KR20100001090A - 면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규펩타이드 및 그의 제조방법 - Google Patents

면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규펩타이드 및 그의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 면역글로불린 G의 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 11개의 아미노산 서열로 구성된 저분자 펩타이드, 및 면역글로불린 G의 Fc 부위를 이용하여 상기 저분자 펩타이드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규 펩타이드는 융합단백질 또는 화학 유도체 형태로써 항체 고정, 항체 정제, 면역바이오센서 제작 및 약물전달시스템(DDS, Drug Delivery System) 등에 유용하게 활용될 수 있다.
면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG), Fc, 펩타이드, 분자진화법

Description

면역글로불린 Ｇ의 Ｆｃ 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드 및 그의 제조방법{Novel peptides with specific binding to Fc domain of IgG and their preparation methods}
본 발명은 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 신규 펩타이드 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 면역글로불린 G의 Fc 부위에 선택적으로 결합하는 11개의 아미노산 서열로 구성된 저분자 펩타이드, 및 상기 저분자 펩타이드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
항원-항체 반응을 이용한 면역센서, 표적지향형 약물전달시스템(targeted drug delivery system), 단백질 칩, 진단 키트 등의 면역반응을 이용한 응용 분야에서 다양한 고체 물질(흡착지, 나노입자, 마이크로입자, 유리 및 금 등)의 표면 또는 다른 생체분자(펩타이드, 단백질, 핵산 및 리피드 등)에 항체를 고정하는 것은 필수 불가결한 과정이다. 따라서 항체의 항원결합부위가 표면에 잘 노출될 수 있도록 항체의 배향성(orientation)을 조절하여 그 고유한 결합 특성을 유지하면서 높은 재현성을 가지고 항체를 고정하는 기술은 칩 또는 센서의 검출 감도에 직접적으로 연결될 뿐 아니라, 약물 전달체의 생체적용을 위하여 필수불가결한 요소이다.
현재까지 고체기질 표면에 항체를 고정하는 방법은 주로 물리적 흡착 또는 선택성이 결여된 공유결합형성 반응에 의존하고 있다. 그러나 이러한 방법으로 항체를 고정하게 되면 입체적 장애(steric hindrance) 또는 무작위적 배향(random orientation) 등의 원인으로 항체 고유의 활성을 감소시키는 결과를 초래한다. 이에 대한 대안으로 단백질 A(Protein A)와 단백질 G(Protein G) 등과 같은 미생물 유래의 항체결합 단백질들(Antibody-binding proteins)이 사용되기도 한다. 상기 단백질들은 항원-항체 반응에 참여하지 않는 항체의 Fc 부위에 강하게 결합함으로써 항원의 접근성을 용이하게 한다. 또한, 상기 단백질들과 항체와의 결합에는 별도의 화학적 수식이 필요하지 않으므로 항체의 고유 기능을 해치지 않는 장점이 있다. 따라서 최근에는 유전공학적, 화학적 방법으로 항체결합 단백질을 변형시킴으로써 상기 문제를 극복하는 연구에 초점이 맞춰지고 있다. 그러나 상기 단백질들은 고비용성, 저안정성, 정제 과정에서의 오염물질 혼합가능성, 항체 활성 감소 및 선택성의 결여 등과 같은 단점을 가지고 있다. 상기 문제점을 극복할 수 있는 방법으로써 저분자 물질에 대한 연구가 이루어지고 있다. 지금까지 덴드리머(dendrimer), 철 이온 또는 캘릭스크라운(calixcrown) 유도체들을 이용한 방법들이 개발되었으나 상기 방법들은 항체에 대한 배향성 조절 및 선택성 없이 모든 종류의 단백질에 비슷한 정도의 결합을 나타내며 결합력이 강력하지 못하다는 단점이 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 항체 결합 단백질 또는 항체 고정용 저분자 물질의 단점을 극복할 수 있는 새로운 형태의 항체 고정용 저분자 펩타이드를 개발하던 중, 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 부위에 선택적으로 강하게 결합하는 신규 펩타이드를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 제조하는 방법, 및 상기 폴리펩타이드를 이용한 IgG의 정제 방법 및 고정화 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 일부 아미노산이 삽입, 결핍 또는 치환되고, 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 대한 결합력이 유지되는 아미노산 서열을 포함하는 IgG의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 11 내지 20중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 형질전환체를 배지 내에서 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) DNA 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 DNA 라이브러리의 유전자에 형광단백질 유전자를 융합시켜 융합단백질을 발현할 수 있는 융합유전자를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 융합유전자를 삽입한 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조한 후 배양하는 단계;
5) IgG의 Fc 단편을 포함하는 폴리펩티드가 코팅된 고체기판에 상기 단계 4)의 형질전환체의 배양액 또는 파쇄액을 처리 및 세척하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 고체기판의 형광을 측정하는 단계; 및
7) 상기 측정된 형광 신호가 검출된 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 카복실기를 포함하는 고체기판의 카복실기를 활성화하는 단계;
2) 제 1항의 폴리펩타이드를 단계 1)의 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및,
3) 상기 단계 2)의 표면처리된 고체기판에 IgG을 결합시키는 단계로 이루어진 IgG 단분자막의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 폴리펩티드를 흡착시킨 컬럼에 항체를 포함하는 조성물을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 IgG 항체의 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 폴리펩티드를 고체기판에 부착하도록 표면처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 고체기판에 IgG을 처리하는 단계를 포함하는 IgG의 고정화 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 폴리펩티드로 표면처리된 고체기판에 상기 폴리펩티드를 매개로 IgG가 고정된 면역센서를 제공한다.
본 발명의 신규 펩타이드는 여러 종류의 고체상 표면에서 IgG에 배향성을 부여하여 고정할 수 있을 뿐만 아니라 IgG의 유래 또는 아형별로 다른 결합 친화도를 가지고 고정할 수 있으므로, 본 발명의 펩타이드 및 IgG의 혼성체를 이용한 표면 처리 기술은 다양한 면역 센서/면역 칩의 제작 및 항체 정제용 흡착 컬럼 재료 및 약물전달용 표적지향형 DDS 수송체 및 생물학적 의약품(단백질, 펩타이드, 핵산 등) 제조에 활용이 가능할 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 일부 아미노산이 삽입, 결핍 또는 치환되고, 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 대한 결합력이 유지되는 아미노산 서열을 포함하는 IgG의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 폴리펩티드는 하기와 같은 단계를 포함하는 제조방법으로 제조하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) DNA 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 제조된 DNA 라이브러리의 DNA 염기서열의 카르복시 말단에 형광단백질 유전자를 융합함으로써, 라이브러리에 중지서열이 없이 형광단백질이 발현하는 융합유전자를 제조하는 단계;
3) 상기 융합 유전자는 제한효소를 이용하여 발현벡터에 삽입한 후, 숙주세포에 형질 전환시키는 단계;
4) 상기 형질 전환체를 배양하여 콜로니(colony)를 형성시킨 후, 이중 형광을 띠는 콜로니만을 선별하여 배양시켜 융합 단백질이 발현되는 세포 펠릿(cell pellet)을 확보하는 단계;
5) 상기 세포 펠릿 라이소자임 용해(lysozyme digestion) 방법을 이용하여 대장균 세포 용해물(cell lysate)를 제조하는 단계; 및
6) 상기 세포 용해물로부터 구축된 융합단백질을 포함한 라이브러리를 가지고 도트블랏 분석(dot blotting assay) 방법으로 펩티드를 스크리닝하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 DNA 라이브러리는 파아지 디스플레이(phage display) 방법, 대장균 표면 디스플레이(E. coli surface display) 방법, 또는 PCR과 클로닝(cloning)을 이용하는 방법(Kawasaki M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 280, Number 3, 26 January 2001 , pp. 842-844(3)) 중 어느 하나를 이용하는 것이 바람직하고, PCR과 클로닝(cloning)을 이용하는 방법이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 2)의 형광단백질은 EGFP(enhanced green fluorescent protein)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명자들은 상기 제조된 DNA 라이브러리의 DNA 염기서열의 카르복시 말단에 형광단백질(EGFP) 유전자를 융합함으로써, 라이브러리에 중지서열이 없이 형광단백질이 발현하여 형광을 나타내도록 제조하였다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 발현벡터는 항시 발현벡터인 것이 바람직하고, pHCE ⅡB 벡터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있고, 또한 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
상기 방법에 있어서, 단계 6)의 스크리닝은 도트블랏 분석(dot blotting assay) 방법을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 도트블랏을 이용하여 분석한 결과, 전체 콜로니 중 형광을 띠는 비율은 50 ~ 60 % 정도였으며 2000개의 형광 콜로니를 스크리닝하여(도 2 참조) 최종 10개의 융합 단백질을 선정하였고, 상기 선별된 콜로니의 유전자 서열을 분석(표 1 참조)하여 서열번호 11 내지 20의 염기서열을 획득하였으며, 상기 염기서열을 통하여 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 확인하였다(표 2 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 획득한 펩타이드의 IgG에 대한 결합력을 알아보기 위해 도트블랏 분석방법을 이용하여 측정하였다. 구체적으로, 인간, 토끼, 쥐(rat), 생쥐(mouse) 및 염소(goat) 면역글로불린 G(immunoglobulin G)으로 처리된 흡착용지(nitrocellulose membrane) 표면에 FcBP-EGFP 후보 펩타이드를 적용한 후 세척하고 남아있는 형광 강도를 측정함으로써 결합력 및 결합부위를 측정하였다. 그 결과, 본 발명의 서열번호 1 내지 10의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드는 IgG에 높은 결합력을 나타내었다(도 3 참조).
또한, 본 발명은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 11 내지 20중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
상기 발현벡터는 항시 발현벡터인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한 다.
상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은
1) 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 서열번호 11 내지 20중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 유전자를 포함하는 벡터를 도입한 형질전환체를 배지 내에서 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 제조방법을 제공한다.
상기 배양 배지로는 당업자에게 공지된 배양 배지 중 형질전환체에 적합한 배지를 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 상기 정제는 당업자에게 공지된 어떠한 정제 방법도 사용 가능하다.
상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은
1) DNA 라이브러리를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 DNA 라이브러리의 유전자에 형광단백질 유전자를 융합시켜 융합단백질을 발현할 수 있는 융합유전자를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 융합유전자를 삽입한 발현벡터를 제조하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조한 후 배양하는 단계;
5) IgG의 Fc 단편을 포함하는 폴리펩티드가 코팅된 고체기판에 상기 단계 4)의 형질전환체의 배양액 또는 파쇄액을 처리 및 세척하는 단계;
6) 상기 단계 5)의 고체기판의 형광을 측정하는 단계; 및
7) 상기 측정된 형광 신호가 검출된 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 폴리펩티드를 흡착시킨 컬럼에 항체를 포함하는 조성물을 처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 IgG 항체의 정제방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 카복실기를 포함하는 고체기판의 카복실기를 활성화하는 단계;
2) 제 1항의 폴리펩타이드를 단계 1)의 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및,
3) 상기 단계 2)의 표면처리된 고체기판에 IgG을 결합시키는 단계로 이루어진 IgG 단분자막의 제조방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 고체기판은 CM-5 Au 센서 칩, 자성미세입자, 유리판, 금나노입자, PLGA 등 생분해성 유기고분자나노입자 또는 각종 (미세)웰플레이트[(micro)well plate]으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다. 상기 고체기판은 카복실기를 갖고 있는 것을 특징으로 하는데, 상기 카복실기가 활성화되면 본 발명의 펩타이드의 말단 아민기와 반응하여 고정할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 IgG는 인간, 토끼, 쥐 또는 염소 유래 IgG인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 표면처리에 의해 고체기판은 배향성이 조절되도록 단백질을 결합할 수 있으며, 고체기판 표면의 균일성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 IgG 고정용 펩타이드를 사용한 단분자막의 제조방법은 기존의 항체결합 단백질(단백질A, 단백질G, 단백질A/G 또는 단백질 L)을 사용한 방법에 비해 물리·화학적으로 안정하며, 다양한 화학적 수식이 가능하여 그 용도가 매우 광범위할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 기존의 저분자 화합물을 사용한 방법에 비해 IgG에 대한 높은 선택성과 결합력을 보이는 것을 그 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 폴리펩티드를 고체기판에 부착하도록 표면처리하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 고체기판에 IgG을 처리하는 단계를 포함하는 IgG의 고정화 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 폴리펩티드로 표면처리된 고체기판에 상기 폴리펩티드를 매개로 IgG가 고정된 면역센서를 제공한다.
상기 면역센서는 카복실기가 활성화된 고체기판에 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 펩타이드로 표면처리한 후 검출하고자 하는 IgG를 고정화함으로써 수득할 수 있다.
상기 면역센서를 이용한 항원-항체 반응을 검출은 고체기판의 종류에 따라 달라질 수 있다. 즉, 상기 고체기판이 CM-5 Au 센서 칩인 경우 상기 면역센서에 항원을 일정한 속도로 주입하면서 표면 플라즈몬 공명법에 의해 항원-항체 결합 정도를 측정할 수 있다. 또한, 상기 고체기판이 자성미세입자인 경우 상기 자성미세입자 자체를 완충용액에서 끓인 후, PAGE 방법으로 측정할 수 있다. 아울러, 상기 고체기판이 유리판인 경우 형광 표지된 IgG를 펩타이드에 처리함으로써 형광을 측정하여 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 １> FcBP - EGFP 양성 대조군( Positive Control ) 발현벡터의 제작
본 발명자들은 항체결합 펩타이드(Fc binding protein; FcBP)와 형광유전자(enhanced green fluorescent protein; EGFP)를 융합하기 위하여 형광유전자인의 염기서열에 대해 5' 말단에 항체결합 펩타이드(CysAlaTrpHisLeuGlyGluLeuValTrpCys)(서열번호: 21)의 정보를 포함한 DNA를 삽입하여 융합벡터를 제작하였다. 항체결합 펩타이드에 해당하는 염기서열은 프라이머를 설계할 때 삽입되었다. 상기 프라이머는 하기와 같다: 정방향 프라이머 염기서열: 5'-GAA TTC CAT ATG GAC TGT GCA TGG CAC CTG GGA GAA CTG GTC TGG TGC ACC GTG AGC AAG GGC GAG GAG CTG TTC-3'(NdeⅠ)(서열번호: 22), 및 역방향 프라이머 염기서열: 5'-CCG CTC GAG CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG CTC GAG-3'(Xho I)(서열번호: 23).
EGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 유전자의 20 μΜ 정방향 프라이머 및 역방향 각각 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP mixture 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 및 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐 링 55℃ 1분, 신장 72℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관(4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1% 아가로즈 젤 전기영동을 통하여 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 상기 최종 PCR 반응산물 및 pET 28a 벡터(Novagen, Cat. No. 69864-3)를 제한효소 Nde I(TaKaRa, Cat. No. 1161A)과 Xho I(TaKaRa, Cat. No. 1094A)으로 37 ℃에서 2 시간 동안 반응 후, DNA Ligation kit(TaKaRa, Cat. No. 6022)를 이용하여 연결함으로써 해당 플라스미드 DNA를 제작하였다. 제작된 플라스미드 DNA는 대장균에서 증폭시킨 후 염기서열을 확인함으로써 항체결합 펩타이드(FcBP)와 형광유전자(EGFP)를 포함한 융합벡터(28a-FcBP-EGFP)임을 확인하였다. 제작된 융합 벡터로부터 발현된 융합단백질은 본 실험의 대조군으로 사용되었다.
< 실시예 2＞ 펩타이드 라이브러리 제작을 위한 DNA 라이브러리
본 발명자들은 펩타이드 라이브러리를 제조하기 위해 우선 9개의 펩타이드 라이브러리를 생성할 수 있는 27개의 무작위(random) DNA서열(A, T, G, C)을 포함한 단일가닥 합성 DNA 라이브러리(Bioneer, Korea)를 제작하였다(Kawasaki M. et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Volume 280, Number 3, 26 January 2001 , pp. 842-844(3)). 상기 제작된 DNA 라이브러리(염기서열: 5'-GCC GCA GCC ATA TGA AAG ATG AAT GTN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNN NNT GCG AAT TCG AGC TCC GTC GA-3'; N: A,T,G 또는 C)(서열번호: 24)를 주형으로 이용 하고, 정방향 프라이머[염기서열; 5'-GC CGC AGC CAT ATG AAA GAT GAA TGT-3'(NdeⅠ)(서열번호: 25)]와 역방향 프라이머[염기서열: 5'-CTC GCC CTT GCT CAC TCG ACG GAG CTC GAA-3'(서열번호: 26)]를 이용하여 PCR 반응을 수행함으로써 메가프라이머 1를 제조하였다(PCR 조건: 초기변성 95℃ 5분, 변성 95℃ 30초, 어닐링 55℃ 1분, 신장 72℃ 1분, 25회 반복, 최종 신장 72℃ 10분, 반응 종결 및 보관 4℃).
상기 PCR 반응 산물을 1 % 아가로즈 젤에 전기 영동한 후 약 800 bp 크기의 DNA 단편을 확인하였다. 제조된 메가 프라이머 1과 역방향 프라이머(염기서열: 5'-ATT CGC GGA TCC CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG-3'(Bam HⅠ)(서열번호: 27)을 각각 1 ㎕, EGFP 유전자를 주형으로 하여 DNA 1 ㎕, 중합효소 활성 완충액 2.5 ㎕, dNTP mixture 2 ㎕, Taq 중합효소 1 ㎕, 멸균증류수 16.5 ㎕를 첨가하여 최종 25 ㎕가 되도록 혼합한 뒤, 하기의 조건으로 PCR 반응을 수행하였다(PCR 조건: 초기변성 95 ℃ 5분, 변성 95 ℃ 30초, 어닐링 55 ℃ 1분, 신장 72 ℃ 2분, 25회 반복, 최종 신장 72 ℃ 10분, 반응 종결 및 보관 4℃). 최종 PCR 반응 생성물은 5'-말단부터 순서대로 NdeⅠ 제한효소 자리, 9개 펩타이드를 암호화할 수 있는 라이브러리 서열, EGFP 유전자를 암호화하는 서열, Bam HⅠ 제한효소 자리를 가지게 된다.
상기 최종 PCR 반응 산물을 NdeⅠ과 BamHⅠ(TaKaRa, Cat. No. 1010A) 제한효소로 처리한 후(37 ℃, 2시간), 아가로즈 젤 전기 영동으로 DNA를 정제하였다. 동일 제한효소로 처리한 pHCE ⅡB 벡터(TaKaRa, Cat. No. BL009)에 CIP(Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal, NEB, Cat. No. M0290S)를 처리하여 DNA 말단의 인 산기를 선택적으로 제거한 후 정제하여 사용하였다. 이렇게 제한효소 처리된 각각의 융합 유전자는 T4 DNA Ligase에 의한 연결 반응(ligation)으로 pHCE ⅡB 항시 발현벡터에 삽입함으로써 펩타이드 라이브러리 제작을 위한 플라스미드(plasmid) DNA 라이브러리(library)를 제작을 완료하였다. 상기 제작된 플라스미드 라이브러리를 바로 E. coli Rosetta 세포(Novagen)에 형질전환(transformation)시킨 후 다음 과정을 진행하였다.
< 실시예 3> 대장균을 이용한 펩타이드 라이브러리 발현
본 발명자들은 상기 <실시예 2>에서 형질전환된 대장균을 암피실린(ampicillin) 항생제가 포함된 LB 플레이트(plate)(Luria-Bertani plate)에 도말하고 37℃에서 18시간 동안 배양하여 콜로니(colony)를 형성시켰다(도 2). 상기 콜로니 중 형광을 띠는 콜로니만을 선택하여 암피실린을 포함한 LB 배지 4 mL에 접종하고 25 ℃에서 20 내지 24시간 동안 배양시킴으로써 FcBP 후보펩타이드-EGFP 융합단백질을 발현시켰다. 원심분리(16600g, 4 ℃, 5분)를 이용하여 회수된 세포 플레이트(cell pellet)를 450 ㎕ 융해 완충용액(lysis buffer)(10 mM BME, 4.5 mM PMSF, 1 mM EDTA, 0.5 % Tween-20, 10 % glycerol)에 분산 시켰다. 그 다음, 라이소자임(lysozyme)을 최종 1 mg/ml의 농도가 되도록 첨가하고, 상온에서 2시간 동안 천천히 교반함으로써 세포를 융해시켰다. 세포 융해액을 원심분리(16600g, 4 ℃, 30분)한 다음, 상등액을 취하여 모든 라이브러리멤버를 희석하여 형광 강도가 비슷한 정도로 농도를 조절한 후 도트블랏분석(dot blotting assay)에 사용하였다.
< 실시예 4> 도트블랏분석를 이용한 FcBP - EGFP 융합단백질 라이브러리 스크리닝
도트블랏분석(Dot blotting assay)은 Easy-Titer ELIFA System(Pierce pierce, Cat. No. 77000)을 사용하여 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)(BioTrace NT membrane, Pall, Cat. No. 66485)위에서 수행되었다. 상기 시스템은 96-웰 플레이트(well plate)와 진공 챔버(vacuum chamber) 사이에 끼워 넣어 사용하는 것으로 웰(Well)을 통하여 5종(인간, 쥐, 토끼, 생쥐 및 염소)의 면역 글로불린 G(Ig G)[인간 IgG(Sigma, Cat. No. I8640), 쥐 IgG(Sigma, Cat. No. I4131), 토끼 IgG(Sigma, Cat. No. I5006), 생쥐 IgG(Sigma, Cat. No. I8765), 염소 IgG(Sigma, Cat. No. I9140)]를 각각 10 μg (0.1 mg/ml 100 ㎕) 씩 가하여 막에 물리적으로 흡착시켰다. 그런 다음, PBS 완충용액(buffer)에 녹인 3 % BSA 용액(150 ㎕)(Sigma, Cat. No. BSAS-100)을 가하여 막 상의 빈자리를 블라킹(blocking)한 후, 남은 BSA 용액을 제거하기 위하여 PBS 완충용액(150 ㎕)으로 세척(washing)하였다.
상기와 같이 준비된 세포 융해액 100 ㎕를 가하여 5분간 정치한 후, 세척 완충용액(shing buffer)(PBS buffer, pH 7.4, 0.05 % Tween-20, 150 ㎕)으로 3번 세척하였다. 그런 다음, 막을 장치에서 분리하여 세척 완충용액에 담근 후, 30분 정도 교반하여 씻어주었다. 후보 펩타이드가 면역 글로불린 불변부위(Fc region)에 결합하는 정도는 해당 펩타이드에 연결된 녹색 형광 단백질(EGFP)로부터 유래한 형광을 LAS-3000(FUJIFILM)으로 촬영함으로써 확인할 수 있었다(도 3).
그 결과, 전체 콜로니 중 형광을 띠는 비율은 50 내지 60 % 정도였으며 2000개의 형광 콜로니를 스크리닝하여 최종 10개의 융합 단백질을 선정하였다. 그런 다음, Plasmid Mini Extraction Kit(Bioneer, Cat. No. K-3111)를 사용하여 이들 후보들의 플라스미드(plasmid)를 정제하였으며, 이를 서열분석(sequencing)하여 하기 표 1 및 표 2에서 보는 바와 같은 서열을 확인하였다.
항체결합 펩타이드의 DNA 염기서열
종류 DNA 서열 서열번호
EGFP 1 DNA TGT CAT AAG AGG AGT TTT TGG GCG GAT AAT TGC 서열번호 11
EGFP 2 DNA TGT CGT ACG CAG TTT CGG CCT AAT CAG ACT TGC 서열번호 12
EGFP 3 DNA TGT CAG CTG TGC GAC TTC TGG CGC ACT CGA TGC 서열번호 13
EGFP 4 DNA TGT TTT GAG GAT TTT AAT GAG CAG AGG ACT TGC 서열번호 14
EGFP 5 DNA TGT CTT GCG AAG TTT TTG AAG GGG AAG GAT TGC 서열번호 15
EGFP 6 DNA TGT TGG CAT AGA CGA ACT CAT AAG ACC TTC TGC 서열번호 16
EGFP 7 DNA TGT CGG ACG ATT CAG ACG AGG TCT CAT TGG TGC 서열번호 17
EGFP 8 DNA TGT ATT AAG TTG GCT CAG CTT CAT TCT GTT TGC 서열번호 18
EGFP 9 DNA TGT TGG AGG CAT CGT AAT GCT ACT GAG TGG TGC 서열번호 19
EGFP 10 DNA TGT CAG AAT TGG ATT AAG GAT GTG CAT AAG TGC 서열번호 20
항체결합 펩타이드의 아미노산 서열
종류 아미노산 서열 서열번호
EGFP 1 C H K R S F W A D N C 서열번호 1
EGFP 2 C R T Q F R P N Q T C 서열번호 2
EGFP 3 C Q L C D F W R T R C 서열번호 3
EGFP 4 C F E D F N E Q R T C 서열번호 4
EGFP 5 C L A K F L K G K D C 서열번호 5
EGFP 6 C W H R R T H K T F C 서열번호 6
EGFP 7 C R T I Q T R S H W C 서열번호 7
EGFP 8 C I K L A Q L H S V C 서열번호 8
EGFP 9 C W R H R N A T E W C 서열번호 9
EGFP 10 C Q N W I K D V H K C 서열번호 10
도 1은 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 스크리닝하는 과정을 나타내는 그림이다.
도 2는 항시 발현벡터 라이브러리로 형질전환된 대장균을 접종한 LB plate 상에 FcBP-EGFP 융합단백질이 발현되어 있는 형광 콜로니(colony)를 나타내는 그림이다.
도 3은 FcBP-EGFP 융합단백질의 IgG의 Fc 부위 부착여부를 도트블랏 분석(Dot Blotting Assay) 방법을 이용하여 분석한 결과를 나타내는 그림이다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel peptides with specific binding to Fc domain of IgG and their preparation methods <130> 8p-06-42 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 1 <400> 1 Cys His Lys Arg Ser Phe Trp Ala Asp Asn Cys 1 5 10 <210> 2 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 2 <400> 2 Cys Arg Thr Gln Phe Arg Pro Asn Gln Thr Cys 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 3 <400> 3 Cys Gln Leu Cys Asp Phe Trp Arg Thr Arg Cys 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 4 <400> 4 Cys Phe Glu Asp Phe Asn Glu Gln Arg Thr Cys 1 5 10 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 5 <400> 5 Cys Leu Ala Lys Phe Leu Lys Gly Lys Asp Cys 1 5 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 6 <400> 6 Cys Trp His Arg Arg Thr His Lys Thr Phe Cys 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 7 <400> 7 Cys Arg Thr Ile Gln Thr Arg Ser His Trp Cys 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 8 <400> 8 Cys Ile Lys Leu Ala Gln Leu His Ser Val Cys 1 5 10 <210> 9 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 9 <400> 9 Cys Trp Arg His Arg Asn Ala Thr Glu Trp Cys 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 10 <400> 10 Cys Gln Asn Trp Ile Lys Asp Val His Lys Cys 1 5 10 <210> 11 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 1 DNA <400> 11 tgtcataaga ggagtttttg ggcggataat tgc 33 <210> 12 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 2 DNA <400> 12 tgtcgtacgc agtttcggcc taatcagact tgc 33 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 3 DNA <400> 13 tgtcagctgt gcgacttctg gcgcactcga tgc 33 <210> 14 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 4 DNA <400> 14 tgttttgagg attttaatga gcagaggact tgc 33 <210> 15 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 5 DNA <400> 15 tgtcttgcga agtttttgaa ggggaaggat tgc 33 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 6 DNA <400> 16 tgttggcata gacgaactca taagaccttc tgc 33 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 7 DNA <400> 17 tgtcggacga ttcagacgag gtctcattgg tgc 33 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 8 DNA <400> 18 tgtattaagt tggctcagct tcattctgtt tgc 33 <210> 19 <211> 33 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 9 DNA <400> 19 Thr Gly Thr Thr Gly Gly Ala Gly Gly Cys Ala Thr Cys Gly Thr Ala 1 5 10 15 Ala Thr Gly Cys Thr Ala Cys Thr Gly Ala Gly Thr Gly Gly Thr Gly 20 25 30 Cys <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFP 10 DNA <400> 20 tgtcagaatt ggattaagga tgtgcataag tgc 33 <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fc binding protein <400> 21 Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys 1 5 10 <210> 22 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 22 gaattccata tggactgtgc atggcacctg ggagaactgg tctggtgcac cgtgagcaag 60 ggcgaggagc tgttc 75 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 23 ccgctcgagc ttgtacagct cgtccatgcc gagctcgag 39 <210> 24 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA library <220> <221> variation <222> (27)..(53) <223> n is A,T,G or C <400> 24 gccgcagcca tatgaaagat gaatgtnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnntgcgaat 60 tcgagctccg tcga 74 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 25 gccgcagcca tatgaaagat gaatgt 26 <210> 26 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 ctcgcccttg ctcactcgac ggagctcgaa 30 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 27 attcgcggat cccttgtaca gctcgtccat gccgag 36

Claims (17)

  1. 서열번호 1 내지 10 중 어느 하나의 아미노산 서열, 또는 상기 아미노산 서열에 있어서 일부 아미노산이 삽입, 결핍 또는 치환되고, 면역글로불린 G(Immunoglobulin G; IgG)의 Fc 단편(fragment)에 대한 결합력이 유지되는 아미노산 서열을 포함하는 IgG의 Fc 단편에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드.
  2. 제 1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자.
  3. 제 2항에 있어서, 서열번호 11 내지 20중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자.
  4. 제 2항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 발현벡터는 항시 발현벡터인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
  6. 제 4항의 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체.
  7. 제 6항에 있어서, 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 1) 제 6항의 형질전환체를 배지 내에서 배양하는 단계; 및
    2) 상기 배양액으로부터 제 1항의 폴리펩타이드를 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 제조방법.
  9. 1) DNA 라이브러리를 제조하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 DNA 라이브러리의 유전자에 형광단백질 유전자를 융합시켜 융합단백질을 발현할 수 있는 융합유전자를 제조하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 융합유전자를 삽입한 발현벡터를 제조하는 단계;
    4) 상기 단계 3)의 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조한 후 배양하는 단계;
    5) IgG의 Fc 단편을 포함하는 폴리펩티드가 코팅된 고체기판에 상기 단계 4)의 형질전환체의 배양액 또는 파쇄액을 처리 및 세척하는 단계;
    6) 상기 단계 5)의 고체기판의 형광을 측정하는 단계; 및
    7) 상기 측정된 형광 신호가 검출된 형질전환체를 선별하는 단계를 포함하는 IgG의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드 선별방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 단계 2)의 형광단백질은 EGFP, ECFP, EYFP 및 RFP로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 단계 3)의 발현벡터는 항시 발현벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 단계 4)의 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 1) 카복실기를 포함하는 고체기판의 카복실기를 활성화하는 단계;
    2) 제 1항의 폴리펩타이드를 단계 1)의 고체기판에 부착하는 표면처리 단계; 및,
    3) 상기 단계 2)의 표면처리된 고체기판에 IgG을 결합시키는 단계로 이루어진 IgG 단분자막의 제조방법.
  14. 제 13항에 있어서, 고체기판은 CM-5 Au 센서 칩, 자성미세입자, 유리판, 금나노입자, PLGA 등 생분해성 유기고분자나노입자 또는 각종 (미세)웰플레이트[(micro)well plate]로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 1) 제 1항의 폴리펩티드를 흡착시킨 컬럼에 항체를 포함하는 조성물을 처리하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 컬럼에 부착된 항체를 용출하는 단계를 포함하는 IgG 항체의 정제방법.
  16. 1) 제 1항의 폴리펩티드를 고체기판에 부착하도록 표면처리하는 단계; 및
    2) 상기 단계 1)의 고체기판에 IgG을 처리하는 단계를 포함하는 IgG의 고정 화 방법.
  17. 제 1항의 폴리펩티드로 표면처리된 고체기판에 상기 폴리펩티드를 매개로 IgG가 고정된 면역센서.
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