KR100979282B1

KR100979282B1 - 실리카 결합단백질을 이용한 바이오-실리카 칩 및 그제조방법

Info

Publication number: KR100979282B1
Application number: KR1020080026803A
Authority: KR
Inventors: 이상엽; 박태정; 최양규; 구본상; 안재혁
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2008-03-24
Filing date: 2008-03-24
Publication date: 2010-08-31
Also published as: US8389225B2; KR20090101582A; US20100035362A1

Abstract

본 발명은 실리카 결합단백질을 이용한 바이오-실리카 칩 및 그 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 실리카 결합단백질과 탐침단백질의 융합단백질이 실리카층을 포함하는 칩에 고정되어 있는 바이오-실리카 칩과 이의 제조방법, 이를 이용한 바이오물질과의 상호작용을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 바이오-실리카 소자 칩은 단백질-DNA, 단백질-리간드, 단백질-항체, 단백질-펩타이드, 단백질-탄수화물, 단백질-단백질 및 세포-바이오 물질 간의 상호작용 검출방법에서 비특이적인 단백질 결합이 일어나지 않는 장점이 있어 바이오센서 등의 응용에 매우 유용할 것이다. 또한, 이의 제조방법은, 바이오 센서에 널리 사용되고 있는 실리카 소자 칩에 별도의 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 탐침 단백질을 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 탐침 단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.

실리카 결합단백질, 단백질 칩, 탐침 단백질, 실리카 칩, 바이오 센서

Description

실리카 결합단백질을 이용한 바이오-실리카 칩 및 그 제조방법{Bio-silica Chip Using Silica Binding Protein and Method for Fabricating the Same}

최근 게놈 프로젝트에 의해 10 여만 개로 예측되는 인간 유전자 중, 1 만여 개의 기능이 밝혀져 있고, 이러한 유전자들의 대부분은 질환과 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 대부분의 질병은 유전자 수준이 아닌 단백질 수준에서 유발되기 때문에, 현재까지 개발되었거나 개발 중에 있는 의약품의 95% 이상이 단백질을 표적으로 하고 있다. 따라서, 단백질 센서 칩은 특정 단백질과 특이적으로 상호작용하는 생체분자의 기능을 밝히고, 단백질 기능분석 및 네트워크 분석을 통하여 얻어진 자료를 바탕으로 고전적인 방법으로는 불가능하였던 질병에 대한 치 료 및 예방법을 개발하는 연구에 있어서 핵심기술로 소량의 물질을 선택적으로 분석할 수 있으며 실시간으로 측정할 수 있기 때문에 기초과학 연구뿐만 아니라, 환경오염 물질의 측정 및 약물이나 바이러스의 진단 등에 널리 이용되고 있다.

단백질 센서 칩 등 바이오센서 중에서는 실리카 칩이 대표적인데, 지금까지 진행되어온 실리카 칩을 이용한 단백질-단백질, DNA-RNA, 탄수화물-단백질 상호작용에 관한 기술은 친화성 태그(Ni-NTA, Streptavidin, GST 등) 또는 실리카 칩 표면에 화학적인 방법, 예를 들면 아민(amine), 리간드 티올(ligand thiol), 알데히드(aldehyde)를 수식화하거나, 기능기가 부착된 리간드를 자기조립 단일층 (self-assembly monolayer)을 형성하여 탐침단백질을 고정하거나, 생체분자의 배향성(orientation)을 분자수준에서 조절하여, 균일하고 안정된 생체분자의 단일층(monolayer)을 형성시키는 기술을 이용하여 위치 특이적으로 고정하여 단백질간 상호작용을 표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 등을 이용하여 분석하였다 (Hentz et al., Anal . Chem., 68:3939, 1996; Kukar et al ., Anal . Biochem ., 306:50, 2002; Hall D., Anal . Biochem ., 288:109, 2001; Canziani, G. et al ., Methods, 19:253, 1999; Brockman, J.M. et al ., JACS, 121:8044, 1999; Nelson, B.P. et al ., Anal . Chem ., 73:1, 2001; Jordan, C.E. et al ., Anal . Chem ., 69:4939, 1997; Goodrich, T.T. et al ., JACS, 126:4086, 2004).

그러나, 상기와 같이 다양한 실리카 칩을 이용한 바이오센서 기술이 개발되었음에도 불구하고, 실리카 칩의 표면 처리기술은 여전히 칩 표면의 화학적 처리 방법이 복잡하고 비특이적인 단백질과 결합하는 등의 큰 단점을 가지고 있었다. 또 한, 단백질의 결합력이 약할 뿐만 아니라 많은 화학물질에 영향을 받을 수 있기 때문에 여러 단백질-단백질 상호작용 검사시에는 제한이 많아 실용화가 어려웠다. 또한, 단백질을 실리카 칩 위에 고정하기 위해서는 높은 순도가 요구되어 복잡한 정제공정이 포함되어야 하므로 경제성이 떨어지는 단점도 있었다. 이에 이와 같은 단점을 보완한 새로운 칩의 개발이 요구되었다.

또한, 바이오센서 개발에 요구되는 점 중의 하나는 바이오물질을 바이오센서 칩에 선택적이며 안정적으로 고정화할 수 있는 기술의 개발인데, 전통적인 고정화 방법은 크게 4가지로, 첫 번째는 센서 칩 표면에 바이오물질을 물리적 또는 화학적으로 흡착시키는 방법이고, 두 번째는 센서 칩 표면에 바이오물질을 공유결합을 생성하게 하는 방법이며, 세 번째는 막, 매트릭스, 고분자 등에 바이오물질이 포착되게 하는 방법이고, 마지막으로 바이오 물질간의 교차결합을 유도하여 센서 칩 표면에 고정화하는 방법이 있었다. 이에 선택적이고 안정적으로 고정화할 수 있도록 이와 상이한 새로운 고정화 방법의 모색이 요청되었다.

한편, 실리카 결합 단백질(silica binding protein, SBP) 중에서 12개의 아미노산으로 이루어진 실리카 결합 단백질이 실리카 표면에 선택적으로 결합한다고 밝혀진 이후 (Brown, S., Nature Biotechnol ., 15:269, 1997; Naik, R. R. et al., J. Nanosci . Nanotechnol ., 2:1, 2002) SBP에 대한 연구가 진행되고 있으나, SBP가 어떻게 실리카 표면을 인식하고 결합하는지에 대한 정확한 메카니즘은 아직 밝혀지지 않았다. 다만, 실리카 표면의 소수성 부분과 SBP의 서열 중 소수성 영역과 분자 인식 (molecular recognition)을 기초로 특이적 결합양상(specific interaction)을 가진다고 예측될 뿐이었다 (Braun, R., et al ., J. Biomater . Sci ., 13:747, 2002).

이에, 본 발명자들은 종래의 실리카 칩의 문제점을 해소하고 특이적이고 안정적으로 탐침단백질을 고정할 수 있고 경제적인 새로운 바이오 실리카 칩을 제공하고자 예의 노력한 결과, 신규한 실리카 결합단백질을 분리하여 이와 탐침단백질을 융합한 융합단백질이 위치 특이적으로 실리카 칩 상에 고정되며, 또한 고정된 융합단백질이 표적물질과 특이적으로 결합하여 효율적으로 상호반응을 분석할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 탐침단백질을 선택적이고 안정적으로 실리카 칩에 고정화할 수 있는 새로운 고정화 방법의 모색하여, 경제적이면서도 표적물질과의 상호작용을 효율적으로 분석할 수 있는 새로운 바이오-실리카 칩을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 바이오-실리카 칩의 제조방법 및 이를 이용한 바이오물질의 검출방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 신규한 실리카 결합단백질 및 이와 탐침단백질의 융합단백질을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 실리카 결합단백질과 탐침단백질의 융합단백질이 실리카층을 포함하는 칩에 고정되어 있는 바이오-실리카 칩을 제공한다.

본 발명은 또한, 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 실리카 결합단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 실리카 결합단백질과 탐침단백질간의 융합단백질, 이를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 이를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 도입하여 수득되는 재조합 미생물을 포함한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 실리카 결합단백질과 탐침 단백질의 융합단백질을 발현시킨 다음, 발현된 융합단백질을 회수하여 실리카층을 포함하는 칩에 고정시키는 것을 특징으로 하는 바이오-실리카 칩의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 바이오-실리카 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA, 항체, 펩티드, 단백질, 및 탄수화물로 구성된 군에서 선택되는 표적과의 상호작용을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명은 실리카 결합단백질이 실리카 칩에 특이적으로 결합하는 성질을 이용하여, 실리카 결합단백질에 탐침 단백질을 융합시킨 융합단백질을 제조하여 이를 특이적으로 실리카 칩에 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오-실리카 칩, 이의 제조방법 및 이를 이용한 검출방법을 제공하는 효과가 있다.

본 발명에 따른 바이오-실리카 소자 칩은 재사용을 위한 회복공정(recovery) 후 재사용이 가능하여, 높은 검출효율을 갖는 연속 분석용 바이오센서에도 적합할 것이고, 단백질-DNA, 단백질-리간드, 단백질-항체, 단백질-펩타이드, 단백질-탄수화물, 단백질-단백질 및 세포-바이오 물질 간의 상호작용 검출방법에서 비특이적인 단백질 결합이 일어나지 않는 장점이 있어 이 시스템을 통한 바이오센서 등의 응용에 매우 유용할 것이다.

또한, 본 발명에 따른 바이오-실리카 칩의 제조방법은, 바이오 센서에 널리 사용되는 실리카 소자 칩에 화학적인 표면 처리공정 없이 선택적으로 탐침 단백질 을 고정함으로써 칩 제작공정이 단순화되고 복잡한 탐침 단백질 정제공정이 필요 없게 되어 생산성과 경제성에 큰 향상효과를 기대할 수 있다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

"탐침 단백질(probe protein)"이란, 단백질 칩 상에 고정되는 단백질 또는 펩타이드로서, 단백질 칩에 부가되어 분석을 수행하는 시료 중의 관심있는 특정 물질과 결합가능한 것을 말한다.

"표적(target)"이란 상기 탐침단백질과 결합하는 특정물질을 말하며, 바람직하게는 펩타이드, 단백질, 탄수화물 등 고정된 탐침단백질과 결합할 수 있는 고분자 화합물을 포함한다.

본 발명은 일 관점에서, 실리카 결합단백질과 탐침단백질의 융합단백질을 이용한 바이오-실리카 칩에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 융합단백질은 실리카 층을 포함하는 칩에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는데, 이때 상기 융합단백질 중 실리카 결합단백질이 특이적으로 실리카로 고정된다. 상기 실리카 층을 포함한 칩은 실리카 층으로만 구성된 칩을 포함하는 개념이며, FET 소자 또는 SPR 소자 및 기타 전기화학센서 소자인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 실리카 층은 산화실리콘, 폴리실리콘, 실리콘 웨이퍼 중 어느 하나일 수 있으나, 역시 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 실리카 결합단백질은 탐침단백질의 N 말단, C말단, 또는 N말단과 C말단의 중간에 결합할 수 있으며, 실리카 결합단백질은 단일체(monomer) 또는 다중체(polymer)로 사용될 수 있는데, 다중체를 사용하는 경우 실리카 결합 친화력이 더 높게 나타날 수 있으므로, 다중체 형태로 사용하는 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에서는, 먼저 실리카 결합단백질인 SBP3(서열번호 1), SBP4(서열번호 2)와 SBP5(서열번호 3)은 Brown, S.에 의해 보고된 문헌에서 나타낸 서열을 이용하였으며, 이들 SBP는 12개의 아미노산으로 이루어져 있는 것이 실리카에 선택적으로 결합한다고 알려져 있다 (Brown, S., Nature Biotechnol ., 15:269, 1997).

서열번호 1: H₂N - MSPHPHPRHHHT - COOH (SBP3)

서열번호 2: H₂N - RGRRRRLSCRLL - COOH (SBP4)

서열번호 3: H₂N - KPSHHHHHTGAN - COOH (SBP5)

본 발명에서는 또한, 새로이 Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 균 주(KCTC0769BP, Hong et al ., Nature Biotechnol ., 22:1275, 2004)로부터 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 신규한 실리카 결합단백질을 분리하여 이들의 안정적인 실리카 결합능을 확인하고 사용하였다. 그러나, 이외의 공지된 실리카 결합단백질을 사용할 수 있음은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

서열번호 4:

H₂N - MAIVKCKPTSAGRRHVVKIVNPELHKGKPYAPLLDTKSKTGGRNNLGRITTRHIGGGHKQ- COOH (rplB1)

서열번호 5: H₂N-VDVLGKAGANRWRGVRPTVRGTAMNPVDHPHGGGEGRNFGKHPVSPWGVQTKGKKTRHNKRTDKYIVRRRGK - COOH (rplB2)

서열번호 6: H₂N-MAIVKCKPTSAGRRHVVKIVNPELHKGKPYAPLLDTKSKTGGRNNLGRITTRHIGGGHKQVDVLGKAGANRWRGVRPTVRGTAMNPVDHPHGGGEGRNFGKHPVSPWGVQTKGKKTRHNKRTDKYIVRRRGK - COOH (rplB12)

상기 60개(rplB1) 혹은 72개(rplB2), 그리고 이를 합한 132개(rplB12)의 아미노산으로 이루어진 실리카 결합단백질은 상기 SBP처럼 특정 산화실리콘 표면에 선택적으로 결합하는 것으로 나타났다. 이들은 수소 결합, 극성, 전자효과와 같은 화학적 요인과 크기나 형태와 같은 구조적 특징에 의해 무기실리카 표면에 선택적으로 결합이 가능한 것 (Weissbuch, I. et al ., Science, 253:637, 1991)으로 보이 나, 실리카 표면에 선택적으로 결합하는 메커니즘이 정확하게 밝혀지지 않았고, 다만 알지닌(Arg)과 히스티딘(His)과 같은 양이온의 특성이 실리카 표면과의 결합에 관여하는 것으로 보여진다.

본 발명에서는 서열번호 1 내지 3의 아미노산 서열로 표시되는 실리카 결합단백질을 코딩하는 유전자의 서열로 각각 서열번호 7 내지 9로 표시되는 유전자의 서열을 이용하였다.

서열번호 7: 5'- ATGTCTCCGCATCCACATCCACGTCATCACCATACC -3'

서열번호 8: 5'- CGTGGCCGTCGTCGTCGTCTGTCTTGCCGTCTGCTG -3'

서열번호 9: 5'- AAACCGAGCCACCACCACCACCACACCGGCGCGAAC -3'

본 발명에 있어서, 또한 서열번호 4 내지 6의 아미노산 서열로 표시되는 신규한 실리카 결합단백질을 코딩하는 유전자의 서열은 서열번호 10 내지 12로 표시되는 유전자의 서열로서 각각 다음과 같다.

서열번호 10:

5'-ATGGCTATCGTTAAATGTAAGCCGACCTCCGCTGGTCGTCGTCACGTTGTTAAAATCGTGAACCCTGAATTACATAAGGGTAAACCTTACGCACCTTTATTAGATACTAAATCTAAAACTGGTGGTCGTAATAATTTAGGACGTATCACTACTCGTCATATCGGTGGTGGTCATAAACAA-3'

서열번호 11:

5'-GTCGACGTACTTGGTAAAGCCGGTGCCAACCGCTGGAGAGGCGTTCGCCCTACAGTTCGCGGTACTGCGATGAACCCGGTAGATCACCCGCACGGTGGTGGTGAAGGTCGTAACTTTGGTAAACACCCGGTATCACCTTGGGGCGTTCAAACCAAAGGTAAGAAAACTCGTCACAACAAACGTACCGATAAATATATCGTACGTCGTCGTGGCAAA -3'

서열번호 12:

5'- ATGGCTATCGTTAAATGTAAGCCGACCTCCGCTGGTCGTCGTCACGTTGTTAAAATCGTGAACCCTGAATTACATAAGGGTAAACCTTACGCACCTTTATTAGATACTAAATCTAAAACTGGTGGTCGTAATAATTTAGGACGTATCACTACTCGTCATATCGGTGGTGGTCATAAACAAGTCGACGTACTTGGTAAAGCCGGTGCCAACCGCTGGAGAGGCGTTCGCCCTACAGTTCGCGGTACTGCGATGAACCCGGTAGATCACCCGCACGGTGGTGGTGAAGGTCGTAACTTTGGTAAACACCCGGTATCACCTTGGGGCGTTCAAACCAAAGGTAAGAAAACTCGTCACAACAAACGTACCGATAAATATATCGTACGTCGTCGTGGCAAA -3'

본 발명에서는 조류독감의 표면항원을 탐침단백질로 하고, 상기 신규로 분리한 실리카 결합단백질에 탐침단백질을 융합한 융합단백질을 발현시킨 후, 이를 실리카 칩에 처리 시 특이적으로 고정되는 것을 확인하였고, 여기에 탐침단백질인 조류독감의 표면항원에 대한 항체를 처리하여 역시 결합이 일어남을 확인하였다. 특히, 타 항체를 함께 처리한 경우 다른 항체와의 결합은 거의 검출되지 않았는바, 이는 본 발명에 따른 바이오-실리카 칩은 특이적으로 표적을 검출해 낼 수 있음을 제시하는 것이다.

본 발명에서는 실리카 결합단백질을 융합단백질의 형태로 이용할 시 실리카를 기질로 사용하는 장치 내에서의 바이오센서 응용에 무한한 확장성을 가지고 있음을 제시하고 있다. 실리카 결합단백질을 바이오센서에 응용한 예가 없으며, 이에 이를 활용할 시 바이오센서의 전기화학적, 형광 및 분광광도적 접근이 용이할 것으로 기대된다.

본 발명은 다른 관점에서, 실리카 결합단백질을 이용한 바이오-실리카 칩의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 융합단백질과 탐침단백질의 융합단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 숙제세포에 도입하여 수득된 재조합 미생물을 배양하여, 실리카 결합단백질과 탐침단백질의 융합단백질을 발현시킨 다음, 발현된 융합단백질을 회수하여 실리카층을 포함하는 칩에 고정하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 숙주세포는 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명에 있어서, 고정은 마이크로 콘택트(microcontact printing) 방법을 통한 패터닝, PDMS(polydimethylsiloxane) 주형을 이용한 미세채널, 또는 마이크로 어레이를 이용한 스팟팅(spotting) 방법을 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 또한, 상기 융합단백질의 고정은, 상기 재조합 미생물을 회수 및 파쇄하여 상기 융합단백질을 정제하여 수득한 다음, 수득된 융합단백질을 실리카층을 포함하는 칩에 처리함으로써 이루어질 수 있다.

본 발명에서 대장균에서 발현된 실리카 결합단백질-탐침단백질의 융합단백질인 rplB12-AIa을 수용성 형태로 발현시킨 다음, 간단한 세포 파쇄공정을 거쳐 이를 함유하는 수용성 분획을 수득하여 이들을 실리카 소자 칩에 처리한 경우, 상기 융합단백질이 특이적으로 일정방향으로 고정되는 것으로 나타났으며, 항체 등 바이오 물질 처리 시 결합능이 저해되지 않고 바이오물질간의 상호작용이 효율적으로 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 바이오-실리카 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA, 항체, 펩티드, 단백질, 및 탄수화물로 구성된 군에서 선택되는 표적과의 상호작용을 검출하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 검출은 표면플라즈마공명(surface plasmon resonance, SPR) 또는 SPR 이미징을 통해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다. SPR은 유리 칩에 얇은 실리카 박막을 코팅한 칩을 이용하여 칩 표면에서 일어나는 반응을 굴절율(refractive index)의 변화를 민감하게 형광 표지 없이 분석할 수 있는 기술이며, 굴절율의 변화를 CCD 카메라를 이용하여 이미지화한 것이 SPR 이미징이다. 바이오센서 시스템에 흔한 분석 방법으로서 현재 상용화되어 있고 단백질-단백질, 단백질-DNA, DNA-DNA 상호작용 검사에 사용되고 있다.

도 1은 본 발명의 실리카 결합단백질(SBP)를 이용한 바이오-실리카 소자 칩 및 센서 시스템의 모식도로서 실리카 결합단백질(SBP)과 조류독감(AI) 표면항 원(AIa)의 융합단백질 구조를 포함하는 검출시스템을 살펴 볼 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 탐침단백질로 조류독감의 표면항원(AI antigen, AIa)인 뉴라미다아제(neuraminidase, NA)의 친수성 도메인 및 스트렙타아비딘만을 예시하였으나, 기타 다른 탐침단백질에 대해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.

실시예 1. 신규한 실리카 결합단백질의 분리

Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 균주(KCTC 0769BP)의 유전자 내에서 rplB 50S ribosomal protein L2를 코딩하는 2003812 내지 2004633까지의 염기서열(NCBI GenBank accesstion no. NC 006300, Gene ID: 3075265)이 실리카 특이적 결합력을 갖는 단백질을 코딩하는 서열번호 10 내지 12로 표시되는 유전자를 발견하였다. 특히 2004454 내지 2004633까지의 염기서열을 rplB1 유전자(서열번호 10)와 2003812 내지 2004021까지의 염기서열을 rplB2 유전자(서열번호 11), 그리고 이들의 융합된 형태의 유전자를 rplB12 유전자(서열번호 12)로 명명하고, 이들로부터 유래되는 단백질을 각각 rplB1(서열번호 4)과 rplB2(서열번호 5)로 명명하였으며 이들의 융합형태인 rplB12(서열번호 6)를 실리카 결합단백질로 하고 바이오센서로 응용이 가능한 형태의 단백질과 융합하여 응용하고자 하였다.

실시예 2. 실리카 결합단백질 - 탐침단백질의 융합단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝

2-1: SBP-cSA 유전자의 클로닝

Streptomyces avidinii(KCTC9757)의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형 DNA로 사용하여 스트렙타비딘 유전자를 얻기 위하여 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머를 사용하였다. 클로닝을 위해 제한효소 HindIII의 절단위치가 서열번호 13의 프라이머에 삽입되었고, 합성된 서열번호 14의 프라이머에는 제한효소 XhoⅠ의 절단위치가 삽입되어 있다.

서열번호 13:

5'- ACAAAAGCTTGGCATCACCGGCACCTGGTAC -3' (프라이머 1)

서열번호 14:

5'- TTAACTCGAGCGGCTTCACCTTGGTGAA -3' (프라이머 2)

상기 서열번호 13와 14의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 스트렙타아비딘의 유전자 산물을 수득하였다. PCR 조건으로 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing) 은 56℃에서 1분간, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한번 하였다.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 약 370 bp 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 두 가지의 제한효소 HindIII와 XhoI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 동일한 제한효소로 절단한 플라스미드 pET-22b(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-cSA를 제작하였다.

상기 M. succiniciproducens MBEL55E 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 15 및 16의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 rplB1의 유전자 산물을 수득하였고, 서열번호 17과 18의 프라이머를 이용하여 rplB2의 유전자 산물을 수득하였다. 각각의 유전자 산물을 두 가지의 제한효소 NdeI과 HindIII를 사용하여 절단한 다음, 상기에서 얻은 DNA 절편들을 동일한 제한효소로 절단한 상기 제작된 플라스미드 pET-cSA에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-rplB1-cSA와 pET-rplB2-cSApET-cSA를 각각 제작하였다.

서열번호 15:

5'- GGAATTCCATATGGCTATCGTTAAATGT -3' (프라이머 3)

서열번호 16:

5'- ATCCAAGCTTTTGTTTATGACCACCACCG -3' (프라이머 4)

서열번호 17:

5'- GGAATTCCATATGGTACTTGGTAAAGCCGGTGCC -3' (프라이머 5)

서열번호 18:

5'- ACATGTCGACGTACTTGGTAAAGCCGGTGCC -3' (프라이머 6)

상기 제작된 pET-rplB1-cSA와 pET-rplB2-cSApET-cSA를 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 100 ㎎/L)이 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-rplB1-cSA와 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-rplB2-cSA를 제조하였다. 도 2는 전기 제작한 플라스미드 pET-rplB1-cSA의 유전자 지도를 나타낸 것이고 도 3은 후기 제작한 플라스미드 pET-rplB2-cSA의 유전자 지도를 나타낸 것이다. 본 실시예에서는 스트렙타비딘의 N-말단에 SBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하였고, 본 발명의 요지상 C-말단에 SBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에 통상적인 지식을 가진 자에게 있어서는 자명한 사실이다.

2-2: SBP - AIa 융합단백질의 발현을 위한 클로닝

실시예 1에서 분리한 신규 실리카 결합단백질인 rplB12 (서열번호 6)와 조류독감의 표면항원인 뉴라미다아제(neuraminidase, NA)의 친수성 도메인(이하 'AIa'라 함)의 융합단백질을 발현시키는 유전자를 재조합 대장균에 클로닝하기 위하여, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E 균주(KCTC 0769BP)의 게놈 DNA(genomic DNA)를 주형 DNA로 사용하였다.

상기 M. succiniciproducens MBEL55E 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서 열번호 15 및 19의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 rplB1의 유전자 산물을 수득하였고, 서열번호 20와 21의 프라이머를 이용하여 rplB2와 AIa이 융합된 형태의 유전자 산물을 수득하였다. AIa의 유전자 서열은 조류독감을 일으키는 인플루엔자 바이러스 중에서 H9N2 한국형의 바이러스 유전자 서열을 택하여 NA중에서 그 일부인 291-302번째의 12개 아미노산(서열번호 22)을 코딩하는 유전자로서 E. coli에서의 codon usage(Miller, J. H., A short corse in bacterial genetics. 1992)를 활용한 새로운 염기서열(서열번호 23)을 작성하여 얻을 수 있었다. 클로닝을 위해 제한효소 NdeI의 절단위치가 서열번호 15의 프라이머에, 그리고 서열번호 19의 프라이머에는 제한효소 SalI의 절단위치가 삽입되었고, 또한, 제한효소 SalI의 절단위치가 서열번호 20의 프라이머에 삽입되었고, 합성된 서열번호 21의 프라이머에는 제한효소 XhoⅠ의 절단위치가 삽입되었다.

서열번호 19:

5'- ATCCGTCGACTTGTTTATGACCACCACCG -3' (프라이머 7)

서열번호 20:

5'- ACATGTCGACGTACTTGGTAAAGCCGGTGCC -3' (프라이머 8)

서열번호 21:

5'-AATACTCGAGGATCGGACGGTTGCTGCCTTTCCAGTTATCACGACAAAGCTTTTTGCCACGACGACGT -3' (프라이머 9)

서열번호 22: H₂N - CRDNWKGSNRPI - COOH (AIa)

서열번호 23: 5'- TGTCGTGATAACTGGAAAGGCAGCAACCGTCCGATC -3'

PCR 조건은 첫 번째 변성(denaturation)은 94℃에서 5분간 한번 하였으며, 이후 두 번째 변성은 94℃에서 1분간, 교잡(annealing)은 56℃에서 1분간, 연장(extension)은 72℃에서 1분간 수행하였으며 이를 30회 반복하였다. 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한번 하였다.

상기 PCR에 의해 수득된 DNA를 아가로즈 겔 전기영동하여, 각각 약 180 bp (rplB1)와 280 bp (rplB2-AIa 융합) 크기의 DNA 절편을 분리하였으며, 이를 rplB1의 경우 제한효소 NdeI과 SalI, rplB2-AIa의 경우 SalI과 XhoI으로 절단한 다음, 상기 DNA 절편을 NdeI과 XhoI 제한효소로 절단한 플라스미드 pET-22b(+) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pET-rplB12-AIa를 제작하였다.

상기 제작된 pET-rplB12-AIa를 열충격(heat shock)방법을 이용하여 대장균 BL21(DE3) (Novagen, Darmstadt, Germany)에 도입하여 엠피실린(ampicillin, 100 ㎎/L)이 첨가된 LB 평판배지(이스트 추출물, 5 g/L; 트립톤, 10 g/L; NaCl, 10 g/L)에서 선별하여 재조합 대장균 BL21(DE3)/pET-rplB12-AIa를 제조하였다. 도 4는 상기 제작된 플라스미드 pET-rplB12-AIa의 유전자 지도를 나타낸다.

본 실시예에서는 AIa의 N-말단에 SBP 단백질인 rplB12를 결합하는 형태를 사 용하였으나, 본 발명의 요지상 C-말단에 SBP 단백질이 결합하는 형태를 사용하여도 동일한 결과를 얻을 수 있음은 이 분야에서 통상적인 지식을 가진 자에게 자명한 사항이다.

실시예 3. 실리카 결합단백질 - 탐침단백질의 융합단백질의 발현

실시예 2-2에서 제작한, 강력하고 유도 가능한 T7 프로모터를 가지고 있는 재조합 플라스미드 pET-rplB12-AIa로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)을 배양하여 rplB12-AIa 융합단백질을 발현하였다.

T7 프로모터는 IPTG(isopropyl-β-thiogalactoside)에 의해서 유전자 발현이 유도되며 pET-rplB12-AIa로 형질전환된 대장균 BL1(DE3)의 경우, 형질전환된 재조합 대장균을 LB 액체배지 200 mL가 담긴 500 mL 플라스크에 접종하여 37℃에서 배양하였다. pET-rplB12-AIa 재조합 플라스미드의 유전자 발현유도는 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도(OD)가 0.4일 때 1 mM의 IPTG를 첨가하여 줌으로써 유도하였다.

유도발현 후 4시간 후에 전체 배양액을 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 100 mL TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0)로 한번 씻은 후에 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후 TE 버퍼(Tris-HCl 10 mM; EDTA 1 mM, pH 8.0) 100 mL 용액에 현탁하여 4℃에서 초음파 분쇄기(Branson Ultrasonics Co., Danbury, CT, 미국)를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 용액을 4℃에서 6000 rpm으로 30분 원심분리하여 불용성 단백질을 버리고 0.2 μm 여과기로 여과하여 rplB12-AIa 융합단백질을 함유하는 수용성 단백질분획을 수득하였다. 상기 단백질은 브래드포드 방법(Bradford, M. et al ., Anal . Biochem., 72:248, 1976)을 이용하여 정량하였다.

실시예 4. 실리카 결합단백질-탐침단백질의 융합단백질의 실리카 결합친화력 확인

상기 실시예 2-1에서 나타낸 rplB1 융합단백질과 rplB2 융합단백질의 실리카 결합능을 확인하기 위해 원자현미경을 이용하여 분석하였다.

실리콘웨이퍼(Si100, LG 실트론, 구미, 한국) 상에 각각 50 μg/mL의 rplB1-cSA와 rplB2-cSA 융합단백질을 각각 처리하여 고정시킨 후, 원자현미경을 이용하여, 융합단백질 처리 전(a) 및 융합단백질 처리 후(b)를 관찰하였다.

그 결과, 도 5(rplB1-cSA 융합단백질) 및 도 6(rplB2-cSA 융합단백질)에 나타난 바와 같이, rplB1-cSA 융합단백질과 rplB2-cSA 융합단백질을 반응한 이후 표면에 바이오물질이 결합하여 나타나는 형태가 다르며 오른쪽의 실리콘 표면에서 융합단백질이 결합하여 올라오면서 표면간의 단차가 별하는 것을 볼 수 있었다. rplB1-cSA 융합단백질의 경우, 약 6.34 nm의 단차가 있는 것으로 보아 rplB1-cSA 융합단백질(약 20 kDa)이 실리콘 표면에 선택적으로 결합되었음을 알 수 있었다 (도 5). 또한, rplB2-cSA 융합단백질의 경우, 약 9.5 nm의 단차가 있는 것으로 보아 rplB2-cSA 융합단백질(약 22 kDa)이 실리콘 표면에 선택적으로 결합되었음을 알 수 있었다 (도 6).

실시예 5. 실리카 결합단백질 - 탐침단백질의 융합단백질을 고정한 바이오-실리카 SPR 칩의 제작 및 이를 이용한 표적 검출

5-1: SBP3 - AIa 융합단백질을 고정한 바이오-실리카 SPR 소자칩의 제작

실리카 결합단백질인 SBP3을 이용하여, 바이오 실리카 칩을 제작하였다.

Brown, S.에 의해 보고된 문헌에서 나타난 실리카 결합단백질인 SBP3(서열번호 1)과 조류독감의 표면항원의 융합된 형태인 24개 아미노산(서열번호 24) 서열을 갖는 펩티드는 (주)펩트론(대전, 한국)에서 합성되었으며, 제조된 펩티드는 PBS 버퍼에 녹여 사용하였다.

서열번호 24: H₂N - MSPHPHPRHHHTCRDNWKGSNRPI - COOH (SBP3-AIa)

SPR 칩(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)에 융합단백질을 고정하기 위하여 미세채널을 이용하여 Biacore 3000 (Biacore AB) SPR 분석기 내부의 시린지펌프(syringe pump)로 5 μL/min 유속으로 흘리면서 0.1 mg/ml (3-메르캅토프로필)트리메톡시실란((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane)을 이용하여 SPR 칩의 표면을 실리카로 표면처리시키기 위해 반응시킨다. 세척버퍼(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4)로 다시 5 μL/min 유속으로 흘려서 충분히 세척한 후 상기 수득된 SBP3-AIa 펩타이드(융합단백질)를 세척버퍼(PBS, pH 7.4)를 이용하여 25 μg/mL 농도로 5 μL/min 유속으로 흘려 실리카로 기능화된 SPR 칩 표면에 융합단백질을 고정화한 다음 세척버퍼(PBS, pH 7.4)로 세척(washing)하여 바이오-실리카 SPR 소자칩을 제작하였다.

(3-메르캅토프로필)트리메톡시실란 ((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane)을 처리한 SPR 칩 상에 실리카 결합단백질의 융합형태인 SBP3-AIa를 반응시킨 후 SPR 칩의 반응유닛(response unit, RU)의 값을 측정한 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 융합단백질의 실리카 칩에의 결합정도를 알 수 있었으며, 약 1100 RU 이상의 높은 값을 나타내어 본 발명에 따른 융합단백질이 실리카 칩에 효과적으로 결합함을 알 수 있었다.

5-2: rplB12 - AIa 융합단백질을 고정한 바이오-실리카 SPR 소자칩의 제작

SPR 칩(Biacore AB, Uppsala, 스웨덴)에 융합단백질을 고정하기 위하여 미세채널을 이용하여 Biacore 3000 (Biacore AB) SPR 분석기 내부의 시린지펌프(syringe pump)로 5 μL/min 유속으로 흘리면서 0.1 mg/ml (3-메르캅토프로필)트리메톡시실란((3-mercaptopropyl)trimethoxysilane)을 SPR 칩을 실리카로 표면처리하기 위하여 표면에 흘려준다. 세척버퍼(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.4)로 다시 5 μL/min 유속으로 흘려서 충분히 세척한 후 실시예 3에서 수득된 수용성 단백질 분획 중 정제된 rplB12-AIa 융합단백질을 세척버퍼(PBS, pH 7.4)를 이용하여 0.1 mg/mL 농도로부터 2배수로 희석한 후 각각의 샘플을 5 μL/min 유속으로 흘려 실리카로 기능화된 SPR 칩 표면에 융합단백질을 고정화한 다음 세척버퍼(PBS, pH 7.4)로 세척(washing)하여 바이오-실리카 SPR 소자칩을 제작하였다.

(3-메르캅토프로필)트리메톡시실란 ((3-mercaptopropyl)trimethoxy -silane)을 처리한 SPR 칩 상에 실리카 결합단백질의 융합단백질인 rplB12-AIa 융합단백질의 반응시킨 농도별 SPR 칩의 반응유닛(response unit, RU)의 값을 측정한 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 융합단백질의 실리카 칩에의 농도별 결합정도를 알 수 있었으며, 농도별 차이가 있긴 하나 전반적으로 높은 RU값을 나타내어 본 발명에 따른 융합단백질이 실리카 칩에 효과적으로 결합함을 살펴볼 수 있었다.

5-3: 바이오-실리카 SPR 칩을 이용한 항원-항체 반응의 검출

항-AI 폴리클로날 항체를 실시예 5-2에서 제작된 바이오-실리카 SPR 칩에 농도별로 반응시켰다. 바이오-실리카 SPR 칩은 25 μg/mL의 농도로 rplB12-AIa 융합단백질을 고정화한 다음 세척버퍼(PBS, pH 7.4)로 세척한 것을 사용하였으며, 항-AI 폴리클로날 항체는 농도별로 각각의 샘플을 5 μL/min 유속으로 흘린 후 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, SPR 칩의 반응유닛(response unit, RU)의 값을 측정한 경우 항-AI 폴리클로날 항체는 50 μg/mL의 농도보다 높은 경우 더 이상의 반응이 향상되지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 9의 (a)). 1 μg/mL의 농도로부터 전반적으로 높은 RU값을 나타내어 본 발명에 따른 융합단백질이 실리카 칩에 효과적으로 결합하여 바이오센서로서 이용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 항-AI 폴리클로날 항체, anti-rabbit IgG 항체 및 anti-mouse IgG 항체를 각각 50 μg/mL의 농도로 상기 바이오-실리카 SPR 칩에 5 μL/min의 유속으로 흘린 후 분석하였다.

그 결과, 도 9의 (b)에 나타난 바와 같이, anti-AI 폴리클로날 항체를 사용한 경우 검출되었으나, 상대적으로 anti-rabbit IgG 항체와 anti-mouse IgG를 사용한 경우 거의 검출되지 않았다. 즉, 본 발명에 따른 바이오-실리카 칩은 특이적으로 표적을 검출해 낼 수 있음을 볼 수 있었다.

5-4: 실리카 표면에서의 항원-항체 반응에 의한 형태( morphology ) 변화 관찰

실리카 표면에서 항원-항체 반응에 의한 바이오물질간의 반응을 확인하기 위해 원자현미경을 이용하여 분석하였다.

실리콘웨이퍼(Si100, LG 실트론, 구미, 한국) 및 산화실리콘(Aldrich, 미국) 상에 각각 50 μg/mL의 rplB12-AIa 융합단백질을 처리하여 고정시킨 후, 50 μg/mL의 항-AI 폴리클로날 항체를 처리하여 하였으며, 각각의 반응은 25℃에서 1시간 동안 교반기 위에서 수행하였다. 그 후, 원자현미경을 이용하여, 융합단백질 처리 전(a), 융합단백질 처리 후(b) 및 항-AI 폴리클로날 항체 처리 후(c)를 관찰하였다.

그 결과, 도 10(실리콘웨이퍼) 및 도 11(산화실리콘)에 나타난 바와 같이, rplB12-AIa 융합단백질과 anti-AI 폴리클로날 항체를 순차적으로 반응한 이후 표면에 바이오물질이 결합하여 나타나는 형태가 점차 커지는 것을 볼 수 있었다. 즉, 순차적으로 rplB12-AIa 융합단백질과 anti-AI 폴리클로날 항체가 결합되었음을 알 수 있었다.

실시예 6. 실리카 결합단백질 - 탐침단백질의 융합단백질을 고정한 바이오-실리카 FET 칩의 제작 및 이를 이용한 표적의 검출

6-1: rplB12 - AIa 융합단백질을 고정한 바이오-실리카 FET 칩의 제작 및 전기화학신호 측정

도 12와 같은 실리카 소자를 갖는 FET(field-effect transistor) 칩을 제작하였다. 칩은 약 20 nm의 높이로 갭(gap)을 형성하고 2μm의 폭을 갖는 이 소자는 산화실리콘 위에 융합단백질이 위치특이적으로 결합할 수 있도록 디자인되었으며, p-타입의 실리카 기질(산화실리콘)에서 전류변화를 측정할 수 있다. 이는 바이오물질 반응 전후의 전압차를 이용하여 반응 유무를 전기신호로서 파악하는 것을 특징으로 한다.

실시예 3에서 수득된 rplB12-AIa 융합단백질을 12.5 μg/ml의 농도로 PBS 버퍼에 희석하여 상기 실리카 소자를 갖는 FET 칩상에 상온에서 한시간동안 반응시킨 후, 증류수로 세차례 세척하여 공기중에서 말린 후 바이오-실리카 FET 소자칩을 제작하였다. 이렇게 제조된 바이오-실리카 FET 소자칩은 조류독감에 대한 항체를 검출하기 위한 바이오센서로서 활용될 수 있으며 아래에 나타낸 실시예로서 증명될 수 있다.

6-2:바이오-실리카 소자 칩내에서의 항원-항체 반응 검출

실시예 6-1에서 제작된 칩의 모든 전기적 신호 측정은 반도체 파라미터 분석 기(semiconductor parameter analyzer, HP4156C)를 이용하여 항원 및 항체를 결합반응시킨 후 질소가스로 소자를 건조시킨 직후 측정하였다. 0~4 V 사이의 전압에서 측정되었으며, 모든 측정은 프로브 스테이션(probe station) 위에서 수행하였다.

상기 소자 칩 내의 산화실리콘 표면 위에 rplB12-AIa 융합단백질 및 항-AI 폴리클로날 항체가 선택적으로 고정화되는지 확인하기 위해 전기화학적 신호변화를 관찰하였다. 실험에 사용된 25 μg/mL의 rplB12-AIa 융합단백질과 50 μg/mL의 anti-AI 폴리클로날 항체는 PBS 버퍼에 현탁하여 사용하였으며, 각 반응 이후 결합되지 않은 샘플을 제거하기 위해 PBS 버퍼를 10분 흘려주어 실리카 소자 칩 표면을 안정화시켰다.

그 결과, 도 13과 도 14에서 나타난 바와 같이, 바이오물질이 반응하기 전(-■-,검정선)의 신호에 비해 rplB12-AIa 융합단백질이 결합된 이후(-●-, 빨강선)와 또 순차적으로 anti-AI 폴리클로날 항체가 결합된 이후(-▼-, 파랑선) 각각 -0.23 V와 -0.55 V의 전기신호 이동이 있는 것을 확인하였다. 즉, 바이오물질이 순차적으로 반응을 하여 센싱하는 것을 관찰할 수 있었다.

또한, 항체의 비특이적 결합이 있는지에 관한 확인을 하기 위해, 항-AI 폴리클로날 항체 대신 대조군으로서 anti-rabbit IgG를 동일한 조건으로 처리하였다.

그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, anti-AI 폴리클로날 항체의 전기신호 변화에 비해 anti-rabbit IgG에 대한 전기신호는 거의 변화하지 않는 것을 측정할 수 있었다. 이에 실리카 소자 칩 표면 위에 비특이적 결합을 일으키지 않는 안정적 인 바이오센서로 항원-항체 반응을 검출할 수 있는 시스템임을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명의 실리카 결합단백질(SBP)를 이용한 바이오-실리카 소자 칩 및 센서 시스템의 모식도로서 실리카 결합단백질(SBP)과 조류독감(AI) 표면항원(AIa)의 융합단백질 구조를 포함하는 검출시스템이다.

도 2는 실리카 결합단백질(SBP)-탐침단백질의 융합단백질을 발현시키기 위한 유전자지도로서, 플라스미드 pET-rplB1-cSA의 유전자 지도이다.

도 3은 실리카 결합단백질(SBP)-탐침단백질의 융합단백질을 발현시키기 위한 유전자지도로서, 플라스미드 pET-rplB2-cSA의 유전자 지도이다.

도 4는 실리카 결합단백질(SBP)-탐침단백질의 융합단백질을 발현시키기 위한 유전자지도로서, 플라스미드 pET-rplB12-AIa의 유전자 지도이다.

도 5는 실리콘 웨이퍼 (Si100) 표면 위에 rplB1-cSA 융합단백질의 반응을 나타내는 원자현미경(atomic force microscopy, AFM) 분석결과이다. 도 5의 a는 실리콘 웨이퍼 표면의 AFM 사진이고, 도 5의 b는 실리콘 웨이퍼 표면에 융합단백질을 결합한 후의 사진이다. 결합한 후에 약 6.3 nm의 높이차이를 나타낸다.

도 6은 실리콘 웨이퍼 (Si100) 표면 위에 rplB2-cSA 융합단백질의 반응을 나타내는 원자현미경(atomic force microscopy, AFM) 분석결과이다. 도 6의 a는 실리콘 웨이퍼 표면의 AFM 사진이고, 도 6의 b는 실리콘 웨이퍼 표면에 융합단백질을 결합한 후의 사진이다. 결합한 후에 약 9.5 nm의 높이차이를 나타낸다.

도 7은 SPR(Surface Plasmon Resonance) 칩을 실리카로 표면을 기능화시킨 칩 상에 실리카 결합단백질의 융합단백질인 25 μg/ml의 SBP3-AIa 융합단백질을 반 응시킨 SPR 칩의 반응유닛(response unit, RU)의 값을 측정한 결과이다.

도 8은 SPR 칩을 실리카로 표면을 기능화시킨 칩 상에 실리카 결합단백질의 융합단백질인 rplB12-AIa 융합단백질을 농도별로 반응시킨 SPR 칩의 반응유닛(response unit, RU)의 값을 측정한 결과를 나타낸다. 도 8의 a는 (3-mercaptopropyl)trimethoxysilane로 SPR 칩 상의 표면을 기능화시킨 후, rplB12-AIa 융합단백질을 농도에 따라 반응시킨 RU 값을 나타낸 그래프이고, 도 8의 b는 도 8의 a에서 나타낸 결과에 대한 SPR sensorgam이다.

도 9는 25 μg/ml의 rplB12-AIa 융합단백질을 항 AI 항체를 농도에 따라 반응시킨 후의 그래프이다. 도 9의 a는 항 AI항체의 농도에 따라 반응시킨 RU 값을 나타낸 그래프이고 도 9의 b는 도 9의 a의 항 AI 항체를 50 μg/ml로 반응시켜서 다른 항체와의 선택적 결합을 확인하기 위한 SPR sensorgam이다.

도 10은 실리콘 웨이퍼 (Si100) 표면 위에 융합단백질과 항 AI 항체와의 반응을 나타내는 원자현미경(atomic force microscopy, AFM) 분석결과이다. 도 10의 a는 실리콘 웨이퍼 표면의 AFM 사진이고, 도 10의 b는 실리콘 웨이퍼 표면에 융합단백질을 결합한 후의 사진이며, 도 10의 c는 실리콘 웨이퍼 표면에 융합단백질을 결합하고 여기에 항체를 결합한 후의 AFM 사진이다.

도 11은 산화실리콘(SiO₂) 표면 위에 융합단백질과 항 AI 항체와의 반응을 나타내는 원자현미경(atomic force microscopy, AFM) 분석결과이다. 도 11의 a는 산화실리콘 표면의 AFM 사진이고, 도 11의 b는 산화실리콘 표면에 융합단백질을 결 합한 후의 사진이며, 도 11의 c는 산화실리콘 표면에 융합단백질을 결합하고 여기에 항체를 결합한 후의 AFM 사진이다.

도 12는 실리카 표면에 바이오물질을 고정화시켜서 전기화학적 신호를 검출하고자 디자인한 field-effect transistor(FET) 센서의 입체적 구조이다. 산화실리콘의 표면위에서 일어나는 SBP 융합단백질과 항 AI 항체와의 반응을 p-타입의 실리카 기질(산화실리콘)에서 전류변화를 측정할 수 있다.

도 13은 칩 내 산화실리콘 표면에 바이오물질을 고정화되기 전후의 전류변화량을 분석한 그래프이다.

도 14는 칩 내 산화실리콘 표면에 바이오물질을 고정화되기 전후의 전기화학적 신호의 변화를 6회에 걸쳐 측정한 전압변화분포도를 나타낸 그래프이다.

도 15는 항 AI 항체와 다른 항체와의 선택적 결합을 확인하기 위한 그래프이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Bio-silica Chip Using Silica Binding Protein and Method for Fabricating the Same <130> P08-B049 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP3 <400> 1 Met Ser Pro His Pro His Pro Arg His His His Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP4 <400> 2 Arg Gly Arg Arg Arg Arg Leu Ser Cys Arg Leu Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP5 <400> 3 Lys Pro Ser His His His His His Thr Gly Ala Asn 1 5 10 <210> 4 <211> 60 <212> PRT <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E rplB1 <400> 4 Met Ala Ile Val Lys Cys Lys Pro Thr Ser Ala Gly Arg Arg His Val 1 5 10 15 Val Lys Ile Val Asn Pro Glu Leu His Lys Gly Lys Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Leu Leu Asp Thr Lys Ser Lys Thr Gly Gly Arg Asn Asn Leu Gly Arg 35 40 45 Ile Thr Thr Arg His Ile Gly Gly Gly His Lys Gln 50 55 60 <210> 5 <211> 72 <212> PRT <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E rplB2 <400> 5 Val Asp Val Leu Gly Lys Ala Gly Ala Asn Arg Trp Arg Gly Val Arg 1 5 10 15 Pro Thr Val Arg Gly Thr Ala Met Asn Pro Val Asp His Pro His Gly 20 25 30 Gly Gly Glu Gly Arg Asn Phe Gly Lys His Pro Val Ser Pro Trp Gly 35 40 45 Val Gln Thr Lys Gly Lys Lys Thr Arg His Asn Lys Arg Thr Asp Lys 50 55 60 Tyr Ile Val Arg Arg Arg Gly Lys 65 70 <210> 6 <211> 132 <212> PRT <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E rplB12 <400> 6 Met Ala Ile Val Lys Cys Lys Pro Thr Ser Ala Gly Arg Arg His Val 1 5 10 15 Val Lys Ile Val Asn Pro Glu Leu His Lys Gly Lys Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Leu Leu Asp Thr Lys Ser Lys Thr Gly Gly Arg Asn Asn Leu Gly Arg 35 40 45 Ile Thr Thr Arg His Ile Gly Gly Gly His Lys Gln Val Asp Val Leu 50 55 60 Gly Lys Ala Gly Ala Asn Arg Trp Arg Gly Val Arg Pro Thr Val Arg 65 70 75 80 Gly Thr Ala Met Asn Pro Val Asp His Pro His Gly Gly Gly Glu Gly 85 90 95 Arg Asn Phe Gly Lys His Pro Val Ser Pro Trp Gly Val Gln Thr Lys 100 105 110 Gly Lys Lys Thr Arg His Asn Lys Arg Thr Asp Lys Tyr Ile Val Arg 115 120 125 Arg Arg Gly Lys 130 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP3 gene <400> 7 atgtctccgc atccacatcc acgtcatcac catacc 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP4 gene <400> 8 cgtggccgtc gtcgtcgtct gtcttgccgt ctgctg 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP5 gene <400> 9 aaaccgagcc accaccacca ccacaccggc gcgaac 36 <210> 10 <211> 180 <212> DNA <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E rplB1 gene <400> 10 atggctatcg ttaaatgtaa gccgacctcc gctggtcgtc gtcacgttgt taaaatcgtg 60 aaccctgaat tacataaggg taaaccttac gcacctttat tagatactaa atctaaaact 120 ggtggtcgta ataatttagg acgtatcact actcgtcata tcggtggtgg tcataaacaa 180 180 <210> 11 <211> 216 <212> DNA <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E rplB2 gene <400> 11 gtcgacgtac ttggtaaagc cggtgccaac cgctggagag gcgttcgccc tacagttcgc 60 ggtactgcga tgaacccggt agatcacccg cacggtggtg gtgaaggtcg taactttggt 120 aaacacccgg tatcaccttg gggcgttcaa accaaaggta agaaaactcg tcacaacaaa 180 cgtaccgata aatatatcgt acgtcgtcgt ggcaaa 216 <210> 12 <211> 396 <212> DNA <213> Mannheimia succiniciproducens MBEL55E rplB12 gene <400> 12 atggctatcg ttaaatgtaa gccgacctcc gctggtcgtc gtcacgttgt taaaatcgtg 60 aaccctgaat tacataaggg taaaccttac gcacctttat tagatactaa atctaaaact 120 ggtggtcgta ataatttagg acgtatcact actcgtcata tcggtggtgg tcataaacaa 180 gtcgacgtac ttggtaaagc cggtgccaac cgctggagag gcgttcgccc tacagttcgc 240 ggtactgcga tgaacccggt agatcacccg cacggtggtg gtgaaggtcg taactttggt 300 aaacacccgg tatcaccttg gggcgttcaa accaaaggta agaaaactcg tcacaacaaa 360 cgtaccgata aatatatcgt acgtcgtcgt ggcaaa 396 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 13 acaaaagctt ggcatcaccg gcacctggta c 31 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 14 ttaactcgag cggcttcacc ttggtgaa 28 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 15 ggaattccat atggctatcg ttaaatgt 28 <210> 16 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 16 atccaagctt ttgtttatga ccaccaccg 29 <210> 17 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 17 ggaattccat atggtacttg gtaaagccgg tgcc 34 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 18 acatgtcgac gtacttggta aagccggtgc c 31 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 19 atccgtcgac ttgtttatga ccaccaccg 29 <210> 20 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 20 acatgtcgac gtacttggta aagccggtgc c 31 <210> 21 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 21 aatactcgag gatcggacgg ttgctgcctt tccagttatc acgacaaagc tttttgccac 60 gacgacgt 68 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Avian Influenza (H9N2 type) antigen <400> 22 Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile 1 5 10 <210> 23 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Avian Influenza (H9N2 type) antigen gene <400> 23 tgtcgtgata actggaaagg cagcaaccgt ccgatc 36 <210> 24 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SBP3-AIa fusion peptide <400> 24 Met Ser Pro His Pro His Pro Arg His His His Thr Cys Arg Asp Asn 1 5 10 15 Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile 20

Claims

실리카 결합단백질과 탐침단백질의 융합단백질이 실리카층을 포함하는 칩에 고정되어 있는 바이오-실리카 칩.
제1항에 있어서, 상기 실리카 결합단백질은 서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 단백질임을 특징으로 하는 바이오-실리카 칩.
제1항에 있어서, 상기 실리카 결합단백질은 탐침단백질의 N말단, C말단 또는 N말단과 C말단의 중간에 결합하는 것을 특징으로 바이오-실리카 칩.
제1항에 있어서, 상기 탐침단백질은 조류독감의 표면항원인 것을 특징으로 하는 바이오-실리카 칩.
서열번호 4 내지 6 중 어느 하나의 아미노산 서열로 표시되는 실리카 결합단백질.
제5항의 실리카 결합단백질을 코딩하는 유전자.
제5항의 실리카 결합단백질과 탐침단백질과의 융합단백질.
제7항의 융합단백질을 코딩하는 핵산을 함유하는 재조합벡터.
제8항의 재조합벡터를 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 도입하여 수득되는 재조합 미생물.
제9항의 재조합 미생물을 배양하여 실리카 결합단백질과 탐침단백질의 융합단백질을 발현시킨 다음, 발현된 융합단백질을 회수하여 실리카층을 포함하는 칩에 고정시키는 것을 특징으로 하는 바이오-실리카 칩의 제조방법.
제10항에 있어서, 상기 융합단백질의 고정은, 상기 재조합 미생물을 회수 및 파쇄하여 상기 융합단백질을 정제하여 수득한 다음, 수득된 융합단백질을 실리카층을 포함하는 칩에 처리함으로써 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바이오-실리카 칩을 이용하는 것을 특징으로 하는 DNA, 항체, 펩티드, 단백질, 및 탄수화물로 구성된 군에서 선택되는 표적과의 상호작용을 검출하는 방법.