서 하나 이상 선택되는 기를 포함하여 구성될 수 있다.
상기 자기조립단분자막은 검출대상인 화학적 또는 생화학적 물질과 특이적으로 반응 또는 결합하는 작용기 및 황 반응기를 포함하며, 상기 황에 의해 금 표면(금 기판)에 자기조립된 것이 바람직하다.
상기 자기조립단분자막은 검출대상인 화학적 또는 생화학적 물질과 특이적으로 반응 또는 결합하는 작용기, 황 반응기, 알칸사슬기 및 에틸렌글리콜 모이어티(moiety)를 포함하여 구성되는 것이 바람직하며, 상기 에틸렌글리콜 모이어티(moiety)는 올리고(에틸렌글리콜) 모이어티인 것이 바람직하다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 무 매트릭스 질량 분석 방법을 이용하여 자기조립단분자막 자체에 대한 질량 분석이 가능하며, 자기조립단분자막의 작용기에 고정화된 고분자 유기물, 유기금속화합물, 펩티드, 탄수화물, 단백질, 지질, 대사체, 항원, 항체, 효소, 아미노산, 압타머, 당 또는 핵산의 화학적/생화학적 외부 물질에 대한 반응 여부 및 반응 양상이 분석 가능하며, 자기조립단분자막의 작용기에 특이적으로 결합한 화학적/생화학적 외부 물질에 대한 분석이 가능하다.
이때, 질량 분석에 의한 분석대상시료의 검출은 위치정보(즉, 분석대상시료에 레이저가 조사되는 위치정보) 및 특정한 위치에서의 분석대상시료의 검출 강도를 포함하며, 이에 의해 검출대상인 분석대상시료의 2차원 영역(area) 정보를 얻을 수 있다. 상기 위치별 분석대상시료의 검출 강도는 2차원 이미지로 변환되는 것이 바람직하며, 이때, 위치별 검출 강도에 따라, 색상, 채도, 명도, 또는 이들의 조합 이 조절되는 것이 바람직하다.
본 발명의 질량 분석방법은 매트릭스를 사용하지 않고 중성의 양이온 수용액을 첨가함으로써 레이저 조사에 의한 분석대상 시료의 탈착 이온화가 유도되므로, 시료의 전처리 과정이 간단하며, 측정 결과의 재현성이 높으며, 측정 위치에 따른 측정 결과의 편차가 적으며, 2차원 맵핑 분석이 가능하며, 질량 분석을 위한 시료의 전처리 과정 중 발생하는 분석 대상 물질의 생화학적 결합 변화가 최소화되는 장점이 있다.
또한 본 발명의 질량 분석방법은 매트릭스를 사용하지 않으므로, 측정 오차를 획기적으로 감소시킬 수 있으며, 정확성 및 민감도가 높아 극 미세량의 생화학적 물질을 검출 가능한 장점이 있으며, 매트릭스를 사용하지 않고 중성의 양이온 수용액을 첨가하여 검출대상물질과 특이적으로 반응하거나 결합한 자기조립단분자막의 광탈착이온화를 유발하므로, 측정 및 전처리에 소요되는 시간이 짧고 간단하며 다양한 생화학적 물질에 적용 가능한 장점이 있다.
다음에 소개되는 실시예는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서, 본 발명은 이하 제시되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.
본 발명의 목적은 매트릭스를 사용하지 않고, 양이온 용액 처리에 의해 자기조립단분자막을 질량 분석하는 방법을 제공하는 것이며, 본 발명에 사용되는 자기조립단분자막은 기 공개된 통상의 방법에 따라 제조 가능하므로(일 예로, Jing Li 등, Langmuir (2007), vol. 23, pp. 11826-11835 및 Benjamin 등, Langmuir (2003), vol.19, pp. 1522-1531 에 공지된 기술에 의해 제조 가능하다.), 하기의 실시예에서는 자기조립단분자막의 제조과정에 대한 상세한 기재를 생략한다.
(실시예 1)
양이온 용액의 전처리에 따른 SAM의 질량 분석
NaI(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 Na+ 양이온 수용액을 제조하였다. KI(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 K+ 양이온 수용액을 제조하였다. 제조된 모든 양이온 수용액의 pH는 중성이었다.
Au와 결합되어 작용기로 알코올기를 가지며, 황 반응기, 알칸사슬기 및 에틸렌글리콜 (이하 EG로 표기함) 모이어티를 갖는 자기조립단분자막 Au-S-(CH2)11- (EG)6-OH를 분석대상 시편으로 하여 제조된 Na+ 양이온 수용액 및 K+ 양이온 수용액에 각각 10분 동안 침지시킨 후, 분리 회수하여 실온에서 10분간 건조하였다.
Na+ 양이온 및 K+ 양이온이 각각 첨가된 시편을 매트릭스를 사용하지 않은 상태로 355 nm UV 레이저를 장착한 MALDI-TOF 질량 분석장비 (독일 Bruker-Daltonics 사의 Autoflex III)를 이용하여 질량 분석하였다. 시편에 조사된 레이저 빔은 펄스당 50 ~ 200 μJ 에너지를 가지는 수 나노미터 시간폭의 펄스였다. 질량 분석 스펙트럼은 30 ~ 50 레이저 shots를 이용하여 얻을 수 있으며, 필요에 따라 200 shots 정도까지 스펙트럼을 얻어 평균하였다.
도 1(a)는 Na+ 양이온이 첨가된 시편의 질량분석 결과이며, 도 1(b)는 K+ 양이온이 첨가된 시편의 질량분석 결과이다. 도 1에서 알 수 있듯이 매트릭스를 사용하지 않고 양이온을 함유하는 수용액으로 처리함으로써, 도 1(a)와 같이 (HO-(EG)6-(CH2)11-S-S-(CH2)11-(EG)6-OH) Na+ (질량 957.6amu) 또는 도 1(b)와 같이 (HO-(EG)6-(CH2)11-S-S-(CH2)11-(EG)6-OH) K+ (질량 973.6amu) 디설파이드(disulfide)형의 특징적인 이온 착물로 레이저 광탈착 이온화되어, 효과적으로 자기조립단분자막의 질량분석이 수행됨을 알 수 있다.
(실시예 2)
양이온 용액의 종류에 따른 SAM의 질량 분석
NaI(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 Na+ 양이온 수용액(1)을 제조하였다. NaCl(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 Na+ 양이온 수용액(2)을 제조하였다. KI(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 K+ 양이온 수용액(3)을 제조하였다. KCl (Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 K+ 양이온 수용액(4)을 제조하였다. 제조된 양이온 수용액의 산도는 중성이었다.
실시예1과 동일하게 금 표면에 부착된 자기조립단분자막 Au-S-(CH2)11-(EG)6-OH를 분석대상 시편으로 하여 시편을 제조된 Na+ 양이온 수용액(1), Na+ 양이온 수용액(2), K+ 양이온 수용액(3), K+ 양이온 수용액(4) 에 10분간 각각 침지한 후, 실온의 공기 중에서 10분간 건조하였다.
Na+ 양이온 및 K+ 양이온이 각각 첨가된 시편을, 매트릭스를 사용하지 않고, 355 nm UV 레이저를 장착한 MALDI-TOF 질량 분석장비 (독일 Bruker-Daltonics 사의 Autoflex III)를 이용하여 질량 분석하였다. 시편에 조사된 레이저 빔은 펄스당 50 ~ 200 μJ 에너지를 가지는 수 나노미터 시간폭의 펄스였다. 스펙트럼은 30 ~ 50 레이저 shots를 이용하여 얻을 수 있으며, 필요에 따라 200 shots 정도까지 스펙트럼을 얻어 평균하였다.
도 2(a)는 시편에 Na+ 양이온 수용액(1)을 첨가한 경우, 도 2(b)는 Na+ 양이온 수용액(2)을 첨가한 경우, 도 2(c)는 K+ 양이온 수용액(3)을 첨가한 경우, 도 2(d)는 K+ 양이온 수용액(4)을 첨가한 경우 측정된 결과를 도시한 것이다.
양이온 수용액의 제조를 위해 사용된 염의 종류에 관계없이 Na+ 양이온 수용액(1) 또는 Na+ 양이온 수용액(2)을 첨가한 경우, 질량스펙트럼에서 (HO-(EG)6-(CH2)11-S-S-(CH2)11-(EG)6-OH)Na+ (질량 957.6 amu 및 isotope pattern)의 디설파이드(disulfide)형 이온착물로 레이저 광탈착 이온화됨을 알 수 있으며, K+ 양이온 수용액(3) 또는 K+ 양이온 수용액(4)을 첨가한 경우, (HO-(EG)6-(CH2)11-S-S-(CH2)11-(EG)6-OH)K+ (질량 973.6amu 및 isotope pattern)의 디설파이드(disulfide)형 이온착물로 레이저 광탈착 이온화됨을 알 수 있다.
도 2(a) 내지 도 2(d)의 결과에서 알 수 있듯이 양이온 수용액을 제조하기 위해 사용된 염의 종류와 관계없이 효과적으로 자기조립단분자막의 분자의 특징적인 디설파이드(disulfide)형 이온착물로 레이저 광탈착 이온화가 발생함을 알 수 있으며, 특히, NaI를 이용하는 경우, 이온화 효율이 가장 좋은 것을 알 수 있다.
(실시예３）
SAM의 종류에 따른 양이온 용액 처리에 의한 질량 분석
하기의 표 1의 금 표면에 부착된 다양한 자기조립단분자막(이하 SAM)을 이용하여 본 발명에 따른 전처리 방법 및 질량 분석을 수행하였다.
(표 1)
Figure 112008029845066-pat00001
NaI(Sigma-Aldrich, > 99.99% )를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 Na+ 양이온 수용액을 제조하였다. 제조된 Na+ 양이온 수용액의 산도는 중성이었다.
표1의 샘플 SAM(a), SAM(b), mixed SAM(c), mixed SAM(d) 각각을 제조된 Na+ 양이온 수용액에 침지한 후, 10분간 실온의 공기 중에서 건조하였다. 이후, 실시예 2과 동일한 조건 및 장치를 이용하여 질량 분석을 수행하였다.
도 3(a)는 SAM(a)의 측정결과이며, 도 3(b)는 SAM(b)의 측정결과이며, 도 3(c)는 mixed SAM(c)의 측정결과이며, 도 3(d)는 mixed SAM(d)의 측정결과이다.
도 3(a) 내지 (d)의 결과에서 알 수 있듯이 자기조립단분자막의 종류에 관계없이 효과적으로 각각의 자기조립단분자막의 분자조성을 보여주는 특징적인 디설파 이드(disulfide)형 이온착물로 레이저 광탈착 이온화가 발생함을 알 수 있다.
하기의 표 2은 실시예 3의 질량 분석 결과를 SAM의 종류별로 정리 도시한 것이다.
(표 2)
Figure 112008029845066-pat00002
(실시예4）
양이온 용액의 전처리에 따른 SAM의 위치별 질량 분석
NaI(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 10 mM 농도의 Na+ 양이온 수용액을 제조하였다. 제조된 양이온 수용액의 산도는 중성이었다. Au와 결합되어 작용기로 알코올기를 가지며, 황 반응기, 알칸사슬기 및 에틸렌글리콜 모이어티를 갖는 자기조립단분자막(SAM) Au-S-(CH2)11-(EG)6-OH, (분석 영역 1 x 1 cm2) 을 분석대상 시편으로 하여 제조된 Na+ 양이온 수용액에 10 분 동안 침지시킨 후, 분리 회수하여 실온의 공기 중에서 10분간 건조하였다.
이후, 실시예 1과 동일한 조건 및 장치를 이용하여 질량 분석을 수행하였으며, SAM이 형성된 영역(분석 영역 1 x 1 cm2) 중 서로 다른 임의의 위치 16곳에 레이저 광을 조사하여 위치에 따른 검출 강도의 변화를 측정하고 비교하였다.
도 4(a)는 서로 다른 위치에서 측정된 16개의 검출 스펙트럼 (HO-(EG)6-(CH2)11-S-S-(CH2)11-(EG)6-OH)Na+을 중첩하여 도시한 것이며, 도 4(b)는 도 4(a)의 peak 중 monoisotopic peak 인 질량 957.6 amu의 peak을 대상으로 하여 위치에 따른 검출 강도를 정리 도시한 것이다.
레이저 광의 조사 위치별 강도의 변화를 시험한 결과 평균 검출 이온 강도는 20406.3이었으며, 표준 편차는 1280.9로 6.3%의 매우 작은 표준편차를 가짐을 알 수 있다. 이는 매트릭스를 사용하여 자기조립분자막의 질량을 분석하는 경우 얻을 수 없는 매우 작은 표준편차값이며, 이에 따라, 본 발명의 검출 방법에 따른 검출 결과가 정량적인 분석의 가능성을 보여주는 유의미한 값임과 동시에 2차원의 케미칼 맵의 측정(chemical mapping)이 가능함을 시사하는 결과이다.
(실시예5）
양이온 용액 농도에 따른 SAM의 질량 분석
NaI(Sigma-Aldrich, > 99.99%)를 이차증류수에 용해시켜 5 mM 농도, 10 mM 농도, 25 mM 농도, 50 mM 농도, 75mM 농도, 100mM 농도, 150mM 농도 및 200mM 농도의 Na+ 양이온 수용액을 각각 제조하였다. 이때 제조된 모든 양이온 수용액의 산도는 중성이었다.
금표면에 부착된 자기조립단분자막 (Au-S-(CH2)11-(EG)6-OH)를 분석대상 시편으로 하여 분석대상 시편을 제조된 각각의 농도별 Na+ 양이온 수용액에 10분간 침지한 후, 분리 회수하여 10분간 실온의 공기 중에서 건조하였다. 이후, 실시예 1과 동일한 조건 및 장치를 이용하여 질량 분석을 수행하였다.
도 5는 양이온의 농도 변화에 따른 검출 강도의 변화를 측정하여 도시한 것으로 양이온의 몰 농도가 커질수록 검출 강도가 증가함을 알 수 있다. 도 5에 도시된 첨가된 양이온의 몰 농도별 검출 강도 값은 5개의 임의의 위치에서 측정된 강도의 평균값이며, 각 농도별 표준편차를 함께 도시하였다. 도 5와 같이 양이온 수용액의 농도를 증가시킴으로써 더 높은 이온 세기를 얻을 수 있음을 알 수 있으며, 이에 따라 높은 농도의 양이온 용액으로 시편을 처리하는 경우, 더 높은 이온 세기를 얻을 수 있어, 매우 높은 측정 감도를 갖는 검출 방법임을 알 수 있다.
이상과 같이 본 발명에서는 구체적인 자기조립단분자막의 종류와 같이 특정된 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명은 상기의 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이러한 기재 로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다.
따라서, 본 발명의 사상은 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니되며, 후술하는 특허청구범위뿐 아니라 이 특허청구범위와 균등하거나 등가적 변형이 있는 모든 것들은 본 발명 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에 따른 자기조립단분자막의 질량 분석 결과를 도시한 것으로, 도 1(a)는 Na+ 양이온이 첨가된 시편의 질량분석 결과이며, 도1(b)는 K+ 양이온이 첨가된 시편의 질량분석 결과이며,
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 자기조립단분자막의 질량 분석 결과를 도시한 것으로, 도 2(a)는 NaI염을 이용하여 제조된 Na+ 양이온 수용액(1)을 첨가한 경우, 도 2(b)는 NaCl염을 이용하여 제조된 Na+ 양이온 수용액(2)을 첨가한 경우, 도 2(c)는 KI염을 이용하여 제조된 K+ 양이온 수용액(3)을 첨가한 경우, 도 2(d)는 KCl염을 이용하여 제조된 K+ 양이온 수용액(4)을 첨가한 경우의 질량 분석 결과이며,
도 3은 본 발명의 실시예 3에 따른 다양한 종류의 자기조립단분자막의 질량 분석 결과를 도시한 것으로, 도 3(a)는 SAM(a)의 질량 분석 결과이며, 도 3(b)는 SAM(b)의 질량 분석 결과이며, 도 3(c)는 mixed SAM(c)의 질량 분석 결과이며, 도 3(d)는 mixed SAM(d)의 질량 분석 결과이며,
도 4는 본 발명의 실시예 4에 따른 자기조립단분자막의 질량 분석 결과를 도시한 것으로, 도 4(a)는 서로 다른 위치에서 측정된 검출 결과를 중첩하여 도시한 것이며, 도 4(b)는 위치별 검출 강도를 정리 도시한 것이며,
도 5는 본 발명의 실시예 5에 따른 자기조립단분자막의 질량 분석 결과를 도시한 것으로, 양이온의 농도 변화에 따른 검출 강도의 변화를 측정하여 도시한 것이다.

Claims (12)

  1. 기재 표면에 자기조립(Self-Assembly)된 자기조립단분자막(SAM; Self-Assembled Monolayer)을 포함하는 분석대상시료에 양이온을 함유하는 양이온 용액을 첨가한 후, 레이저 광탈착 이온화법을 이용하여 상기 자기조립단분자막의 질량 분석이 수행되며, 상기 첨가는 상기 분석대상시료를 상기 양이온 용액에 침지하거나, 상기 분석대상시료에 상기 양이온 용액을 스프레이 도포하거나, 상기 분석대상시료에 상기 양이온 용액 액적을 떨어뜨려 수행되는 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 양이온 용액은 양이온 수용액인 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 양이온 용액은 알칼리금속 양이온, 알칼리토금속 양이온, 유기 양이온 또는 이들의 혼합 양이온을 함유하는 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 양이온 용액의 양이온 몰농도는 0.0001mM 내지 1 M인 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  5. 제 2항에 있어서,
    상기 양이온 용액은 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 유기염 또는 이들의 혼합염의 용해액인 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 알칼리금속염, 알칼리토금속염 또는 이들의 혼합염은 음이온이 요오드이온, 플루오르이온, 염소이온, 브롬이온, 수산화이온, 인산이온, 질산이온, 초산이온, 구연산이온, 타르타르산이온, 황산이온, 탄산이온 및 염소산이온군에서 선택된 염인 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 자기조립단분자막은 산소를 함유하는 모이어티(moiety)를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 산소를 함유하는 모이어티는 에틸렌글리콜 (-O-CH2-CH2-), 카복실산 (-COOH), 알코올(-OH), 에테르(-O-), 에스테르(-COO-), 케톤(-CO-), 알데히드 (-COH), 아미드(-NH-CO-) 및 이들의 방향족 치환기 군에서 하나 이상 선택된 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 자기조립단분자막은 화학적 또는 생화학적 물질과 특이적으로 반응 또는 결합하는 작용기 및 황 반응기를 포함하는 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 자기조립단분자막은 고분자 유기물, 유기금속화합물, 펩티드, 탄수화물, 단백질, 지질, 대사체, 항원, 항체, 효소, 아미노산, 압타머, 당 또는 핵산이 고정화 되어 있는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 질량 분석은 TOF-MS, MALDI FT-MS, MALDI q-TOF 또는 AP-MALDI 장치를 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 무(無) 매트릭스 질량 분석 방법.
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