KR100718207B1 - 금속 결합 단백질을 이용한 바이오-금속 칩 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골드 결합 단백질(GBP)을 이용한 바이오-골드 칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 골드 결합 단백질(GBP)을 코딩하는 유전자와 목적단백질(또는 목적펩티드)을 함유하는 재조합벡터, 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 골드 결합 단백질(GBP)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터, 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 골드 결합 단백질(GBP)을 코딩하는 유전자 및 목적단백질(또는 목적펩티드)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 골드 결합 단백질(GBP)-목적단백질의 융합단백질, 표면발현모체에 의해 골드 결합 단백질(GBP) 또는 골드 결합 단백질(GBP)-목적단백질의 융합단백질이 표면발현된 세포를 제작한 다음, 이를 골드 칩에 위치특이적으로 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오-골드 칩의 제작방법, 상기 방법으로 제작된 바이오-골드 칩 및 이를 이용한 바이오물질의 검출방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 골드 결합 단백질(GBP)을 이용하여 골드 칩 표면의 전처리 없이 직접 바이오물질을 고정함으로써, 복잡한 금속 칩 수식화 공정없이 바이오-골드 칩을 제작할 수 있어 생산성과 경제성에 향상된 효과를 기대할 수 있다.

골드 결합 단백질(GBP), 세포 표면 발현모체, 바이오-금속 칩

Description

금속 결합 단백질을 이용한 바이오-금속 칩 및 그 제조방법 {Bio-metal Chip Using Metal Binding Protein and Method for Fabricating the Same}

도 1은 플라스미드 pTrcGBP-SA의 유전자 지도이다.

도 2는 본 발명의 GBP를 이용한 바이오-골드 칩 및 센서 시스템 모식도이다.

도 3은 본 발명에 사용된 GBP와 스트렙타아비딘(streptavidin, SA)의 융합단백질 도메인 구조(domain structure)이다.

도 4는 바이오-골드 칩 상에서 GBP 융합단백질과 항 GFP 항체와의 반응을 나타내는 SPR(Surface Plasmon Resonance) 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명에 따른 바이오-골드 칩 상에서 GBP-SA 융합단백질을 이용한 탄수화물-단백질 상호작용의 반응의 결과를 나타낸 UV-vis spectroscopy 분석결과를 나타내는 그래프로, 1번 곡선은 bare gold nanoparticle + GBP융합단백질 + biotin-mannose + ConA-Texas Red, 2번 곡선은 bare gold nanoparticle + GBP융합단백질 + biotin-mannose, 3번 곡선은 bare gold nanoparticle의 분석결과이다.

도 6은 재조합 플라스미드 pTacFadLGBP-1의 유전자 지도이다.

도 7은 세포표면에 발현된 GBP에 의해 세포가 골드 표면에 고정된 것을 확인한 SPR 분석결과를 나타내는 그래프로, (A)는 세포 XL1-Blue의 각도의 함수에 대한 반사율의 함수로 표현된 것이고, (B)는 세포 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1)의 각도 함수에 대한 반사율의 함수로 표현된 것이다. (C)는 세포 XL1-Blue와 세포 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1)의 시간의 함수에 대한 공명각도의 함수로 표현한 그래프이다.

도 8은 골드 표면에 고정되어 있는 세포를 광학 현미경(optical microscope)으로 확인한 사진이다.

도 9는 세포 수에 따른 세포고정화 정도의 차이를 확인한 SPR 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 외부 pH 조건에 따른 세포고정화 정도의 차이를 확인한 SPR 분석결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 골드 표면에 고정된 세포가 일정 기간 동안 안정적으로 유지되는 것을 확인한 SPR 분석결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 금속 결합 단백질(metal binding protein, MBP)을 이용한 바이오-금속 칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, MBP를 코딩하는 유전자와 목적단백질(또는 목적펩티드)을 함유하는 재조합벡터, 표면 발현모체(surface anchoring motif)를 코딩하는 유전자와 MBP를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터, 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 MBP를 코딩하는 유전자 및 목적단백질( 또는 목적펩티드)을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 각각 배양하여 MBP-목적단백질 융합단백질, 표면발현모체에 의해 MBP가 표면발현된 세포 및 표면발현모체에 의해 MBP-목적단백질이 표면발현된 세포를 각각 제작한 다음, 이를 금속 칩에 위치 특이적(site-specific)으로 수식화(modification)하는 것을 특징으로 하는 바이오-금속 칩의 제작방법, 상기 방법으로 제작된 바이오-금속 칩 및 이를 이용한 바이오물질의 검출방법에 관한 것이다.

최근 게놈 프로젝트에 의해 10 여만 개로 예측되는 인간 유전자 중, 1 만여 개의 기능이 밝혀져 있고, 이러한 유전자들의 대부분은 질환과 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 대부분의 질병은 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 유발되기 때문에, 현재까지 개발되었거나 개발 중에 있는 의약품의 95% 이상이 단백질을 표적으로 하고 있다. 따라서, 단백질 센서 칩은 특정 단백질과 특이적으로 상호작용하는 생체분자의 기능을 밝히고, 단백질 기능분석 및 네트워크 분석을 통하여 얻어진 자료를 바탕으로 고전적인 방법으로는 불가능하였던 질병에 대한 치료 및 예방법을 개발하는 연구에 있어서 핵심기술로 소량의 물질을 선택적으로 분석할 수 있으며 실시간으로 측정할 수 있기 때문에 기초과학 연구뿐만 아니라, 환경오염 물질의 측정 및 약물이나 바이러스의 진단 등에 널리 이용되고 있다.

금속 칩을 이용한 바이오센서 중에서는 골드 칩이 대표적인데, 지금까지 진행되어온 골드 칩을 이용한 단백질-단백질, DNA-RNA, 탄수화물-단백질 상호작용에 관한 기술은 친화성 태그(Ni-NTA, Streptavidin, GST 등) 또는 골드 칩 표면에 화학적인 방법, 예를 들면 아민(amine), 리간드 티올(ligand thiol), 알데히드 (aldehyde)를 수식화하거나, 기능기가 부착된 리간드를 자기조립 단일층 (self-assembly monolayer)을 형성하여 목적단백질을 고정하거나, 생체분자의 배향성(orientation)을 분자수준에서 조절하여, 균일하고 안정된 생체분자의 단일층(monolayer)을 형성시키는 기술을 이용하여 위치 특이적으로 고정하여 단백질간 상호작용을 surface plasmon resonance(SPR)를 이용하여 분석하였다 (Hentz et al., Anal . Chem., 68:3939, 1996; Kukar et al ., Anal . Biochem ., 306:50, 2002; Hall D., Anal . Biochem ., 288:109, 2001; Canziani, G. et al ., Methods, 19:253, 1999; Brockman, J.M. et al ., JACS, 121:8044, 1999; Nelson, B.P. et al ., Anal . Chem ., 73:1, 2001; Jordan, C.E. et al ., Anal . Chem ., 69:4939, 1997; Goodrich, T.T. et al ., JACS, 126:4086, 2004).

그러나, 상기와 같이 다양한 골드 칩을 이용한 바이오센서 기술이 개발되었음에도 불구하고, 현재 금속 칩의 표면 처리기술은 칩 표면의 화학적 처리 방법이 복잡하고 비특이적인 단백질과 결합하는 등의 큰 단점을 가지고 있으며, 결합력이 약할 뿐만 아니라 많은 화학물질에 영향을 받을 수 있기 때문에 여러 단백질-단백질 상호작용 검사시에는 제한점이 많아 실용화가 어렵다. 또한, 단백질을 금속 칩 위에 고정하기 위해서는 높은 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 단점도 있다.

이에 바이오센서 개발에 요구되는 점 중의 하나는 바이오물질을 바이오센서 칩에 선택적이며 안정적으로 고정화할 수 있는 기술의 개발이다. 전통적인 고정화 방법은 크게 4가지 나눌 수 있다. 첫 번째는 센서 칩 표면에 바이오물질을 물리적 또는 화학적으로 흡착시키는 방법이고, 두 번째는 센서 칩 표면에 바이오물질을 공유결합을 생성하게 하는 방법이다. 세 번째는 막, 매트릭스, 고분자 등에 바이오물질이 포착되게 하는 방법이고, 마지막으로 바이오물질간의 교차결합을 유도하여 센서 칩 표면에 고정화하는 방법이 있다.

현재 센서 칩 표면에 세포를 고정화하기 위해 널리 사용되는 방법으로 피브로넥틴(fibronectin), 콜라겐(collagen) 등의 ECM (extracellular matrix) 단백질에 있는 세포-결합 펩티드를 사용하여 세포를 고정시키는 방법이 있다. 센서 칩 표면을 개선하기 위해 널리 사용되는 세포-결합 펩티드에는 Arg-Gly-Asp (RGD), Arg-Glu-Asp-Val (REDV) 등이 있다(Shin, H. et al., J. Biomed . Mater . Res ., 61:169, 2002; Ranieri, J.P. et al ., J. Biomed . Mater . Res., 29:779, 1995; Hubbell, J.A. et al., Biotechnol ., 9:568, 1991). 이러한 세포-결합 펩티드는 세포막에 위치해 있는 수용체(receptor)와 결합하는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 길이가 짧아 합성이 쉽고 경제적이며, 센서 칩 표면에서 세포가 유연하게 흡착할 수 있게 표면을 개선해주는 장점이 있다. 최근에는 자기조립기술을 접목하여 세포를 고정화하는 연구가 발표되었으나 (Choi, J.W. et al ., Biosens. Bioelectron ., 20:2300, 2005), 이 기술은 일차적으로 센서 칩 표면을 세포-결합 펩티드가 포함된 DNA 또는 단백질로 코팅을 한 후 세포를 고정하기 때문에 12시간 이상의 준비시간이 필요하고, 외부 환경에 의해 세포-결합 펩티드가 변성되거나 탈착되기 쉬우며 세포-결합 펩티드를 선택적으로 조절하기가 쉽지 않다.

최근에 단백질의 분비 발현 기술을 토대로 한 세포 표면 발현기술(cell surface display)이 등장하였다. 세포 표면 발현기술이란 우리가 원하는 단백질을 세포 표면에 부착하여 발현시키는 기술로, 박테리아나 효모 등 미생물의 표면 단백질을 표면 발현모체 (surface anchoring motif)로 사용하여 외래 단백질을 표면에 발현시키는 기술로서, 재조합 생백신, 펩티드/항체 라이브러리(library) 제작 및 스크리닝(screening), 전세포 흡착(whole cell absorbent), 전세포 생물 전환 촉매 등 다양한 응용범위를 가지고 있는 기술이다. 성공적인 세포 표면발현을 위해서는 사용하는 미생물의 표면 단백질을 이용하여 외래 단백질을 세포 표면에 발현시키기 위한 적당한 표면 단백질을 선정해야 하는데, 지금까지 대장균에서 사용된 표면 발현모체는 세포 외막 단백질, 지질 단백질(lipoprotein), 분비 단백질(secretory protein), 편모 단백질과 같은 표면기관 단백질 등 크게 4가지이다. 그람음성 박테리아의 경우 LamB, PhoE, OmpA 등과 같은 세포 외막에 존재하는 단백질을 주로 이용하였다. 표면 발현모체 중 하나인 FadL 단백질은 대장균의 지방산 대사와 수송에 관련된 외막 단백질로 20개의 역평행한 β-구조로 구성되어 있다 (Gristalli, G. et at ., Arch . Biochem . Biophys ., 377:324, 2000). FadL은 9개의 내부 루프가 세포질 내부로 향해 있고, 10개의 루프가 세포 외막으로 향해 있는데, 이 중 9번째 루프에 리파아제 유전자를 융합해서 리파아제를 세포 표면에 안정적이고 지속적으로 발현시킨 연구가 보고된 바 있다 (Lee, S.H. et at ., Appl . Envion . Microbial., 70:5074, 2004).

최근에 파지 디스플레이 또는 세균 디스플레이 기술을 이용하여 골드, 산화철, 산화아연, 백금, 실버, 이산화규소, 제올라이트 등의 무기금속에 선택적으로 결합을 하는 펩티드인 MBP(metal binding protein)의 염기서열이 밝혀졌다 (Sarikaya, M. et al ., Nature Materials, 2:577, 2003). 금속 결합 단백질 중에서 14개의 아미노산으로 이루어진 골드 결합 단백질 (gold binding protein, GBP)이 골드 표면에 선택적으로 결합한다고 밝혀진 이후 (Brown, S., Nature Biotechnol ., 15:269, 1997) GBP에 대한 연구가 진행되고 있으나, GBP가 어떻게 골드 표면을 인식하고 결합하는지에 대한 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 또한, 지금까지 GBP를 이용한 항원-항체 반응, 단백질-단백질 반응을 검출하는 예는 보고되었으나 (Richasrd, G. et al ., Biosens. Bioelectron ., 13:1117, 1998; Soh, N. et al., Talanta, 60:733, 2003), 다른 생물 공학적 응용에 사용된 연구는 보고된 바는 없다.

골드 표면에 흡착된 단백질은 사용한 버퍼나 밀리큐 증류수 (Milli Q water)에 아주 오랜 시간 떨어지지 않았고, 이는 퓨전 단백질이 그 표면에 아주 강하게 결합되어 있다는 것을 의미한다. 골드 표면과 GBP의 결합 메카니즘은 아직 정확히 밝혀져 있지 않지만, 골드 표면의 소수성 부분과 GBP의 서열 중 소수성 영역과 분자인식 (molecular recognition)을 기초로 특이적 결합양상(specific interaction)을 가진다고 예측하였다 (Braun, R., et al ., J. Biomater . Sci ., 13:747, 2002). 또한 GBP는 14개의 아미노산으로 구성되어 있으며 단일체(monomer), 이중체(dimer), 삼중체(trimmer), 또는 다중체(polymer) 형태로 사용되어 질 수 있으며, 삼중체 이상일 때 골드와 결합 친화력이 높은 것으로 나타났다 (Braun, R., et al., J. Biomater . Sci ., 13:747, 2002).

이에 본 발명자들은 골드 칩 표면에 특이적으로 결합하는 GBP 성질을 이용하여 GBP-목적단백질의 융합단백질이 고정된 바이오-골드 칩 및 대장균에서 유래한 세포 외막 단백질인 FadL에 의해 GBP 또는 GBP-목적단백질의 융합단백질이 표면발현된 세포가 골드 칩 표면 위에서 선택적이며 효율적이고, 안정적으로 고정될 수 있는 바이오-골드 칩을 고안하게 되었다.

본 발명자들은 또한, 삼중체의 GBP를 이용하여 스트렙타아비딘(SA)을 GBP에 융합 발현시켜 골드 칩 상에 위치 특이적으로 고정한 다음, 비오틴이 결합된 바이오물질을 선택적으로 고정함으로써 목적 바이오물질간의 상호반응을 효율적으로 분석할 수 있는 분석시스템을 고안하게 되었다.

본 발명자들은 바이오물질을 골드 칩에 위치특이적으로 고정한 바이오-골드 칩의 간단한 제작방법을 개발하고자 노력한 결과, 골드 결합 단백질를 이용하여 GBP-목적단백질의 융합단백질, 표면 발현모체에 의해 GBP가 표면발현된 세포를 각각 제작하고, 이를 금속 칩에 위치 특이적(site-specific)으로 고정함으로써 장시간 안정적으로 바이오물질반응을 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 GBP를 코딩하는 유전자와 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 구성된 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 GBP-목적단백질의 융합단백질을 제작한 다음, 이를 골드 칩에 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오-골드 칩의 제작방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 GBP를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 세포표면에 발현되도록 구성된 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 표면 발현모체에 의해 GBP가 표면발현된 미생물을 제작한 다음, 이를 골드 칩에 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오-골드 칩의 제작방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 세포표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 GBP를 코딩하는 유전자 및 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 GBP와 목적단백질이 융합된 형태로 세포표면에 발현되도록 구성된 재조합벡터로 형질전환된 미생물을 배양하여 GBP-목적단백질의 융합단백질이 표면발현된 미생물을 제작한 다음, 이를 골드 칩에 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오-골드 칩의 제작방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제작된 바이오-골드 칩 및 이를 이용한 바이오물질의 검출방법를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 목적단백질 또는 목적펩티드를 코딩하는 유전자와 GBP를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계; (b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 목적단백질 또는 목적펩티드와 GBP의 융합단백질을 발현시키는 단계; (c) 상기 융합단백질이 발현된 미생물을 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합단백질을 함유하는 수용성 분획을 수득하는 단계; 및 (d) 상기 융합단백질을 함유하는 수용성 분획을 골드 칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계를 포함하는 바이오-골드 칩의 제작방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 GBP를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 세포표면에 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계; (b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 표면 발현모체에 의해 GBP를 표면발현시키는 단계; 및 (c) 상기 융합단백질이 표면발현된 미생물을 골드 칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계를 포함하는 바이오-골드 칩의 제작방법을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 GBP를 코딩하는 유전자 및 목적단백질 또는 목적펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 GBP 및 목적단백질 또는 목적펩티드가 융합된 형태로 세포표면에 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계; (b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 표면 발현모체에 의해 GBP-목적단백질 또는 목적펩티드의 융합단백질을 표면발현시키는 단계; 및 (c) 상기 융합단백질이 표면발현된 미생물을 골드 칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계를 포함하는 바이오-골드 칩의 제작방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 숙주세포는 대장균인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 GBP는 목적단백질의 N말단, C말단, 또는 N-C중간에 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 GBP는 삼중체 또는 다중체인 것을 특징으로 할 수 있고, GBP 삼중체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제작되고, GBP-목적단백질의 융합단백질, 표면발현 모체에 의해 GBP가 표면발현된 세포 및 표면발현 모체에 의해 GBP-목적단백질의 융합단백질이 표면발현된 세포가 골드 칩에 위치특이적으로 고정되어 있는 바이오-골드 칩 및 상기 바이오-골드 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 바이오물질간의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 표면 발현모체는 FadL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 상기 목적단백질은 아비딘인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 아비딘은 스트렙타아비딘 또는 스트렙타아비딘에 기타 펩티드를 융합시킨 형태인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 목적펩티드는 RGD 펩티드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 고정은 마이크로 콘택트(microcontact printing) 방법을 통한 패터닝, PDMS(polydimethylsiloxane) 주형을 이용한 미세채널, 또는 마이크로 어레이를 이용한 spotting 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 검출은 SPR 또는 SPR 이미징을 통해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. SPR은 유리 칩에 얇은 금속 박막을 코팅한 칩을 이용하여 칩 표면에서 일어나는 반응을 굴절율(refractive index)의 변화를 민감하게 형광표지 없이 분석할 수 있는 기술이며, 굴절율의 변화를 CCD 카메라를 이용하여 이미지화한 것이 SPR 이미징이다. 바이오센서 시스템에 흔한 분석 방법으로서 현재 상용화되어 있고 단백질-단백질, 단백질-DNA, DNA-DNA 상호작용 검사에 사용되고 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제작되고, MBP-RGD 펩티드의 융합단백질이 고정되어 있는 바이오-골드 칩 및 상기 바이오-골드 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포의 패터닝 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 세포가 흡착하는 일종의 리간드 물질인 RGD 펩티드를 GBP에 융합 발현시켜 골드 칩에 패터닝한 후, 이를 이용하여 세포를 골드 칩에 패터닝하여 다양한 약물 스크리닝 검사에 활용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 GBP는 42개의 아미노산으로 이루어져 있으며 골드에 선택적으로 결합한다고 알려져 있다. 상기 GBP처럼 특정 무기금속에 선택적으로 결합하는 MBP는 수소 결합, 극성, 전자효과와 같은 화학적 요인과 크기나 형태와 같은 구조적 특징에 의해 무기금속 표면에 선택적으로 결합이 가능하다 (Weissbuch, I. et al ., Science, 253:637, 1991). 그러나 상기 GBP의 경우 골드 표면에 선택적으로 결합하는 메커니즘이 정확하게 밝혀지지 않았고, 다만 아미노산 서열 중 -KTQATS-가 용액중의 Au(Ⅲ) 이온으로부터 골드 크리스털 형성에 관여된다는 것이 보고되었다 (John, L. et al ., J. Mater . Chem ., 14:2325, 2004).

본 발명은 대장균으로부터 발현된 GBP-SA 융합단백질을 수용성 형태로 발현하여 간단한 세포 파쇄공정을 거친 다음, 이들을 골드 칩에 상기 융합단백질을 위 치 특이적으로 일정방향으로 고정하여 바이오-골드 칩을 제작하였다. 상기 바이오-골드 칩을 이용한 결과, 바이오물질간의 상호작용을 효율적으로 유도할 수 있었고, 결국 항체를 이용하여 반응을 쉽게 표지체가 없이(label free) 검색할 수 있었다.

또한, 상기 GBP를 세포 표면에 안정적으로 발현시키기 위한 표면 발현모체로 대장균에서 유래한 세포 외막 단백질 FadL를 선택하였고, 본 발명자들은 GBP의 N-말단에 대장균 세포외막 단백질을 코딩하는 유전자가 융합되고 항생제 내성유전자, 프로모터를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터로부터 형질전환된 미생물을 제공한다. 균주의 선별을 위하여 엠피실린 저항 유전자를 이용하였다. 본 발명에 있어서, 상기 GBP를 세포 표면에 안정하게 발현될 수 있도록 적절한 표면 발현모체를 사용한 점을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 금속 칩 표면의 전처리 과정 없이 GBP가 세포 표면에 발현된 미생물을 직접적으로 고정할 수 있는 방법을 제공한다. 기존의 고정화 방법은 일차적으로 센서 칩 표면을 N-말단 또는 C-말단이 변형된 DNA 또는 단백질로 코팅을 한 후 세포를 고정시켜야 하므로 그 과정이 복잡하고 번거로우며, 준비 시간 또한 12시간 이상을 필요로 한다. 이에 비해 본 발명은 세포 표면에 상기 폴리펩티드가 발현된 미생물을 직접 센서 칩 표면에 흘려주므로, 그 과정이 간편할 뿐 아니라 짧은 시간 내에 미생물이 효율적으로 고정할 수 있었다. PBS 버퍼로 시료를 준비하였기에 세포가 안정적으로 유지되며, 세포 표면에 발현된 GBP도 안정적으로 세포 표면에서 유지될 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 세포가 다양한 외부 환경에서도 안정적으로 금속 칩 표면에 고정이 되는 것을 특징으로 하고 있다. 상기 세포표면에 발현된 GBP가 다양한 pH 조건에서도 그 활성을 잃지 않고 골드 칩 표면에 고정이 되므로, 실제 여러 외부 환경에서 세포를 고정시키기 위해 본 방법을 적용할 수 있을 것이다.

또한 본 발명은 상기 GBP에 국한되지 않고, 최근에 밝혀지고 있는 여러 무기금속에 선택적으로 결합하는 MBP를 사용해서 (Sarikaya, M. et al ., Nature Materials, 2:577, 2003) 다양한 센서 칩에서의 세포 고정 기술을 적용할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

이하, 하기 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 결론적으로 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 바이오물질로 비오틴이 결합된 DNA를 사용한 것만을 기술하였으나, 비오틴을 결합시킬 수 있는 것이라면 특별히 제한되지 않는다는 것과 여러 다른 단백질을 이용한 바이오물질간의 상호작용 및 세포-바이오물질간의 상호작용의 검출에 적용할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

또한, 하기 실시예에서는 FadL과 GBP를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터를 사용한 것만을 기술하였으나, FadL과 GBP 및 목적단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합벡터를 이용하여 FadL에 의해 GBP-목적단백질의 융합단백질이 표면발현된 세포가 고정된 바이오-금속 칩을 제작할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

실시예 1: GBP-SA 유전자의 클로닝

GBP-SA를 발현시키는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, 보고된 GBP의 아미노산의 서열(Brown, S., Nature Biotechnol . 15:269, 1999)을 참고로 하였다. 재조합 플라스미드 pTrc-EGFP-SA (Park J.P., et al ., Biotechnol. Bioproc . Eng., 9:137, 2004)를 주형 DNA로 사용하여 GBP 및 스트렙타아비딘이 융합된 형태로 발현되도록 하기 위하여 서열번호 1~3의 프라이머를 사용하였다. 클로닝을 위해 제한효소 NcoI의 절단위치가 서열번호 1의 프라이머에 삽입되었고, 합성된 서열번호 3의 프라이머에는 제한효소 BamHⅠ의 절단위치가 삽입되어 있다.

서열번호 1: 5'-GCGAATTCCATGGGCAAAACCCAGGCGACCAGCGGCACCATCCAGAGCATGCA

TGGTAAAACGCAAGCCACGTCT-3' (프라이머 1)

서열번호 2: 5'-GGTAAAACGCAAGCCACGTCTGGTACGATTCAATCTATGCACGGTAAAACCC

AAGCGACGAGCGGTACCATTCAGTCTGGCATCATCACCGGCACCTG-3' (프라이머 2)

서열번호 3: 5'-CGCGCGGGATCCTTACGGCTTCACCTTGGTG-3' (프라이머 3)

상기 pTrc-EGFP-SA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 2와 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 다음, 상기 증폭된 PCR 산물을 주형 DNA로 사용하고, 최종적으로 서열번호 1과 3의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 최종적으로 GBP와 스 트렙타아비딘이 융합된 형태의 산물을 수득하였다. PCR 조건으로 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing)은 56℃에서 1분간, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한번 하였다.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 500 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지의 제한효소 NcoI과 BamHI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, 스웨덴)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pTrcGBP-SA를 제작하였다.

상기 제작된 pTrcGBP-SA를 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 XL1-Blue에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 50 ㎎/L)과 박토-아가(bacto-agar, 15 g/L)가 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 XL1-Blue/pTrcGBP-SA를 제조하였다. 도 1은 전기 제작한 플라스미드 pTrcGBP-SA의 유전자 지도를 나타낸 것이다. 본 실시예에서는 스트렙타아비딘의 N-말단에 GBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하였고, 본 발명의 요지상 C-말단에 GBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명한 사실이다.

실시예 2: GBP-SA 융합단백질의 발현

강력하고 유도 가능한 trc 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pTrcGBP-SA로 형질전환된 대장균 XL1-Blue(Stratagene, La Jolla, Calif., 미국)을 배양하여 GBP-SA 융합단백질을 발현하였다. trc 프로모터는 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pTrcGBP-SA로 형질전환된 대장균 XL1-Blue의 경우, 다음과 같이 스트렙타아비딘에 융합된 GBP를 제조하였다. 형질전환된 재조합 대장균을 LB 액체배지 200 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pTrcGBP-SA 재조합 플라스미드는 trc 프로모터를 가지고 있어 IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. 유전자 발현유도는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.6일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 행하였다.

유도발현 후 4시간 후에 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, conn., 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하여 GBP-SA 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질분획을 수득하였다. 상기 단백질은 브래드포드 방법(Bradford, M. et al ., Anal . Biochem., 72:248, 1976)을 이용하여 정량하였다.

실시예 3: GBP-SA 융합단백질을 고정한 바이오-골드 칩의 제작

실시예 2에서 수득된 GBP-SA 융합단백질을 함유하는 수용성단백질 분획을 히페스버퍼(10 mM HEPES, 0.3 M NaCl and 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 1 mg/mL 농도로 희석하였다. 골드 칩(K-MAC, 대전, 한국)을 H₂SO₄/H₂O₂ (3/1, v/v) 용액으로 30분 처리하여 표면의 유기물을 완전히 제거하고 PDMS(polydimethylsiloxane) 주형을 골드 칩에 장착한 다음 골드 칩과 PDMS 주형사이의 미세채널을 이용하여 시린지펌프 (syringe pump, SP210iw, World Precision Instruments, Inc., 미국)로 5 μL/min 유속으로 흘리면서 골드 칩의 표면에 고정한다. 세척버퍼(PBS, pH 8.0)로 다시 10 μL/min 유속으로 흘려서 충분히 세척 후 3 프라임에 비오틴이 수식화되어 있는 탐침 DNA를 마지막으로 증류수로 10 μL/min 유속으로 흘려 세척 후 질소가스로 미세채널을 흘려서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법으로, AutoLab SPR instrument (Eco Chemie, KM Utrecht, Netherlands, 생명공학연구소 나노바이오센터)에 장착한 다음, 상기 수용성 단백질 분획 50 μL를 SPR용 골드 칩에 가하고 30분간 반응시켜, 상기 융합단백질을 위치 특이적으로 고정하였다. 다음으로 세척버퍼(10 mM HEPES, 0.3 M NaCl and 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 세척(washing)하였다.

또한 대조 실험군으로 1 mg/mL GFP를 히페스버퍼(HEPES buffer) 고정용액으로 희석한 다음, 상기와 같은 방법으로 골드 칩에 고정하였다.

실시예 4: 바이오-골드 칩을 이용한 단백질-단백질 상호작용의 검출

anti-GFP 폴리클로날 항체를 실시예 3에서 제작된 골드 칩과 상온에서 30분 간 반응시킨 다음, 세척버퍼(10 mM HEPES, 0.3 M NaCl and 0.05% Tween 20, pH 7.4)로 상온에서 세척하였다. 상기 반응에 따른 골드칩의 표면 굴절율(refractive index) 또는 반응유닛(response unit, RU)의 값을 이용하여 반응을 검출하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, GBP-EGFP 융합 단백질은 골드 칩에 선택적으로 고정되어 anti-GFP 폴리클로날 항체에 의해 검출되었으나, 상대적으로 EGFP 단백질은 anti-GFP 폴리클로날 항체에 의해 거의 검출되지 않았다.

실시예 5: 바이오-골드 칩을 이용한 DNA 혼성화 검출

골드 칩에서 DNA-DNA 혼성화 반응 및 단백질-DNA 상호작용 검출은 Corn 그룹에서 보고한 바 있다. 즉 골드 칩 표면에 부착된 기능기를 자기조립 단일층 (self assembly monolayer)을 이용하여 표면에 수식화하고, 이를 이용하여 탐침(probe) DNA를 고정하고 다시 표적 DNA를 혼성화 반응하여 SPR imaging 기법을 통하여 보고하였다 (Brockman, J.M. et al ., JACS, 121:8044, 1999; Smith, E.A. et al ., Langmuir., 17:2502, 2001). EGFP 유전자를 아비딘 유전자로 대체한 다음, 실시예 1과 2를 반복하여 GBP-아비딘 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질 분획을 제조한 다음, 상기 수용성 단백질 분획을 실시예 3과 같은 방법으로 골드칩에 위치 특이적으로 고정하여 GBP-아비딘 융합단백질이 고정된 바이오-골드 칩을 제작할 수 있다.

상기 GBP-아비딘 융합단백질이 고정된 바이오-골드 칩은 비오틴이 결합되어 있는 DNA와 반응시켜 아비딘-비오틴 결합에 의한 DNA 혼성화 반응 검출에 이용할 수 있다 (도 2).

실시예 6: 바이오-골드 칩을 이용한 세포 패터닝

RGD 펩티드를 이용한 유리, 고분자, 골드 표면상에서 세포 패터닝 기술을 이용하여 약물 스크리닝 기술에 대한 활용 가능성이 제시되었다 (Lee, K.B. et al ., Langmuir., 20:2531, 2004; Pitt, C.G. et al ., Biomaterials, 1981:215). 이와 같이 EGFP 유전자를 RGD 펩티드 유전자로 대체한 다음, 실시예 1과 2를 반복하여 GBP-RGD 펩티드 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질 분획을 제조한 다음, 상기 수용성 단백질 분획을 실시예 3과 같은 방법으로 골드 칩에 위치 특이적으로 고정하여 GBP-RGD 펩티드 융합단백질이 고정된 바이오-골드 칩을 제작할 수 있다.

상기 GBP-RGD 펩티드 융합단백질이 고정된 바이오-골드 칩은 세포 패터닝에 이용할 수 있다 (도 2). 즉, GBP-RGD 펩티드 융합단백질을 골드 칩에 마이크로 콘택트 프린팅 방법을 이용하여 패터닝한 후 패터닝된 RGD를 이용하여 다시 세포를 패터닝하여 약물 스크리닝에 사용할 수 있다. 상기 패터닝은 형광현미경(fluorescence microscopy)을 통해 검출할 수 있다.

실시예 7: 바이오-골드 칩을 이용한 탄수화물-단백질 상호작용의 검출

상기 실시예 3을 통해서 획득된 GBP-SA 융합단백질을 이용하여 탄수화물-단백질 상호작용의 검출할 수 있다. 즉, 바이오-골드 칩 위에서 융합단백질을 캡쳐 리간드로 사용하여 고정한 다음 비오틴을 컨쥬게이션된 모노 싸카라이드인 만노스를 흘려 반응한 후, 다시 렉틴 단백질의 한 종류인 콘카나발린 A (concanovalin A) 에 Texas Red가 복합된(conjugated) 물질을 작용시켜 탄수화물-단백질 상호작용을 검출할 수 있었다. 상기 반응은 UV-vis spectroscopy를 통해 확인하였다 (도 5).

실시예 8 :재조합 발현 벡터 pTacFadLGBP-1의 제조

FadL 유전자를 클로닝하기 위하여, 대장균 W3110 (F- mcrA mcrB IN(rrnD rrnE) 1E, KCTC 2223)의 염색체를 주형 DNA로 사용하고, 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머를 사용하여, PCR (첫 번째 변성 94℃ 3분, 두 번째 변성 94℃ 30초, 교잡 58℃ 30초, 연장 72℃ 70초, 26회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)을 수행하였다. 상기 PCR로부터 회수된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동법을 사용하여 약 1.16 Kb 크기의 DNA 절편을 분리하였다.

GBP 유전자는 상기 실시예 1에서 클로닝하여 만든 pTrc99AGBP-SA 벡터를 주형 DNA로 사용하고, 서열번호 6과 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 PCR(첫 번째 변성 94℃ 3분, 두 번째 변성 94℃ 30초, 교잡 58℃ 30초, 연장 72℃ 20초, 26회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)을 수행하였다. 이 PCR로부터 수득된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동법을 사용하여 약 140 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였다.

서열번호 4 : 5'-CAGCGAATTCATGGTCATGAGCCAGAAAACC-3’（프라이머 4)

서열번호 5 : 5'-TGCATTCTAGAACGATTCTGTGCAGGAACTGG-3’(프라이머 5)

서열번호 6 :　5'-AATCGTTCTAGAGCTAGCATGCACGGCAAAACCCAGG-3’(프라이머 6)

서열번호 7 : 5'-GACAAGCTTACTAGTATTAAGACTGAATGGTACCGCTCGTCGC-3’(프라이머 7)

FadL-GBP 유전자를 클로닝하기 위하여, 위에서 수득한 FadL 유전자와 GBP 유전자를 주형 DNA로 사용하고, 서열번호 4와 서열번호 7의 프라이머를 사용하여 PCR(첫 번째 변성 94℃ 3분, 두 번째 변성 94℃ 30초, 교잡 58℃ 30초, 연장 72℃ 1분 20초, 26회 반복, 마지막 연장 72℃ 7분)을 수행하였다. 이 PCR로부터 수득된 DNA는 아가로즈 겔 전기영동법을 사용하여 약 1.3 Kb 크기의 DNA 절편을 분리하고, 이를 제한 효소 EcoRI과 HindⅢ으로 절단하였다. 이를 동일한 제한효소로 절단한 tac 프로모터를 갖는 플라스미드 pTac99A벡터 (Park, S.J. et al ., Biotechnol . Techn., 12:1071, 2000)에 삽입하여 재조합 플라스미드 pTacFadLGBP-1을 제조하였다. 이 재조합 벡터를 열충격(heat shock)방법으로 대장균 XL1-Blue (recA1 endA1 gyrA96 thi -1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F´ proAB lacI ^q ZM15 Tn10 (Tet^r)], Stratagene)에 도입하여 형질전환한 후, 엠피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 평판배지에서 선별하여 재조합 발현벡터 pTacFadLGBP-1을 수득하였다(도 6). 본 실시예에서는 FadL-GBP의 융합단백질을 코딩하는 재조합벡터를 제조하였으나, 본 발명의 요지상 목적단백질의 C-말단에 FadL-GBP의 융합단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 사실이다.

실시예 9: 재조합 벡터를 이용해 표면에 GBP가 발현된 세포

상기 실시예 8에서 제조된 재조합 벡터 pTacFadLGBP-1로 형질전환된 대장균 XL1-Blue를 앰피실린(50 μg/L)이 첨가된 LB 액체 배지 100 mL이 담긴 250 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 상기 재조합 벡터는 tac 프로모터를 가지고 있어 IPTG를 처리하면 유전자 발현을 유도할 수 있다. 따라서 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 흡광도가 0.4일 때 0.1 mM IPTG를 첨가하여 유전자 발현을 유도하였다. IPTG 처리를 하여 4시간 후 배양액을 4℃, 6000 rpm에서 10분 동안 원심분리 하였다. 상등액은 버리고 수득한 세포는 PBS (phosphate buffered saline, 10 mM, pH 7.4)버퍼로 세척한 후에 다시 4℃, 6000 rpm에서 10분 동안 원심분리 한 후 다시 PBS 버퍼로 현탁하였다. 이때 세포가 터지지 않도록 주의한다.

실시예 10: 세포표면에 발현된 GBP에 의해 골드 표면에 고정된 세포의 측정

상기 실시예 9에서 제조된 형질 전환체 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1)가 골드 표면 위에 선택적으로 고정화되는지 확인하기 위해 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance, 이하 SPR) 현상을 이용하였다. GBP가 표면발현된 세포 XL1-Blue(pTacFadLGBP-1)를 1×10⁷ CFU/mL되도록 PBS 버퍼에 현탁하여 300 μL 준비한다. 또한 대조 실험군으로 세포 XL1-Blue가 1×10⁷ CFU/mL되도록 PBS 버퍼에 현탁하여 300 μL 준비한다. 골드 칩(K-MAC, 대전, 한국)은 piranha (30% H₂O₂/70% H₂SO₄)용액으로 세척하여 표면의 유기물을 완전히 제거한 후 K-MAC SPR 장비에 장착하고, PBS 버퍼를 20분 흘려주어 골드 칩 표면을 안정화시킨다. 이 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1) 세포를 시료 주입부에 넣고 30분간 반응을 시킨 다음, PBS 버퍼를 흘려주었다. K-MAC의 SPR은 단일채널 표면 플라즈몬 공명 장비이므로 대조 실험을 하기 위해, 다시 piranha 용액으로 세척한 골드 칩을 SPR 장비에 장착한 후 PBS 버퍼를 20분 흘려주어 골드 칩 표면을 안정화 시킨 후 XL1-Blue 세포를 시료 주입부에 넣고 30분간 반응을 시킨 다음 PBS 버퍼를 흘려주었다. 실시간 상호작용에 의해 얻어진 결과는 도 7에 나타냈다.

대장균 XL1-Blue의 경우, SPR 센서 칩 표면에서 반응 전후의 각도가 51.4도에서 51.43도로 0.03도 변했다. 이는 XL1-Blue 세포가 골드 칩 표면에 고정되지 않았음을 의미한다. 대장균 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1)의 경우, SPR 센서 칩 표면에서 반응 전후의 각도가 51.4도에서 51.9도로 약 0.5도가 변하였고, 이는 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1) 세포가 SPR 센서 칩 표면에 선택적으로 고정되었음을 의미한다.

실시예 11: 세포 표면에 발현된 GBP에 의해 골드 표면에 고정된 세포 사진

골드 표면에 고정된 세포를 광학 현미경(optical microscope)을 통해 확인하였다. 상기 실시예 10에서 사용한 세포는 그람음성세균으로 세포벽이 얇고 세포벽의 위치도 두 세포막 사이에 존재한다. 크리스탈 비올렛을 사용하여 세포를 염색하면 크리스탈 비올렛이 세포벽에 흡착하여 세포가 보라색으로 보이므로 골드 표면위에 고정된 세포를 보다 쉽게 확인할 수 있다. 실시예 10에서 SPR을 통해 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1) 세포가 SPR 센서 칩 표면에 고정됨이 확인된 골드 칩을 꺼내어 표면을 건조시키기 위해 상온에서 20분 놓아두었다. 그리고 골드 칩 표면에 크리스탈 비올렛 (1 g/50 mL) 50 μL를 떨어뜨리고 3분 후에 증류수로 씻어내었다. 이를 광학 현미경을 사용하여 골드 칩 표면에 세포가 고정되어 있음을 확인하였다 (도8).

실시예 12: 세포 수에 따른 세포의 고정화 정도

세포 수에 따른 고정화 정도의 차이를 SPR를 이용하여 확인하였다. 상기 실시예 10에서 사용한 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1) 세포가 1×10⁷ CFU/mL일 때, SPR 각도가 0.507±0.043도 변화하였다. 또한, 상기 세포가 1×10⁶ CFU/mL, 1×10⁵ CFU/mL일 때, 각각 SPR 각도가 0.248±0.033, 0.049±0.007도씩 변화됨을 확인하였다. 도 9에서 세포 수가 많아질수록 SPR 각도 변화폭이 크므로 측정 범위가 확장되지만 세포가 완전히 고정되어 평형에 도달하기까지 시간이 다소 걸리는 것을 알 수 있다.

실시예 13: 세포 표면에 발현된 GBP의 pH에 대한 안정성

외부 pH에 따른 세포 고정화 정도의 차이를 SPR을 이용하여 확인하였다. 다양한 pH 조건에서 상기 실시예 9에서 제조된 XL1-Blue (pTacFadLGBP-1) 세포 1.3×10⁷ CFU/mL를 흘려주어 SPR 각도의 변화를 측정하였다(도10). 일반적으로 세포를 고정시키기 위해 사용되는 버퍼 조건(pH 7.4)에서뿐만 아니라, 산성 또는 염기성인 조건에서도 세포가 센서 칩 표면에 고정됨을 확인하였다. 이는 세포 표면에 발현된 GBP가 다양한 pH 환경에서도 그 활성을 잃지 않고 골드 칩 표면에 안정적으로 결합되는 것을 의미한다.

실시예 14: 센서 칩 표면에 일정시간 동안 고정되어 있는 세포

센서 칩 표면위에 고정되어 있는 세포가 얼마나 오랫동안 안정적으로 유지되는지 확인하기 위하여 SPR를 사용하였다. PH 7.4에서, 상기 실시예 9에서 제조된 XL1-Blue(pTacFadLGBP-1) 세포 1×10⁷ CFU/mL를 SPR 센서 칩에 흘린 결과, 세포가 센서 칩 표면에 고정됨으로써 SPR 각도가 52.16도에서 52.71도로 약 0.55도 증가하였고, 약 60시간(210,000초) 이후에는 약 0.05도 감소되었다 (도11). 이는 GBP가 발현된 세포가 60시간 동안 센서 칩 표면에 안정적으로 고정되어 있음을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 것은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 MBP가 금속 칩에 특이적으로 결합하는 성질을 이용하여, MBP-목적단백질의 융합단백질과 표면발현모체에 의해 MBP가 표면발현된 세포 및 MBP-목적단백질이 표면발현된 세포를 금속 칩에 위 치 특이적으로 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오-금속 칩의 제작방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 의하면, 바이오칩에 널리 사용되는 골드 칩에 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 목적단백질과 세포를 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 목적단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 바이오-금속 칩은 다양한 pH 조건에서도 금속 칩 표면에 안정적으로 고정되고, 여러 환경에서 세포 고정 실험을 할 수 있어, 높은 검출효율을 나타내고, 단백질-DNA, 단백질-중금속, 단백질-항체, 단백질-펩타이드, 탄수화물-단백질, 단백질-단백질 및 세포-바이오물질간의 상호작용 검출방법에서 비특이적인 단백질 결합이 일어나지 않는 장점이 있어 이 시스템을 통한 신약의 스크리닝 등에 매우 유용할 것이다.

Claims (24)

1. 다음의 단계를 포함하는 바이오-골드 칩의 제작방법:

   (a) 골드 결합 단백질을 코딩하는 유전자와 목적단백질 또는 목적펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계;

   (b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 골드 결합 단백질과 목적단백질 또는 목적펩티드의 융합단백질을 발현시키는 단계;

   (c) 상기 융합단백질이 발현된 미생물을 회수한 다음, 파쇄하여 상기 융합단백질을 함유하는 수용성 분획을 수득하는 단계; 및

   (d) 상기 융합단백질을 함유하는 수용성 분획을 골드 칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 골드 결합 단백질은 삼중체 또는 다중체인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 골드 결합 단백질 삼중체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 골드 결합 단백질은 목적단백질 또는 목적펩티드의 N말단, C말단 또는 N-C중간에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 목적단백질은 아비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 목적펩티드는 RGD 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제작되고, 골드 결합 단백질과 목적단백질의 융합단백질이 고정되어 있는 바이오-골드 칩.
9. 제6항의 방법에 의해 제작되고, 아비딘과 골드 결합 단백질의 융합단백질이 고정되어 있는 바이오-골드 칩.
10. 제9항의 바이오-골드 칩에 비오틴이 결합되어 있는 DNA를 반응시키는 것을 특징으로 하는 DNA 혼성화 반응의 검출방법.
11. 제7항의 방법에 의해 제작되고, 골드 결합 단백질과 RGD 펩티드의 융합단백질이 고정되어 있는 바이오-골드 칩.
12. 제11항의 바이오-골드 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 세포 패터닝 방법.
13. 다음의 단계를 포함하는 바이오-골드 칩의 제작방법:

    (a) 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 골드 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 두 유전자가 융합된 형태로 세포표면 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계;

    (b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 표면 발현모체에 의해 골드 결합 단백질(GBP)을 표면발현시키는 단계; 및

    (c) 상기 융합단백질이 표면발현된 미생물을 골드 칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계.
14. 다음의 단계를 포함하는 바이오-골드 칩의 제작방법:

    (a) 표면 발현모체를 코딩하는 유전자와 골드 결합 단백질을 코딩하는 유전자 및 목적단백질 또는 목적펩티드를 코딩하는 유전자를 함유하고, 상기 골드 결합 단백질과 목적단백질 또는 목적펩티드가 융합된 형태로 세포 표면에 발현되도록 구성된 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입하여 형질전환 미생물을 준비하는 단계;

    (b) 상기 형질전환 미생물을 배양하여 표면 발현모체에 의해 골드 결합 단백질-목적단백질 또는 목적펩티드의 융합단백질을 표면 발현시키는 단계; 및

    (c) 상기 융합단백질이 표면발현된 미생물을 골드 칩에 위치 특이적으로 고정시키는 단계.
15. 제14항에 있어서, 상기 목적단백질은 아비딘인 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제14항에 있어서, 상기 목적펩티드는 RGD 펩티드인 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제14항에 있어서, 상기 표면 발현모체는 FadL인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 삭제
19. 제14항에 있어서, 상기 골드 결합 단백질은 삼중체 또는 다중체인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제19항에 있어서, 상기 골드 결합 단백질 삼중체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제14항에 있어서, 상기 고정은 금속 칩 표면의 전처리 과정 없이 상기 골드 결합 단백질이 발현된 세포를 직접 고정하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제13항 내지 제17항 및 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제작되고, 골드 결합 단백질이 표면발현된 미생물이 고정되어 있는 바이오-골드 칩.
23. 삭제
24. 제22항의 바이오-골드 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 단백질-DNA, 단백질-항체, 단백질-펩티드, 탄수화물-단백질 및 단백질-단백질간의 상호작용으로 구성된 군에서 선택된 상호작용을 검출하는 방법.

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