KR101345674B1

KR101345674B1 - Ｏｎｃｈｉｐ 질량분석을 위한 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩

Info

Publication number: KR101345674B1
Application number: KR1020110045414A
Authority: KR
Inventors: 정봉현; 정용원; 김영은
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2011-05-13
Publication date: 2013-12-30
Also published as: KR20120127129A

Abstract

본 발명은 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩, 이를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 표적물질을 검출 또는 분석하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, (1) 기판 상에 금속 격자 패턴을 형성시키는 단계;(2) 금속 표면 상에 티올이 혼합된 자기조립 단분자층을 형성시키는 단계; 및 (3) 기판에 소수성 분자를 부착시키는 단계를 포함하여 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩을 제조할 수 있으며, 본 발명의 바이오칩은 다중 단백질들의 혼합물로부터 목적하는 단백질의 신뢰 높은 질량 분석이 가능하고, SPR 이미징 분석에도 사용할 수 있다.

Description

Ｏｎｃｈｉｐ 질량분석을 위한 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩{Hydrophilic/hydrophobic patterned biochips for on chip MALDI-TOF MS}

본 발명은 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩, 이를 제조하는 방법 및 이를 이용하여 표적물질을 질량분석/검출하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로 질량분석기는 화합물의 질량을 측정하는 분석기기로서, 분석대상 화합물을 하전시켜 이온화한 후 질량 대 전하량(mass-to-charge; m/z)을 측정하여 화합물의 분자량을 결정하도록 설계되어 있다. 화합물의 이온화방법으로서는 전자빔을 이용하는 전자이온화법, 고속의 원자를 충돌시키는 방법, 레이저를 이용하는 방법 및 시료를 전기장 속에 스프레이 하는 방법 등이 알려져 있다.

한편, 단백질과 핵산 등의 거대 분자량을 갖는 생화학 물질의 질량분석을 위한 방법으로는 레이저를 이용하는 MALDI-TOF 질량분석법(MALDI-TOF MS: Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectroscopy)이 있으며, 이를 이용한 질량분석기가 개발되어 널리 상품화되어 이용되고 있다. MALDI-TOF를 이용한 질량분석법은 다음과 같이 수행된다. 소량의 매트릭스 용액을 금속 플레이트에 가해 건조시키고, 분석대상 시료 용액을 떨어뜨려 건조시킨다. 이후 매트릭스와 결정화된 시료가 위치한 곳에 레이저를 조사하면 매트릭스의 도움으로 시료가 탈착/이온화된다. 보통 이 시료가 위치한 금속 플레이트와 질량을 분석하는 센서 사이에 전기장을 걸게 되어 있어, 이온화된 시료가 전기장의 전위차에 의해 센서쪽으로 이동하게 된다. 이때, 시료의 전하량을 알 경우 센서에 도착하는 시간 등을 변수로 시료의 질량을 분석할 수 있는 것이다. 상기 질량분석의 원리와 같이, MALDI 질량분석법으로 합성 고분자 시료를 분석할 경우, 레이저에 의한 탈착 및 이온화를 돕기 위해서 분석 시료와 함께 유기산 매트릭스를 섞어준다. 만약 유기산 매트릭스를 함께 사용하지 않을 경우, 고분자 시료가 레이저를 직접 흡수하기 때문에 고분자 시료의 분해가 일어난다. 이와 같이, 시료 자체가 분해되는 것을 방지하기 위하여 다양한 유기산 매트릭스가 MALDI-TOF 질량분석법에 사용되고 있다. 또한, MALDI-TOF는 사용이 용이하고 많은 샘플을 빠르게 분석할 수 있는 장점을 가지고 있어 광범위한 영역에서 사용되고 있고, 항체를 이용한 타겟 단백질의 농축(enrichment)후에 MALDI-TOF와 같은 질량분석 기술을 이용한 분석방법은 통상적인 immunoassay에서는 얻을 수 없는 목적 단백질에 대한 다양한 정보를 제공하여 새로운 진단기술로 가능성을 보여주고 있다. 그러나, 현재까지는 다중의 단백질이 혼합되어 있는 시료로부터 원하는 단백질만을 검출하고 정확히 질량 분석할 수 있는 MALDI 질량 분석용 바이오칩 자체에 대한 연구가 부족한 실정이며, 사람의 혈청과 같이 여러 단백질이 섞여 있는 경우, 많은 background 단백질 관련 피크들의 방해로 인하여 분석시료의 정밀도를 떨어뜨린다. 특히, 항체를 이용하여 목적 단백질을 포획하고 이를 질량분석하는 단계를 하나의 칩(chip)상에서 실시하는 on chip 분석의 경우, 분석방법의 간소화를 보장하여 보다 신뢰성있는 단백질 질량분석법으로 여겨지고 있으나, 항체 칩을 이용하여 다수의 단백질을 질량분석을 수행할 수 있는 바이오칩에 대한 개발이 부족하였다.

한편, 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance; 이하, 'SPR'이라 약칭함) 센서 기술은 단백질과 같은 생체물질이 센서 표면에 결합될 경우 신호 변화를 일으키는 현상을 이용하여 바이오센서 및 바이오칩 측정방법으로 많이 이용되고 있다(Nice, E.C. and Catimel, B., BioEssays, 1999, 21, 339-352). 표면 플라즈몬이란 금속 표면과 같은 도체 표면을 따라서 전파하는 자유전자의 양자화된 진동이다. 이와 같은 표면 플라즈몬은 프리즘과 같은 유전매체를 지나 유전 매체의 임계각 이상의 각도로 금속박막에 입사하는 입사광에 의해 여기 되며 일정한 각도에서 공명을 일으킨다. 이러한 SPR이 일어나는 입사각, 즉 공명각은 금속박막에 근접한 물질의 굴절률 변화에 민감하다. SPR 센서는 이러한 성질을 이용하여 금속박막에 근접한 물질, 즉 시료의 굴절률 변화로부터 시료의 정량 분석, 정성 분석 및 박막인 시료의 두께를 측정하는데 이용된다. SPR 바이오센서의 가장 큰 장점은 비표지 (label-free) 방식의 센서라는 점이며 현재까지 단백질체학, 유전학 연구, 의료 진단 및 신약개발 등을 포함한 다양한 바이오텍 관련 연구 분야 및 식품가공, 환경과학 분야에 이르기까지 유용하게 사용되고 있다(Ince and Narayanaswamy, Anal. Chim. Acta, 569:1-20, 2006; Lee, et al., Langmuir, 22:5241-5250, 2006).

이에 본 발명자들은 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩을 제조하고, 이에 다중의 단백질들이 혼합되어 있는 시료를 적용시켜 on-chip immuno-MALDI 질량분석을 수행한 결과, 원하는 단백질만이 검출되고, 정확한 질량 분석 수행이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 MALDI-TOF 뿐만 아니라, SPR 이미징(imaging) 시스템에도 적용할 수 있으며, 다중 단백질들의 혼합물로부터 여러 목적 단백질의 신뢰 높은 질량 분석이 가능한 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오칩을 사용하여, 표적 물질을 검출하고, 분석하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 (1) 기판 상에 금속 격자 패턴을 형성시키는 단계;(2) 금속 표면 상에 티올이 혼합된 자기조립 단분자층을 형성시키는 단계; 및 (3) 기판에 소수성 분자를 부착시키는 단계를 포함하는 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "바이오칩"이란 표면 개질된 유리, 실리콘, 폴리프로필렌 등의 고분자 기판을 포함하는 여러가지 종류의 고체 표면에 DNA, 단백질, 세포 등의 바이오 물질을 정해진 위치에 고밀도로 부착시킨 것을 의미한다.

상기 기판은 유리, 실리콘, 폴리프로필렌, 나일론, 플라스틱 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 유리 기판이다.

상기 제조방법에 있어서, 금속은 Ni, Cu, Zn, Au 및 이의 합금으로 구성된 군에서 선택될 수 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는 상기 금속은 Au이다.

본 발명에서는 상기 금속을 증착시켜서 금속 박막을 형성할 수 있는데, 이때, 증착은 전자빔 증착기(electron beam evaporator), CVD(Chemical Vapor Deposition), PVD(Physical Vapor Deposition), 조합 액적 화학 증착기, 단순 증착기 등에 의해 수행될 수 있으나, 당업계에서 통상적으로 사용되는 증착방법이라면 제한없이 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오 칩의 특징 중 하나는 금이 격자 패턴으로 증착되는 것이다. 본 발명의 일 실시예에서는 섀도 마스크(shadow mask)를 사용하여 유리 기판 상에 금속이 패턴을 이루도록 하였으며, 1 mm 직경 당 5 x 4의 금속 스팟(spot)이 포함되도록 하였다(실시예 1).

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 (2) 단계는, 티올이 혼합된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가하여 자기조립 단분자층을 형성시키는 단계이다.

본 발명에서 용어“자기조립단분자층(self-assembly monolayer)”이란 분자 용액에 기판을 넣었을 때, 분자와 기판과의 상호작용과 분자 간의 상호작용으로 분자가 기판 표면에 자율적으로 정열된 배열 상태를 이루는 1개의 분자층으로 구성된 얇은 막을 말한다.

상기 (2) 단계를 통해, 금으로 패턴화된 바이오 칩에서, 금 박막위에 티올-PEG 링커가 부착될 수 있다. 링커는 친수성 분자이면 그 종류에 제한이 없으나, 바람직하게는 말단에 카르복실기가 결합된 헥사 (에틸렌 글리콜) 운데칸 티올(carboxyl-terminated hexa (ethylene glycol) undecane thiol), 말단에 하이드록실기가 결합된 트리 (에틸렌 글리콜) 운데칸 티올(tri (ethylene glycol) undecane thiol) 또는 이들의 혼합물이다. 본 발명의 일 실시예에서는, 0.1 mM HS-PEG-COOH 및 0.9 mM HS-PEG-OH이 혼합된 에탄올 용액을 16시간 동안 반응시켜, 칩의 금 표면 상에 티올이 혼합된 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)이 형성되도록 하였다(실시예 2).

본 발명의 제조방법에 있어서, 상기 (3) 단계는, 금 박막 이외의 기판 표면에 소수성 분자를 부착시켜, 친수성 분자가 결합된 금 박막 주변에 소수성을 부가한다. 소수성 분자의 종류는 제한되지 않으나, 소수성 분자를 포함하는 실란 물질이 바람직하며, 보다 바람직하게는, 퍼플루오로알킬실란(perfluoroalkylsilane)이 다. 본 발명의 일 실시예에서는 2% 퍼플루오로알킬실란(perfluoroalkylsilane) (FM1010)과 칩을 반응시켜, 기판 표면에 소수성을 부가시켜 주었다(실시예 2).

또한, 본 발명은 (1) 기판 상에 금속 격자 패턴을 형성시키는 단계; (2) 기판에 소수성 분자를 부착시키는 단계; 및 (3) 시스테인이 태그(tag)된 단백질 G(Cysteine-tagged protein G)를 추가하여 상기 금속 표면 상에 단백질 G층을 형성시키는 단계를 포함하는 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩의 제조방법을 제공한다.

상기의 바이오칩은 기판 상에 금속 격자 패턴을 형성 시킨 후, 먼저 기판에 소수성 분자를 부착시킨 후, 시스테인이 태그된 단백질 G 를 금속 표면상에 부착시는 단계로 구성된다.

항체 결합 단백질로 잘 알려진, 시스테인이 태그된 단백질 G은 금 박막 표면 단백질 층을 형성하고, 항체와 잘 결합할 수 있다.

본 발명의 바이오칩 제조방법은 항체 고정, 항원 반응, on chip 단백질 분해 및 MALDI 매트릭스 처리 등 여러 단계의 on-chip immuno-MALDI 분석법의 모든 반응을 일정한 조건에서 수행할 수 있게 하여, 간편하게 단백질들의 혼합물로부터 여러 타겟 단백질의 신뢰 높은 질량 분석 및 항체-항원 반응의 정량분석을 위한 SPRi 분석이 가능한 바이오칩을 제조할 수 있다.

또한, 본 발명은 금으로 격자 패턴화된 바이오 칩에 있어서, 금 표면에는 친수성 분자 또는 시스테인이 태그(tag)된 단백질 G가 결합되며, 금 표면 이외의 기판에는 소수성 분자가 결합된 것을 특징으로 하는 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩에 관한 것이다.

본 발명의 바이오칩은 상기 설명한 제조방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 바이오칩은 금 박막 위에 친수성 분자가 결합되어 있고, 금 박막 주변의 기판 표면에는 소수성 분자가 결합되어 있어, 금 박막의 친수성 분자에 항체가 특이적으로 고정될 수 있으며, 항원-항체 반응으로 표적 단백질을 손쉽게 검출할 수 있다. 또한, 본 발명의 바이오칩은 MALDI-TOF 질량 분석에 사용될 수 있다. 본 발명의 바이오칩은 on chip 단백질 분해 및 MALDI 매트릭스 처리 등 여러 단계의 on-chip immuno-MALDI 분석법의 모든 반응을 일정한 조건에서 수행할 수 있게 하여, 다중 단백질들로 이루어진 혼합물에서 목적하는 단백질들만의 질량을 정확하게 측정할 수 있는 장점이 있다. 특히, 본 발명의 일 실시예에서는 다중의 단백질들이 혼합되어 있는 사람의 혈청 내 목적 단백질의 검출 및 질량 분석이 가능함을 확인하였다. 또한, 상기 바이오칩은 질량 분석 전에 SPR 이미징 시스템의 기판으로도 바로 사용될 수 있어, 항체-항원반응의 정량분석이 가능하다. MALDI-TOF-MS 및 SPR 이미징 시스템을 결합시키면, MS 분석 전에 내부 표준물질 사용 없이도 항체-항원 결합의 정량분석이 가능하다. 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩을 사용하여 SPR 이미징 분석 후, MALDI 매트릭스를 스팟에 바로 적용시켜 MALDI-TOF MS 분석할 수 있는 특징이 있다.

또한, 본 발명은 (1) 표적 물질의 항체를 상기 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩의 친수성 분자 또는 시스테인이 태그(tag)된 단백질 G에 고정화시키는 단계; 및 (2) 표적물질을 포함하는 시료를 상기 바이오칩에 반응시키는 단계;를 포함하는, 바이오칩을 이용한 표적 물질의 검출방법 또는 질량분석 방법에 관한 것이다.

본 발명에 용어 "표적 물질"이란, 바이오칩을 사용하여 시료 내에 존재하고 있는 지 여부를 검출하고자 하는 물질로서, 표적 물질의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), 폴리펩타이드, 단백질일 수 있다. 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "시료"란 검출하고자 하는 표적 물질이 들어 있는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출방법에 있어서, (2) 단계의 바이오칩을 사용하여 SPR 이미징(imaging) 분석, MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석, 또는 SPR 이미징 분석 후 MALDI-TOF 질량분석을 수행하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 여러 종류의 항체를 바이오칩의 친수성 분자 또는 시스테인이 태그된 단백질 G에 고정화시킨 후, 상기 항체들에 특이적인 항원을 항체와 반응하도록 하였다. 그리고, 상기 바이오칩을 이용하여 SPR 이미징 분석 또는 MALDI-TOF-MS 분석을 수행하였으며, 그 결과, 성공적으로 타겟 항원들을 감지할 수 있었고, 정확한 질량 정보를 얻을 수 있었다. 또한, 본 발명의 패턴화된 금 바이오 칩 시스템에서, 항원이 결합되고, 질소로 건조된 칩을 SPR 이미징 시스템에 바로 적용해 본 결과, 항체 고정 및 특이적 항원의 포획이 SPR 이미징 데이터에 정확히 나타났다. SPR 이미징 실험 후, 분석된 바이오칩은 SPR 이미징 분석기에서 분리하였다. 그런 후, MALDI 매트릭스를 금 스팟을 포함하는 항원에 적용시켜서 MALDI-MS 분석을 수행하여, SPR 이미징 분석과 MALDI-MS를 하나의 바이오칩으로 수행할 수 있었다. 따라서 본 발명의 바이오칩은 친수성/소수성 성질로 인하여 on chip MALDI-TOF MS 분석시 일정한 반응조건을 갖게 해주어, 정확한 질량 분석이 가능하며, 금 박막을 이용하여 다양한 바이오 물질을 고정화하여 분석할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 친수성/ 소수성으로 패턴화된 바이오칩을 사용하여 on chip immuno-MALDI-TOF 질량분석을 수행하면, 다수의 단백질이 혼합되어 있는 혼합물에서도 원하는 단백질만을 정확하게 검출하고, 분석할 수 있다. 또한, 바이오칩 표면의 친수성/소수성은 복잡한 여러 단계로 구성된 on chip immuno-MALDI-MS를 수행하는 동안에도 계속해서 유지되었으며, on chip immuno-MALDI-MS의 각 단계를 일정한 조건에서 수행할 수 있게 하여, 다중 단백질들의 혼합물로부터 여러 목적 단백질의 정확한 질량 분석을 간편하게 할 수 있고, SPR 이미징 분석에도 사용할 수 있다.

도 1은 친수성/ 소수성으로 패턴화된 바이오칩의 제조방법 및 on chip MALDI-MS 분석을 도식화한 것이다(A). 또한, modification 전에 금으로 패턴화된 칩(왼쪽 그림), 친수성/ 소수성으로 패턴화된 칩 표면에 항체를 고정시킨 경우(가운데 그림) 및 MALDI 매트릭스를 적용시킨 경우의 칩(오른쪽 그림)의 사진을 나타낸 것이다(B).
도 2는 본 발명의 칩(왼쪽)과 공지된 당업계의 MALDI 샘플 플레이트(오른쪽)를 사용하여 안지오텐신 II(A) 및 시토크롬 C(B)의 MALDI 질량 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 티올이 혼합된 SAM 위 또는 Cys3-protein G 층 위에 인간 IgG 항체를 고정시킨 후, MALDI 질량 분석을 수행한 결과이다.
도 4는 β2-마이크로글로불린(A), IL6(B), CRP(C), PSA(D), 인간 IgG(E)에 대한 항체를 칩에 고정시킨 후, 다중 단백질 혼합물로부터 포획된 항원의 MALDI 질량 분석 결과를 나타낸 것이다. 다양한 전하 상태 내에서 타겟 항원의 분자량과 상응하는 피크를 보였다.
도 5는 β2-마이크로글로불린(A), IL6(B), CRP(C), PSA(D), 인간 IgG(E)에 대한 항체를 칩에 고정시킨 후, 사람의 혈청 샘플에 포함되어 있는 단백질로부터 포획된 항원의 MALDI 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 금 박막 위에 단백질 G 층을 형성시키고, 단백질 G층에 항체를 고정시킨 후, 다중 단백질 혼합물로부터 포획된 항원의 MALDI 질량 분석 결과를 나타낸 것이다. 사용된 항체는 β2-마이크로글로불린(A), IL6(B), CRP(C), PSA(D), 인간 IgG(E)에 대한 항체이다.
도 7은 항-CRP 항체(A-D) 또는 대조군으로 인간 IgG(E)에 대한 항체를 사용하여, 항체를 통해 포획된 CRP의 MALDI 질량 분석 결과를 나타낸 것이다. 또한, CRP 항원의 농도를 달리하여, MALDI 질량 분석 수행한 결과, 농도 의존적으로 질량 피크가 증가되었다.
도 8은 티올이 혼합된 SAM에 결합된 항원-항체의 SPR 이미지를 나타낸 것이다. Ab: 항체, Ag: 항원.
도 9는 Cys3-protein G 층 위에 결합된 항원-항체의 SPR 이미지를 나타낸 것이다. Ab: 항체, Ag: 항원.
도 10은 SPR 이미징 분석 후, CRA(A), PSA(B), 및 IL6(C)의 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 PSA 항체에 의해 포획된 PASfmf 트립신으로 분해시킨 후, MALDI 질량 분석한 결과이다. (A)는 PSA 항체를 사용한 경우이고, (B)는 항체를 사용하지 않은 경우, (C)는 대조군으로서 CRP 항체를 사용한 경우이다. 트립신 자기분해 피크는 'T'로 표시하였고, PSA 분해 피크는 ‘*’로 표시하였다.
도 12는 PSA의 트립신 분해물을 MALDI 질량 분석한 결과이다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 재료 준비

말단에 카르복실기가 결합된 헥사 (에틸렌 글리콜) 운데칸 티올(carboxyl-terminated hexa (ethylene glycol) undecane thiol, SH-PEG-COOH) 및 말단에 하이드록실기가 결합된 트리 (에틸렌 글리콜)운데칸 티올(tri (ethylene glycol) undecane thiol, SH-PEG-OH)은 Nanoscience Instrument에서 구입하였다.

N-(3-디메틸아미노프로필)-N’-에틸카보디이미드(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide, EDC), N-하이드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS), 암모니움 아세테이트(ammonium acetate), 헥산(hexane), β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin) 및 MALDI 매트릭스 α 시아노-4-하이드록시 신남산(α-cyano-4-hydroxy cinnamic acid (CHCA)) 및 2-(4-하이드록시-페닐아조) 벤조산(2-(4-hydroxy-phenylazo) benzoic acid (HABA))은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다.

항-인간 칼리크레인 3/PSA 항체, 항-인간 인터루킨 6 항체, 재조합 인간 칼리크레인 3/PSA 및 재조합 인간 인터루킨 6 항체는 R&D Systems (Minneapolis, MN)에서 구입하였다. 항-β2-마이크로글로불린 항체는 Abchem(UK)에서 구입하였고, 항-CRP 항체 및 재조합 인간 CRP는 Calbiochem에서 구입하였다. 아민 PEG는 SunBio, Inc에서, 퍼플루오로알킬실란(Perfluoroalkylsilane (FM1010))은 Nanocrystal CO., LTD에서 구입하였다.

실시예 2: 친수성/소수성으로 패턴화된 금 박막 바이오칩의 제조

친수성/소수성으로 패턴화된 금 박막 어레이(직경1 mm)는 도 1에 나타난 바와 같이, 2단계의 화학반응을 통해 금으로 패턴화된 유리 칩 상에 형성될 수 있다.

먼저, 섀도 마스크(shadow mask)를 통해 금을 증발시켜, 유리 기판 상에 금 패턴을 형성시켰다. 제조된 패턴화된 금 박막 칩은 2.2 x 2.2 cm의 크기를 가지며, 1 mm 직경 당 5 x 4의 금 스팟(spot)을 포함하였다. 패턴화된 금 박막 칩을 70% (v/v) 황산과 30% (v/v) 과산화수소가 섞인 농축된 피아나(piranha solution) 용액으로 세정하고, 탈이온수로 세척하였다. 칩과 0.1 mM HS-PEG-COOH 및 0.9 mM HS-PEG-OH이 혼합된 에탄올 용액을 16시간 동안 반응시켜, 칩의 금 표면 상에 티올이 혼합된 자기조립 단분자층(self-assembled monolayer, SAM)이 형성되도록 하였다. 다음으로, 에탄올로 칩을 세척하고, 질소 가스로 건조시켰다. 유리 기판 표면에 소수성을 부가시키기 위해, 칩과 2% 퍼플루오로알킬실란(FM1010)을 녹인 헥산을 30분간 반응시킨 후, 칩을 헥산 및 에탄올로 세척하고, 질소 가스로 건조시켰다. 상기 방법으로 제조된 칩은 4℃에서 저장되거나, 항체 고정을 위해 활성화될 수 있다.

티올이 혼합된 SAM의 카르복실 그룹을 활성화시키기 위해 증류수에 0.1 M EDC 및 0.4 M NHS을 녹인 용액을 15분간 흘려준 후, 물로 세척하고, 질소가스로 건조시켰다.

또한, 시스테인이 태그(tag)된 단백질 G(Cys3-protein G)을 사용하여, 칩의 금 표면 상에 단백질 G 층을 형성시킬 수 있었다. Cys3-protein G을 금 표면에 고정시키기 전에, 2% 퍼플루오로알킬실란(FM1010)을 녹인 헥산과 칩을 30분간 반응시켜 유리 기판의 소수성을 부가시켰다. 헥산과 에탄올로 칩을 세척하고, 질소 가스로 건조시킨 후, 0.1 mg/mL Cys3-protein G가 녹은 PBS 용액 0.5 μL을 칩의 금 표면에 부가시켜, 1시간 동안 반응시켰다. 0.1% tween 20과 함께 PBS로 칩을 세척하였다. 상기와 같은 방법으로 Cys3-protein G가 금 표면에 고정되어 있는 칩을 제조하였고, 이를 항체 고정에 사용하였다.

실시예 3: 항체/항원 분석

항체 고정을 위해, PBS(0.5 μL, 0.1 mg/mL)에 녹인 항체들을 친수성/소수성으로 패턴화된 칩의 금 스팟 위에 첨가하여 90분간 반응시켰다.

다음으로, PBST (10 mM phosphate-saline buffer, 0.1% tween20)로 세척하고, 칩을 1 mg/mL BSA 블록킹 용액(blocking solution (in PBST)) 내에 30분간 담지시켜, 비특이적으로 결합된 항체 및 PBST를 제거하였다. BSA 블록킹 용액 적용 전에, NHS 에스테르가 결합된 칩과 1 mg/mL 아민 PEG(in PBS)을 30분간 반응시켜, 반응하지 않은 NHS 에스테르 그룹을 제거시켰다. 다음으로, 항원(0.5 μL, 10-100 μg/mL)을 각각의 스팟에 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 상기 칩을 PBST 및 PBS로 세척한 다음, 10mM의 암모니움 아세테이트(ammonium acetate (pH 7.5))로 헹군 후, 질소로 건조시켰다.

실시예 4: SPR 이미징 분석

house-customized SPR 이미징 시스템을 사용하여 공지된 방법으로 SPR 이미징 분석을 수행하였다. 바이오 칩의 금 스팟위에 비특이적 인간 IgG, β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin (11.6 KDa)), 인간 인터루킨 6(IL6, 20 KDa), C-반응성 단백질(C-reactive protein (CRP, 23 KDa)), 전립선 특이 항원 (prostate-specific antigen (PSA, 30 KDa))에 대한 항체를 부착시켰다.

구체적으로, 항-CRP 항체(0.5 μL, 0.1 mg/mL), 항-PSA 항체(0.5 μL, 0.1 mg/mL), 비특이적 인간 IgG(0.5 μL, 0.1 mg/mL, β2-마이크로글로불린(0.5 μL, 0.1 mg/mL), 또는 항-IL6 항체(0.5μL, 0.1 mg/mL)를 금 스팟 위에 고정시켰다. 항원(0.5 μL, 0.1 mg/mL)을 각 금 스팟에 적용시켰고, 1시간 동안 반응시켰다. 구체적으로, 4개의 항원(β2-microglobulin, IL6, CRP, PSA; 각 항원이 20μg/mL씩 포함)을 포함하는 단백질 혼합 용액 및 0.1 mg/mL BSA를 항체가 부착된 금 스팟에 적용시켰다. 마지막으로, 상기 설명한 바와 같이, 칩을 세척, 헹구고 건조시켰다.

실시예 5: 트립신 분해( On - chip tryptic digestion )

바이오 칩에 의해 포획된 단백질을 트립신으로 분해하기 위해, 샘플이 처리된 바이오 칩의 각 금 표면위에 10 mM 암모니움아세테이트(ammonium acetate (0.01 mg/mL, pH8.0)) 내의 0.5 μL의 트립신 용액을 반응시켰다. 37℃에서 밤새 분해시킨 후, 50% ACN/0.1% TFA 내의 α시아노-4-하이드록시 시나믹산(CHCA) 매트릭스 용액(0.5 μL, 10 mg/mL)을 첨가하여 반응시키고, 증발시켰다.

실시예 6: MALDI - TOF 질량 분석

337 nm 에서 작동하는 펄스된 질소 레이저를 갖춘 AXIMA-CFR plus MALDI-TOF 질량 분광기(Shimadzu/Kratos, Manchester, UK)를 사용하여 MALDI-TOF-MS 분석을 수행하였다.

MALDI 매트릭스 용액을 10mg/mL CHCA 또는 2-(4-하이드록시-페닐아조) 벤조산(2-(4-hydroxy-phenylazo) benzoic acid (HABA))를 50% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세틱산(trifluoroacetic acid)에 용해시켜 제조하였다.

탄소 테이프를 사용하여 패턴 바이오칩을 MALDI 샘플 기판위에 고정시켰다.

단백질(linear 모드) 및 펩타이드(reflectron 모드)에 대한 스펙트럼을 양성-이온 모드에서 얻었다. 리니어(linear) 모드는 시토크롬 C 및 우혈청 알부민의 혼합물을 사용하여 측정하였고, 리플렉트론(reflectron) 모드는 안지오텐신 II([M+H]⁺ _Average=1046.54) 및 ACTH fragment 1839 ([M+H]⁺ _Average=2467.19)의 혼합물을 사용하여 측정하였다.

본 발명의 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩으로 MALDI를 수행하여 얻은 단백질 질량을 공지된 MALDI 샘플 기판을 사용한 경우와 비교해보았다. 그 결과, 공지된 샘플 기판을 사용한 경우와 본 발명의 칩을 사용한 경우에 있어서, 모델 단백질 뿐만 아니라 펩타이드(안지오텐신 II(angiotensin II), 1046.54 Da 및 시토크롬 C(cytochrome C), 12361.9 Da)의 질량분석에서 유사한 신호 강도(mv)를 보였다(도 2).

실시예 7: 카르복실기가 부착된 금 박막 칩을 이용한 SPRI 및/또는 MALDI - MS 분석 수행

SPRI 및/또는 MALDI-MS 분석으로 타겟 항원을 검출하기 위하여, 다양한 종류의 항체를 카르복실기가 부착된 금 박막 칩 표면에 고정시켰다. 하기 5개의 항체 중 하나의 항체가 패턴화된 금 박막 바이오 칩의 각 스팟에 부착되었다.

부착된 항체: 비특이적 인간 IgG, β2-마이크로글로불린(β2-microglobulin (11.6 KDa)), 인간 인터루킨 6(IL6, 20 KDa), C-반응성 단백질(C-reactive protein (CRP, 23 KDa)), 전립선 특이 항원 (prostate-specific antigen (PSA, 30 KDa))에 대한 항체

칩에 고정된 인간 IgG의 MALDI 질량 분석결과만이 항체의 여러 전하 상태를 보여주었다(도 3).

4개의 항원(β2-microglobulin, IL6, CRP, PSA 각 항원이 20 μg/mL씩 포함)을 포함하는 단백질 혼합 용액 및 0.1 mg/mL BSA를 항체들이 부착된 금 스팟에 적용시켰다. 세척 후, 표면을 질소 가스로 건조시킨 후, MALDI 매트릭스를 처리하여 포획된 항원의 immuno-MALDI-TOF MS 분석을 수행하였다.

각 항체 스팟의 질량 스펙트럼은 다양한 전하 상태 내에서 타겟 항원의 분자량과 상응하는 특이적인 항원 피크를 보였다(도 4). 또한, 혈청 성분의 피크가 비특이적으로 6000~9000m/z의 질량 범위에서 관찰되었지만, 여러 단백질의 On chip immuno-MALDI MS 분석은 인간 혈청 샘플내의 단백질 혼합물에 대해서도 성공적이었다(도 5).

실시예 8: Cys3 - protein G 가 부착된 칩을 이용한 MALDI - MS 분석 수행

항체 결합 단백질로 잘 알려진, 시스테인이 태그된 단백질 G(Cysteine-tagged protein G)은 금 박막 표면 단백질 층을 형성하고, 항체와 잘 결합하였다.

본 발명에서 단백질 G 층은 친수성/소수성 항체 어레이의 제조에 성공적으로 적용되었다.

이 경우, 실시예 2에서 설명한 바와 같이, 칩의 유리 표면을 퍼플루오로알킬실란으로 반응시킨 후, 남아있는 금 스팟에 단백질 G를 부착시켰다.

실시예 7과 같이, 항체를 결합시키고, 항원을 반응시킨 후, on chip MALDI-TOF-MS 분석을 수행하였다.

타겟 항원들은 각각의 단백질 G에 대한 on chip MALDI-TOF-MS을 통해 성공적으로 감지되었다(도 6).

실시예 9: SPR 이미징 시스템과 MALDI - TOF - MS 의 결합

실시예 8에서 수행한 질량 분석에 이어서, on chip MALDI-MS system을 사용하여 CRP 항원의 농도 의존적인 MS 분석또한 수행하였다. 첨가하는 CRP 항원의 농도를 1 μg/mL 에서100 μg/mL 증가시키자, 이에 따라 증가된 질량 피크가 관찰되었다(도 7).

분석물의 정확한 정량을 위해서는 일반적으로 신중한 실험 디자인과 함께 내부 표준물질의 사용이 필요하다. MALDI-TOF-MS와 SPR 이미징 시스템을 결합시키면, MS 분석 전에 내부 표준물질 사용 없이도 항체-항원 결합의 정량분석이 가능하다. 본 발명의 패턴화된 금 바이오 칩 시스템에서, 항원을 결합시키고, 질소로 건조된 칩을 SPR 이미징 시스템에 바로 적용해보았다.

공유결합 또는 단백질 G의 도움을 통한 항체 고정 및 특이적 항원의 포획이 SPR 이미징 데이터에 정확히 나타났다(도 8, 도 9).

도 9는 티올이 혼합된 SAM에 항원항체가 결합되어 나타난 SPR 이미지이고, 도 10은 Cys3-단백질 G 층에 항원 항체가 결합되어 나타난 SPR 이미지이다.

SPR 이미징 실험 후, 분석된 바이오 칩은 SPR 이미징 분석기에서 분리하였다. 그런 후, MALDI 매트릭스를 금 스팟을 포함하는 항원에 적용시켜서 MALDI-MS 분석을 수행하였다(도 10).

실시예 10: on - chip 단백질 분해 및 MALDI - MS 분석

항-PSA 항체는 상기 설명한 단백질 분석방법대로 금 스팟에서 PSA를 포획하는데 사용하였다. PSA가 포획된 금 스팟 위에 트립신 용액(0.5 μL, 10 μg/mL)을 떨어뜨렸다.

바이오 칩의 친수성/소수성 특성으로 인해 일관적인 분해 조건을 모든 금 스팟에 적용시킬 수 있었다. 세척 단계를 거치지 않고, 펩타이드에 대한 MALDI 매트릭스를 스팟에 바로 적용시켰고, MALDI-TOF MS 분석하였다.

항체로 인해 포획된 PSA의 트립신 분해물의 MALD 질량분석 결과는 도 11에 표시하였다. PAS 분해 펩티드 피크는 항체 및 트립신의 분해 피크와 뚜렷히 구별되었다. 또한, m/z 1409.92, 1875.78 및 2233.46에서 이온들을 확인하였고, 이것들은 PSA의 트립신 분해물에서 얻은 피크와 일치하였다(도 12).

Claims

(1) 기판 상에 금속 격자 패턴을 형성시키는 단계;
(2) 금속 표면 상에 티올이 혼합된 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 첨가하여 자기조립 단분자층을 형성시키는 단계; 및
(3) 기판에 소수성 분자를 부착시키는 단계
를 포함하는 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 기판은 유리, 실리콘, 폴리프로필렌, 나일론, 플라스틱 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 금속은 Ni, Cu, Zn, Au 및 이의 합금으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 티올이 혼합된 폴리에틸렌글리콜(PEG)는 말단에 카르복실기가 결합된 헥사 (에틸렌 글리콜) 운데칸 티올(carboxyl-terminated hexa (ethylene glycol) undecane thiol), 말단에 하이드록실기가 결합된 트리 (에틸렌 글리콜) 운데칸 티올(tri (ethylene glycol) undecane thiol) 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (3) 단계의 소수성 분자는 퍼플루오로알킬실란(perfluoroalkylsilane)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
(1) 기판 상에 금속 격자 패턴을 형성시키는 단계;
(2) 기판에 소수성 분자인 퍼플루오로알킬실란을 부착시키는 단계; 및
(3) 시스테인이 태그(tag)된 단백질 G를 추가하여 상기 금속 표면 상에 단백질 G층을 형성시키는 단계
를 포함하는 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩의 제조방법.
삭제
제7항에 있어서, 상기 기판은 유리, 실리콘, 폴리프로필렌, 나일론, 플라스틱 및 금속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 금속은 Ni, Cu, Zn, Au 및 이의 합금으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제3항, 제5항 내지 제7항 및 제9항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법으로 제조되는 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩.
(1) 표적 물질의 항체를 제11항의 바이오칩의 친수성 분자 또는 시스테인이 태그(tag)된 단백질 G에 고정화시키는 단계; 및
(2) 표적 물질을 포함하는 시료를 상기 바이오칩에 반응시키는 단계;
를 포함하는, 바이오칩을 이용한 표적 물질의 검출방법.
제12항에 있어서, 상기 (2) 단계의 바이오칩을 사용하여 SPR 이미징(imaging) 분석, MALDI-TOF(Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) 질량 분석, 또는 SPR 이미징 분석 후 MALDI-TOF 질량분석을 수행하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출방법.
제12항에 있어서, 상기 시료는 혈청, 조직, 세포, 타액, 뇌척수액 또는 뇨로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출방법.