CN101506228A - 半胱氨酸-标记的葡萄球菌g蛋白变体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及N－端半胱氨酸－标记的链球菌G蛋白变体。由于该变体以取向的方式结合到生物芯片或生物传感器的表面，与未标记的G蛋白变体相比，所述变体提供了具有改善的抗体－固定能力的生物芯片和生物传感器。

Description

半胱氨酸-标记的葡萄球菌G蛋白变体
技术领域
[1]本发明涉及N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体，编码所述变体的核酸序列、表达载体和宿主细胞，制备所述变体的方法，以及通过使用所述变体或聚合物制造的生物芯片和生物传感器。
背景技术
[2]由于抗体特异性结合抗原的特性，抗体已经被广泛用于涉及疾病的诊断和治疗的医学研究以及生物分析(Curr.Opin.Biotechnol.12(2001)65-69，Curr.Opin.Chem.Biol，5(2001)40-45)。最近，作为免疫测定，免疫传感器已经被开发，其需要抗体固定在固相支持体上，并测量电流、电阻和质量的变化、或测量光学性质或类似性质(AffinityBiosensors.Vol.7：Techniques and Protocols)。其中，利用光学性质的、基于表面等离子体共振的免疫传感器已经被商业化。所述基于表面等离子体共振的生物传感器提供定性信息(两个分子是否彼此特异性结合)和定量信息(反应动力学和平衡常数)，并且还进行实时检测而不使用标记，因而对于测量抗原-抗体结合特别有用(J.Mol.Recognit.1999.12，390-408)。
[3]
[4]在免疫传感器中，抗体被选择性地并且稳定地固定在固相支持体上是非常重要的。固定抗体的技术被分为两类，物理固定和化学固定。物理固定技术(Trends Anal.Chem，2000 19，530-540)已经被最低限度地使用，因为它们引起蛋白质的变性，并且结果再现性较差。相比之下，化学固定技术(Langmuir，1997，13，6485-6490)已经被广泛应用，原因在于由于它们允许蛋白质通过共价键合的牢固结合的特征，它们显示出良好的再现性和广泛的应用。然而，当应用化学固定技术进行抗体固定时，抗体——不对称的大分子——经常失去它们的取向和与抗原结合的活性(Analyst 121，29R-32R)。
[5]为了增强抗体与抗原结合的能力，在抗体被连接到固体基底之前可以使用载体，并且应用G蛋白作为载体的技术是已知的。然而，问题是当被结合到所述载体上时，该G蛋白本身也失去取向和与抗体结合的能力。
[6]因此，为了解决这类问题，已经提出了各种方法。例如，用2-亚氨基硫杂环戊烷(2-iminothiolane)处理链球菌G蛋白以进行蛋白质的氨基酸基团的磷酸化，随后该磷酸化的链球菌G蛋白被固定在抗体上。但是，该方法涉及磷酸化具有氨基的氨基酸(精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、赖氨酸(Lys))的氨基，而不是磷酸化任何特异位点，因此所述方法导致低的特异性并且在化学处理后需要额外的纯化过程(Biosensors and Bioelectronics，2005，21，1-3-110)。
发明内容
技术问题
[7]为了解决抗体在结合到免疫传感器时失去取向的问题，本发明人已经进行了大量的研究。结果，制备了N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体，并且通过实验确认了所述G蛋白变体的有效性。
技术方案
[8]本发明的一个目标是提供N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体、和编码所述N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体的核酸序列。所述G蛋白来源于，例如，链球菌属(Streptococcus)。半胱氨酸标记物可以通过连接体连接到G蛋白。
[9]本发明的另一个目标是提供包含所述编码所述N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体的核酸序列的表达载体和用所述表达载体转化的宿主细胞。
[10]本发明的又一个目标是提供制备G蛋白变体的方法，所述方法包括培养含有所述表达载体的宿主细胞以表达所述G蛋白变体，和分离所述G蛋白变体。
[11]本发明的又一个目标是提供通过将所述G蛋白变体连接到固相支持体的表面而制造的生物传感器以及制造生物芯片和生物传感器的方法，其中所述G蛋白用硫羟基连接到所述固相支持体。
[12]
附图说明
[13]图1示出与抗体结合的链球菌G蛋白的结合结构域(B1、B2)。
[14]图2A示出用于G蛋白制备的片段和用于G蛋白变体制备的5个片段。图2B示出制备用于G蛋白变体制备的表达载体的方法，其中链球菌G蛋白用1到5个半胱氨酸残基进行标记，所述方法通过将所述片段插入到所述载体而进行(pET-cys1-L-G蛋白、pET-cys2-L-G蛋白、pET-cys3-L-G蛋白、pET-cys4-L-G蛋白、pET-cys5-L-G蛋白；cys：半胱氨酸；L：连接体，四个天冬酰胺残基和一个赖氨酸残基；G蛋白：链球菌G蛋白的结构)。
[15]图3是蛋白质电泳(SDS-PAGE)照片，显示半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体在大肠杆菌(E.coli)中的表达模式。
[16]图4是显示在将四种不同类型的链球菌G蛋白变体(四种不同类型的链球菌G蛋白；蛋白G：作为对照，一种不具有硫羟基的链球菌G蛋白，cys1-G：具有1个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白，cys2-G：具有两个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白，cys3-G：具有三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白)结合到金薄膜表面之后所测量的表面等离子体共振信号的变化的图。
[17]图5是显示表面等离子体共振信号的变化的图，所述表面等离子体共振信号通过使人抗体在由结合到金薄膜表面的四种不同类型的链球菌G蛋白变体(与图4中说明的那些相同)形成的层上反应而得到。
[18]图6是蛋白质电泳照片，显示抗体固定的状况，所述抗体固定通过使四种不同类型的链球菌G蛋白变体(与图4中说明的那些相同)固定在金纳米颗粒上并且随后结合抗体而获得。
[19]图7是照片图像，其使用荧光扫描仪如下获得：通过将半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体固定在马来酰亚胺基结合到其上的玻璃表面上，随后使用微阵列点样器在玻璃表面上形成荧光标记物标记的单克隆抗生物素Cy3抗体的阵列，而链霉抗生物素-Cys作为对照。
[20]图8是显示表面等离子体共振信号的变化的图，所述表面等离子体共振信号通过使抗PSA的抗体(0.5μg/ml)在由结合到金薄膜表面的四种不同类型的链球菌G蛋白变体(与图4中说明的那些相同)形成的层上反应，并且随后使抗原PSA(0.5μg/ml)与其反应而获得。
[21]图9示出使用基于表面等离子体共振的生物感应器，以表面等离子体共振信号变化表示的抗体结合能力的测量结果，其中N-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体和C-端半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体结合到金薄膜表面。
具体实施方式
[22]根据实现本发明的上述目标的实施方式，本发明涉及半胱氨酸-标记的链球菌G蛋白变体，其具有下列结构：
[23]Metx-(Cys)n-Ly-G蛋白-Qz
[24]其中Met表示甲硫氨酸；L表示连接体；G蛋白包括两个抗体结合结构域(B1、B2)；Q表示用于蛋白质纯化的标记物；x、y和z各自为0或1；并且n是从1到10的数字。
[25]G蛋白是从G组链球菌中分离的细菌细胞壁蛋白，并且已知结合到哺乳动物抗体的Fc和Fab区(J.Immunol.Methods 1988，112，113-120)。然而，已知G蛋白结合到Fc区的亲和力大约10倍于结合到Fab区的亲和力。天然G蛋白的DNA序列被分析并已经被公开。链球菌G蛋白变体和链球菌A蛋白是与细胞表面有关的各种蛋白质之一，其在革兰氏阳性细菌中发现，并且具有与免疫球蛋白抗体结合的特性。此外，链球菌G蛋白变体比链球菌A蛋白更有用，因为链球菌G蛋白变体能够结合更广泛的哺乳动物抗体，使得其被用作所述抗体的合适受体。
[26]在本发明中，G蛋白的来源不受到特别限制，而天然G蛋白——其氨基酸序列通过缺失、添加、置换或类似的方法被修饰——可以被合适地用于本发明的目的，只要其具有与抗体结合的能力。在本发明的实施例中，只有链球菌G蛋白的抗体结合结构域(B1，B2)被使用。
[27]G蛋白-B1结构域由三个β-折叠和一个α-螺旋组成，并且在其C-端部分的第三个β-折叠和α-螺旋参与与免疫球蛋白G的结合。B1结构域由SEO ID NO：1表示，而B2结构域由SEQ ID NO：2表示。当B1和B2结构域的氨基酸序列相互比较时，有四个序列存在差异，但是，在它们的结构之间几乎没有差异。在本发明的实施例中，使用其中在其N-端10个氨基酸被删除的B1结构域(图1)。据报道，即使使用N-端侧10个氨基酸残基被删除的B1结构域的形式，这对于与抗体结合的功能也没有影响(Biochem.J.(1990)267，171-177，J.Mol.Biol(1994)243，906-918，Biochemistry(2000)39，6564-6571)。
[28]如在这里使用的，术语“半胱氨酸标记((Cys)n)”指由一个或多个半胱氨酸残基组成的肽，其融合在G蛋白的N-端。半胱氨酸标记的例子包括由1到10个半胱氨酸残基组成的标记，优选由1到5个半胱氨酸残基组成的标记，并且更优选由1到3个半胱氨酸残基组成的标记。
[29]在本发明的G蛋白变体中，半胱氨酸标记可以通过共价键直接连接到G蛋白，或者可以通过连接体连接。所述连接体是具有任何序列的肽，其被插入在所述G蛋白和半胱氨酸之间。连接体可以是由2到10个氨基酸残基组成的肽。在本发明的实施例中，具有5个氨基酸残基的连接体被使用。本发明的半胱氨酸标记没有被插入在G蛋白的内部，并且提供在附着于固相支持体时具有取向的G蛋白。如果连接体被连接，则硫羟基易于暴露到外面。因而，G蛋白可以以定向性更有效地结合到生物传感器上。
[30]为了容易地分离本发明的G蛋白变体，在其C-端可以进一步包括用于蛋白质纯化的标记(Q)。在本发明的实施例中，六组氨酸被标记在其C-端，但是对于用于蛋白质纯化的标记，任何已知的标记可以被用于本发明的目的而不对其进行限制。本发明的变体可以包含甲硫氨酸——其在原核生物中用作起始密码子，或者不包含甲硫氨酸。在本发明的实施例中，每个变体都被制备成以1到5个半胱氨酸连接。
[31]本发明涉及编码G蛋白变体的核酸序列、包含所述核酸序列的表达载体以及用所述表达载体转化的宿主细胞。所述载体是允许DNA插入到宿主细胞中以表达G蛋白变体的任何媒介物，包括载体如质粒载体、黏粒载体、和噬菌体载体，优选质粒载体。对于本发明的目的，表达载体可以包括表达调控元件如启动子、起始密码子、终止密码子、加A信号以及增强子。
[32]在实施方式中，如图2所述制备包含编码链球菌G蛋白变体的核酸序列的表达载体，所述链球菌G蛋白变体在其N-端用1到5个半胱氨酸残基标记(pET-cys1-L-G蛋白、pET-cys2-L-G蛋白、pET-cys3-L-G蛋白、pET-cys4-L-G蛋白、pET-cys5-L-G蛋白)。图3是蛋白质电泳(SDS-PAGE)照片，显示半胱氨酸标记的蛋白质的表达模式，该蛋白质在用所述表达载体转化的大肠杆菌中表达。
[33]能够表达本发明的G蛋白变体的任何宿主细胞可以被使用。所述宿主细胞的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。[34]本发明的G蛋白变体可以通过肽合成方法制备，特别是，通过遗传工程方法有效地制备。所述遗传工程方法是在宿主细胞如大肠杆菌中通过基因操作表达大量期望蛋白质的方法，并且相关的技术被详细描述在公开的文件(Molecular Biotechnology；Priciple and Application ofRecombinant DNA；ASM Press：1994，J.Chem.Technol.Biotechnol.1993，56，3-13)中。
[35]半胱氨酸是具有硫羟基的氨基酸，并且已知其通过插入到蛋白质中而特异性固定蛋白质(FEBS Lett.1990，270，41-44，Biotechnol.Lett.1993，15，29-34)。公开了在链球菌G蛋白的C端结合半胱氨酸的方法。然而，在本发明中，具有硫羟基的半胱氨酸被用于标记N-端，其远离链球菌G蛋白变体的活性结构域。与抗体结合的链球菌G蛋白的活性结构域位于其C端(所述第三个β折叠和α-螺旋)。因此，半胱氨酸不被用于标记G蛋白变体的内部，而是被用于在其N-端进行标记，因此使抗体结合能力的损失最小化，其中所述损失可能由于用半胱氨酸残基标记C-端而发生。
[36]在确定这点的具体实施方式中，本发明人在将N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体和C-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体各自结合到金薄膜表面上之后，通过应用基于表面等离子体共振的生物传感器(SPR)检测表面等离子体共振信号的变化，测量抗体结合能力。已证实，当相同浓度的N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体和C-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体被结合到金薄膜表面上时，相似量的蛋白质结合到其上。然后，通过与低浓度的抗体(0.5μg/ml)反应，确定N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体和C-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体的的抗体结合能力。结果，当它们与0.5μg/ml的抗体反应时，固定在支持体上的N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体的抗体结合能力比固定在该支持体上的C-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体的抗体结合能力高大约30％(N-端：396RU，C-端：276RU)。基于上述结果，发现，在低浓度下，固定在支持体上的N-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体的抗体结合比率比固定在所述支持体上的C-端半胱氨酸-标记的G蛋白变体的抗体结合比率高。因此，已证实：N-端半胱氨酸标记远离半胱氨酸-标记的G蛋白变体的C-端，所述C-端是结合抗体的活性结构域(an active domain todomain with the antibody)，因此G蛋白的抗体结合能力的损失被降到最低(图9)。
[37]在本发明的实施方式中，制备链球菌G蛋白变体，其中一个、两个、三个、四个以及五个半胱氨酸各自结合到其上(实施例2)。基因操作按照上述发明进行，并且随后所操作的基因的每一个被插入到蛋白表达载体中。每一种蛋白质被表达，并且通过蛋白质电泳进行分离。在此时，在标记1到3个半胱氨酸残基的情况下，重组链球菌G蛋白变体的活性形式产生得甚至更多。
[38]在另一实施方式中，本发明涉及通过将所述G蛋白变体结合到固相支持体表面来制造生物芯片和生物传感器的方法。固相支持体的例子包括金属或膜、陶瓷、玻璃、聚合物表面或硅氧烷，如下列表1中所述。
[39]表1 用于具有半胱氨酸基团的蛋白质的自组装单层形成的基底
Figure A200780031771D00101
Figure A200780031771D00111
[40]
[41]在本发明的优选具体实施方式中，提供了生物芯片和生物传感器，其中所制备的G蛋白变体直接结合到金属表面(金、银、铜、铁、铂、锌等)和半导体并随后被固定。在本发明中，应用基于表面等离子体共振的生物传感器(SPR)测量表面等离子体共振信号的变化，以实时检测将半胱氨酸标记的G蛋白变体吸附到金薄膜表面的反应。结果，标记有一个到三个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号(平均大约2400RU)和未标记的重组蛋白的表面等离子体共振信号(平均大约2700RU)几乎没有差异(图4)。然而，当标记有一个到三个半胱氨酸残基的重组蛋白和未标记的重组蛋白结合到金薄膜表面上，并随后与抗体结合时，与未标记的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化(1000RU)相比，标记有一个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加大约4倍(4000RU)，标记有两个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加大约3.2倍(3200RU)，而标记有三个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加大约4.8倍(4800RU)(图5)。因此，证实了本发明的G蛋白变体对于将抗体固定在金薄膜的表面上非常有用。
[42]根据本发明的又一具体实施方式，提供了金纳米颗粒，其通过半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体结合到抗体。在将未标记的重组蛋白和标记有一个、两个和三个半胱氨酸残基的重组链球菌G蛋白变体结合到金纳米颗粒上之后，通过蛋白质电泳确定与抗体结合的模式。结果，与当抗体只与金纳米颗粒反应时相比，当抗体在链球菌G蛋白变体结合到所述金纳米颗粒上之后反应时，更多的抗原结合到其上。而且，与未标记的重组蛋白相比，标记有一个、两个和三个半胱氨酸残基的重组链球菌G蛋白变体结合更大量的抗原。根据该结果，证实了半胱氨酸标记的重组链球菌G蛋白变体对于将抗原固定在金纳米颗粒上非常有用(图6)。
[43]仍根据本发明的另一具体实施方式，本发明涉及生物传感器，其中本发明的半胱氨酸标记的硫羟基共价键合到与陶瓷制品、玻璃、聚合物、硅氧烷、膜或类似物等结合的马来酰亚胺基团、环氧基、硝基苯酚脯氨酸基团和甲基碘基团上，以将G蛋白变体固定在固相支持体上，并且随后所述抗体结合到所述G蛋白变体上。
[44]在本发明的实施方式中，在链球菌G蛋白变体通过具有一个、两个和三个半胱氨酸残基的半胱氨酸标记的硫羟基结合到玻璃表面上的马来酰亚胺基团之后，使用微阵列点样器，用标记有荧光标记物的抗体和作为对照的链亲和素-Cy3制备阵列。然后，使用荧光扫描仪，测量蛋白质的特异性结合的程度和非特异性结合的影响。结果，没有观测到链亲和素-Cy3(1毫克/毫升)的荧光信号。荧光信号随着单克隆抗-生物素-Cy3抗体浓度的增加而增加，这表示标记有一个、两个、和三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体特异性结合到抗体。进一步，当每一个具有相同浓度的链球菌G蛋白变体与所述抗体反应时，它们显示出高的结合能力，甚至在与低浓度的所述抗体反应时也是如此。结果，证实了标记有一个、两个和三个半胱氨酸残基的重组链球菌G蛋白对于将抗体固定在具有马来酰亚胺基的玻璃表面上是有用的(图7)。
[45]仍在本发明的另一具体实施方式中，本发明涉及使用生物传感器检测抗原的方法，所述方法包括通过将G蛋白变体固定在所述固相支持体上，并且随后将抗体结合到其上来制备生物传感器。
[46]为了检测抗原结合，在将没有用半胱氨酸标记的重组蛋白和标记有一个、两个和三个半胱氨酸残基的重组链球菌G蛋白变体结合在金薄膜表面上并且随后固定抗体之后，应用基于表面等离子体共振的生物传感器(SPR)测量表面等离子体共振信号的变化。当抗原-抗体结合事件发生时，已经知道高浓度的抗体抑制所述抗原的识别(Biosensors and Bioelectronics 21(2005)103-110)。因此，低浓度的抗体(0.5μg/ml)被固定，并且随后与抗原反应。结果，当抗体被结合时(抗人激肽释放酶3/PSA(Kallikrein 3/PSA)抗体，R&D systems)，未标记的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加114RU，标记有一个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加472RU，标记有两个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加376RU，而标记有三个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加491RU。然后，抗原(重组人激肽释放酶3/PSA(Kallikrein 3/PSA)，0.5μg/ml)与所述抗体反应。结果，未标记的重组蛋白的表面等离子体共振信号的变化增加7RU，标记有一个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的相同变化增加49RU，标记有两个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的相同变化增加41RU，而标记有三个半胱氨酸残基的重组蛋白的表面等离子体共振信号的相同变化增加74RU。从该结果发现，标记有三个半胱氨酸残基的重组蛋白有效促进与抗原的结合(图8)。
[47]在下文中，本发明将参考实施例进行详细描述。然而，这些实施例只是用于说明性目的，而本发明不意图受到其限制。
具体实施方式
[48]实施例1：半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体的蛋白表达分析
[49]<1-1>标记有一个、两个、三个、四个和五个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体的基因制备
[50]为了在N-端用一个、两个、三个、四个和五个半胱氨酸残基标记，制备了六条引物。在所述六条引物中的五条有义引物的碱基序列中，起始密码子(ATG)之后是1到5个半胱氨酸密码子(TGC)，并且为了提供与G蛋白的连接，GAC GAC GAC GAC AAG(四个天冬氨酸(Asp)密码子和一个赖氨酸(Lys)密码子)被包括在内。而且，为了将基因插入到表达载体pET21a(Novagen)中，NdeI限制酶酶切位点被引入到N端引物中，并且XhoI限制酶酶切位点被引入到C端引物。为了获得链球菌的基因组基因，用引物(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8的碱基对，SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的碱基对，SEQ ID NO：5和SEQID NO：8的碱基对，SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8的碱基对，SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8的碱基对)进行聚合酶链反应(PCR)。因此，只获得了氨基酸区域(B1[一种10个起始氨基酸残基被切割的形式]，B2)，所述氨基酸区域已知为抗体结合的结构域。所获得的片段用限制酶——其与被引入每一引物中的酶相同——切割。然后，被切割的片段被插入到用NdeI和XhoI限制酶切割的pET21a载体中，从而制备pET-cys1-L-G蛋白、pET-cys2-L-G蛋白、pET-cys3-L-G蛋白、pET-cys4-L-G蛋白和pET-cys5-L-G蛋白载体(图2)。所述表达载体在N-端表达Met。
[51]引物1：有义(SEQ ID NO：3)
[52]5′-CATATGTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3′
[53]引物2：有义(SEQ ID NO：4)
[54]5′-CATATGTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3′
[55]引物3：有义(SEQ ID NO：5)
[56]5′-CATATGTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3′
[57]引物4：有义(SEQ ID NO：6)
[58]5′-CATATGTGCTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3′
[59]引物5：有义(SEQ ID NO：7)
[60]5′-CATATGTGCTGCTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG-3′
[61]引物6：反义(SEQ ID NO：8)
[62]5′-CTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGT-3′
[63]
[64]<1-2>蛋白质电泳的照片，显示标记有一个、两个、三个、四个和五个半胱氨酸的链球菌G蛋白变体的表达
[65]用制备的pET-cys1-L-G蛋白、pET-cys2-L-G蛋白、pET-cys3-L-G蛋白、pET-cys4-L-G蛋白和pET-cys5-L-G蛋白转化大肠杆菌BL21细胞，并且在37℃下振荡培养直到O.D(光密度，A600nm)变成0.6。然后，IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside)，1mM的总浓度)被加入到其中，从而在25℃诱导蛋白质表达。14小时之后，大肠杆菌被离心，并且用超声破碎所获得的细胞团(Branson，sonifier 450，3KHz，3W，5分钟)，以产生总蛋白溶液。通过离心将所述总蛋白溶液分离成为可溶组分蛋白质的溶液和不溶性蛋白质的溶液。上面获得的蛋白质溶液与缓冲溶液(12mM Tris-Cl，pH 6.8，5％甘油，2.88mM巯基乙醇，0.4％SDS，0.02％溴酚蓝)混合并在100℃加热5分钟，然后所得之物被加载在聚丙烯酰胺凝胶上，所述凝胶由被5％积层胶(pH6.8，宽10cm，长12.0cm)覆盖的1mm厚的15％的分离胶(pH8.8，20厘米宽，10厘米长)组成。随后，在200到100V和25毫安下进行电泳1小时，并且用考马斯亮蓝染色液染胶，以确认所述重组蛋白。
[66]图2中泳道的说明如下：
[67]泳道1：蛋白质大小标志物，
[68]泳道2：用质粒pET-cys1-L-G蛋白转化的大肠杆菌的总蛋白质，
[69]泳道3：用质粒pET-cys1-L-G蛋白转化的大肠杆菌的可溶组分蛋白质，
[70]泳道4：用质粒pET-cys1-L-G蛋白转化的大肠杆菌的不溶组分蛋白质，
[71]泳道5：用质粒pET-cys2-L-G蛋白转化的大肠杆菌的总蛋白质，[72]泳道6：用质粒pET-cys2-L-G蛋白转化的大肠杆菌的可溶组分蛋白质，
[73]泳道7：用质粒pET-cys2-L-G蛋白转化的大肠杆菌的不溶组分蛋白质，
[74]泳道8：用质粒pET-cys3-L-G蛋白转化的大肠杆菌的总蛋白质，
[75]泳道9：用质粒pET-cys3-L-G蛋白转化的大肠杆菌的可溶组分蛋白质，
[76]泳道10：用质粒pET-cys3-L-G蛋白转化的大肠杆菌的不容组分蛋白质，
[77](B)泳道1：蛋白质大小标志物，
[78]泳道2：用质粒pET-cys4-L-G蛋白转化的大肠杆菌的总蛋白质，
[79]泳道3：用质粒pET-cys4-L-G蛋白转化的大肠杆菌的可溶组分蛋白质，
[80]泳道4：用质粒pET-cys4-L-G蛋白转化的大肠杆菌的不溶组分蛋白质，
[81]泳道5：用质粒pET-cys5-L-G蛋白转化的大肠杆菌的总蛋白质，
[82]泳道6：用质粒pET-cys5-L-G蛋白转化的大肠杆菌的可溶组分蛋白质，
[83]泳道7：用质粒pET-cys5-L-G蛋白转化的大肠杆菌的不溶组分蛋白质。
[84]从质粒pET-cys1-L-G蛋白：cys1-G产生的蛋白质
[85]从质粒pET-cys2-L-G蛋白：cys2-G产生的蛋白质
[86]从质粒pET-cys3-L-G蛋白：cys3-G产生的蛋白质
[87]从质粒pET-cys4-L-G蛋白：cys4-G产生的蛋白质
[88]从质粒pET-cys5-L-G蛋白：cys5-G产生的蛋白质
[89]
[90]<1-3>标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的链球菌蛋白
G变体和对照(未用半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体)的表达和纯化
[91]为了纯化在如<1-2>中所述的表达之后获得的可溶蛋白质溶液，其中接合有六组氨酸的六个重组基因被表达的破碎细胞的溶液被加样到IDA Excellulose填充柱上。用洗脱液(50mM Tris-Cl，0.5M咪唑，0.5M NaCl，pH8.0)洗脱缀合(或偶联)有组氨酸的六种重组蛋白。洗脱的蛋白质溶液在PBS(磷酸缓冲盐溶液，pH7.4)缓冲溶液中透析。
[92]实施例2：将标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体和未标记的链球菌G蛋白变体重组蛋白结合到金薄膜表面，以固定抗体：检测所述表面上的变体重组蛋白结合到金薄膜表面并且固定所述抗体的反应，利用表面等离子体共振信号的变化，通过表面等离子体共振生物传感器进行检测。
[93]用95％硫酸和30％过氧化氢水溶液(体积比3:1)的混和溶液处理金薄膜芯片30分钟，然后顺序用双蒸水、乙醇和双蒸水洗涤所述芯片。随后，以氮气干燥所述芯片并将其安放在BIA-core表面等离子体共振传感器上。150μL分别标记有一个、两个和三个半胱氨酸的重组蛋白的200μg/mL溶液以及未标记的重组蛋白的200μg/mL溶液各自以5μL/分钟的流速被引入到所安放的芯片的金薄膜表面，从而固定所述蛋白质。在金薄膜表面和上述蛋白质反应之后，100μL的BSA(3mg/ml)以5μL/分钟的流速被引入，以防止非特异性反应。随后，100μL的抗体(100μg/ml，人IgG，Sigma)以5μL/分钟的流速被引入，以产生生物传感器，其中G蛋白变体和所述抗体被固定在金薄膜上，并且等离子体共振信号的变化被测量(图5)。
[94]实施例3：将标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体和未标记的链球菌G蛋白变体结合到金纳米颗粒并且固定抗体：将标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体和未标记的链球菌G蛋白变体结合到金纳米颗粒，固定抗体，并且用蛋白电泳确认所述抗体
[95]用PBS缓冲液洗涤2.5 O.D/ml的金纳米颗粒，然后在4℃下与100μL一系列链球菌G蛋白变体(200μg/ml)的每一种反应16小时。反应产物与10μL的抗体(3.5克/毫升，抗兔IgG(全分子)-TRITI偶联物，Sigma)在环境温度下反应2小时。而且，作为对照，2.5 O.D/ml的金纳米颗粒与10μL的抗体(3.5克/毫升)在环境温度下反应2小时。在反应完成之后，反应产物被离心，从而除去任何未反应的抗体分子，并且所得之物用PBS缓冲液洗涤。
[96]此后，与金纳米颗粒结合的蛋白质通过蛋白质电泳进行确认。图6示出的泳道的说明如下：
[97]泳道1：直接与金纳米颗粒结合的抗体。
[98]泳道2：未用半胱氨酸标记的G蛋白被固定在金纳米颗粒上并且随后抗体被结合到其上。
[99]泳道3：将标记有一个半胱氨酸残基的G蛋白变体固定在金纳米颗粒上。
[100]泳道4：将标记有两个半胱氨酸残基的G蛋白变体固定在金纳米颗粒上。
[101]泳道5：将标记有三个半胱氨酸残基的G蛋白变体固定在金纳米颗粒上。
[102]结果，与仅与抗体反应的金纳米颗粒相比，与链球菌G蛋白变体偶联并与抗体反应的金纳米颗粒与更大量的抗原分子结合。同样，与未标记重组蛋白相比，更大量的抗原分子与标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的重组链球菌G蛋白变体结合。从上述结果，确定了半胱氨酸标记的重组链球菌G蛋白变体在将抗体固定在金纳米颗粒中是有用的(图6)。
[103]
[104]实施例4：使标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体与在玻璃表面上形成的马来酰亚胺基反应以固定抗体：用玻璃表面上的马来酰亚胺基——其共价结合硫羟基——偶联上面修饰的重组蛋白，并且使用荧光扫描仪测量特异性抗体-结合反应
[105]玻璃表面被浸在Piranha溶液(食人鱼溶液)(硫酸：过氧化氢，3:1 v/v)中并且允许在烘箱中在90℃反应20分钟。反应之后，用水和乙醇洗涤玻璃表面，然后该玻璃表面被浸在含有1％ APTS((3-氨丙基)三甲氧基硅烷，09326，SIGMA-ALDRICH)的乙醇中15到20分钟以进行反应，从而提供氨化的表面。在反应完成之后，用乙醇洗涤玻璃表面，随后在烘箱中在100℃加热直到使用。所制备的氨化表面被浸在10mM溶解于DMSO(二甲基亚砜，D2650，SIGMA-ALDRICH)中的BMPS(N-[b-马来酰亚胺丙氧基]琥珀酰亚胺酯，22298，Pierce，USA)的溶液中反应大约30分钟。提供在最终玻璃表面上的马来酰亚胺基团——该基团将共价结合到SH基，与玻璃表面上用一个、两个或三个半胱氨酸残基标记的链球菌G蛋白变体反应，以固定所述蛋白质。在一系列链球菌G蛋白变体被固定的表面上，应用微阵列点样器，将荧光标记物质标记的抗体、单克隆抗生物素Cy3抗体(C5585，SIGMA-ALDRICH)以及对照——链亲和素Cy3(来自阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的链亲和素-Cy3，S6420 SIGMA-ALDRICH)排列到阵列中，并且随后使用荧光扫描仪测量特异性蛋白结合的程度和非特异性结合的影响。结果，没有检测到链亲和素-Cy3(1毫克/毫升)的荧光信号，并且由于荧光信号随着所述抗体——单克隆抗生物素Cy3抗体——的浓度的增加而增加，证实特异性地进行了与用一个、两个或三个半胱氨酸残基标记的链球菌G蛋白变体的抗体反应。同样，当所述抗体在使链球菌G蛋白变体以同样的浓度反应之后进行反应时，该反应在低浓度的具有高结合力的所述抗体下发生。据此，证实了标记有一个、两个和三个半胱氨酸残基的重组链球菌G蛋白变体对于将抗体固定在连接有马来酰亚胺的玻璃表面上是有用的(图7)。
[106]实施例5：将标记有一个、两个或三个半胱氨酸残基的链球菌G蛋白变体和未标记的链球菌G蛋白变体重组蛋白结合到金薄膜表面，并且随后使抗原一抗体反应发生：将所述表面上的修饰的重组蛋白结合到金薄膜表面以固定抗体，并且随后使用表面等离子体共振传感器，利用表面等离子体共振信号的变化来测量抗原检测反应(antigen-sensing reaction)
[107]用95％硫酸和30％过氧化氢水溶液(体积比3:1)的混和溶液(65℃)处理金薄膜芯片30分钟，然后依次用双蒸水、乙醇和双蒸水洗涤所述芯片。随后，以氮气干燥所述芯片并将其安装在BIA—core表面等离子体共振传感器上。150μL分别标记有一个、两个和三个半胱氨酸的重组蛋白的200μg/mL溶液以及未标记的重组蛋白的200μg/mL溶液(对照)各自以5μL/分钟的流速被引入到所安放的芯片的金薄膜表面，从而固定所述蛋白质。在金薄膜表面和上述蛋白质反应之后，100μL的BSA(3毫克/毫升)以5μL/分钟的流速被引入，以防止非特异性反应。随后，100μL的抗体(0.5μg/ml，抗人激肽释放酶3/PSA(Kallikrein 3/PSA)抗体，R&D systems)以5μL/分钟的流速被引入，并且使具有固定化抗体和50μL抗原(0.5μg/ml，重组人激肽释放酶3/PSA)的生物传感器进行反应。然后，检测等离子体共振信号的变化(图8)。
工业应用
[108]根据本发明的半胱氨酸—标记的G蛋白变体通过其硫羟基以取向的方式与生物传感器的固相支持体结合，因此有效地与抗体结合。因此，所述半胱氨酸标记的G蛋白变体可以被满意地用于利用抗原抗体反应的生物芯片和生物传感器中。
[109]

Claims (17)

1.一种半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，以下列式子表示：
Metx-(Cys)n-Ly-G蛋白-Qz
其中Met是甲硫氨酸；L是连接体；Q是用于蛋白质纯化的标记；x、y和z各自为0或1；并且n是从1到10的数。
2.根据权利要求1所述的半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，其中所述G蛋白包括来源于链球菌的G蛋白的B1和B2区。
3.根据权利要求2所述的半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，其中在所述G蛋白变体的B1结构域的N-端的10个氨基酸残基被删除。
4.根据权利要求1或2所述的半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，其中所述半胱氨酸标记由1至5个半胱氨酸残基组成。
5.根据权利要求2所述的半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，其中所述半胱氨酸标记由三个半胱氨酸残基组成。
6.根据权利要求1所述的半胱氨酸标记的链球菌G蛋白变体，其中所述连接体由四个天冬酰胺残基和一个赖氨酸残基组成。
7.核酸序列，其编码根据权利要求2或3所述的蛋白质。
8.表达载体，其包含根据权利要求7所述的核酸序列。
9.宿主细胞，其选自KCTC10948BP、KCTC10949BP、KCTC10950BP、KCTC10951BP和KCTC10952BP，所述细胞包含根据权利要求8所述的表达载体。
10.产生G蛋白变体的方法，所述方法包括培养根据权利要求9所述的宿主细胞，和从其分离所述G蛋白变体。
11.生物芯片或生物传感器，所述生物芯片或生物传感器通过将根据权利要求1所述的蛋白质结合到固相支持体的表面而制造。
12.根据权利要求11所述的生物芯片或生物传感器，其中所述固相支持体选自陶瓷、玻璃、聚合物、硅氧烷和金属。
13.根据权利要求12所述的生物芯片或生物传感器，其中所述金属是金。
14.根据权利要求10到12任一项所述的生物芯片或生物传感器，所述生物芯片或生物传感器通过将抗体结合到根据权利要求1所述的蛋白质而产生。
15.根据权利要求12所述的生物芯片或生物传感器，其中所述固相支持体选自陶瓷、玻璃、聚合物和硅氧烷，所述固相支持体的表面用选自马来酰亚胺基团、环氧基、硝基苯酚脯氨酸基团和甲基碘基团中的任一基团加以改性。
16.根据权利要求15所述的生物芯片或生物传感器，其中根据权利要求1所述的蛋白质通过硫羟基共价结合到所述表面上的马来酰亚胺基团、环氧基、硝基苯酚脯氨酸基团和甲基碘基团中的任一种。
17.一种分析抗原的方法，其应用根据权利要求14所述的生物芯片或生物传感器。
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011138641A1 (en) * 2010-05-05 2011-11-10 Sanitaria Scaligera Srl A construct comprising a ni and/or au substrate
EP2635564B1 (en) 2010-11-02 2017-04-26 Bayer Intellectual Property GmbH N-hetarylmethyl pyrazolylcarboxamides
KR101345674B1 (ko) * 2011-05-13 2013-12-30 한국생명공학연구원 Ｏｎ ｃｈｉｐ 질량분석을 위한 친수성/소수성으로 패턴화된 바이오칩
JP2013059313A (ja) * 2011-08-19 2013-04-04 Tosoh Corp システインタグを付加したＦｃ結合性タンパク質、および当該タンパク質を利用した吸着剤
KR101598581B1 (ko) * 2013-12-02 2016-02-29 한국생명공학연구원 광활성 메티오닌 모사체 도입 단백질 g 변이체
US9914757B2 (en) 2013-05-30 2018-03-13 Korean Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Methionyl tRNA synthetase for biosynthesis of photomethionine-labeled protein and method for preparing photoactive protein G variant using same
US10759834B2 (en) 2014-10-17 2020-09-01 The University Of Chicago Methods and compositions involving protein G variants
JP6869600B2 (ja) * 2016-06-28 2021-05-12 東ソー株式会社 システインタグを付加したフコース結合性レクチン、および当該レクチンを利用した吸着剤

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956296A (en) 1987-06-19 1990-09-11 Genex Corporation Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US4977247A (en) * 1986-02-14 1990-12-11 Genex Corporation Immobilized protein G variants and the use thereof
SE9503925D0 (sv) * 1995-11-07 1995-11-07 Pharmacia Biotech Ab Separationsmedium för IgG
EP0882463B1 (en) 1996-01-25 2005-06-08 Kaneka Corporation Adsorbent for immunoglobulins and complexes thereof and adsorption device
EP0972530A4 (en) 1997-03-25 2003-01-29 Kaneka Corp ADSORBENT FOR ELIMINATION OF HEPATITIS C VIRUS, ADSORBER AND METHOD OF ADSORPTION
US6406921B1 (en) * 1998-07-14 2002-06-18 Zyomyx, Incorporated Protein arrays for high-throughput screening
KR100368073B1 (ko) 1999-03-09 2003-01-24 한국생명공학연구원 융합파트너를 이용한 재조합 단백질의 제조방법
KR20010105686A (ko) * 2000-05-17 2001-11-29 구자홍 압축기
DE10196636T1 (de) * 2000-09-28 2003-09-04 Seagate Technology Llc Critical-Event-Log für ein Plattenlaufwerk
US7045283B2 (en) 2000-10-18 2006-05-16 The Regents Of The University Of California Methods of high-throughput screening for internalizing antibodies
AU2001296023A1 (en) 2000-10-30 2002-05-15 Takeda Chemical Industries Ltd. Process for producing peptide
JP4685294B2 (ja) 2001-09-18 2011-05-18 株式会社カネカ 新規ペプチド、生産方法、新規吸着体、吸着器および吸着方法
US7825227B2 (en) 2002-05-09 2010-11-02 Prolexys Pharmaceuticals, Inc. Method for purification of a protein complex and identification of its components
US20040009528A1 (en) 2002-07-11 2004-01-15 Shyh-Yu Shaw Protein chips
EP1564286A1 (en) 2004-02-11 2005-08-17 Université de Liège Hybrid proteins of beta-lactamase class A
WO2005121178A2 (en) 2004-06-08 2005-12-22 Wisconsin Alumni Research Foundation Immunoaffinity chromatography polyol-responsive monoclonal antibodies

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