KR101907758B1 - 말디톱 질량 분석법을 이용한 당 분자의 질량 분석 장치 및 이의 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 말디톱 질량 분석법을 이용한 당 분자의 분석 장치 및 이의 분석 방법에 관한 것이다.　 본 발명의 일 실시예에 따른 말디톱 질량 분석 장치는 당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성된 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플이 적용되고, 파릴렌(parylene) 매트릭스를 포함하는 고체 매트릭스 칩; 상기 고체 매트릭스 칩 상의 상기 환원 반응 물질을 이온화하기 위한 이온화 부; 및 상기 이온화된 상기 환원 물질을 질량 분석하는 질량 분석부를 포함한다. 또한, 상기 환원 반응 물질은 상기 당 분자보다 분자량이 크고 이온화가 더 용이하다.

Description

말디톱 질량 분석법을 이용한 당 분자의 질량 분석 장치 및 이의 분석 방법{Device for analyzing sugar based on MALDI-Tof mass spectrometry and method of analyzing the same}

본 발명은 당 화합물의 분석 기술에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는, 말디톱 질량 분석법을 이용한 당 분자의 분석 장치 및 이의 분석 방법에 관한 것이다.

일반적으로 질량 분석기는 화합물의 질량을 측정하는 분석 기기로서 화합물을 하전시켜 이온화한 후 질량 대 전하량을 측정하여 화합물의 분자량을 결정하게 된다. 말디톱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight; maldi-Tof) 질량 분석 방법은 분석하고자 하는 화합물(피분석물이라 함)의 이온화를 돕는 매트릭스를 상기 피분석물과 혼합하여 분석 장치의 타겟에 배치한 후 레이저를 상기 피분석물에 조사하여 상기 피분석물을 이온화시키고, 이후 이온화된 화합물로부터 질량 분석을 수행한다. 이와 같이, 말디톱 질량 분석 방법은, 화합물이 상기 매트릭스의 도움을 받아 쉽게 이온화되는 특징을 이용한다.

상기 말디톱 질량 분석 방법은 유기 매트릭스를 이용하여 단백질, 펩티드, DNA 또는 핵산과 같은 분자량이 큰 물질의 분자량 측정을 펩토몰 수준까지 고감도로 분석할 수 있는 장점이 있다. 그러나, 상기 유기 매트릭스를 이용한 말디톱 질량 분석 방법은, 이온화가 어려운 히드록실기(-OH)를 포함하고 비교적 안정한 분자 구조를 갖는 글루코스 또는 갈락토즈와 같은 당(sugar) 분자가 상기 유기 매트릭스에 의해 이온화가 잘 일어나지 않기 때문에, 당 분자에 대해서는 적용이 어렵다.

최근, 신생아 선천성 대사 이상 질환의 진단은 아미노산, 호르몬, 지방산과 같은 성장에 필요한 대사 물질의 측정을 통해 진단이 이루어지고 있다. 대표적인 질환으로는 페닐케톤뇨증(phenylketonuria, PKU), 호모시스틴뇨증 (homocystinuria), 단풍 당뇨증(Maple syrup urine disease, MSUD), 및 갈락토스혈증 (Galactosemia)이 있다. 이들 질환의 진단을 위해서는 페닐알라닌, 메티오닌, 또는 루이신과 같은 아미노산과 단당류인 갈락토즈의 측정이 필요하다. 현재는 아미노산과 같은 분자량이 큰 물질은 질량 분석기를 이용하여 측정하고 질량 분석기를 통해 분석이 어려운 갈락토즈의 경우에는 단당류가 갖는 알데히드기(-CHO)를 이용한 환원력을 이용하여 정량화 하는 별도의 분석 방법을 통해 측정하고 있다. 이러한 별개의 검사 방법은 해당 질병의 신속하고 경제적인 진단에 장해가 되고 있다.

본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 말디톱 질량 분석법에 의해 저분자량을 갖는 당 분자를 정확하게 측정하고, 나아가 단백질, 펩티드, DNA 및 핵산과 같은 분자량이 큰 물질과 함께 당 분자가 혼합되어 있는 혼합 피분석물에 대하여 대사 이상과 같은 질병 요인의 진단할 수 있도록 해당 물질들을 동시에 측정할 수 있는 신뢰성 있는 말디톱 질량 분석 장치를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는, 전술한 이점을 갖는 당 분자의 말디톱 질량 분석을 위한 샘플 플레이트를 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제는, 전술한 이점을 갖는 당 분자의 말디톱 질량 분석 방법을 제공하는 것이다.

상기 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 말디톱 질량 분석 장치는, 당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성된 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플이 적용되고, 파릴렌(parylene) 매트릭스를 포함하는 샘플 플레이트; 상기 샘플 플레이트 상의 상기 환원 반응 물질을 이온화하기 위한 이온화 부; 및 상기 이온화된 상기 환원 물질을 질량 분석하는 질량 분석부를 포함한다. 상기 환원 반응 물질은 상기 당 분자보다 분자량이 더 클 수 있다.

일 실시예에서, 상기 측정 전구체는, 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 측정 전구체는 o-phenylenediamine (OPD)를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 환원 반응 물질은, 헤테로 사이클릭 화합물을 포함할 수 있다. 상기 환원 반응 물질은, 2,3-디아미노펜아진(2,3-diaminophenazin; 또는 DAP), 2,2',5,5-테트라메틸벤지딘 (2,2',5,5'-tetramethylbenzidine) 또는 horseradish peroxidase 효소의 기질인 벤지딘 유도체 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

상기 당 분자는 알데히드기를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 당 분자는 칼락토즈 및 글루코스 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 또한, 상기 샘플 플레이트는 기판 및 상기 기판 상에 형성된 유기 매트릭스를 더 포함하고, 상기 파릴렌 매트릭스는 상기 유기 매트릭스 상에 형성될 수 있다.

상기 다른 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플플레이트는 말디톱 질량 분석 장치에 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 샘플 플레이트는, 당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성되고 상기 당 분자에 비하여 분자량이 더 큰 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플이 적용되는 고체 매트릭스를 포함할 수 있다. 상기 고체 매트릭스는 파릴렌(parylene) 매트릭스를 포함할 수 있다.

일 실시예에서, 상기 측정 전구체는 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 측정 전구체는 o-phenylenediamine (OPD)를 포함할 수 있다.

상기 환원 반응 물질은 헤테로 사이클릭 화합물을 포함할 수 있다. 상기 환원 반응 물질은, 2,3-디아미노펜아진(2,3-diaminophenazin; 또는 DAP), 2,2',5,5-테트라메틸벤지딘 (2,2',5,5'-tetramethylbenzidine) 또는 horseradish peroxidase 효소의 기질인 벤지딘 유도체 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

상기 당 분자는 칼락토즈 및 글루코스 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 샘플 플레이트는 기판 및 상기 기판 상에 형성된 유기 매트릭스를 더포함하고, 상기 파릴렌 매트릭스는 상기 유기 매트릭스 상에 형성될 수 있다. 상기 피분석 샘플은 단백질, 펩티드, 핵산 및 DNA 중 적어도 어느 하나를 더 포함할 수 있다.

상기 또 다른 기술적 과제를 해결하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 말디톱 질량 분석 방법은, 파릴렌 매트릭스를 포함하는 샘플 플레이트를 제공하는 단계; 당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성되고, 상기 당 분자보다 분자량이 더 큰 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플을 형성하는 단계; 상기 피분석 샘플을 상기 파릴렌 매트릭스 상에 적용하는 단계; 상기 샘플 플레이트 상의 상기 환원 반응 물질을 이온화하기 위해 레이저를 조사하는 단계; 및 상기 이온화된 상기 환원 물질을 질량 분석하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 측정 전구체는, 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물을 포함할 수 잇다. 또한, 상기 환원 반응 물질은, 헤테로 사이클릭 화합물을 포함할 수 있다. 또한, 상기 당 분자는 칼락토즈 및 글루코스 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 분자량이 작은 당 분자를 상기 당 분자와 반응하여 정량적으로 환원되는 측정 전구체로부터 상기 당 분자보다 분자량이 더 크고 이온화가 더 용이한 환원 반응 물질을 이용하고, 상기 환원 반응 물질을 파릴렌 매트릭스를 포함하는 샘플 플레이트를 이용하여, 상기 환원 반응 물질을 이온화시켜 이를 질량 분석함으로써, 상기 분자량이 작은 당 분자를 정확하게 측정할 수 있는 말디톱 질량 분석 장치가 제공될 수 있다. 또한, 상기 파릴렌 매트릭스에 유기 매트릭스를 복합화하여 상기 당 분자와 함께 단백질, 펩티드, DNA 및 핵산과 같은 분자량이 큰 물질을 신뢰성 있게 측정할 수 있는 말디톱 질량 분석 장치가 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 고체 매트릭스를 이용하여 당 분자를 정확하게 측정할 수 있는 말디톱 질량 분석 장치용 샘플 플레이트가 제공될 수 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 당 분자 또는 분자량이 큰 물질과 당 분자의 혼합물을 정확히 측정할 수 있는 말디톱 질량 분석 방법이 제공될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 말디톱 분석 장치를 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실험예에 따른 당 분자의 말디톱 질량 분석을 위한 피분석 샘플을 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 측정 전구체인 O-Phenylenediamine(OPD)와 환원 반응 물질인 2,3-diaminopheazin (DAP)를 파릴렌(Parylene) 매트릭스를 포함하는 고체 매트릭스 칩을 이용하여 말디톱 분석을 한 결과를 나타내는 질량 분석 스펙트럼이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 분자인 갈락토즈와 측정 전구체인OPD가 나타내는 발색에 대하여 2 종류의 버퍼 용액에서 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정한 결과를 도시하며, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 분자인 글루코스와 측정 전구체인 OPD가 나타내는 발색을 2 종류의 버퍼 용액에서 측정된 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정한 결과를 도시한다.
도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 분자인 갈락토즈와 측정 전구체인 OPD와 환원 반응 물질인 DAP를 흡광도 별로 파릴렌 매트릭스를 포함하는 고체 매트릭스 칩을 이용하여 말디톱 분석을 한 결과를 나타내는 질량 분석 스펙트럼이며, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 글루코즈와 OPD가 반응하여 얻어지는 DAP의 발색 강도를 말디톱 질량 분석 방법에 따른 스펙트럼의 DAP 질량 피크 세기와 비교하여 얻은 표준 곡선을 나타낸다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.

본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.　 오히려, 이들 실시예는 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다.

또한, 이하의 도면에서 각 층의 두께나 크기는 설명의 편의 및 명확성을 위하여 과장된 것이며, 도면상에서 동일 부호는 동일한 요소를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는" 는 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.　 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다.　 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.

본 명세서에서 제 1, 제 2 등의 용어가 다양한 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들을 설명하기 위하여 사용되지만, 이들 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들은 이들 용어에 의해 한정되어서는 안됨은 자명하다.　 이들 용어는 하나의 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 다른 영역, 층 또는 부분과 구별하기 위하여만 사용된다.　 따라서, 이하 상술할 제 1 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분은 본 발명의 가르침으로부터 벗어나지 않고서도 제 2 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 지칭할 수 있다.

본 발명의 실시예에서, 당 분자의 질량 분석을 위하여, 상기 당 분자는 말디톱 질량 분석을 위해 직접 이온화되는 것 대신에 당 분자와 반응하여 당 분자의 환원력을 이용하여 환원되는 환원 반응 물질을 생성하는 측정 전구체가 적용된다. 상기 당 분자는 측정 전구체를 정량적으로 환원시키고, 상기 환원 반응 물질이 이온화되어 이온화된 환원 반응 물질이 말디톱 분석 장치를 통해 분석된다. 따라서, 말디톱 분석을 위한 피분석 샘플은 상기 당 분자와 상기 측정 전구체 사이의 반응 화합물인 상기 환원 반응 물질을 포함할 수 있으며, 상기 환원 반응 물질의 질량 분석을 통해 상기 당 분자의 질량 분석이 간접적으로 수행된다.

상기 당 분자는, 환원력을 제공하는 알데히드기를 포함하는 화합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 당 분자는 갈락토즈 또는 글루코스와 같은 단당류일 수 있다. 그러나, 이는 예시적일 뿐, 상기 당 분자는 환원력을 갖는 여하의 단당류 또는 다당류일 수 있다.

상기 측정 전구체는, 상기 당 분자에 의해 정량적으로 환원되어 분자량이 크고 상기 당 분자에 비하여 더 이온화가 잘되는 환원 반응 물질을 형성하는 전구체 물질일 수 있다. 일 실시예에서, 상기 측정 전구체는, 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 측정 전구체는, O-페닐렌디아민(O-phenylenediamin; 또는 OPD)일 수 있다.

상기 환원 반응 물질은 헤테로 사이클릭 화합물일 수 있다. 예를 들면, 상기 헤테로 사이클릭 화합물은 2,3-디아미노펜아진(2,3-diaminophenazin; 또는 DAP), 2,2',5,5-테트라메틸벤지딘 (2,2',5,5'-tetramethylbenzidine) 또는 horseradish peroxidase 효소의 기질인 벤지딘 유도체 중 어느 하나일 수 있다. 상기 환원 반응 물질의 분자량은 100 내지 1000의 범위 내일 수 있다. 상기 분자량의 범위 내에서, 유기 매트릭스와 고체 매트릭스의 질량 피크에 방해 없이 신뢰성 있는 질량 분석 결과를 얻을 수 있으며, 이에 관하여는 후술하도록 한다. 상기 환원 반응 물질의 분자량이 500 미만인 경우에는 상기 환원 반응 물질의 질량 분석 신호와 후술하는 유기 매트릭스의 질량 분석 신호와의 구별이 어려울 수 있지만, 본 발명의 실시예에 따른 방법에 의해 용이하게 분석될 수 있다. 또한, 상기 헤테로 사이클릭 화합물의 분자량이 500을 초과하는 경우에는 기존 유기 매트릭스를 사용하여 신뢰성 있는 측정이 가능하다.

상기 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플은 저분자 물질의 정량 분석을 위해 고체 매트릭스인 파릴렌(parylene) 매트릭스에 적용될 수 있다. 상기 파릴렌 매트릭스는 폴리(p-자일렌) 중간체로부터 제조되는 화합물이며, 파릴렌 N으로 통칭될 수도 있다. 예를 들면, 상기 파릴렌 매트릭스는 파릴렌 C 및 파릴렌 D일 수 있으며, 이에 F, Cl 및 Br과 같은 할로겐 원소나 다른 적합한 기가 결합될 수 있으며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 파릴렌 매트릭스는 고체 매트릭스 칩을 형성하기 위한 기판 상에 열분해법(pyrolysis) 및 화학기상증착법(chemical vapor deposition)과 같은 박막 증착 공정을 통해 중합 형성될 수 있다. 이의 중합 형성과 관련하여서는 공지의 기술이 참조될 수 있다.

상기 환원 반응 물질과 함께 피분석 샘플 내에 단백질, 펩티드, 핵산 및 DNA와 같은 고분자 피분석 물질이 포함된 경우, 상기 환원 반응 물질과 상기 고분자 피분석 물질의 동시 질량 분석을 위하여, 상기 고체 매트릭스 칩은 상기 파릴렌 매트릭스와 함께 유기 매트릭스를 더 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 상기 고체 매트릭스 칩은, 기판, 상기 기판 상에 형성된 상기 유기 매트릭스 층 및 상기 유기 매트릭스 층 상에 형성된 파릴렌 매트릭스 박막을 포함할 수 있다. 상기 유기 매트릭스 층을 상기 파릴렌 매트릭스 박막의 하지에 배치함으로써 질량 분석시 레이저 조상에 의한 유기 매트릭스의 이온화에 의한 이온 물질들은 상기 파릴렌 매트릭스 박막의 장벽에 의해 질량 분석부 내부로의 유입이 억제되어 질량 분석 노이즈가 억제될 수 있다. 그러나, 본 발명이 이러한 구성에 한정되는 것은 아니며, 상기 유리 매트릭스와 상기 파릴렌 매트릭스의 적층 순서는 반대가 되거나 서로 혼합되어 단일 층을 형성할 수도 있으며, 전술한 구성이 복합된 적층 구조를 가질 수도 있다.

상기 유기 매트릭스 층의 형성을 위한 유기 매트릭스 박막은, α-시아노(ciano)-4-하이드록시시나믹산(hydroxycinnamic)(CHCA), 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid), 아세토니트릴(acetonitrile) 및 물 중 선택된 2 이상의 혼합물일 수 있으며, 이는 예시적일 뿐, 분석하려는 고분자 화합물의 종류에 따라서 다양하게 선택될 수 있다.

필요에 따라, 상기 고체 매트릭스 칩은 피분석 물질의 이온화 정도를 향상시켜 감도를 개선하기 위하여, 상기 파릴렌 매트릭스 박막 상에 샘플 고정을 위한 그래핀 또는 탄소 나노 튜브와 같은 3차원 구조체를 포함하는 추가 층이 더 형성될 수도 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 말디톱 분석 장치(100)를 도시하는 도면이다.

도 1을 참조하면, 전술한 파릴렌 매트릭스를 포함하는 고체 매트릭스가 형성된 샘플 플레이트(Sample plate)를 준비한다. 샘플 플레이트는 기판 및 상기 기판 상에 형성된 고체 매트릭스 박막을 포함할 수 있으며, 샘플 키트라고 지칭될 수도 있다.

이후, 당 분자를 측정하기 위하여, 상기 샘플 플레이트 상에 상기 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플을 적용한다. 상기 샘플 플레이트 상의 피분석 샘플에 대하여 건조 공정이나 결정화 공정을 수행하여 질량 분석을 위한 적합한 피분석 샘플을 형성한다.

일 실시예에서, 피분석 샘플을 간단히 형성하기 위하여 상기 고체 매트릭스 상에 미리 측정 전구체의 코팅층이 형성된 샘플 플레이트를 사용할 수도 있다. 상기 샘플 플레이트 상에 측정이 요구되는 당 분자를 포함하는 피분석 샘플을 적가하면, 샘플 플레이트 상에서 상기 당 분자에 의한 측정 전구체의 환원 반응에 의해 질량 분석될 전술한 환원 반응 물질이 형성될 수도 있다.

상기 피분석 샘플이 형성된 샘플 플레이트는 말디톱 질량 분석기의 샘플 안치를 위한 챔버(Main source chamber)에 장착된다. 이후, 레이저, 레이저 감쇄기 및 프리즘과 같은 광학계를 포함하는 이온화부(110)는 상기 피분석 샘플 내의 상기 환원 반응 물질을 이온화하기 위하여 샘플 플레이트 상에 레이저를 조사한다. 상기 레이저 조사에 의해 이온화된 상기 환원 반응 물질은 상기 샘플 플레이트로부터 탈착되고 전기장에 의해 가속되어 비행 튜브를 통과할 수 있다. 상기 비행 튜브를 통과한 이온화된 상기 환원 반응 물질이 검출기에 충돌하게 되고, 상기 질량 분석 장치의 연산부는 상기 이온화된 환원 반응 물질이 상기 샘플 플레이트의 표면으로부터 검출기에 도달하기 까지의 소요 시간을 계산함으로써 환원 반응 물질의 질량을 파악할 수 있다. 상기 환원 반응 물질은 상기 이온화 과정 중에 화학적 변화를 겪을 수 있지만, 이 경우 적합한 보정이나 계산을 통하여 상기 환원 반응 물질에 대한 정확한 질량 분석을 수행할 수 있다. 상기 질량 분석 결과로부터 최초 당 분자에 대한 질량 분석을 역산하게 된다.

이하에서는, 본 발명의 실시예에 따른 질량 분석 방법을 이용하여 당 분자의 신뢰성 있는 측정을 위한 구체적 실험예에 의해 설명하기로 한다. 하기의 개시 사항은 설명을 위한 것일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니다.

실험예

질량 분석이 요구되는 당 분자는 갈락토즈이며, 측정 전구체로서 OPD를 사용하여 피분석 샘플을 형성하였다. 갈락토즈와 OPD의 반응은 50 mM의 phosphocitrate 버퍼 및 메탄올을 용매로서 사용하여 수행되었다. 이때 horseradish peroxidase 효소를 100 μg/ml의 농도로 혼합하였다. 이 경우, 상기 OPD의 농도는 1 mg/ml로 고정하여 사용하였고, 생성되는 DAP는 490 나노미터의 파장에서 흡광도(OD)를 측정하여 정량하였다. 이 경우, 환원 반응 물질은 DAP이다.

말디톱 질량 분석에서 피분석 샘플의 이온화를 위해 사용하는 통상적인 유기 매트릭스 물질은 수백 Da 정도의 분자량을 가지는데, 분석하고자 하는 화합물의 분자량이 매트릭스 물질의 분자량과 유사한 경우 매트릭스 분해물이 질량분석 스펙트럼에 나타나게 되므로, 수백 Da 수준의 화합물의 질량분석에는 사용하기 어렵다는 단점이 있다. 즉, 유기 매트릭스에 의한 질량피크는 재현성이 없이 발생하여 m/z 가 500 이하인 영역에 시료의 질량피크가 발생하는 경우 이들 유기 매트릭스에 의한 질량피크와의 분리가 어려워 신호측정이 거의 불가능하다. 따라서, OPD(분자량: 108.14 g/mol)와 DAP(분자량: 210.23 g/mol)는 유기 매트릭스의 질량 피크가 강하게 발생하는 저분자량 범위에서 신호 피크를 발생시키므로 기존 말디톱 질량 분석으로는 분석이 어려움을 고려하여, 500 이하의 이온량 (m/z)을 갖는 저분자 물질을 측정하기 위해 기존 유기매트릭스 질량 피크를 방해하지 않으면서도 저분자 물질의 정량 분석이 가능한 고체 매트릭스인 파릴렌 매트릭스를 사용하였다.

상기 고체 매트릭스 칩은 기존 유기 매트릭스로 사용되는 ?-시아노(ciano)-4-하이드록시시나믹산(hydroxycinnamic)(CHCA)를 스테인레스 기판에 분주 및 건조한 후, 50 나노미터 두께를 갖는 파릴렌 박막을 증착하여 제조되었다. 질량 분석은 Bruker사의 Microflex 기종의 질량 분석기를 이용하여 레이저 탈착 및 이온화 질량 분량 분석을 통해 수행되었다. 이때 상기 질량 분석기의 리플렉터(도 1의 리플렉터 참조)는 포지티브 모드에서 레이저의 파워세기가 최고 출력의 70 % 내지 90 % 수준으로 조절되었으며 질량 분석부의 게인 값은 7 배 내지 12.6 배의 범위 내로 조절하여 질량 분석을 수행하였다.

도 2는 본 발명의 실험예에 따른 당 분자의 말디톱 질량 분석을 위한 피분석 샘플을 도시한다.

도 2를 참조하면, D-갈락토즈가 산화되면서 2 개의 OPD 분자가 하나의 DAP 분자로 정량적으로 환원되는 환원 반응 물질을 형성할 수 있다. 이 때 horseradish peroxidase 효소를 100 μg/ml의 농도로 혼합하였다. 상기 OPD와 DAP를 파릴렌 매트릭스를 포함하는 고체 매트릭스 칩을 사용하여 측정하였다.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 측정 전구체인 O-Phenylenediamine(OPD)와 환원 반응 물질인 2,3-diaminopheazin (DAP)를 파릴렌(Parylene) 매트릭스를 포함하는 고체 매트릭스 칩을 이용하여 말디톱 분석을 한 결과를 나타내는 질량 분석 스펙트럼이다.

도 3을 참조하면, 이온량 (m/z, m은 질량이고, z는 이온가수임)이 500 이하의 저분자 물질 범위에서 기존 말디톱 질량 분석 스펙트럼에서 발견되는 유기 매트릭스의 질량 피크 없이 피분석 물질인 OPD와 DAP의 질량 피크인 [M+H]⁺(M은 원래 측정하고자 하는 분자이고, H는 측정하고자 하는 분자 M에 결합된 수소 이온을 나타낸다)이 측정됨을 확인할 수 있다.

도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 분자인 갈락토즈와 측정 전구체인OPD가 나타내는 발색에 대하여 2 종류의 버퍼 용액에서 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정한 결과를 도시하며, 도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 분자인 글루코스와 측정 전구체인 OPD가 나타내는 발색을 2 종류의 버퍼 용액에서 측정된 시간에 따른 흡광도의 변화를 측정한 결과를 도시한다.

도 4a에서, 갈락토즈의 농도는 0 내지 192.5 ug/ml의 범위이고, 갈락토즈와 OPD 사이의 반응은 50 mM phosphocitrate 버퍼에서 진행되었으며, 이때 OPD의 농도는 1 mg/ml로 고정하여 사용되었다. 생성되는 DAP는 430 나노미터의 파장에서 240 분간 10 분 간격으로 흡광도(OD)를 측정하여 반응의 진행을 측정하였다. 도 4a에서 보이는 바와 같이 갈락토즈의 농도에 따라 DAP의 생성이 진행되어 발색이 강하게 나타남이 관찰되었다. 또한, 반응시간에 따라 정량적으로 발색이 강해짐이 관찰되었다.

도 4b를 참조하면, 글루코스의 농도는 0 - 192.5 ug/ml의 범위이고, 글루코스와 OPD 사이의 반응은 50 mM phosphocitrate 버퍼에서 진행되었으며, 이때 OPD의 농도는 1 mg/ml로 고정하여 사용되었다. 생성되는 DAP는 430 나노미터의 파장에서 240 분간 10분 간격으로 흡광도를 측정하여 반응의 진행을 측정하였다. 도 4b에서 보이는 바와 같이 반응 시간에 따라 정량적으로 발색이 강해짐을 관찰되었다.

또한, 글루코즈의 농도에 따른 DAP의 생성으로 인한 흡광도(OD)는 상기 도 4a에서 갈락토즈의 반응과 달리 크게 증가하지 않는 것으로 관찰되었다. 이와 같은 결과는 갈락토즈의 환원력이 글루코즈의 환원력에 비해 크다는 것을 나타내며, 글루코즈의 환원력이 상기 농도 범위에서 정량을 수행하기 위해 필요한 만큼의 DAP를 생성하는 것이 상대적으로 어려움을 나타낸다. 즉, 상기 농도 범위에서 글루코즈의 환원력은 갈락토즈의 정량에 영향을 끼칠 만큼 크지 않음을 알 수 있다.

도 5a는 본 발명의 일 실시예에 따른 당 분자인 갈락토즈와 측정 전구체인 OPD와 환원 반응 물질인 DAP를 흡광도 별로 파릴렌 매트릭스를 포함하는 샘플 플레이트를 이용하여 말디톱 분석을 한 결과를 나타내는 질량 분석 스펙트럼이며, 도 5b는 본 발명의 일 실시예에 따라 글루코즈와 OPD가 반응하여 얻어지는 DAP의 발색 강도를 말디톱 질량 분석 방법에 따른 스펙트럼의 DAP 질량 피크 세기와 비교하여 얻은 표준 곡선을 나타낸다.

도 5a를 참조하면, 갈락토즈의 환원력을 이용하여 갈락토즈가 산화될 때 DAP를 생성하는 반응으로 흡광도가 변할 때 흡광도별 시료를 이용하여 레이져 탈착 및 이온화 질량 분석이 수행되었다. 이때, 갈락토즈의 피분석 샘플은 파릴렌 매트릭스 칩 상에 1 마이크로리터 만큼 점적하고, 건조하여 질량 분석을 수행하였다. 질량 분석에서 DAP의 질량 피크인 [M+H]⁺가 측정 가능하였으며, DAP가 증가하여 발생하는 흡광도에 따라 DAP의 질량 피크도 정량적으로 증가하는 것이 관찰된다.

도 5b를 참조하면, 갈락토즈의 환원력에 의해 갈락토즈가 산화될 때, DAP를 생성하는 반응으로 흡광도가 변할 때 흡광도별 시료를 이용하여 레이져 탈착/이온화 질량분석을 수행하여 얻은 DAP의 질량피크의 크기를 상호 도시한 표준 곡선이 얻어질 수 있다. 갈락토즈의 환원력으로 발생하는 DAP의 흡광도(OD)인 0.027 내지 0.97의 범위 내에서 얻어진 표준 곡선의 분석으로 DAP의 흡광도(OD)와 질량 피크의 크기와의 비율은 3398 AU/OD로 계산되었다.

또한, 표준 곡선의 선형성(r)은 0.99로 계산되어 갈락토즈의 환원력으로 발생하는 DAP의 흡광도(OD)는 0.027 내지 0.97의 범위 내에서 매우 높은 선형성을 가짐을 알 수 있다. 이와같은 결과는 파릴렌 매트릭스 칩을 이용한 레이져 탈착/이온화 질량분석을 통해 본 발명에서 제공하는 갈락토즈의 정량이 흡광도 측정방법과 비교할 때 매우 높은 선형성으로 이루어질 수 있음을 나타낸다.

상기 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 갈락토즈의 환원력을 이용하여 OPD반응을 통해 DAP를 생성하는 반응과 생성된 DAP를 파릴렌 매트릭스 칩 기반의 레이져 탈착/이온화 방법으로 질량분석을 수행하여 갈락토즈를 효과적으로 정량 가능함을 나타낸다. 본 발명은 상기 실시예를 통해 개시한 것과 같이 갈락토즈와 OPD의 반응과 고체 매트릭스의 일종인 파릴렌 매트릭스 칩을 이용하여 갈락토즈를 효과적으로 정량하는 방법을 제공한다. 하지만, 본 발명이 속한 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 상기 방법 외에 다양한 고체 매트릭스를 사용할 수 있으며, 갈락토즈의 환원력에 의해 환원되는 다양한 물질을 사용할 수 있으므로 본 발명은 상기 본 실시예에 따른 방법으로 한정되지 않는 것을 이해할 것이다.

이상에서 설명한 본 발명이 전술한 실시예 및 첨부된 도면에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하다는 것은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 명백할 것이다.

Claims (20)

1. 당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성된 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플이 적용되고, 기판, 상기 기판 상에 형성되는 유기 매트릭스, 및 상기 유기 매트릭스 상에 형성되는 파릴렌(parylene) 매트릭스를 포함하는 샘플 플레이트;
   상기 샘플 플레이트 상의 상기 환원 반응 물질을 이온화하기 위한 이온화 부; 및
   상기 이온화된 상기 환원 물질을 질량 분석하는 질량 분석부를 포함하며,
   상기 환원 반응 물질은 상기 당 분자보다 분자량이 더 큰 말디톱 질량 분석 장치.
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 측정 전구체는 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물을 포함하는 말디톱 질량 분석 장치.
3. 제 1 항에 있어서,
   상기 측정 전구체는 o-phenylenediamine (OPD)를 포함하는 말디톱 질량 분석 장치.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 환원 반응 물질은 헤테로 사이클릭 화합물을 포함하는 말디톱 질량분석 장치.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 환원 반응 물질은 2,3-디아미노펜아진(2,3-diaminophenazin; 또는 DAP), 2,2',5,5-테트라메틸벤지딘 (2,2',5,5'-tetramethylbenzidine) 또는 horseradish peroxidase 효소의 기질인 벤지딘 유도체 중 어느 하나를 포함하는 말디톱 질량 분석 장치.
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 당 분자는 알데히드기를 포함하는 말디톱 질량 분석 장치.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 당 분자는 칼락토즈 및 글루코스 중 적어도 어느 하나를 포함하는 말디톱 질량 분석 장치.
8. 삭제
9. 말디톱 질량 분석 장치에 사용되는 샘플 플레이트로서,
   상기 샘플 플레이트는 기판, 상기 기판 상에 형성되는 유기 매트릭스, 및 당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성되고 상기 당 분자에 비하여 분자량이 더 큰 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플이 적용되는 고체 매트릭스를 포함하며,
   상기 고체 매트릭스는 파릴렌(parylene) 매트릭스를 포함하고,
   상기 파릴렌 매트릭스는 상기 유기 매트릭스 상에 형성되는 샘플 플레이트.
10. 제 9 항에 있어서,
    상기 측정 전구체는 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물을 포함하는 샘플 플레이트.
11. 제 9 항에 있어서,
    상기 측정 전구체는 o-phenylenediamine (OPD)를 포함하는 샘플 플레이트.
12. 제 9 항에 있어서,
    상기 환원 반응 물질은, 헤테로 사이클릭 화합물을 포함하는 샘플 플레이트.
13. 제 9 항에 있어서,
    상기 환원 반응 물질은, 2,3-디아미노펜아진(2,3-diaminophenazin; 또는 DAP), 2,2',5,5-테트라메틸벤지딘 (2,2',5,5'-tetramethylbenzidine) 또는 horseradish peroxidase 효소의 기질인 벤지딘 유도체 중 어느 하나를 포함하는 샘플 플레이트.
14. 제 9 항에 있어서,
    상기 당 분자는 칼락토즈 및 글루코스 중 적어도 어느 하나를 포함하는 샘플 플레이트.
15. 삭제
16. 제 9 항에 있어서,
    상기 피분석 샘플은 단백질, 펩티드, 핵산 및 DNA 중 적어도 어느 하나를 더 포함하는 샘플 플레이트.
17. 기판, 상기 기판 상에 형성되는 유기 매트릭스, 및 상기 유기 매트릭스 상에 형성되는 파릴렌 매트릭스를 포함하는 샘플 플레이트를 제공하는 단계;
    당 분자와 반응하는 측정 전구체가 정량적으로 환원되어 형성되고, 상기 당 분자보다 분자량이 더 큰 환원 반응 물질을 포함하는 피분석 샘플을 형성하는 단계;
    상기 피분석 샘플을 상기 파릴렌 매트릭스 상에 적용하는 단계;
    상기 샘플 플레이트 상의 상기 환원 반응 물질을 이온화하기 위해 레이저를 조사하는 단계; 및
    상기 이온화된 상기 환원 물질을 질량 분석하는 단계를 포함하는 말디톱 질량 분석 방법.
18. 제 17 항에 있어서,
    상기 측정 전구체는 아민기, 알데히드기 또는 하이드록실기를 갖는 방향족 화합물을 포함하는 말디톱 질량 분석 방법.
19. 제 17 항에 있어서,
    상기 환원 반응 물질은 헤테로 사이클릭 화합물을 포함하는 말디톱 질량분석 방법.
20. 제 17 항에 있어서,
    상기 당 분자는 칼락토즈 및 글루코스 중 적어도 어느 하나를 포함하는 말디톱 질량 분석 방법.

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