JP2009542203A - システインタグ付きブドウ球菌タンパク質g変異体 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、N末端システインタグ付き連鎖球菌タンパク質G変異体、これをコードする核酸配列、発現ベクターおよび宿主細胞、前記変異体を製造する方法、並びに前記変異体または重合体を用いて製造されたバイオチップおよびバイオセンサに関する。
抗体は、抗原に特異的に結合するために、疾病の診断および治療に関連した医学的研究と生物学的分析に広範囲に使用されてきた(Curr. Opin. Biotechnol. 12 (2001) 65-69, Curr. Opin. Chem. Biol. 5(2001) 40-45)。最近では、免疫学的測定法の一環として、抗体を固体支持物質に固定化し、電流、抵抗、質量の変化および光学的特徴などを測定する免疫センサが開発されている(Affinity Biosensors. vol. 7: Techniques and Protocols)。これらの中でも、光学的な特徴を用いた表面プラズモン共鳴に基づいた免疫センサが商業化されたが、表面プラズモン共鳴に基づいたバイオセンサは、定性的情報(2分子が特異的に結合するか)と定量的情報(反応速度と平衡定数)を提供するだけでなく、標識なしで実時間で感知することができるため、抗原・抗体の結合の測定に特に有用である(J. Mol. Recognit. 1999, 12, 390-408)。
[技術的課題]
そこで、本発明者らは、上述した免疫センサにおいて抗体が結合するときに方向性を失うという問題点を解消するために研究した結果、N末端システインタグ付きタンパク質G変異体を製造し、その有用性を実験によって確認した。
本発明の目的は、N末端システインタグ付きタンパク質G変異体、およびこれをコードする核酸配列を提供することにある。タンパク質Gは、例えば、連鎖球菌に由来したものである。前記システインタグはリンカーを介してタンパク質Gに連結できる。
図1は連鎖球菌タンパク質Gが抗体と結合する結合ドメインB1、B2を示す。
前述した本発明の目的を達成するための第1様態として、本発明は、下記構造を有する、システインタグ付き連鎖球菌タンパク質G変異体に関する。
(Metはメチオニン、Lはリンカー、タンパク質Gは抗体に結合する2つのドメイン(B1、B2)を含み、Qはタンパク質精製のためのタグであり、x、yおよびzはそれぞれ0または1であり、nは1〜10である。)
タンパク質Gは、グループG連鎖球菌(streptococci)から分離されたバクテリア細胞膜タンパク質であって、哺乳動物の抗体のFc部分およびFab部分に結合するものと知られている (J. Immunol. Methods 1988, 112,113-120)。ところが、タンパク質Gは、抗体のFc部分に対する結合力がFab部分に対する結合力より約10倍程度高いと知られている。天然のタンパク質GのDNA配列は分析されて公知になっている。連鎖球菌タンパク質G変異体と連鎖球菌タンパク質Aは、グラム陽性細菌(Gram-positive bacteria)から発見される、細胞表面に関連した多様なタンパク質の一つであって、免疫グロブリン抗体に結合するという特徴がある。それらの中でも、連鎖球菌タンパク質G変異体が連鎖球菌タンパク質Aよりさらに有用に用いられているが、これは、連鎖球菌タンパク質G変異体がより広い範囲の哺乳動物の抗体と結合することができるから、抗体の受容体としての使用にさらに適するためである。
実施例1:システインタグ付き連鎖球菌タンパク質G変異体のタンパク質発現の分析
<1−1>1個、2個、3個、4個および5個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質G変異体の遺伝子製作
N末端に1個、2個、3個、4個および5個のシステインをタグ付けするために、6個のプライマーを製作した。これらの6個のプライマーのうち、5個のセンスプライマーの塩基配列にはATG(開始コドン)の後にTGC(システインコドン)を1個〜5個まで添加し、タンパク質Gとの連結環としてGAC GAC GAC GAC AAG(4個のAspコドンと1個のリシンコドン)を含んでいる。また、この遺伝子を発現ベクターpET21a(Novagen)に挿入するために、N末端のプライマーにはNdeIを、C末端のプライマーにはXhoI制限酵素切断部位を導入した。連鎖球菌ゲノム遺伝子を得て前記プライマー(配列番号3と配列番号8の塩基対、配列番号4と配列番号8の塩基対、配列番号5と配列番号8の塩基対、配列番号6と配列番号8の塩基対、配列番号7と配列番号8の塩基対)で重合鎖反応(PCR(polymerase chain reaction))して、抗体に結合するドメインとして知られている(B1[10個の切断された初期アミノ酸残基を有する形態]、B2)アミノ酸部分のみを得た。得られたフラグメントを各プライマーに導入された制限酵素で切断した後、NdeIおよびXhoI制限酵素で切断されたpET21aベクターに挿入してpET−cys1−L−proteinG、pET−cys2−L−proteinG、pET−cys3−L−proteinG、pET−cys4−L−proteinG、pET−cys5−L−proteinGベクターを製作した(図2)。前記発現ベクターはN末端にMetを発現する。
プライマー1:センス(配列番号3)
5’−CATATGTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG−3’
プライマー2:センス(配列番号4)
5’−CATATGTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG−3’
プライマー3:センス(配列番号5)
5’−CATATGTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG−3’
プライマー4:センス(配列番号6)
5’−CATATGTGCTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG−3’
プライマー5:センス(配列番号7)
5’−CATATGTGCTGCTGCTGCTGCGACGACGACGACAAGAAAGGCGAAACAACTACTGAAG−3’
プライマー6:アンチセンス(配列番号8)
5’−CTCGAGTTCAGTTACCGTAAAGGTCTTAGT−3’
製作されたpET−cys1−L−proteinG、pET−cys2−L−proteinG、pET−cys3−L−proteinG、pET−cys4−L−proteinG、pET−cys5−L−proteinGによって形質転換されたE.Coli BL21を37℃でO.D.(optical density)(A600nm)0.6となるまで振とう培養した後、総濃度1mMのIPTG(isopropyl β- D-thiogalactopyranoside)を添加して25℃でタンパク質発現を誘導した。14時間の後、細胞を遠心分離して得た大腸菌を超音波(Brason、Sonifier450、3KHz、3W、5min)で破砕した後、全体タンパク質溶液を得た。また、遠心分離によって溶解性分画タンパク質溶液と非溶解性分画タンパク質に分離して溶液をそれぞれ得た。ここで得られたタンパク質溶液を緩衝液(12mM Tris−Cl、pH6.8、5%グリセロール、2.88mMメルカプトエタノール、0.4% SDS、0.02%臭化フェノールブルー)と混合して100℃で5分間加熱した後、厚さ1mmの15%分離ゲル(pH8.8、横20cm、縦10cm)上に5%貯蔵ゲル(pH6.8、横10cm、縦12.0cm)を覆ったポリアクリルアミドゲルにロードした後、200〜100V、25mAで1時間電気永動し、クマシー染色液で染色して組み換えタンパク質を確認した。
Lane2:プラスミドpET−cys1−L−proteinGで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Lane3:プラスミドpET−cys1−L−proteinGで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Lane4:プラスミドpET−cys1−L−proteinGで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Lane5:プラスミドpET−cys2−L−proteinGで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Lane6:プラスミドpET−cys2−L−proteinGで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Lane7:プラスミドpET−cys2−L−proteinGで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Lane8:プラスミドpET−cys3−L−proteinGで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Lane9:プラスミドpET−cys3−L−proteinGで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Lane10:プラスミドpET−cys3−L−proteinGで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
(B)Lane1:タンパク質サイズマーカー
Lane2:プラスミドpET−cys4−L−proteinGで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Lane3:プラスミドpET−cys4−L−proteinGで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Lane4:プラスミドpET−cys4−L−proteinGで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
Lane5:プラスミドpET−cys5−L−proteinGで形質転換された大腸菌の全体タンパク質
Lane6:プラスミドpET−cys5−L−proteinGで形質転換された大腸菌の溶解性分画タンパク質
Lane7:プラスミドpET−cys5−L−proteinGで形質転換された大腸菌の非溶解性分画タンパク質
プラスミドpET−cys1−L−proteinGで生産されたタンパク質:cys1−G
プラスミドpET−cys2−L−proteinGで生産されたタンパク質:cys2−G
プラスミドpET−cys3−L−proteinGで生産されたタンパク質:cys3−G
プラスミドpET−cys4−L−proteinGで生産されたタンパク質:cys4−G
プラスミドpET−cys5−L−proteinGで生産されたタンパク質:cys5−G
<1−2>のように発現した後で得られた溶解性タンパク質溶液を精製するために、IDA excelluloseで充填されたカラムにヘキサヒスチジンが結合されている6種の組み換え遺伝子を発現させた細胞を破砕した溶液をロードした。ヒスチジンが結合されている6種の組み換えタンパク質を溶離溶液(50mM Tris−Cl、0.5Mイミダゾール、0.5M NaCl、pH8.0)で溶離した。溶離されたタンパク質溶液は緩衝溶液PBS(pH7.4)で透析した。
2.5O.D/mLの金ナノ粒子をPBS緩衝溶液で洗浄した後、100μLの一連の連鎖球菌タンパク質G変異体(200μg/mL)と4℃で16時間反応させた後、抗体10μL(3.5g/mL、抗−ウサギIgG(Whole Molecule)−TRITCコンジュケート、Sigma)を常温で2時間反応させた。また、対照群として2.5O.D/mLの金ナノ粒子に抗体10μL(3.5g/mL)を常温で2時間反応させた。前記反応の後、遠心分離を用いて、反応していない抗体を除去し、PBS緩衝溶液で洗浄した。
lane1:金ナノ粒子に直接抗体を結合、
lane2:金ナノ粒子に、システインをタグ付けしていないタンパク質Gを固定化した後、抗体を結合
lane3:金ナノ粒子に、1個のシステインをタグ付けしたタンパク質Gを固定化した後、抗体を結合
lane4:金ナノ粒子に、2個のシステインをタグ付けしたタンパク質Gを固定化した後、抗体を結合
lane5:ナノ粒子に、3個のシステインをタグ付けしたタンパク質Gを固定化した後、抗体を結合
その結果、金ナノ粒子に抗体のみ反応したときよりは、連鎖球菌タンパク質G変異体を結合し抗体を反応させたときにさらに多くの抗原が結合した。また、タグ付けしていない組み換えタンパク質より、1個、2個および3個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質G変異体はさらに多くの抗原が結合した。上記の結果より、システインタグ付き組み換え連鎖球菌タンパク質G変異体が金ナノ粒子における抗原の固定化に有用であることを確認することができた(図6)。
ガラス表面をピラニア(硫酸:過酸化水素、3:1v/v)溶液に浸漬させて20分間90℃のオーブンで反応させた。反応の後、水とエタノールで洗った後、アミン表面を作るために、1%APTS((3-Aminopropyl)trimethoxysilane、09326、SIGMA−ALDRICH)が含まれたエタノール15〜20分間浸漬させて反応させた。反応済みのガラス表面はエタノールで洗浄した後、100℃のオーブンで使用する前まで加熱した。作られたアミン表面上に10mM BMPS(N-[b-Maleimidopropyloxy]succinimide ester、22298、PIERCE、USA)をDMS(dimethyl sulfoxide、D2650、SIGMA−ALDRICH)に溶かして30分間浸漬させて反応させた。SH基と共有結合すべき、最終ガラスの表面上に作られたマレイミド基と1個、2個、3個のシステインをタグ付けした連鎖球菌タンパク質G変異体を表面上に反応させてタンパク質を固定化した。一連の連鎖球菌タンパク質G変異体が固定化された表面に、蛍光標識物質を付着させた抗体モノクローナル抗−ビオチンCy3(C5585、SIGMA−ALDIRCH)および対照群としてのストレプトアビジン−Cy3(Streptavidin-Cy3 from Streptomyces avidinii、S6420 SIGMA−ALDRICH)のアレイをマイクロアレイを用いて作った後、蛍光スキャナを用いて特異的タンパク質の結合度合いと非特異的結合が及ぼす影響を測定した。その結果、ストレプトアビジン−Cy3(1mg/mL)の蛍光シグナルが現れておらず、抗体モノクローナル抗−ビオチンCy3の濃度が増加するほど蛍光シグナルが増加することからみて、1個、2個および3個のシステインをタグ付けした連鎖球菌G変異体との抗体反応が特異的に行われたことを確認した。また、同一濃度の連鎖球菌タンパク質G変異体をそれぞれ反応させた後で抗体を反応させたとき、低濃度の抗体と高い結合力を示すことからみて、1個、2個および3個のシステインをタグ付けした組み換え連鎖球菌タンパク質Gが、マレイミド基が結合されているガラスの表面などに抗体を固定化することに有用であることを確認することができた(図7)。
金薄膜チップを95%硫酸と30%過酸化水素水(体積比3:1)との混合溶液(65℃)で30分間処理し、3次蒸留水でチップを洗浄した後、エタノールで洗浄し、3次蒸留水でチップを洗浄した。その後、窒素ガスでチップを乾燥させてBia−core表面プラズモン共鳴センサに装着した。装着されたチップの金薄膜の表面に、濃度200μg/mLの1個、2個および3個のシステインをタグ付けした組み換えタンパク質とタグ付けしていない組み換えタンパク質を150μLずつ5μL/minの流れ率で注入させて前記タンパク質を固定化した。金薄膜の表面と前記タンパク質を反応させた後、非特異的な反応を防ぐために、BSA(3mg/mL)100μLを5μL/minの流れ率で注入させた。その後、抗体(0.5μg/mL、抗−human Kallikrein 3/PSA抗体、R&D systems)100μLを5μL/minの流れ率で注入して、抗体が固定されたバイオセンサに50μLの抗原(0.5μg/mL、Recombinant Human Kallikrein 3/PSA)を反応させてプラズモン共鳴信号の変化を測定した(図8)。
本発明に係るシステインタグ付きタンパク質G変異体は、そのチオール基を介してバイオセンサの固体支持物質に方向性をもって結合して抗体を効率よく結合させることにより、抗原−抗体反応を用いるバイオチップおよびバイオセンサに有用に使用できる。
Claims (17)
- 下記式で表される、N末端システインタグ付きタンパク質G変異体。
Metx−(Cys)n−Ly−タンパク質G−Qz
(Metはメチオニン、Lはリンカー、Qはタンパク質精製のためのタグであり、x、yおよびzはそれぞれ0または1であり、nは1〜10である。) - 前記タンパク質Gは連鎖球菌に由来したタンパク質GのB1およびB2ドメインからなることを特徴とする、請求項1に記載のタンパク質G変異体。
- 前記タンパク質GのB1ドメインはN末端の10個のアミノ酸が除去されたことを特徴とする、請求項2に記載のタンパク質G変異体。
- システインタグが1〜5個のシステインからなる、請求項1または2に記載のタンパク質G変異体。
- システインタグが3個のシステインからなる、請求項2に記載のタンパク質G変異体。
- リンカーが4個のアスパラギンと1個のリシンからなる、請求項1に記載のタンパク質G変異体。
- 請求項2または3のタンパク質をコードする核酸配列。
- 請求項7の核酸配列を含む発現ベクター。
- 請求項8の発現ベクターを含むKCTC10948BP、KCTC10949BP、KCTC10950BP、KCTC10951BP、およびKCTC10952BPよりなる群から選択される、宿主細胞。
- 請求項9の宿主細胞を培養し、これからタンパク質G変異体を分離することを特徴とする、タンパク質G変異体の製造方法。
- 請求項1のタンパク質を固体支持物質の表面に結合させて製造されたバイオチップまたはバイオセンサ。
- 固体支持物質がセラミック、ガラス、高分子、シリコンおよび金属の中から選ばれることを特徴とする、請求項10に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
- 前記金属が金である、請求項11に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
- 請求項1のタンパク質に抗体を結合させて製造された、請求項10〜12のいずれか1項に記載のバイオチップイまたはバイオセンサ。
- 固体支持物はセラミック、ガラス、高分子およびシリコンの中から選ばれ、これらの表面はマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基から選ばれるいずれか一つの基で修飾されたことを特徴とする、請求項12に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
- 請求項1のタンパク質がチオール基を介して前記表面のマレイミド基、エポキシ基、ニトロフェノールプロリン基およびヨウ化メチル基のいずれか一つに共有結合されることを特徴とする、請求項15に記載のバイオチップまたはバイオセンサ。
- 請求項14のバイオチップまたはバイオセンサを用いて抗原を分析する方法。
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