KR100931027B1

KR100931027B1 - Ｎ-말단에 시스테인 태그된 단백질 ｇ 변형체

Info

Publication number: KR100931027B1
Application number: KR1020070052560A
Authority: KR
Inventors: 정봉현; 이정민; 정선옥; 정용원
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-06-27
Filing date: 2007-05-30
Publication date: 2009-12-10
Also published as: EP2046816A1; CN101506228A; KR20080000507A; EP2046816A4; US20100173430A1; WO2008016221A1; JP2009542203A; US8541005B2

Abstract

본 발명은 단백질 G(protein G) 의 N-말단에 시스테인 태그 (cysteine tag)된 단백질 G 변형체에 관한 것으로서, 상기 변형체는 바이오칩 및 바이오센서의 표면에 방향성 있게 결합하므로 시스테인을 태그하지 않은 단백질 G에 비해 항체 고정 능력이 향상된 바이오칩 및 바이오센서를 제공한다.

시스테인 태그, 스트렙토코커스, 단백질 G(protein G), 바이오센서, 플라즈몬 공명 (Surface Plasmon Resonance)

Description

Ｎ-말단에 시스테인 태그된 단백질 Ｇ 변형체 {Cysteine-tagged streptococcus protein G variant}

도 1은 스트렙토코커스 단백질 G가 항체와 결합하는 결합 도메인인 B1, B2를 나타낸 것이다.

도 2의 A는 단백질 G를 만들기 위해 제작한 단편 및 단백질 G 변형체를 만들기 위해 제작한 5개의 단편을 나타낸 것이고, B는 상기 단편을 삽입하는 벡터 및 단편을 삽입하여 스트렙토코커스 단백질 G에 1개 내지 5개의 시스테인을 태그한 단백질 G 변형체를 만들기 위해 발현벡터를 제조하는 방법을 나타낸 것이다 (pET-cys1-L-proteinG, pET-cys2-L-proteinG, pET-cys3-L-proteinG, pET-cys4-L-proteinG, pET-cys5-L-proteinG, cys: 시스테인, L: linker, 4개의 아스파라긴과 한 개의 라이신, protein G:스트렙토코커스 단백질 G의 구조이다.)

도 3는 시스테인 태그된 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 대장균에서의 발현되는 양상을 나타내는 단백질 전기영동 사진(SDS-PAGE)이다.

도 4은 금 박막 (Gold thin film) 표면에 네 개의 다른 종류의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합하여 측정한 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 나타내는 그래프이다(네 개의 다른 종류의 스트렙토코커스 단백질 G; protein G: 대조군으로 티올기가 결합하지 않은 스트렙토코커스 단백질 G, cys1-G: 한 개의 시스테인이 결합되어 있는 스트렙토코커스 단백질 G, cys2-G: 두 개의 시스테인이 결합되어 있는 스트렙토코커스 단백질 G, cys3-G: 세 개의 시스테인이 결합되어 있는 스트렙토코커스 단백질 G).

도 5는 금 박막 (Gold thin film) 표면에 네 개의 다른 종류의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 (도 4에 상기된 것과 동일)가 결합된 층위에 사람의 항체를 반응시켜 얻은 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 나타내는 그래프이다.

도 6는 금 나노 입자(Gold nano-particle)에 네 개의 다른 종류의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 (도 4에 상기된 것과 동일)를 고정화시킨 후, 항체를 결합하여 항체의 고정화 양상을 단백질 전기영동으로 나타낸 사진이다.

도 7는 말레이미드 그룹이 결합되어 있는 유리표면에 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 고정화시킨 후 그 표면에 형광표지물질이 부착된 항체 Monoclonal anti-biotin Cy3와 대조군으로 스트립토아비딘-Cy3를 마이크로 어레이어를 이용하여 어레이를 만든 후 형광스캐너를 이용하여 얻은 이미지 사진이다.

도 8는 금 박막 (Gold thin film) 표면에 네 개의 다른 종류의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 (도 4에 상기된 것과 동일)가 결합된 층위에 PSA에 대한 항체(0.5ug/ml)를 반응시킨 후 항원인 PSA(0.5ug/ml)를 반응하여 얻은 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 나타내는 그래프이다.　

도 9는 N-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체와 C-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체를 금 박막 표면에 결합시켜 항체의 결합 능력을 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR) 를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 통해 측정한 결과이다.

본 발명은 N 말단에 시스테인이 태그된 스트렙토코커스 단백질 G 변형체, 이를 코딩하는 핵산서열, 발현벡터, 숙주세포 및 상기 변형체를 제조하는 방법 및 상기 변형체 또는 중합체를 사용하여 제조된 바이오칩 및 바이오센서에 관한 것이다.

항체는 항원에 매우 특이적으로 결합하기 때문에 질병의 진단 및 치료에 관련된 의학적 연구와 생물학적인 물질을 분석하는데 광범위하게 사용되어왔다 (Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 65-69, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 40- 45).　 최근에는 면역학적 측정법의 일환으로 항체를 고체지지물질에 고정화하고 전류, 저항, 질량의 변화 및 광학적인 특징 등을 측정하는 면역센서가 개발되었다 (affinity biosensors. vol. 7: Techniques and protocols).　 그 중 광학적인 특징을 이용한 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 면역센서가 상업화되었는데, 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서는 정성적인 정보(두 분자들이 특이적으로 결합을 하는지)와 정량적인 정보(반응 속도(Kinetics)와 평형상수(equilibrium constants))를 제공할 뿐만 아니라 표지 없이 실시간으로 감지할 수 있어, 항원과 항체 결합을 측정하는데 특히 유용하다(J. Mol. Recognit. 1999, 12, 390-408).

면역센서에서는 고체지지물질에 항체를 선택적이고 안정적으로 고정화시키는 것이 매우 중요하다.　 항체를 고정화하는 기술에는, 크게 화학적 고정화방법과 물리적인 고정화방법의 두 가지가 있다.　 물리적인 방법(Trends Anal. Chem.2000 19, 530-540)은 재현성이 적고 단백질을 변성시키기 때문에 거의 사용되지 않고 있으며 화학적인 방법(Langumur, 1997, 13, 6485-6490)이 단백질을 공유결합으로 잘 결합시켜 재현성이 좋고 적용범위가 넓어 많이 사용되고 있다. 그러나 화학적인 방법으로 항체를 고정화 시킬 때, 항체가 비대칭 거대분자이기 때문에 항체가 방향성을 잃거나 항원을 결합하는 활성을 잃게 되는 경우가 있다(Analyst 121, 29R-32R).

항체의 항원결합능력을 더 좋게 하기 위해 항체를 고체지지물질에 결합시키기 전에 지지체를 사용하는 경우가 있으며, 이 지지체로 단백질 G를 사용하는 기술 이 공지되어 있다. 그러나 이러한 단백질 G자체도 지지체에 결합할 때, 방향성을 잃어 항체와 결합하는 능력이 감소하는 문제가 있다.

따라서 이와 같은 문제를 해결하기 위해서 여러 가지 방법이 제안되었다.　 예를 들면, 스트렙토코커스 단백질 G 에 2-iminothiolane를 처리하여 단백질의 아미노산기를 인산화 시킨 후에 인산화된 스트렙토코커스 단백질 G를 이용하여 항체를 고정하는 것이다. 그러나 이 방법은 특정한 부분을 인산화하는 것이 아니라 아미노기를 가지는 아미노산(Arg, Asn, Gln, Lys)의 아미노기를 인산화시키므로 특이성이 떨어질 뿐만 아니라 화학처리를 한 다음에 정제를 해야 하는 번거로움이 있다(Biosensors and Bioelectronics, 2005, 21, 103-110).　

본원 발명자는 상기와 같은 면역센서에서 항체가 결합할 때 방향성을 잃는 문제점을 해소하고자 연구한 결과 시스테인이 N-말단에 태그된 단백질 G 변형체를 제조하게 되었고, 그의 유용성을 실험을 통해 확인하였다.

본 발명의 목적은 N 말단에 시스테인 태그된 단백질 G 변형체 및 이를 코드하는 핵산서열을 제공하는 것이다.　단백질 G 는 한 예로서 스트렙토코커스 유래의 것이다. 상기 시스테인 태그는 링커를 통해 단백질 G 에 연결될 수 있다.　

본 발명의 또 다른 목적은 시스테인 태그된 단백질 G 변형체를 코드하는 핵산서열을 포함하는 발현벡터와 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터를 포함하는 숙주세포를 배양하여 단백질 G 변형체를 발현시키고 이를 분리하는 것을 특징으로 하는 단백질 G 변형체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시켜 제조된 바이오센서 및 티올기를 통해 단백질 G 변형체를 고체지지물질에 결합시키는 것을 특징으로 하는 바이오칩 및 바이오센서의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위한 첫 번째 양태로서, 본 발명은 하기 구조를 가지는, N- 말단에 시스테인이 태그된 단백질 G 변형체에 관한 것이다.　

Met_x-(Cys)n-L_y- 단백질 G - Q_z

(Met 은 메티오닌, L은 링커, 단백질 G는 항체와 결합하는 두개의 도메인(B1,B2)를 포함하고, Q 는 단백질 정제를 위한 태그이고 x, y 또는 z 는 각각 0 또는 1이며, n 은 1 내지 10 이다)

단백질 G는 그룹 G 스트렙토코카이 (streptococci)에서 분리된 박테리아 세포막 단백질 (cell wall protein)로서, 포유동물의 항체의 Fc 부분 및 Fab 부분과 결합하는 것으로 알려져 있다 (J. Immuunol. Methods 1988, 112,113-120) 그러나 단백질 G는 항체의 Fc 부분에 대한 결합력이 Fab 부분에 대한 결합력보다 약 10배정도 높다고 알려져 있다. 천연의 단백질 G 는 시퀀스되어 그 DNA　 서열이 공지되어 있다. 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 스타필로코칼 단백질 A는 그람 양성 세균들(Gram-positive bacteria)에서 발견되는 세포 표면과 관련된 다양한 단백질 중 하나로, 면역 글로블린 항체에 결합하는 특징이 있다. 그 중에서도 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 스타필로코칼 단백질 A보다 더 유용하게 이용되고 있는데, 이는 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 보다 넓은 범위의 포유동물의 항체와 결합할 수 있어, 항체의 수용체로 사용하기에 더 적합하기 때문이다.　

본 발명에 있어서, 단백질 G 는 그 기원이 특별히 제한되지 아니하며, 항체 결합력을 보유하는 한 천연형의 단백질 G 에 아미노산이 결실 부가 치환 등이 일어난 것도 본 발명의 목적에 부합되게 사용될 수 있다.　 본 발명의 실시예에서는 스트렙토코커스 단백질 G의 유전자 중 항체와 결합하는 결합 도메인 (B1,B2)만을 사용하였다.　

단백질 G-B1 영역은 3개의 β-sheet와 1개의 α-helix로 구성되는데, 그 중 C-말단의 3번째 β-sheet와 α-helix가 항체 G와의 결합에 관여한다. B1 영역은 서열번호 1, B2 영역은 서열번호 2로, B1의 아미노산 서열과 B2의 아미노산 서열을 비교하면, 4개의 서열의 차이가 있으나 구조의 차이는 거의 없다. 본원 실시예에서는 B1 영역의 경우, N-말단 쪽에 10개의 아미노산을 제거한 형태를 사용하였는데 (도 1), 10개의 아미노산이 제거된 형태는 항체와의 결합 기능에 아무런 영향이 없음이 알려져 있다(Biochem. J. (1990) 267, 171-177, J. mol. Biol (1994) 243, 906-918, Biochemistry (2000) 39, 6564-6571).　

본 발명에서 시스테인 태그 (Cys)n" 란 단백질 G 의 N-말단에 융합되는 하나 이상의 시스테인으로 구성된 펩타이드를 말한다.　 시스테인 태그는 예로서 1　 내지 10 개의 시스테인으로 구성된다.　 바람직하게는 시스테인은 1 내지 5개의 시스테인, 더욱 바람직하게는 하나 내지 3개의 시스테인으로 구성된 태그이다.　　　　

본 발명의 단백질 G 변형체에서 시스테인 태그는 단백질 G 에 직접 공유결합으로 연결될 수도 있으나, 링커(L)를 통하여 연결될 수도 있다.　 링커는 단백질 G 와 시스테인 사이에 삽입되는 것으로 임의의 서열을 가진 펩타이드이다.　 링커는 아미노산 2개 내지 10개로 구성된 펩타이드이면 족하다.　 본 발명의 실시예에서는 5 개의 아미노산으로 구성된 링커를 사용하였다.　 본 발명의 시스테인 태그는 단백질 G 내부에 삽입된 것이 아니고 단백질 G가 고체지지물질에 부착될 때 방향성을 제공하기 위한 것으로서 링커를 부착하면 티올기가 외부에 더 쉽게 노출되어 바이오센서에 더 효율적으로 방향성을 부여하여 결합시킬 수 있다.

본 발명의 단백질 G 변형체는 분리를 편하게 하기 위하여, C-말단에 단백질 정제를 위한 태그 (Q)를 추가로 포함할 수 있다.　 본 발명의 실시예에서는 핵사 히스티딘을 C-말단에 결합시켰으나, 본 발명의 목적상 단백질 정제를 위한 태그는 공지된 태그를 제한 없이 사용할 수 있다.　 본 발명의 변형체는 원핵세포의 개시코돈인 메티오닌을 포함하거나 또는 포함하지 아니할 수 있다.　 본 발명의 실시예 에서는 각각 시스테인이 하나 내지 다섯 개가 연결된 변형체를 제조하였다.

본 발명은 상기 단백질 G 변형체를 코드하는 핵산서열 및 이를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.　 벡터는 숙주세포에 DNA 를 도입하여 단백질 G 변형체를 발현시키기 위한 수단으로서 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 등이 사용될 수 있으며, 플라스미드 벡터가 바람직하다.　 본 발명의 목적상 발현벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인헨서 같은 발현조절 엘리먼트를 포함할 수 있다.　

실시예에서는, N 말단에 1 내지 5개의 시스테인이 태그된 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 코딩하는 염기서열을 포함하는 발현벡터(pET-cys1-L-proteinG, pET-cys2-L-proteinG, pET-cys3-L-proteinG, pET-cys4-L-proteinG, pET-cys5-L-proteinG) 을 도 2와 같이 제조하였다.　　 도 3은 상기 발현 벡터에 의해 형질전환된 E.coli로부터 발현된 시스테인이 태그된 단백질의 발현 양상을 나타내는 단백질 전기영동 사진(SDS-PAGE)이다.

숙주세포는 본 발명의 단백질 G 변형체를 발현할 수 있는 임의의 숙주세포를 사용할 수 있다.　 대장균 (E.coli), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 등이 그 예이다.

본 발명의 단백질 G 변형체는 펩타이드 합성법에 의해 제조할 수도 있으나, 유전공학적 방법에 의해 특히 효율적으로 제조할 수 있다.　 유전공학적 방법은 유 전자조작에 의해 원하는 단백질을 대장균(E. coli) 등의 숙주세포에서 다량으로 발현시키는 방법으로서 이에 관한 기술은 공지문헌에 상세히 기술되어 있다(molecular biotechnology: Principle and Application of Recombinant DNA ; ASM Press: 1994, J. chem. Technol. Biotechnol. 1993, 56, 3-13).　

시스테인은 티올 잔기를 가지고 있는 아미노산으로 시스테인을 유전공학적으로 단백질에 삽입하면 단백질을 특이적으로 고정화시킬 수 있음이 알려져 있다 (FEBS Lett. 1990, 270, 41-44, Biotechnol. Lett. 1993, 15, 29-34). 스트렙토코커스 단백질 G의 C-말단에 시스테인을 결합하는 방법은 공지되어 있다. 그러나 본 발명에서는 스트렙토코커스 단백질 G 변형체의 활성부위와 멀리 떨어진 N-말단에 티올기가 있는 시스테인을 태그하였다. 스트렙토코커스 단백질 G 가 항체와 결합하는 활성부위는 C-말단(3번째 베타 시트와 알파 헬릭스)에 존재하므로, 시스테인을 단백질 G 변형체 내부가 아닌 N-말단에 부착시킴으로써 C-말단에 시스테인을 붙이는 등의 방법에 의하였을 때 생길 수 있는 항체의 결합 능력상실을 최소화하였다.　

이를 입증하는 구체적인 일 실시예로서, 본 발명자는 N-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체와 C-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체를 금 박막 표면에 결합시켜 항체의 결합 능력을 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR) 를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 통해 측정하였다. 같은 농도의 N-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체와 C-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체를 금박막 표면에 결합시켜 유사한 양의 단백질이 결합되었다는 것을 확인하 였다. 그 후에, 저농도의 항체(0.5μg/ml)를 반응하여 N-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체와 C-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체의 항체 결합 능력 확인하였다. 그 결과, 0.5μg/ml의 항체를 반응하였을 때, 지지체에 고정된 N-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체의 항체결합 능력이 지지체에 고정된 C-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체에 비해 약 30% (N-말단:396RUC-말단:276RU)정도 높았다. 위의 결과를 보면, 저 농도에서 지지체에 고정된 N-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체가 지지체에 고정된 C-말단에 시스테인을 붙인 단백질 G 변형체보다 항체 결합률이 높은 것을 알 수가 있었다. 그러므로 N-말단에 시스테인을 태그한 단백질 G가 항체와 결합하는 활성부위인 C-말단부위와 멀리 떨어져 있으므로, 단백질 G 가 항체에 결합하는 능력의 상실이 최소화되었다는 것을 입증하였다.(도 9)

본 발명의 실시예에서는 시스테인을 한 개, 두 개, 세 개, 네 개 그리고 다섯 개 결합시킨 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 제조하였으며(실시예 2), 각 단백질 변형체를 발현시킬수 있는 형질전환된 대장균을 제조하고 이를 2006년 05월 22일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여 KCTC10948BP, KCTC10949BP, KCTC10950BP, KCTC10951BP 및 KCTC10952BP를 부여 받았다. KCTC10948BP 균주는 벡터 pET-M-cys1-L-protein G를 도입하여 발현시키는 균주로서, 시스테인 1개가 태그된 단백질 G 변형체를 생산하는 균주이고, KCTC10949BP는 시스테인 2개가 태그된 단백질 G 변형체(pET-M-cys2-L-protein G 도입), KCTC10950BP는 시스테인 3개(pET-M-cys3-L-protein G), KCTC10951BP는 시스테인 4개(pET-M-cys4-L-protein G), 및 KCTC10952BP(pET-M-cys5-L-protein G)는 시스테인 5개가 각각 태그된 단백질 G 변형체를 생산할 수 있는 형질전환된 대장균 균주이다. 위의 발명에 따라 유전자 조작을 한 후 단백질 발현 벡터에 삽입하여 단백질을 발현한 다음 단백질 전기영동을 통해 단백질을 분리하였다. 이 때　 1 내지 3개의 시스테인을 태그한 경우 보다 많은 활성형의 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 생산되었다.

본 발명의 다른 양태에서는 상기 단백질 G 변형체를 고체지지물질의 표면에 결합시켜 제조된 바이오 칩 및 바이오 센서의 제조방법에 관한 것이다.

상기 고체지지물질로는 하기 표 1에 기재된 금속 또는 멤브레인, 세라믹, 유리, 고분자 표면 또는 실리콘 등이 사용될 수 있다.

본 발시스테인 그룹을 가진 단백질이 자기조립 단분자층을 형성하는 기질

표면 화학 전처리 유/무	기질 종류	응용 분야
표면 화학 전처리 유/무	기질 종류	박막, 표면	나노입자 또는 나노 구조물
무	Ag	○
	Ags		○
	Au	○	○
	CdSe		○
	CdS		○
	AuAg		○
	AuCu		○
	Cu	○	○
	FePt		○
	GaAs	○
	Ge	○
	Hg	○
	Pd	○	○
	Pt	○	○
	Stainless Steel 316L	○
	Zn	○
	ZnSe	○
	PdAg		○
	Ru, Ir		○
유 (말레이미드 그룹, 에폭시 그룹, 나이트로페놀 플로린 그룹, 및 메틸 아이오다이드그룹)	멤브레인	○
	세라믹	○
	유리	○
	고분자 표면	○
	실리콘	○

본 발명의 바람직한 한 구체예에서는 상기에서 제조한 단백질 G 변형체가 직접적으로 금속표면 (금, 은, 구리, 철, 백금, 아연 등) 및 반도체에 결합하여 고정화된 바이오칩 및 바이오센서를 제공한다.　 본 발명에서는 시스테인이 태그된 단백질 G 변형체가 금 박막 표면에 흡착되는 반응을 실시간으로 감지할 수 있는 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR) 를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다.　 그 결과, 시스테인을 한개 내지 세 개 태그한 재조합 단백질 (평균 약 2400 RU) 과 태그하지 않은 재조합 단백질 (평균 약 2700 RU) 의 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화에 별 차이가 없었으나 (도 4), 시스테인을 한개 내지 세 개 태그한 변형체와 태그하지 않은 단백질 G를 금 박막 표면에 결합시킨 후에 항체와 결합시켰을 때, 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 태그하지 않은 재조합 단백질 (1000 RU) 에 비해 한 개의 시스테인을 태그한 재조합 단백질은 약 4배 (4000 RU), 두 개 태그한 재조합 단백질은 약 3.2 배 (3200 RU), 그리고 세 개를 태그한 경우에는 약 4.8 배 (4800 RU) 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다 (도 5). 이는 본 발명에 의한 단백질 G 변형체가 금 박막 표면에서 항체를 고정화하는데 매우 유용함을 확인하는 것이다.

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 통해 항체가 결합한 금 나노 입자를 제공한다. 금 나노 입자에 시스테인을 태그하지 않는 재조합 단백질과 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 결합한 후 항체와 반응하는 양상을 단백질 전기영동을 통해서 확인하였다. 그 결과, 금 나노 입자에 항체만 반응했을 때보다는 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합하고 항체를 반응시켰을 때 보다 많은 항원이 결합하였다.　 또한 태그하지 않는 재조합 단백질보다 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 보다 많은 항원이 결합하였다. 위의 결과로부터 시스테인이 태그된 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 금 나노 입자에서 항원을 고정화 시키는데 유용한 것을 확인할 수 있었다(도 6).

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 본 발명의 시스테인 태그의 티올기가 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘, 멤브레인 등에 결합되어 있는 말레이미드 그룹, 에폭시 그룹, 나이트로페놀 플로린 그룹 및 메틸 아이오다이드 그룹에 공유결합하여 단백질 G 변형체를 고체지지물질에 고정시킨 후 이에 항체를 결합시킨 바이오 센서에 관한 것이다.　　　

본 발명의 실시예에서는 유리 표면 위에 만들어진 말레이미드 그룹에 한 개, 두 개, 세 개의 시스테인을 가진 시스테인 태그의 티올기를 이용해서 특이적으로 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합시킨 후에 형광으로 표지되어 있는 항체와, 대조군으로서 스트립토아비딘-Cy3를 마이크로 어레이어를 이용하여 어레이를 만든 후 형광스캐너를 이용하여 특이적 단백질 결합 정도와 비특이적 결합이 미치는 영향을 측정하였다. 그 결과, 스트립토아비딘-Cy3(1mg/ml)의 형광 시그널이 나타나지 않았고, 항체 Monoclonal anti-biotin Cy3의 농도가 증가될수록 형광 시그널이 증가되는 것으로 보아 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 항체 반응이 특이적으로 이루어졌다는 것을 확인하였다. 또한 같은 농도의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 각각 반응한 후에 항체를 반응시켰을 때, 저 농도의 항체와 높은 결합력을 보이는 것으로 보아 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인이 태그된 재조합 스트렙토코커스 단백질 G의 말레이미드 그룹이 결합되어 있는 유리표면 등에 항체를 고정화시키는데 유용한 것을 확인할 수 있었다(도 7).

본 발명의 또 다른 구체예에서는, 단백질 G 변형체를 상기 고체지지물질에 고정시킨 후 이에 항체를 결합시킨 바이오센서를 이용하여 항원을 감지하는 것에 관한 것이다.　 금 박막 표면에 시스테인을 태그하지 않은 재조합 단백질과 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합시킨 후에 항체를 고정화시킨 다음 항원이 결합하는 것을 표면 플라즈몬 공명에 기초를 둔 바이오센서 (SPR) 를 통해 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다. 항체를 결합하는데 있어서 고농도의 항체를 결합하는 것은 항원을 인식하는데 오히려 방해가 된다고 알려져 있기 때문에, (Biosensors and Bioeletronics 21 (2005) 103-110) 저 농도의 항체(0.5μg/ml)를 고정화시킨 다음에 항원을 결합하였다. 그 결과, 항체(anti-human Kallikrein 3/PSA antibody, R?D systems)를 결합하였을 때, 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 태그하지 않은 재조합 단백질 (114 RU) ,한 개의 시스테인을 태그한 재조합 단백질은 (472 RU), 두 개 태그한 재조합 단백질은 (376 RU), 그리고 세 개를 태그한 경우(491 RU) 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다. 그 위에, 항체에 결합하는 항원(Recombinant Human kallikrein 3/PSA, 0.5μg/ml)을 반응시켰더니, 태그하지 않은 재조합 단백질 (7 RU) ,한 개의 시스테인을 태그한 재조합 단백질은 (49 RU), 두 개 태그한 재조합 단백질은 (41 RU), 그리고 세 개를 태그한 경우(74 RU) 정도 표면 플라즈몬 공명 신호의 변화가 증가하였다. 이 실험을 통해 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 단백질가 효과적으로 항원을 결합시킨다는 것을 알 수 있었다(도 8).　　　　　

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 시스테인 태그된 스트렙토코커스 단백질 G 변형체의 단백질 발현 분석

<1-1> 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 그리고 다섯 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체의 유전자 제작

N-말단에 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 그리고 다섯 개의 시스테인을 태그하기 위해서 6개의 프라이머를 제작하였다. 위의 6개의 프라이머 중에 5개의 센스 프라이머의 염기서열에는 ATG(개시 코돈) 뒤에 TGC(시스테인 코돈)를 1개에서부터 5개까지 첨가를 하였고 단백질 G와 연결고리로서 GAC GAC GAC GAC AAG (4개의 Asp 코돈과 1개의 라이신 코돈)을 포함하고 있다. 또한 이 유전자를 발현벡터인 pET21a (Novagen) 에 삽입하기 위해서 N-말단의 프라이머에는 NdeI을, C-말단의 프라이머에는 XhoI 제한 효소 절단 부위를 도입하였다. 스트렙토코커스 지노믹 유전자를 얻어 위의 프라이머(서열번호 3과 서열번호 8의 염기쌍, 서열번호 4과 서열번호 8의 염기쌍, 서열번호 5과 서열번호 8의 염기쌍, 서열번호 6과 서열번호 8의 염기쌍, 서열번호 7과 서열번호 8의 염기쌍)로 중합사슬 반응(PCR(polymerase chain reaction))하여 항체와 결합하는 도메인으로 알려진(B1[앞에 10개의 a.a.잘린 형태] ,B2) 아미노산부분만을 얻었고 얻어진 단편을 각 프라이머에 도입된 제한 효소로 절단한 후 NdeI 및 XhoI 제한효소로 잘린 pET21a 벡터에 삽입하여 pET-cys1-L-protein G, pET-cys2-L-protein G, pET-cys3-L-protein G, pET-cys4-L-protein G, pET-cys5-L-protein G 벡터를 제작하였다. (도 2) 상기 발현벡터는 N-말단에 Met 를 발현한다.

프라이머 1: 센스 (서열번호 3)

5'-CATATGTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3'

프라이머 2: 센스 (서열번호 4)

5'-CATATGTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3'

*프라이머 3: 센스 (서열번호 5)

5'-CATATGTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3'

프라이머 4: 센스 (서열번호 6)

5'-CATATGTGCTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3'

프라이머 5: 센스 (서열번호 7)

5'-CATATGTGCTGCTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3'

프라이머 6: 안티센스 (서열번호 8)

5'-CTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGT-3'

<1-2> 한 개, 두 개, 세 개, 네 개, 그리고 다섯 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 발현을 나타내는 단백질 전기영동 사진

제작된 pET-cys1-L-protein G, pET-cys2-L-protein G, pET-cys3-L-protein G, pET-cys4-L-protein G, pET-cys5-L-protein G에 의해 형질 전환된 E. coli BL21 (이들을 각각 2006년 05월 22일자로 한국 생명공학연구원에 기탁하였으며, 각각 수탁번호 KCTC10948BP, KCTC10949BP, KCTC10950BP, KCTC10951BP, KCTC10952BP를 부여받았다)을 37℃에서 O.D. (optical density, A600nm) 0.6이 될 때 까지 진탕 배양 후, 총 농도 1 mM의 IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 25℃에서 단백질 발현을 유도하였다.　 14시간 후, 세포를 원심 분리하여 얻은 대장균을 초음파 (Branson, Sonifier450, 3 KHz, 3 W, 5 min)로 파쇄 한 후, 전체 단백질 용액을 얻었고 원심분리를 통해 용해성 분획 단백질용액과 비용해성 분획 단백질로 분리하여 용액을 각각 얻었다. 위에서 얻어진 단백질 용액을 완충액(12 mM Tris-Cl, pH 6.8, 5% 글리세롤, 2.88 mM 머캅토에탄올, 0.4% SDS, 0.02% 브롬화페놀 블루)과 혼합하여 100℃에서 5분간 가열 후 1㎜ 두께의 15% 분리 젤 (pH 8.8, 가로 20 cm, 세로 10 cm) 위에 5% 저장 젤 (pH 6.8, 가로 10 ㎝, 세로 12.0 ㎝)을 덮은 폴리아크릴아마이드 젤에 로딩한 후 200-100 V, 25 ㎃로 1시간 동안 전기영동하고 쿠마시 염색액으로 염색하여 재조합 단백질을 확인하였다.　

도면 2의 레인 설명은 다음과 같다;　

(가) 레인 1: 단백질 크기 마커,

레인 2: 플라스미드 pET-cys1-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 전체 단백질,

레인 3: 플라스미드 pET-cys1-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질,

레인 4: 플라스미드 pET-cys1-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질,

레인 5: 플라스미드 pET-cys2-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 전체 단백질,

레인 6: 플라스미드 pET-cys2-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질,

레인 7: 플라스미드 pET-cys2-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질,

레인 8: 플라스미드 pET-cys3-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 전체 단백질,

레인 9: 플라스미드 pET-cys3-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질,

레인 10: 플라스미드 pET-cys3-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질,

(나) 레인 1: 단백질 크기 마커,

레인 2: 플라스미드 pET-cys4-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 전체 단백질,

레인 3: 플라스미드 pET-cys4-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질,

레인 4: 플라스미드 pET-cys4-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질,

레인 5: 플라스미드 pET-cys5-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 전체 단백질,

레인 6: 플라스미드 pET-cys5-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 용해성 분획 단백질,

레인 7: 플라스미드 pET-cys5-L-proteinG로 형질전환된 대장균의 비용해성 분획 단백질.　

플라스미드 pET-cys1-L-proteinG에서 생산된 단백질:cys1-G

플라스미드 pET-cys2-L-proteinG에서 생산된 단백질:cys2-G

플라스미드 pET-cys3-L-proteinG에서 생산된 단백질:cys3-G

플라스미드 pET-cys4-L-proteinG에서 생산된 단백질:cys4-G

플라스미드 pET-cys5-L-proteinG에서 생산된 단백질:cys5-G

<1-3> 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 와 대조군(시스테인이 태그되어 있지 않은 스트렙토코커스 단백질 G 변형체)의 발현 및 정제　

<1-2>와 같이 발현한 후에 얻어진 용해성 단백질 용액을 정제하기 위해서 IDA excellulose로 충진되어진 컬럼에 헥사 히스티딘이 결합되어 있는 6종류의 재조합 유전자를 발현시킨 세포를 파쇄한 용액을 로딩하였다. 히스티딘이 결합되어 있는 6종류의 재조합단백질을 용리 용액(50mM Tris-Cl, 0.5M imidazole, 0.5M NaCl, pH8.0)으로 용리했다. 용리된 단백질 용액은 완충 용액 PBS(phosphate-buffered Saline,pH7.4)으로 투석하였다.

실시예 2 : 한 개, 두 개, 세 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 태그하지 않은 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 재조합 단백질을 금 박막 표면에 결합시켜 항체을 고정화: 표면 플라즈몬 공명센서를 통해 표면 위의 변형된 재조합 단백질을 금 박막 표면에 결합시키고 항체를 고정화하는 반응을 표면 플라즈몬 공명 신호 변화로 측정

금 박막 칩을 95% 황산과 30% 과산화수소수 (부피 비 3 : 1) 혼합 용액 (65℃)에서 30분 동안 처리한 후, 3차 증류수로 칩을 세척한 후에 에탄올로 세척하고 3차 증류수로 칩을 세척하였다.　 그 후에 질소 가스로 칩을 건조시켜 Bia-core 표면 플라즈몬 공명센서에 장착하였다. 장착된 칩에 200 ug/ml농도의 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 단백질과 태그하지 않는 재조합 단백질을 150ul씩 금 박막 표면에 5ul/min의 흐름율로 주입을 시켜 위의 단백질들을 고정화 시켰다.　금 박막 표면과 위의 단백질을 반응 한 후 비 특이적인 반응을 막기 위해서 BSA(3mg/ml)를 100ul를 5ul/min의 흐름율로 주입을 시켰다.　 그 후에 항체(100ug/ml, human IgG, sigma), 100ul를 5ul/min의 흐름율로 주입하여 금 박막에 단백질 G 변형체 및 항체가 고정된 바이오센서를 제작하고 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다(도 5).

실시예 3 : 금 나노 입자에 한 개, 두 개, 세 개 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 태그하지 않은 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합하고 항체를 고정화: 금 나노 입자에 한 개, 두 개, 세 개 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 테그하지 않은 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합하고 항체를 고정화시켜 단백질 전기영동으로 확인

2.5 O.D /ml인 금 나노 입자를 PBS 완충용액으로 세척한 후 100ul의 일련의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체(200ug/ml)와 4 ℃ 에서 16 시간동안 반응 시킨 후에 항체 10ul(3.5g/ml,anti-rabbit IgG (Whole Molecule) -TRITC conjugate, sigma)를 상온에서 2 시간동안 반응시켰다.　 또한 대조군으로 2.5 O.D /ml인 금 나노 입자에 항체 10ul(3.5g/ml)를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.　 위의 반응 후에 원심분리를 이용해서 반응하지 않은 항체를 제거하였고 PBS 완충용액으로 세척하였다.

그 후에 금 나노 입자에 결합되어 있는 단백질들은 단백질 전기영동을 통해 확인하였다. 도면 6의 레인 설명은 다음과 같다;

레인 1:금 나노 입자에 직접 항체를 결합,

레인2: 금 나노 입자에 시스테인을 태그하지 않은 단백질 G를 고정화한 후에 항체를 결합,

레인 3:금 나노 입자에 시스테인을 한 개 태그한 단백질 G를 고정화한 후에 항체를 결합,

레인4:금 나노 입자에 시스테인을 두 개 태그한 단백질 G를 고정화한 후에 항체를 결합,

레인5:금 나노 입자에 시스테인을 세 개 태그한 단백질 G를 고정화한 후에 항체를 결합.

그 결과, 금 나노 입자에 항체만 반응했을 때보다는 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 결합하고 항체를 반응시켰을 때보다 많은 항원이 결합하였다.　 또한 태그하지 않는 재조합 단백질보다 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 보다 많은 항원이 결합하였다. 위의 결과로부터 시스테인이 태그된 재조합 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 금 나노 입자에서 항원을 고정화 시키는데 유용한 것을 확인할 수 있었다(도 6).　　

실시예 4 : 유리 표면 위에 만들어진 말레이미드 그룹에 한 개, 두 개, 세 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 반응시켜 항체를 고정화: 형광스캐너를 이용하여 위의 변형된 재조합 단백질을 유리 표면 위에 티올기와 공유결합하는 말레이미드 그룹에 결합시키고 특이적으로 항체가 결합하는 반응을 측정

유리 표면을 피라나 (황산:과산화수소, 3:1 v/v) 용액에 침지시켜 20분간 90℃ 오븐에서 반응시켰다.　 반응 후, 물과 에탄올에 씻은 다음, 아민 표면을 만들어 주기 위해 1% APTS(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 09326, SIGMA-ALDRICH)가 포함된 에탄올에 15~20 분간 침지시켜 반응시켰다.　 반응이 끝난 유리 표면은 에탄올로 씻은 후, 100℃ 오븐에서 사용하기 전까지 가열하였다. 만들어진 아민 표면 위에 10 mM BMPS(N-[b-Maleimidopropyloxy]succinimide ester, 22298, PIERCE, USA)를 DMSO(dimethyl sulfoxide, D2650,SIGMA-ALDRICH)에 녹여 30분 정도 침지시켜 반응시켰다.　 SH 기와 공유결합하게 될, 최종 유리 표면 위에 만들어진 말레이미드 그룹과 한 개, 두 개, 세 개 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 표면 위에 반응시켜 단백질을 고정화시켰다. 일련의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체가 고정화된 표면에 형광표지물질이 부착된 항체 Monoclonal anti-biotin Cy3 (C5585, SIGMA-ALDRICH) 와 대조군으로 스트립토아비딘-Cy3 (Streptavidin-Cy3 from Streptomyces avidinii, S6420 SIGMA-ALDRICH)를 마이크로 어레이어를 이용하여 어레이를 만든 후 형광스캐너를 이용하여 특이적 단백질 결합 정도와 비특이적 결합이 미치는 영향을 측정하였다.　 그 결과, 스트립토아비딘-Cy3(1mg/ml)의 형광 시그널이 나타나지 않았고, 항체 Monoclonal anti-biotin Cy3의 농도가 증가될수록 형광 시그널이 증가되는 것으로 보아 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 항체 반응이 특이적으로 이루어졌다는 것을 확인하였다. 또한 같은 농도의 스트렙토코커스 단백질 G 변형체를 각각 반응한 후에 항체를 반응시켰을 때, 저 농도의 항체와 높은 결합력을 보이는 것으로 보아 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인이 태그된 재조합 스트렙토코커스 단백질 G가 말레이미드 그룹이 결합되어 있는 유리표면 등에 항체를 고정화시키는데 유용한 것을 확인할 수 있었다(도 7).

실시예 5 : 한 개, 두 개, 세 개의 시스테인을 태그한 스트렙토코커스 단백질 G 변형체와 태그하지 않은 스트렙토코커스 단백질 G 변형체 재조합 단백질을 금 박막 표면에 결합시킨 후 항원-항체 반응: 표면 플라즈몬 공명센서를 통해 표면 위의 변형된 재조합 단백질을 금 박막 표면에 결합시키고 항체를 고정화한 후에 항원을 감지하는 반응을 표면 플라즈몬 공명 신호 변화로 측정

금 박막 칩을 95% 황산과 30% 과산화수소수 (부피 비 3 : 1) 혼합 용액 (65℃)에서 30분 동안 처리한 후, 3차 증류수로 칩을 세척한 후에 에탄올로 세척하고 3차 증류수로 칩을 세척하였다.　 그 후에 질소 가스로 칩을 건조시켜 Bia-core 표면 플라즈몬 공명센서에 장착하였다. 장착된 칩에 200 ug/ml농도의 한 개, 두 개, 그리고 세 개의 시스테인을 태그한 재조합 단백질과 태그하지 않는 재조합 단백질(control)을 150ul씩 금 박막 표면에 5ul/min의 흐름율로 주입을 시켜 위의 단백질들을 고정화 시켰다.　 금 박막 표면과 위의 단백질을 반응 한 후 비 특이적인 반응을 막기 위해서 BSA(3mg/ml)를 100ul를 5ul/min의 흐름율로 주입을 시켰다.　 그 후에 항체(0.5ug/ml, anti-human Kallikrein 3/PSA antibody, R?D systems), 100ul를 5ul/min의 흐름율로 주입하여 항체가 고정된 바이오센서에 50ul의 항원(0.5ug/ml, Recombinant Human kallikrein 3/PSA)을 반응하여 플라즈몬 공명 신호의 변화를 측정하였다(도 8).

본 발명에 따른 시스테인 태그된 단백질 G 변형체는 그 티올기를 통해 바이오센서의 고체지지물질에 방향성 있게 결합하여 항체를 효율적으로 결합시키므로 항원-항체 반응을 이용하는 바이오칩 및 바이오센서에 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Cystein-tagged Staphylococcal protein G variant <130> PA9704-0263/KR <150> KR10-2006-58123 <151> 2006-06-27 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 55 <212> PRT <213> Staphylococcus sp. <400> 1 Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr 1 5 10 15 Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr 20 25 30 Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 35 40 45 Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 <210> 2 <211> 55 <212> PRT <213> Staphylococcus sp. <400> 2 Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asp Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr 1 5 10 15 Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr 20 25 30 Ala Asp Asp Asp Gly Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr 35 40 45 Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 50 55 <210> 3 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1:sense <400> 3 catatgtgcg acgacgacga caagaaaggc gaaacaacta ctgaag 46 <210> 4 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2: sense <400> 4 catatgtgct gcgacgacga cgacaagaaa ggcgaaacaa ctactgaag 49 <210> 5 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3: sense <400> 5 catatgtgct gctgcgacga cgacgacaag aaaggcgaaa caactactga ag 52 <210> 6 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 :sense <400> 6 catatgtgct gctgctgcga cgacgacgac aagaaaggcg aaacaactac tgaag 55 <210> 7 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 :sense <400> 7 catatgtgct gctgctgctg cgacgacgac gacaagaaag gcgaaacaac tactgaag 58 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 :sense <400> 8 ctcgagttca gttaccgtaa aggtcttagt 30

Claims

하기 식으로 표현되는, N-말단에 시스테인 태그된 단백질 G의 B1 및 B2 영역으로 구성된 변형체

Met_x-(Cys)n-L_y- 단백질 G의 B1 및 B2 도메인 - Q_z

(Met 은 메티오닌, L은 링커, Q 는 단백질 정제를 위한 태그이고 x, y 또는 z 는 각각 0 또는 1이며, n 은 1 내지 10 이다).
삭제
제1항에 있어서, 상기 단백질 G의 B1 영역은 N 말단의 아미노산 10개가 제거된 것인 단백질 G 변형체.
제1항에 있어서, 시스테인 태그는 1 내지 5개의 시스테인으로 구성된 단백질 G 변형체.
제1항에 있어서, 시스테인 태그는 3개의 시스테인으로 구성된 단백질 G 변형체.　　　　　
제1항에 있어서, 링커는 4개의 아스파라긴과 1개의 라이신인 단백질 G 변형체.
제1항 또는 제3항의 단백질을 코딩하는 핵산서열.
제7항의 핵산서열을 포함하는 발현벡터.
제8항의 발현벡터를 포함하는 KCTC 10948BP , KCTC 10949BP, KCTC 10950BP,　 KCTC 10951BP 및 KCTC 10952BP로 구성되는 군으로부터 선택되는 숙주세포.
제9항의 숙주세포를 배양하고, 이로부터 단백질 G 변형체를 분리하는 것을 특징으로 하는 단백질 G 변형체의 제조방법.
제1항의 단백질을 고체지지물질의 표면에 결합시켜 제조된 바이오 칩 또는 바이오 센서.
제11항에 있어서, 고체지지물질이 세라믹, 유리, 고분자, 실리콘 및 금속 중에서 선택되는 것인 바이오 칩 또는 바이오 센서.
제12항에 있어서, 상기 금속이 금(골드)인 바이오 칩 또는 바이오 센서.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항의 단백질에 항체를 결합시켜 제조된 바이오 칩 또는 바이오 센서.
제12항에 있어서, 고체지지물이 세라믹, 유리, 고분자 및 실리콘 중에서 선택되며 이들 표면이 말리이미드 그룹, 에폭시 그룹, 나이트로페놀 플로린 그룹 및 메틸 아이오다이드 그룹으로부터 선택되는 어느 하나의 그룹으로 수식된 것인 바이오 칩 또는 바이오 센서.　
청구항 제15항에 있어서, 제1항의 단백질이 티올기를 통해 상기 표면의 말레이미드 그룹, 에폭시 그룹, 나이트로페놀 플로린 그룹 및 메틸 아이오다이드 그룹 중 어느 하나에 공유결합되는 것을 특징으로 하는 바이오 칩 또는 바이오 센서.　
제 14항의 바이오 칩 또는 바이오 센서를 이용하여 항원을 분석하는 방법.