WO2014010813A1 - 항체의 Ｆｃ 부위 결합 펩타이드를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 - Google Patents

항체의 Ｆｃ 부위 결합 펩타이드를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 Download PDF

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WO2014010813A1
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fmoc
column
adsorption column
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정상전
강효진
이영미
최원우
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한국생명공학연구원
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    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
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    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
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    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production

Definitions

  • the present invention relates to an adsorption column for antibody purification using a peptide (Fc binding peptide, FcBP) that specifically binds to an Fc region of an antibody, and a method for purifying an antibody using the adsorption column.
  • FcBP peptide binding peptide
  • Non-Patent Documents 1-5 the technology related to the production and purification of antibodies has been the subject of academic and industrial interest.
  • the purification step is cost-intensive so that subsequent processes such as purification in the production of therapeutic volume antibody take about 50 to 80% of the total cost, much effort is being made to develop the purification technology of the antibody (Non-Patent Document 5- 6).
  • Non-Patent Documents 7 and 11 are examples of proteins that are highly denatured.
  • Non Patent Literatures 7, 12 and 13 New ligands include thiols, dyes, triazine-based compounds, and natural and / or non-natural peptides (Non Patent Literatures 7, 12 and 14).
  • affinity 3 ⁇ 4 10 "3 ⁇ there is selectively specific binding force is low and has a problem of a 10- 5 ⁇ level (non-Patent Document 7) antibody.
  • the present inventors have developed an IgG Fc domain-binding peptide (FcBP), which binds IgG with high selectivity and specificity (hereinafter referred to as FcBP).
  • FcBP IgG Fc domain-binding peptide
  • the antibody was successfully immobilized on a surface plasmon resonance (SPR) chip and further used to immobilize the antibody on another solid phase surface (self-sustaining particle, slide glass surface).
  • FcBP developed by the present inventors is a low molecular peptide that selectively and specifically binds to the Fc region of immunoglobulin G.
  • Such FcBP can be constructed by selecting a polypeptide that specifically binds to a polypeptide comprising an Fc fragment of IgG from a single stranded synthetic DNA library comprising a random DNA sequence. Since FcBP binds to the Fc region rather than the antigen-binding site of IgG, it strongly binds to IgG without affecting the antigen-binding ability of IgG. Therefore, FcBP can be used for immobilizing and immobilizing IgG on various types of solid surface surfaces. Patent Application No. 10-2008-0060863).
  • FcBP not only has excellent binding capacity with antibodies, but also can elute bound antibodies without denaturation of the antibody under relatively mild conditions. It was found and completed the column for antibody purification using FcBP and the purification method of the antibody using the same.
  • a column was prepared using FcBP, and the produced column was confirmed to have excellent binding ability to human IgG.
  • the column was able to elute the antibody under mild conditions and showed an antibody purification effect of more than 95% purity, and in the durability test of the column, the FcBP column was used more than 100 times (data are presented up to 30 times or more).
  • the present invention was found to be ineffective even during the present invention.
  • Non-Patent Document 2 S.J. Kim, Y. Park, H. J. Hong, Mol. Cells 20 (2005) 17.
  • Non-Patent Document 3 D. Michael i, Semin. Oncol. 32 (2005) 82.
  • Non-Patent Document 4 B. Monzavi-Karbassi, T. Kieber-Emmons, Biotechniques 30 (2001) 170.
  • Non-Patent Document 5 A.C.A. Roque, C. R. Lowe, M.A. Taipa, Biotechnol. Prog. 20 (2004) 639.
  • Non-Patent Document 6 N. Tugcu, D.J. Roush, K.E. Goklen, Biotechnol. Bioeng. 99 (2008) 599.
  • Non-Patent Document 7 A.C.A. Roque, C.S.O. Silva, M.A. Taipa, J. Chromatogr. A 1160 (2007) 44.
  • Non-Patent Document 8 A.A. Shukla, B. Hubbard, T. Tressel, S. Guhan, D.
  • Non-Patent Document 9 B. Akerstrom, T. Brodin,. Reis, L. Bjorck, J. I ⁇ unol. 135 (1985) 2589.
  • Non-Patent Document 10 L. Bjorck, G. Kronvall, J. I ⁇ unol. 133 (1984) 969.
  • Non-Patent Document ii G. Fassina, M. Ruvo, G. Palombo, A. Verdoliva, M. Marino, J. Biochem. Biophys. 282 Methods 49 (2001) 481.
  • Non-Patent Document 12 R. Li, V. Dowd, D.J. Stewart, S.J. Burton, C. R. Lowe, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 190.
  • Non-Patent Document 13 A. Verdoliva, D. Marasco, A. De Capua, A. Sapor i to,
  • Non-Patent Document 14 D. Low,. O'Leary, N.S. Puj r, J. Chromatogr. B 848 (2007) 48.
  • Non-Patent Document 15 Y. Jung, H.J. Kang, J.M. Lee, S.O. Jung, W.S. Yun,
  • Non-Patent Document 16 W VIII. DeLano, M.H. Ultsch, A.M. De Vos, J. A. Wells, Science 287 (2000) 1279.
  • Non-Patent Document 17 K. Takatsu, T. Ishizaka, K. Ishizaka, J. Immunol. 114 (1975) 1838.
  • Non-Patent Document 18 J.C. Le, P. V. Bondarenko, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16 (2005) 307.
  • Non-Patent Document 19 N.G. Housden, S. Harrison, S.E. Roberts, J. A. Beckingham, M. Grai lie, E. Sutra, M.G. 293 Gore, Biochem. Soc. Trans. 31 (2003) 716.
  • Non-Patent Document 20 Yang, M. Jin, J. Chen, Y. Yang, P. Zheng, A. Zhang, Y. Song, H. Zhou, H. Chen, J. 295 Vet. Diagn. Invest. 19 (2007) 355. ⁇ Detailed Description of the Invention ⁇
  • FcBP Fc binding peptide
  • the present invention provides an adsorption column for purification of antibodies equipped with a resin to which a peptide (Fc binding peptide, FcBP), which binds to an Fc region of an antibody, is mounted.
  • a peptide Fc binding peptide, FcBP
  • the high affinity FcBP binding peptide (FcBP) binds to the antibody and elutes the antibody at a mild pH, thereby purifying an unstable protein.
  • FcBP FcBP binding peptide
  • 1 is a chromatogram showing elution to Herceptin and pH gradient complete solution bound to an affinity column.
  • La shows five types of affinity columns [FcBP column, FcBP-Ser (two of FcBP Cysteine is substituted for serine during synthesis), FcBP-Red (reduces disulfide bonds in FcBP by DTT) column, protein A column and protein G column, respectively.
  • FIG. Lb is a chromatogram comparing the binding force of the FcBP column and the protein well column to Herceptin.
  • Figure lc is a chromatogram comparing the binding of FcBP-red and protein columns to Herceptin.
  • Figure ID is a chromatogram comparing the binding force to Herceptin of FcBP column, FcBP-Red column and FcBP-Ser column.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of SDS-PAGE analysis of purified porcine IgG using an affinity column (IgG heavy chain and light chain are denoted by * and, respectively).
  • FIG. 3 (A) shows the purified proteins using the Protein G column (lane 1: molecular weight marker, lane 2: whole pig serum protein: lane 3-5; fraction 2-4; lane 6) 10: fraction 20 ′ 24).
  • FIG. 3B is a diagram showing the purified proteins using the Protein A column (lane 1: molecular weight marker; lane 2: whole porcine antibody protein; lane 3-5: fraction 2-4; lane 6- 10 fractions 19 ⁇ 23).
  • Figure 3 (C) is a picture confirming the purified proteins using the FcBP column (lane 1: molecular weight marker; lane 2: whole porcine antibody protein; lanes 3-5 5: fractions 2-4; lanes 6-10 fractions 19-23).
  • Figure 3 (D) is a picture showing the results confirmed by Western blot purified porcine IgG antibody in the FcBP column (lane 1: molecular weight marker; lane 2: whole pig serum protein; lane 3: fraction 3; lane 4: Fraction 21; lanes 5-7: in lanes 2-4 Anti-pig IgG Western blot).
  • Figure 5 is chromatogram 3 ⁇ 4 showing the regeneration of IgG purification according to the reuse of the FcBP column
  • Figure 6 is a graph showing the results of the surface plasmon resonance (SPR) analysis of the interaction of FcBP / pig IgG.
  • the antibody To purify the antibody, the antibody must be adsorbed on a column and separated from the sample, and the adsorbed antibody must be eluted without denaturation.
  • the present invention provides an adsorption column for purification of an antibody equipped with a resin to which an Fc binding peptide (FcBP) that binds to an Fc region of an antibody is fixed.
  • FcBP Fc binding peptide
  • the FcBP is immunoglobulin GCI ⁇ unoglobulin G
  • Oligopeptides that bind to the Fc domain of IgG can be used, and it is preferable that the oligopeptides are composed of 7 to 17 amino acids, but the number of the amino acids is not limited thereto.
  • the FcBP binds to the Fc region of the antibody to be purified with high selectivity and specificity. In addition, since the FcBP binds to the Fc region rather than the antigen binding site of the antibody, the FcBP does not affect the antigen binding capacity of the antibody.
  • the FcBP may be immobilized on a solid phase such as a resin, as an affinity ligand of an antibody.
  • the FcBP is DCHKRSFMDNCT (SEQ ID NO: 1), DCRTQFRPNQTCT (SEQ ID NO: 2) DCQLCDFWRTRCT (SEQ ID NO: 3), DCFEDFNEQRTCT (SEQ ID NO: 4), DCLAKFLKGKDCT (SEQ ID NO: 5), DCWHRRTHKTFCT (SEQ ID NO: 6) ,
  • DCRTIQTRS CT (SEQ ID NO: 7), DCIKLAQLHSVCT (SEQ ID NO: 8) ,
  • DCWRHRNATEWCT SEQ ID NO: 9
  • DCQNWIKDVHKCT SEQ ID NO: 10
  • DCAWHLGELVWCT SEQ ID NO: 11
  • OCAFHLGELVWCT SEQ ID NO: 12
  • oligopeptide consisting of DCAYHLGELVWCT (SEQ ID NO: 13) and any one amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences in which one or two amino acids in these amino acid sequences are added, deleted or substituted.
  • the amino acid sequence is shown in Table 1 below.
  • FCBP-Ser DSAWHLGELWST The FcBP is an oligopeptide with or without two cysteine disulfide bonds in the molecule in the amino acid sequence, and FcBP-Ser substituted two serine residues with serine in the amino acid sequence is DSAWHLGELWST. Oligopeptides (SEQ ID NO: 14) can also be used.
  • the antibody purification adsorption column may be connected to the resin through the FcBP linker (linker).
  • the linker can be coupled to the N- terminus or the C- terminal of FcBP ⁇ , is preferably coupled to the C- terminal.
  • the linker is a
  • Y is a linker and consists of alkyl, oxygen ( ⁇ 0-), amine (-NH-), urea ( ⁇ NHCONH ⁇ ), amide -CONH-, ester (-COO—), and aryl It is any one selected from the group]) is preferably any one selected from the group consisting of, but not limited to, may be a suitable alkyl, peptide or analog.
  • the linker is any one of the terminal amine (NH 2 ) group selected from the group consisting of maleimide, azide and alkyne It may be substituted with a functional group, and may be substituted with other suitable functional groups, but is not limited thereto.
  • the FcBP derivative may have any one structure selected from the group consisting of the following structures, but is not limited thereto.
  • the resin is preferably selected from the group consisting of agarose, sepharose, cellulose, dextran, polyacrylate and polystyrene, and more preferably, but not limited to, sepharose.
  • N-terminal linker (N-terminal linker)-DSAXHLGELWST-C0 2 H (or C0N3 ⁇ 4)
  • the N-terminal linker is NH 2 (CH 2 CH 2 0) 6 CH 2 CH 2 C0- and C-terminal linker.
  • the resin was mounted on a column to prepare various FcBP affinity adsorption columns.
  • the FcBP adsorption column prepared in the present invention was able to dissolve the antibody in a complete solution of pH 2.5-5.0 due to the rapid dissociation rate after antibody binding.
  • the antibody was eluted with a buffer solution of pH 2.5 to 3.0, and when two cysteines in the amino acid sequence of FcBP removed intramolecular disulfide bonds It was confirmed that the antibody can be eluted with a buffer solution of pH 3.0 to 5.0.
  • the FcBP ligand has the advantage of overcoming the loss of IgG-induced IgG activity when used to purify IgG. This is because the lysis buffer can be purified at an acidity of higher pH than is required for experiments on other columns.
  • the degree of elution using the pH gradient buffer solution after adsorbing the porcine antibody to the FcBP affinity column The measured and purified fractions were confirmed by SDS ⁇ PAGE and Western blot.
  • the FcBP column was found to elute IgG under mild conditions of pH 2.5 to pH 5.0. It was confirmed that the purified amount of the column was greater than the purified amounts of Protein G and Protein A (see FIGS. 3A-D).
  • the recovery of purified IgG was confirmed by loading the pig serum protein on the FcBP affinity column, As a result of confirming the recovery of ig G while reusing it repeatedly up to 30 times, the FcBP column reduced the amount of IgG recovered as the total amount of protein loaded increased, and it was confirmed that the reuse was possible regardless of the number of repetitions (FIGS. 4 to 6). Reference).
  • it can be usefully used as an adsorption column for antibody purification to replace the adsorption column using protein affinity ligands such as protein A and protein G.
  • the present invention also provides a method for purifying antibodies using an adsorption column for antibody purification equipped with a resin to which FcBP is immobilized.
  • the antibody is preferably IgG, but is not limited thereto.
  • the binding of the antibody of step 1) is preferably performed at pH 6.5 to pH 8.0.
  • the washing of step 2) is preferably used a complete solution of pH 5.5 to pH 6.5.
  • the elution of the antibody of step 3) is preferably performed using a pH gradient complete solution or a constant pH complete solution, but is not limited to the above method.
  • a pH gradient buffer it is preferable to elute the antibody using an elution buffer of pH 2.5 to pH 5.0.
  • Adsorption column prepared using the FcBP of the present invention is excellent in binding ability to human IgG, can elute the antibody in milder conditions compared to the column using protein A and G, the antibody having a purity of 95% or more The purification effect was shown, and by confirming that the antibody purification effect does not decrease even during reuse of 100 or more times in the durability test of the column, it can be usefully used as an adsorption column for antibody purification.
  • Reagents used for peptide synthesis were DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2- (1- benzotriazole-l-yl) -l, l, 3,34 tetramethyluronium hexafluorophosphate, HBTU) -containing DMF, 0.5 M hydroxybenzotirazole (HOBt))-containing DMF, 20% piperidine-containing DMF, and C-terminal amino acid to solid phase peptide synthesis using the Fmoc amino acid blocks and linkers listed. It proceeded sequentially.
  • the amount of reagent used in the following procedure was based on 0.25 dl ole.
  • 0.5 g of clear amide resin (0.5 mmole / g, Peptide International, USA) was added to the synthesis reactor, and each Fmoc-amino acid block 1 ⁇ ole was weighed to obtain peptide N from the C-terminus to the peptide amino acid sequence. -Prepared to the end. Removal of Fmoc protection from the clear amide resin, activation of the Fmoc-amino acid and attachment of the activated moiety to the clear amide resin proceeded sequentially from the C-terminal amino acid.
  • Fmoc removal was performed in DMF containing 20% piperidine, and activation and incorporation of residues were carried out with 2 ml 0.5 M H0BT containing DMF solution, 2 ml 0.5 M HBTU containing DMF solution and 174 ul DIPEA for 5 minutes. The mixture was then poured into a reaction vessel containing resin and mixed for 2 hours. Confirmation of the incorporation reaction was carried out by Kaiser test method, and if confirmed as unreacted, the induction reaction was repeated one more time or capped with a 20% Ac 2 0 containing DMF solution. In each introduction reaction and Fmoc removal process, the resin was thoroughly washed with DMF and DCM before proceeding to the next step.
  • the linker was introduced to the N-terminus of the peptide in the FcBP-1 attached resin protected with the protecting group completed in step (a) of ⁇ Example 1>.
  • the linker used was amino -dPEG 6 -acid.
  • the introduction of the amino -dPEG 6 -ac id proceeded according to the general solid phase peptide synthesis. 250 mg of the peptide-attached resin attached in ⁇ a> of Example 1 was removed, placed in a reaction vessel, and poured with DCM.
  • Fmoc-amido-dPEG 6 -acid of 0.2 ole and DMF solution containing 0.4 ml 0.5 M H0BT, DMF solution containing 0.4 ml 0.5 M HBTU, and 34.8 ul DIPEA were mixed for 5 minutes and poured into a reaction vessel containing resin for 2 hours. Mixed. Confirmation of the introduction reaction was carried out by Kaiser test method and if unreacted, the reaction reaction was repeated one more time or 20% Ac 2 0 containing DMF. Capping was done with the solution.
  • peptide-attached resin prepared in step (b) of ⁇ Example 1> 100 mg was mixed with 2 ml of a mixture of TFA, TIS, water, and EDT (94: 1.0: 2.5: 2.5) at room temperature for 120 minutes. Peptides were cleaved from the resin. The cleavage mixture was filtered, the filtrate was concentrated about halfway with nitrogen gas and then ether was poured to precipitate the peptide. The precipitated ' peptides were washed three more times with ether and dried with nitrogen gas. The dried precipitate was dissolved in 0.1% TFA-30% AcCN-containing water, stirred for 6 hours, and then concentrated.
  • the concentrated solution was dissolved in an ACN: 0.1 M ammonium acetate 1: 1 solution at a concentration of 0.1 mg / ml and stirred for 24 hours while being exposed to air. Progression of disulfide formation reaction was observed by HPLC, and when judged not to proceed anymore, the reaction mixture was lyophilized to obtain peptide precipitate (29 mg).
  • the peptide precipitate obtained by lyophilization in (c) of ⁇ Example 1> was isolated under prep-LC primary purification conditions, further purified by prep-IX secondary purification conditions, and lyophilized.
  • H-Asp (t Bu) -Cy s (Tr t) -A 1 a-Phe- H is (Tr t)-Leu-Gly-Glu (tBu) -Leu-Val-Trp (Boc) —Cys (Trt) -ThrCtBu) -Pure amide resin was measured as 1.22 g.
  • H-Asp (tBu) -Cys (Trt) -Ala-Tyr (tBu)- was obtained in the same manner as in the amino acid introduction according to the preparation of amino-dPEG 6 -FcBP-l of ⁇ Example 1-1>.
  • H-Asp (tBu) -Ser (tBu) -Ala-Trp (Boc)- It was measured as 1.23 g of 3 (0-? 16 ⁇ ⁇ ⁇ 1 1)--31 ⁇ (0) -5 ⁇ 3 ⁇ 4)-1 ⁇ ⁇ 1)-pure amide resin.
  • Solid phase synthesis method of FcBP-Ser and N-terminus of these peptides are acetylated and Ac- (FcBP-l with 1,8-diamino-3,6_dioxaoctane linker introduced at C-terminus ) -NHC3 ⁇ 4C3 ⁇ 40CH 2 CH 2 0C3 ⁇ 4CH 2 NH 2
  • Ac- (FcBP-2) -NHCH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 NH 2
  • Ac— (FcBP-Ser) ⁇ shows the solid phase synthesis of NHCH 2 CH 2 0CH 2 CH20CH 2 CH 2 N3 ⁇ 4.
  • the synthesis of other peptides and derivatives thereof mentioned in the specification was also procured using the solid phase peptide synthesis method shown in the examples.
  • the reagents used for peptide synthesis were DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2- (1 ⁇ - benzotriazole-l-yl) -l, l, 3,3
  • Fmoc removal was performed in DMF containing 20% piperidine, and activation and incorporation of residues were performed with 2 ml 0.5 M H0BT containing DMF solution, 2 ml 0.5 M HBTU containing DMF solution and 174 ul DIPEA for 5 minutes. After mixing Pour into the reactor and mix for 2 hours. Confirmation of introduction reaction was performed by Kaiser test method and if unreacted, introduction reaction was repeated one more time or capping with tooth «F solution containing 20% Ac 2 0. In each introduction reaction and Fmoc removal, the resin was thoroughly washed with DMF and DCM before proceeding to the next step. This process was repeated until the peptide sequence of FcBP-1 was completed.
  • peptide-attached resin prepared in step (a) of ⁇ Example 2-1> was mixed with 2 ml of a mixture of TFA, TIS, water and EDT (94: 1.0: 2.5: 2.5) at room temperature for 120 minutes.
  • the peptide was cleaved from the resin by stirring.
  • the cleavage mixture was filtered, the filtrate was concentrated about halfway with nitrogen gas and then ether was poured to precipitate the peptide.
  • the precipitated peptide was washed three more times with ether and dried with nitrogen gas.
  • the dried precipitate was dissolved in 0.1% TFA-30% AcCN-containing water, stirred for 6 hours, and then concentrated.
  • the concentrate was dissolved in ACN: 0.1 M ammonium acetate 1: 1 solution at a concentration of 0.1 mg / ml and stirred for 24 hours while being exposed to air. Progression of disulfide bond formation reaction was observed by HPLC, and when judged not to proceed anymore, the reaction mixture was lyophilized to obtain peptide precipitate (31 mg).
  • Example 2-1 Ac- (FcBP-1) -NHCH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 As a result of the removal of the protecting group and the separation of the resin in the preparation of N3 ⁇ 4, 29 mg Got.
  • Example 2-1 Ac— (FcBP-1) -NHCH 2 CH 2 0C3 ⁇ 4CH 2 0CH 2 CH 2 NH 2 was obtained in the same manner as in the purification.
  • Ac— (FcBP-2) -NHCH 23 mg of 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 NH 2 was obtained and identified as MW 1663.87 and M + 1 1665.07.
  • Ac-Asp (tBu)- was obtained by the same method as the amino acid introduction in the preparation of Ac- (FcBP-1) -NHCH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 N3 ⁇ 4 in ⁇ Example 2-1>.
  • Cys (Trt) -Al a- Tyr (tBu) -His (Trt) -Leu to G ly-Glu (t Bu) -Leu-Va l-Trp (Boc) -Cys (Trt) -Thr (t Bu)- NHCH 2 CH 2 0CH 2 CH 2 0C3 ⁇ 4CH 2 NH-trityl resin was measured as 1.33 g.
  • N3 ⁇ 4C3 ⁇ 4C3 ⁇ 40CH 2 (3 ⁇ 40CH 2 CH 2 NH 2 , Fmoc-L-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -0H, Fmoc-L-Trp (Boc) -0H, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc -L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu (0tBu) -0H, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc— L—His (Trt) OH, Fmoc-L-Trp (Boc)- 0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys (Trt) -0H, Fmoc-Asp (tBu) -0H and Ac 2 0
  • the amount of reagent used in the following procedure was based on 0.25 mmole.
  • 0.5 g of 0-bis— (aminoethyl) ethylene glycol trityl resin (0.5 ⁇ ole / g, Novabiochem, USA) is added to the synthesis reactor, followed by sufficient pouring of DMF and waiting for 30 minutes.
  • Add 640 nig of di (N-succinimidyl) carbonate to the reaction vessel and mix for 2 hours.
  • the reaction mixture is filtered off and washed thoroughly using alternating DMF and DCM. ⁇ 0.25M 1, 2-bis (2-aminoethoxy) ethane in DMF Pour the ml and mix for 2 hours.
  • reaction solution is filtered off and washed thoroughly using alternating DMF and DCM. Then 1 mmole of each Fmoc-amino acid block was weighed and prepared from the C-terminus to the N-terminus in the order of peptide amino acid sequence.
  • the reaction of attaching the activated residue to the resin prepared by activating Fmoc ⁇ amino acid was performed sequentially from the C-terminal amino acid. Fmoc removal was performed in DMF containing 20% piperidine, and activation and incorporation of residues were carried out with 2 ml 0.5 M H0BT containing DMF solution, 2 ml 0.5 M HBTU containing DMF solution and 174 ul DIPEA for 5 minutes.
  • the resin was dried in a peptide reaction and weighed (3 ⁇ 1) 3 ⁇ )- ⁇ 3-3 ⁇ 4 (80 ⁇ -3 (0-1 11-( ⁇ -(1 811)-Leu-Va 1- Trp (Boc) -Cys (Trt) ⁇ Thr (tBu)
  • peptide-attached resin prepared in step (a) of ⁇ Example 2-5> was mixed with 2 ml of a mixture of TFA, TIS, water and EDT (94: 1.0: 2.5: 2.5) at room temperature for 120 minutes.
  • the peptide was cleaved from the resin by stirring.
  • the cleavage mixture was filtered, the filtrate was concentrated about halfway with nitrogen gas and then ether was poured to precipitate the peptide.
  • the precipitated peptide is washed three more times with ether and with nitrogen gas. Dried.
  • the dried precipitate was dissolved in 0.1% TFA-30% AcCN-containing water, stirred for 6 hours, and then concentrated.
  • the concentrated solution was dissolved in ACN: 0.1 M ammonium acetate 1: 1 solution at a concentration of 0.1 mg / ml, and stirred for 24 hours while being exposed to air. Progression of disulfide bond formation reaction was observed by HPLC, and when observed to no longer proceed, the reaction solution was lyophilized to obtain peptide precipitate (21 mg).
  • the peptide precipitate obtained by lyophilization in (b) of ⁇ Example 2-5> was isolated under prep-LC primary purification conditions, further purified by prep-LC secondary purification conditions, and lyophilized.
  • the amount of reagent used in the following procedure was based on 0.25 ⁇ ole.
  • 0.5 g of 0-bis- (aminoethyl) ethylene glycol trityl resin (0.5 mmole / g, Novabiochem, USA) was added to the synthesis reactor and weighed 1 mmole of each Fmoc-amino acid block in the order of peptide amino acid sequence. Prepared from C-terminus to N-terminus.
  • the reaction of activating Fmoc-amino acid to attach the activated residue to 0-bis- (aminoethyl) ethylene glycol trityl resin proceeded sequentially from the C-terminal amino acid.
  • Fnrac removal was performed in DMF containing 20% piperidine, and activation and incorporation of residues were carried out with 2 ml 0.5 M H0BT containing DMF solution, 2 ml 0.5 M HBTU containing DMF solution and 174 ul DIPEA for 5 minutes. The mixture was then poured into a reactor containing resin and mixed for 2 hours. Confirmation of the introduction reaction was carried out by Kaiser test method and if confirmed as the reaction reaction, the introduction reaction was repeated one more time or capping with DMF solution containing 20% Ac 2 0. The resin was thoroughly washed with DMF and DCM before proceeding to the next step in each introduction reaction and Fmoc removal process. This process was repeated until the peptide sequence of FcBP-1 was completed.
  • the concentrate was dissolved in ACN: 0.1 M ammonium acetate 1: 1 solution at a concentration of 0.1 mg / ml and stirred for 24 hours while being exposed to air. Progress of the disulfide bond formation reaction was observed by HPLC, and when judged not to proceed any more, the reaction solution was lyophilized to obtain peptide precipitate (35 mg).
  • the peptide precipitate obtained by lyophilization in (b) of Example 2b6 was separated under prep-LC primary purification conditions, further purified by prep-LC secondary purification conditions, and lyophilized.
  • the obtained peptides were each confirmed to be 98% or higher by analytical HPLC, and the molecular weight of the synthesized peptides was confirmed by a Malditop mass spectrometer (Suc- (FcBP-1) -NHC3 ⁇ 4C3 ⁇ 40C3 ⁇ 4CH 2 () CH 2 CH 2 NH 2 was 26). mg was obtained and identified as 1759.79 and M + 1 1761.01.).
  • the amount of reagent used in the following procedure was based on 0.25 ⁇ ole.
  • 0.5 g of bis- (aminoethyl) ethylene glycol trityl resin (0.5 mmole / g, Novabiochem, USA) was added to the synthesis reactor and weighed 1 mmole of each Fmoc-amino acid block, followed by C amino acid sequence Prepared from the end to the N-end.
  • the reaction of activating Fmoc ⁇ amino acid to attach the activated residue to bis- (aminoethyl) ethylene glycol trityl resin was performed sequentially from the amino acid of C ⁇ terminal.
  • Fmoc removal was performed in DMF containing 20% piperidine, and activation and incorporation of residues were performed in 2 ml 0.5 M H0BT containing DMF solution, 2 ml
  • the mixture was mixed with 0.5 M HBTU-containing DMF solution and 174 ul DIPEA for 5 minutes and then poured into a resin-containing reactor for 2 hours.
  • Confirmation of the introduction reaction was carried out by Kaiser test method, and if it was confirmed as the reaction reaction, the introduction reaction was repeated one more time or capping with DMF solution containing 20% Ac 2 0.
  • the resin was thoroughly washed with DMF and DCM before proceeding to the next step in each introduction reaction and Fmoc removal process. This process was repeated until the peptide sequence of FcBP-1 was completed.
  • peptide-attached resin prepared in step (a) of ⁇ Example 2-7> was mixed with 2 ml of a mixture of TFA, TIS, water and EDT (94: 1.0: 2.5: 2.5) at room temperature for 120 minutes.
  • the peptide was cleaved from the resin by stirring.
  • the cleavage mixture was filtered, the filtrate was concentrated about halfway with nitrogen gas and then ether was poured to precipitate the peptide.
  • the precipitated peptide was washed three more times with ether and dried with nitrogen gas.
  • the dried precipitate was dissolved in 0.1% TFA-30% AcCN-containing water, stirred for 6 hours, and then concentrated.
  • the affinity resins using the FcBP® linker shakers prepared in ⁇ Example 1> and ⁇ Example 2> were prepared according to the manufacturer's protocol. Specifically, 5 m N ⁇ -hydroxysuccinimide (N-hydroxysuccinimide, NHS) of L (Sigma-Aldr ich, USA ]) - activated Sepharose TM 4 Fast FlowCGE Healthcare, Uppsala, Sweden) to contain 30 mg FcBP Reaction with 0.2 M NaHC0 3 (pH 8.5; 10 mL) at 4 ° C for 1 day.
  • the beads were washed with 0.5 M ethane containing blocking buffer (150 niM NaCl) with amine (ethanolaniine, H 8.5) and then reacted with the same buffer for 1 hour. I was. Then, after washing with distilled water, the beads were stored at 4 ° C. Was "amount approximately 2.5 ⁇ 0.5 mg / mL wet resin of the peptide fixed to the resin, which was calculated by subtracting the recovered peptide.
  • Example 4 Preparation of FcBP Affinity Column Columns were prepared using the respective FcBP affinity resins prepared in ⁇ Example 3>.
  • FcBP is an FcBP (non-patent document 16) having a disulfide bond therein
  • FcBP-Ser column was constructed by replacing two cysteine residues with serine in the amino acid sequence of FcBP, and then loading the modified peptide on the column.
  • Another FcBP-Red column was prepared by treatment with 50 mM DTT to reduce disulfide bonds before using the FcBP column (Non-Patent Document 17).
  • the FcBP column used is NH 2 (C3 ⁇ 4CH 2 0) 6 CH 2 CH 2 C0-DCAWHLGELVWCT-NH 2
  • the disulfide-bonded cysteine was designated with a special symbol (*)) and the FcBP-Ser column was NH 2 (C3 ⁇ 4C3 ⁇ 40) 6 CH 2 C3 ⁇ 4C (H) SAWHLGELVWST-NH 2 [NH 2 (CH 2 C3 ⁇ 40) 6 C3 ⁇ 4CH 2 C ()- ⁇ 3 -3 ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ ⁇ - ⁇ 3-1 ⁇ ⁇ 6 ⁇ ⁇ ⁇ -1 11 31-3 ⁇ 4 3 ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ 2 ] was used.
  • Herceptin is known as a therapeutic antibody of human Ig3 ⁇ 4 type
  • Binding affinity to IgG was determined as follows. In order to measure the IgG purification ability using the adsorption column, the Herceptin purification experiment was performed after attaching the column to ACTA FPLC (GE Healthcare). After equilibration with 100 mM phosphate buffer (pH 8.0), 36.5 mg and 20 were added to 5 mL of the above buffer. Antibody samples were prepared by dissolving mg Herceptin, respectively, and then adsorbed onto the column. The antibody was separated by dissolving sequentially from pH 8.0 to pH 2.0 with a pH gradient complete solution, and was completed by adjusting the ratio of phosphate and citric acid () H 2.0 and 50 mM) buffers.
  • the eluate was aliquoted by 1 niL, and the UV absorbance was observed at 254 nm, and the fractions showing UV absorbance were collected and immediately neutralized with boric acid complete solution (1 M and pH 8.5), and the protein was analyzed by SDS-PAGE. Protein amount was determined by the Bradford assay.
  • the column using the hybrids prepared in Examples ⁇ 2 ⁇ 3> and ⁇ 2 ⁇ 4>, respectively has a fast dissociation rate after antibody binding, so that the antibody can be eluted with a complete solution of pH 3.0 to 4.0. It was.
  • the column using the two-cysteine prepared in Examples ⁇ 2x1> and ⁇ 2x4> containing the FcBP disulfide bond in the molecule is a complete solution of pH 2.5 ⁇ 3.0, respectively, Whereas elution was possible, the column using two-cysteine-free FcBP containing intramolecular disulfide bonds was able to elute the antibody with a buffer solution of pH 3.0-5.0.
  • K d 20 nM
  • Y. Jung, HJ Kangl JM Lee, SO Jung, WS Yun, SJ Chung, BH Chung, Anal. 288 Biochem. 374 (2008) 99 showing high molecular density of FcBP on the resin surface. This may be due to the small molecular weight of FcBP compared to the protein affinity ligand, the low density of protein G in the resin, as well as the increased binding efficiency of IgG.
  • FcBP-Red had a significant binding capacity to IgG even though there was no disulfide bond.
  • the FcBP-red column began to elute the antibody at a higher pH than the results seen when using Protein A or FcBP column, and IgG was separated more smoothly than Protein A or Protein G ( Figure lc).
  • the cysteine residue in FcBP is substituted with serine, the binding force was reduced, and thus the cysteine residue was confirmed that FcBP is essential for IgG binding (FIG. Id).
  • Antibodies produced by pigs infected with microorganisms can be widely used commercially in the diagnosis of diseases caused by these microorganisms (J. Yang, M. Jin, J. Chen, Y. Yang, P. Zheng, A. Zhang, Y Song, H. Zhou, H. Chen, J. Vet. Diagn. Invest. 19 (2007) 355), purification levels were analyzed using IgG isolated from pig serum.
  • IgG purification from pig serum pig serum was diluted in 6-fold 100 mM phosphate buffer (pH 8.0) and injected directly into the column to equilibrate the buffer. The amount injected was varied between 2 and 5 mL and contained 10 to 50 mg of the total serum protein amount.
  • Porcine IgG antibodies were purified on these three columns and quantified by SDS-PAGE analysis and Bradford analysis, both of which were very similar in purity and recovery. As a result of confirming the diagram of the SDS-PAGE analysis, purified IgG was purified with purity of 95% or more regardless of the kind of affinity column. Purification by FcBP column was visualized by Western blot using porcine IgG antibodies (FIG. 3).
  • the durability of the adsorption column was tested by confirming the recovery of IgG according to the reuse of the FcBP adsorption column.
  • FcBP affinity column was used for 5, 10, 15, 20, 25 and Repeated 30 times used for antibody purification and analyzed the results. As a result, the total separation capacity was maintained even 30 times using pig serum sample in the FcBP column (Fig. 5). The experiment was repeated more than 100 times after that and similar effects were observed.
  • CM5 sensor chip CM-5 Au
  • dextran matrix from Biacore AB, Uppsala, Sweden
  • the FcBP adsorption resin prepared by the above method was filled in a column having a diameter of 1 cm and a length of 10 mL to prepare an adsorption column.
  • the adsorption column was washed with 0.1 M, pH 8.0 phosphate buffer solution (50 mL), and the antibody solution (or serum) diluted with phosphate buffer solution was flowed into the column at a rate of 0.5 ml / min to adsorb the antibody (antibody under the above conditions). For cultures up to 44 mg of antibody is adsorbed on 1 ml of resin). After application of the sample, the column was washed with pH 6.0 MES buffer (100 ml). The antibody was then eluted with pH 3.0 citric acid buffer or pH 2.5 glycine buffer. The eluted antibody fraction was immediately neutralized with pH 8.0 1.0 M Tris buffer to prevent denaturation.

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Abstract

본 발명은 항체의 Fc 부위 결합 펩타이드(Fc binding peptide, FcBP)를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 및 상기 흡착 칼럼을 이용하여 항체를 정제하는 방법에 관한 것으로, 구체적으로 새로운 아미노산 서열의 FcBP 또는 이에 링커(linker)연결된 혼성체를 개발하여 이를 이용하여 칼럼을 제작하였으며, 제작된 칼럼은 인간 IgG에 대한 결합능력이 우수하고 온화한 조건에서 항체를 용출시킬 수 있으며 95% 이상의 순도를 가진 항체 정제 효과를 보였고, 칼럼의 내구성 실험에서 100번 이상 사용하는 동안에도 항체 정제 효과가 저하되지 않는 것을 확인함으로써, 단백질 A 및 G와 같은 단백질 친화성 리간드의 고비용, 낮은 안정성 및 오염 가능성 등의 문제점을 해결할 수 있는 항체 정제용 흡착 칼럼에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
항체의 F c 부위 결합 펩타이드를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼 【기술분야】
본 발명은 항체의 Fc 부위에 특이적으로 결합하는 펩타이드 (Fc binding peptide, FcBP)를 이용한 항체 정제용 흡착 칼럼, 및 상기 흡착 칼럼을 이용하여 항체를 정제하는 방법에 관한 것이다. 【배경기술】
질병의 치료 및 진단에 있어서, 항체의 사용이 증가하고 있으며， 임상시험을 마친 바이오 의약품의 약 20%가 항체 제제이다. 이에 항체의 생산 및 정제에 관련된 기술이 학문적 및 산업적 관심의 대상이 되고 있다 (비특허문헌 1—5). 특히， 치료용적 항체의 제작에서 정제 등의 후속 과정이 전체 비용의 50 ~ 80 % 정도를 차지할 정도로 정제 단계가 비용 집약적이기 때문에 항체의 정제 기술을 개발하는데 많은 노력을 기울이고 있다 (비특허문헌 5-6). ：
지난 20 년에 걸쳐서， 항체 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피 (affinity chromatography)를 이용하여 왔으며， 박테리아로부터 유래된 단백질 A 및 단백질 G 와 같은 천연의 IgG—결합 단백질 (natural IgG- binding protein)이 친화성 리간드로서 흔히 사용되고 있다 (비특허문헌 7-10). 그러나， 단백질 리간드는 생산 비용이 높고， 안정성이 낮으며， 박테리아 성분으로 인한 오염 가능성이 크다는 문제점이 있다. 더욱이 결합 항체를 용출시키기 위해 가혹한 조건이 요구되므로 항체가 변성될 가능성이 크다는 단점이 있다 (비특허문헌 7 및 11).
이에 합성 리간드가 단백질 리간드의 대안으로 개발되어 왔다 (비특허문헌 7， 12 및 13). 새로운 리간드는 티올 (thiol), 염료 (dyes), 트리아진계 (triazine-based) 화합물 (compound) , 및 천연 및 /또는 비천연의 펩타이드를 포함한다 (비특허문헌 7， 12 및 14). 이와 같이 항체 리간드가 개발되었음에도 불구하고， 박테리아 유래 단백질이 여전히 IgG 정제를 위한 친화성 리간드로 일반적으로 사용되고 있는데 이는 주로 상기 단백질이 IgG 와 선택적이고 특이적으로 결합하여 정제의 효율이 높기 때문이다. 이러한 특이성 및 선택성은 단백질 A 및 단백질 G의 IgG에 대한 강한 결합 친화성 ( = 10~5~ 1(Γ8 Μ)과 관련이 있다. 이에 반하여 지금까지 보고된 대부분의 합성 리간드는 항체와의 결합 친화성이 ¾ = 10"3~ 10— 5 Μ 정도 (비특허문헌 7)로 항체와의 선택적 특이적 결합력이 낮다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 이전 발명에서 IgG Fc-결합 펩타이드가 인간 IgG에 대해 강한 결합 친화성 ( = 85 nM)을 가지고 있다는 것을 밝혔다.
본 발명자들은 IgG와 높은 선택성 및 특이성을 가지고 결합하는 IgG Fc 도메인 -결합 펩타이드 (Fc domain-binding peptide, 이하 FcBP 라 함)를 개발하였고 (대한민국 특허출원 제 10-2008-0060863 호)， 이를 이용하여 표면 플라즈마 공명 (surface plasmon resonance, SPR) 칩 위에 항체를 고정하는데 성공하였으며, 나아가 다른 고체상 표면 (자서입자， 슬라이드 글라스 표면)에 항체를 고정하는데 이용하였다.
본 발명자들이 개발한 FcBP는 면역글로블린 G의 Fc 부위에 선택적이고 특이적으로 결합하는 저분자 펩타이드이다. 이런 FcBP 는 무작위 DNA 서열을 포함하는 단일가닥 합성 DNA 라이브러리로부터 IgG 의 Fc 단편을 포함하는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 선별하여 제작될 수 있다. 이런 FcBP 는 IgG 의 항원결합부위가 아닌 Fc 부위를 결합하기 때문에 IgG 의 항원 결합능에 영향을 미치지 않고 IgG 에 강하게 결합하기 때문에 여러 종류의 고체상 표면에서 IgG 에 배향성을 부여하여 고정시키는데 이용할 수 있다 (대한민국 특허출원 제 10-2008-0060863호) .
항체를 정제하기 위해서는 우선 항체와 선택적 특이적으로 결합을 하여 시료로부터 원하는 항체를 흡착， 분리하여야 하고 그리고는 다시 이 흡착된 항체를 변성 없이 분리 용출시켜야한다.
본 발명자들은, FcBP가 항체와의 결합력이 뛰어날 뿐만 아니라, 결합된 항체를 비교적 완화된 조건에서 항체의 변성 없이 분리 용출시킬 수 있는 것을 발견하고， FcBP 를 이용한 항체 정제용 칼럼 및 이를 이용한 항체의 정제방법을 완성하였다.
다시 말하자면， 본 발명에서는 FcBP 를 이용하여 칼럼을 제작하였으며， 제작된 칼럼은 인간 IgG 에 대한 결합능력이 우수한 것을 확인하였다. 또한， 상기 칼럼은 온화한 조건에서 항체를 용출시킬 수 있고 95% 이상의 순도를 가진 항체 정제 효과를 보였으며， 칼럼의 내구성 실험에서 FcBP 칼럼은 100 번 이상 (자료는 30 번 이상까지만 제시함) 사용하는 동안에도 효과가 저하되지 않는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 【선행기술문헌】
【비특허문헌】
(비특허문헌 DS. J . Demarest , S.M. Glaser , Current Opinion in Drug Discovery and Development 11 270 (2008) 675.
(비특허문헌 2)S.J. Kim, Y. Park, H.J. Hong, Mol. Cells 20 (2005) 17.
(비특허문헌 3)D. Michael i, Semin. Oncol . 32 (2005) 82.
(비특허문헌 4)B. Monzavi-Karbassi , T. Kieber-Emmons , Biotechniques 30 (2001) 170.
(비특허문헌 5)A.C.A. Roque , C.R. Lowe, M.A. Taipa, Biotechnol. Prog. 20 (2004) 639.
(비특허문헌 6)N. Tugcu, D.J. Roush, K.E. Goklen, Biotechnol . Bioeng. 99 (2008) 599.
(비특허문헌 7)A.C.A. Roque, C.S.O. Silva, M.A. Taipa, J. Chromatogr. A 1160 (2007) 44.
(비특허문헌 8)A.A. Shukla, B. Hubbard, T. Tressel, S. Guhan, D.
Low, J. Chromatogr. B 848 (2007) 278 28.
(비특허문헌 9)B. Akerstrom, T. Brodin, . Reis, L. Bjorck, J. I隱 unol. 135 (1985) 2589.
(비특허문헌 10 )L. Bjorck, G. Kronvall, J. I隱 unol. 133 (1984) 969. (비특허문헌 ii)G. Fassina, M. Ruvo, G. Palombo, A. Verdoliva, M. Marino, J. Biochem. Biophys. 282 Methods 49 (2001) 481.
(비특허문헌 12)R. Li, V. Dowd, D.J. Stewart , S.J. Burton, C.R. Lowe, Nat. Biotechnol. 16 (1998) 190.
(비특허문헌 13)A. Verdoliva, D. Marasco, A. De Capua, A. Sapor i to,
P. Bel lof iore, V. Manfredi , R. Fattorusso, C. Pedone , M. Ruvo, ChemBioChem 6 (2005) 1307. ,
(비특허문헌 14)D. Low, . O'Leary, N.S. Puj r, J. Chromatogr . B 848 (2007) 48.
(비특허문헌 15)Y. Jung, H.J. Kang, J.M. Lee, S.O. Jung, W.S. Yun,
S.J. Chung, B.H. Chung, Anal. 288 Biochem. 374 (2008) 99.
(비특허문헌 16)W丄. DeLano, M.H. Ultsch, A.M. De Vos, J. A. Wells, Science 287 (2000) 1279.
(비특허문헌 17)K. Takatsu, T. Ishizaka, K. Ishizaka, J. Immunol. 114 (1975) 1838.
(비특허문헌 18)J.C. Le, P.V. Bondarenko, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 16 (2005) 307.
(비특허문헌 19)N.G. Housden, S. Harrison, S.E. Roberts, J. A. Beckingham, M. Grai lie, E. Sutra, M.G. 293 Gore, Biochem. Soc. Trans. 31 (2003) 716.
(비특허문헌 20)J. Yang, M. Jin, J. Chen, Y. Yang, P. Zheng, A. Zhang, Y. Song, H. Zhou, H. Chen, J. 295 Vet. Diagn. Invest . 19 (2007) 355. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 목적은 항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드 (Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 흡착 칼럼을 이용하여 항체를 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드 (Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 제공한다.
또한， 본 발명은
1) 상기 FcBP가 고정된 레진이 장착된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 처 리하여 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계;
2) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
3) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법을 제공한다. 【유리한 효과】
인간 IgG의 결합 친화성 (binding affinity)과 유사한， 높은 친화성을 갖는 FcBP(Fcᅳ binding peptide)는 항체에 대한 결합 능력이 높고, 온화한 pH에 서 항체를 용출시키므로 불안정한 단백질인 항체를 정제할 수 있으며， 100 번 의 재사용 후에도 초기 항체 정제 능력을 그대로 가지므로 항체 정제용 칼럼에 유용하계 이용될 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 친화성 칼럼에 결합한 허셉틴 및 pH 구배 완층용액으로의 용출 을 보여주는 크로마토그램이다.
도 la는 5가지 종류의 친화성 칼럼 [FcBP 칼럼， FcBP-Ser (FcBP의 2개의 시스테인이 합성 동안 세린으로 치환됨) 칼럼， FcBP-Red(DTT에 의해 FcBP에서 이황화 결합을 감소시킴) 칼럼， 단백질 A칼럼 및 단백질 G칼럼]에서 각각 허 셉틴에 대한 결합력을 보여주는 크로마토그램이다.
도 lb는 FcBP 칼럼과 단백잘 칼럼의 허셉틴에 대한 결합력을 비교한 크 로마토그램이다.
도 lc는 FcBP-red 칼럼과 단백질 칼럼의 허셉틴에 대한 결합력을 비교 한 크로.마토그램이다.
도 Id는 FcBP 칼럼， FcBP-Red 칼럼 및 FcBP-Ser 칼럼의 허셉틴에 대한 결합력을 비교한 크로마토그램이다.
도 2는 친화성 칼럼에 의한 돼지 IgG정제의 크로마토그램이다.
도 3은 친화성 칼럼을 사용하여 정제된 돼지 IgG의 SDS-PAGE 분석을 수 행한 결과를 보여주는 그림이다 (IgG 중쇄 (heavy chain) 및 경쇄 (light chain) 는 각각 은 * 및 로 표시함).
도 3의 (A)는 단백질 G 칼럼을 사용하여 정제한 단백질들을 확인한 그 림이다 (레인 1: 분자량 마커， 레인 2: 전체 돼지 혈청 단백질: 레인 3 - 5; 분 획물 2 - 4; 레인 6ᅳ 10: 분획물 20ᅳ 24)이다.
도 3의 (B)는 단백질 A 칼럼을 사용하여 정제한 단백질들을 확인한 그 림이다 (레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 전체 돼지 항체 단백질; 레인 3 - 5: 분 획물 2 - 4; 레인 6 - 10분획물 19ᅳ 23).
도 3의 (C)는 FcBP 칼럼을 사용하여 정제한 단백질들을 확인한 그림이 다 (레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 전체 돼지 항체 단백질; 레인 3 - 5: 분획물 2 - 4； 레인 6— 10분획물 19 - 23).
도 3의 (D)는 FcBP 칼럼에서 정제된 돼지 IgG 항체를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 보여주는 그림이다 (레인 1: 분자량 마커; 레인 2: 전체 돼지 혈 청 단백질; 레인 3: 분획물 3; 레인 4: 분획물 21; 레인 5 - 7: 레인 2 - 4에 대한 항돼지 IgG 웨스턴 블랏).
도 4는 적용된 샘플의 양에 대하여 FcBP 칼럼으로부터 IgG의 회수량을 보여주는 크로마토그램이다.
도 5는 FcBP 칼럼의 재사용에 따른 IgG 정제의 재생력을 보여주는 크로 마토그 ¾이다,
도 6은 FcBP/돼지 IgG의 상호작용에 대한 SPR(surface plasmon resonance) 분석을 수행한 결과를 보여주는 그래프이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】
이하， 본 발명을 상세히 설명한다.
항체를 정제하기 위해서는 항체가 칼럼 (column)에 흡착되어 시료로부터 분리되어야 하며， 그리고 흡착된 항체가 변성 없이 용출되어야 한다.
본 발명은 항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드 (Fc binding peptide, FcBP)가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 제공한다.
본 발명에 있어서， 상기 FcBP는 면역글로불린 GCI画 unoglobulin G,
IgG)의 Fc 부위 (domain)에 결합하는 올리고펩타이드는 모두 사용가능하며， 7 내지 17개의 아미노산으로 구성된 을리고펩타이드인 것이 바람직하나 상기 아미노산의 갯수는 이에 한정되지 않는다.
상기 FcBP는 정제하고자 하는 항체의 Fc 부위에 높은 선택성 (selectivity)과 특이성 (speci f icity)을 가지고 결합한다. 또한， 상기 FcBP는 항체의 항원결합부위가 아닌 Fc 부위를 결합하기 때문에， 항체의 항원 결합력에 영향을 미치지 않는다. 또한， 상기 FcBP는 항체의 친화성 리간드로서 통상 수지 등의 고체상에 고정될 수 있다.
상기 FcBP는 DCHKRSFMDNCT (서열번호: 1)， DCRTQFRPNQTCT (서열번호: 2) DCQLCDFWRTRCT (서열번호: 3), DCFEDFNEQRTCT (서열번호: 4)， DCLAKFLKGKDCT (서열번호: 5), DCWHRRTHKTFCT (서열번호: 6)，
DCRTIQTRS CT (서열번호: 7)， DCIKLAQLHSVCT (서열번호： 8)，
DCWRHRNATEWCT (서열번호: 9)， DCQNWIKDVHKCT (서열번호： 10),
DCAWHLGELVWCT (서열번호: 11)， OCAFHLGELVWCT (서열번호: 12),
DCAYHLGELVWCT (서열번호: 13) 및 이들 아미노산 서열에서 한 개 또는 두 개의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열로 구성되는 을리고펩타이드인 것이 바람직하다. 상기 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
【표 1】
FcBP의 아미노산서열
Figure imgf000010_0001
14 FCBP-Ser DSAWHLGELWST 상기 FcBP는 상기 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인이 분자 내 이황화 결합을 하거나 하지 않은 올리고펩타이드가 모두 사용가능하며, 상기 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인 잔기를 세린으로 치환시킨 FcBP-Ser은 DSAWHLGELWST (서열번호: 14)인 올리고펩타이드도 사용가능하다.
본 발명에 있어서， 상기 항체 정제용 흡착 칼럼은 FcBP가 링커 (linker)를 통해 레진에 연결될 수 있다.
상기 링커는 FcBP의 N-말단 또는 C-말단에 결합될 수 있고 ·, C-말단에 결합되는 것이 바람직하다.
상기 링커 (linker)는
1) (NH2(CH2CH20)n(CH2)aC(0)-, [여기서 n은 1 ~ 30이고 a는 1 ~ 10이다 ·]);
2) (-NH(CH2CH20)n(CH2)aN¾, [여기ᄌ in은 1 ~ 50이고， a는 2 ~ 10이])；
3) (-NH(CH2CH20)m(CH2)aY(CH2CH20)n(CH2)bNH2, [여기서 m 및 n은 각각 1 ~ 30이고， a와 b는 각각 2 ~ 10이며， Y는 링커이고, 알킬， 산소 (ᅳ 0-), 아민 (-NH-), 유레아 (ᅳ NHCONHᅳ)， 아미드 -CONH-, 에스테르 (-COO—) 및 아릴로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이다])로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않으며， 적절한 알킬， 펩타이드 또는 유사체일 수 있다. 상기 링커는 말단의 아민 (NH2)기가 말레이미드 (maleimide), 아지드 (azide) 및 알킨 (alkyne)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 기능기로 치환될 수 있으며， 그 외 다른 적 절한 기능기로 치환된 것 일 수 있으나 이에 한정되지 않는다 .
이 런 을리고 펩타이드에 링 커 및 적 절한 반웅기 의 도입은 항체의 용해도를 개선하고 고체기판 사이에 충분한 공간을 제공한다 .
상기 FcBP 유도체는 하기 구조들로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 구조를 갖는 것일 수 있으나 이에 한정되지 않는다 .
1) 아미노 -dPEG6-DCAWHLGELWCT ;
2) 아미노— dPEG6-DCAFHLGELVWCT ;
3) 아미노— dPEG6-DCAYHLGELVWCT ;
4) 아미노 -dPEG6-DSA丽 LGEL ST ;
5) AC-DCAWHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2；
6) Ac-D,CAFHLGELVWCT-NHCH2CH20CH2CH20C¾CH?NH2；
7) Ac-DCAYHLGELVWCT-NHCH2CH20 C¾C¾0CH2C¾NH2；
8) Ac-DS HLGELVWST-NHC¾CH20CH2C¾0C¾CH2NH2；
9) Ac-DCAWHLGELVWCT NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2 ;
10 ) Ac-DCAFHLGELWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2；
11 ) Ac-DCAYHLGELWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2 HC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2
12 ) Suc-DCAWHLGELV T-NHCH2C¾OCH2C¾OC¾CH2NH2；
13) Suc-DCAFHLGELVWCT— NHC¾CH20C¾CH20C¾CH2NH2；
14) Sueᅳ DCAYHLGELVWCT— NHCH2CH20 CH2CH20CH2C¾NH2 ;
15) Suc-DSAWHLGELVWST-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2N¾；
16 ) Sue— DCATOLGELVWCT-NHCH2CH20CH2CH20C¾CH2NHC ；
17 ) Suc-DCAFHLGELWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2；
18 ) Suc-DCAYHLGELVWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2； 19) SUC-CAWHLGELVWCT-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2NH2 ; 20) Suc-CAFHLGELVWCT-NHCH2CH20C¾CH20CH2CH2NH2；
21) Suc-CAYHLGELWCT-NHCH2CH20 CH2CH2OCH2CH2NH2；
22) Suc-SAWHLGEL ST-NHCH2C¾OCH2CH2OCH2CH2N¾；
23 ) SLIC-CAWHLGELVWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2； 24) Suc-CAFHLGELVWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0 HCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2; 및 25 ) Suc-CAYHLGELVWCT-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHC0NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2.
본 발명에 있어서， 상기 레진은 아가로스， 세파로스， 셀를로스， 덱스트란， 폴리아크릴 레이트 및 폴리스틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하고， 세파로스인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 실시예에서는 1) Ac-DC/ VHLGELVWCT-(C-말단 링커); 2) (N- 말단 링커) -DCAWHLGELVWCT-C02H (또는 C0N¾); 3) Ac-DCAXHLGELWCT-(C-말단 링커) (X = F 또는 Y); 4) (N-말단 링커) -DCAXHLGELVWCT— C02H (또는 C0N¾)(X = F 또는 Y); 5) Ac-DSAXHLGELVWSTᅳ (C-말단 링커 ); 및 6). (N-말단 링커) - DSAXHLGELWST-C02H (또는 C0N¾) [본 실시예에서는 N-말단 링커로는 NH2(CH2CH20)6CH2CH2C0-를 그리고 C-말단 링커로는 NH-CH2CH20C¾CH20C¾CH2NH2 또는 NH-CH2CH20C¾CH20CH2CH2NHC0NH-CH2C¾0CH2C¾0CH2CH2NH2를 사용함]의 다양한 FcBP-링커 흔성체를 제조한 후， 이들을 각각 레진에 고정시킨 다음， 상기 레진을 칼럼에 장착하여 다양한 FcBP 친화성 흡착 칼럼을 제작하였다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼의 IgG에 대한 결합력을 알아보기 위해， 상기 다양한 FcBP 친화성 흡착 칼럼을 이용하여 허셉틴에 대한 결합력을 측정한 결과， 매우 우수한 허셉틴에 대한 결합력을 나타내었다. 이런 결합력은 단백질 A 및 단백질 G를 이용한 흡착 칼럼과 유사한 수준임을 확인하였다 (도 la 및 도 lb 참조 )·
본 발명의 실시예에서는 FcBP의 이황화 결합이 IgG에 대한 결합력에 미치는 영향을 알아보기 위해, FcBP에 시스테인 잔기를 세린으로 치환한 FcBP- Ser, 및 FcBP의 이황화 결합을 감소시킨 FcBP-red를 각각 이용한 칼럼을 제작한 후 허셉틴에 대한 결합력을 측정한 결과， 상기 FcBP 친화성 흡착 칼럼에 비해 FcBP-Ser 및 FcBPᅳ red의 IgG에 대한 결합력은 다소 낮아졌으나 여전히 우수한 허셉틴에 대한 결합력을 나타내었다 (도 la 및 도 lb 참조). 본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼에 흡착된 IgG가 온화한 조건에서 용출이 가능한지 알아보기 위해， FcBP 흡착 칼럼 , 단백질 A 칼럼， 단백질 G 칼럼， FcBP-Ser 칼럼 및 FcBP-red 칼럼에 각각 흡착된 JgG를 pH 구배 완충용액을 이용하 용출시킨 결과， FcBP 흡착 칼럼의 경우 단백질 A 또는 단백질 G에 비해 더 온화한 조건 (pH 2.5 ~ 5.0)에서 IgG가 분리되는 것을 확인하였다 (도 lc 및 도 Id 참조). ■
구체적으로, 본 발명에서 제작된 FcBP 흡착 칼럼은 항체 결합 후 해리속도가 빨라서 pH 2.5 - 5.0의 완층용액으로 항체의 용출이 가능하였다. FcBP의 아미노산 서열 중 두 개의 시스테인이 분자내 이황화 결합을 형성한 경우에는 pH 2.5 ~ 3.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능하였고， FcBP의 아미노산 서열 중 두 개의 시스테인이 분자내 이황화 결합이 제거된 경우에는 pH 3.0 ~ 5.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능한 것을 확인하였다. 이는 FcBP 리간드가 IgG를 정제하는데 사용할 때， 산에 의해 유도되는 IgG 활성의 손실을 극복할 수 있는 장점을 가지는 것을 알 수 있었다. 왜냐하면 용해 완충용액이 다른 칼럼의 실험에서 요구되는 것보다 더 높은 pH의 산성에서도 정제할 수 있기 때문이었다.
본 발명의 실시예에서는 본 발명에 I서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼의 돼지 IgG의 분리 능력을 확인하기 위해， 돼지 항체를 FcBP 친화성 칼럼에 흡착시킨 후 pH 구배 완충용액을 이용하여 용출 정도를 측정하였고 정제하여 얻은 분획물을 SDSᅳ PAGE 및 웨스턴 블랏을 이용하여 확인한 결과， FcBP 칼럼은 pH 2.5 ~ pH 5.0의 온화한 조건에서 IgG가 용출되는 것을 확인하였고， FcBP 칼럼의 정제된 양이 단백질 G 및 단백질 A의 정제한 양보다 많음을 확인하였다 (도 3의 A 내지 D 참조).
본 발명의 실시예에서는 본 발명에서 제작된 FcBP 친화성 흡착 칼럼의 재사용에 따른 IgG의 회수량을 알아보기 위해， 돼지 혈청 단백질을 FcBP 친화성 칼럼에 적재하여 정제된 IgG의 회수량을 확인하였으며， 30회까지 반복하여 재사용하면서 igG의 회수량을 확인한 결과， FcBP 칼럼은 적재한 단백질 총량이 늘어날수톡 IgG 회수량이 감소하였고， 반복 횟수에 상관없이 재사용이 가능한 것을 확인하였다 (도 4 내지 도 6 참조).
따라서， 본 발명의 FcBP 친화성 흡착 칼럼은 IgG에 대한 높은 결합력을 가지고, 흡착된 IgG를 온화한 조건 (pH= 2.5 - 5.0)에서도 용출할 수 있으며, 100번의 재사용 후에도 초기 IgG 정제 능력을 유지할 수 있음을 확인함으로써， 단백질 A 및 단백질 G와 같은 단백질 친화성 리간드를 이용한 흡착 칼럼을 대체하는 항체 정제용 흡착 칼럼으로 유용하게 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 FcBP가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼을 이용한 항체의 정제 방법을 제공한다.
구체적으로， 상기 방법^
1) 본 발명의 FcBP가 고정된 레진이 장착된 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 처리하여 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계 ;
2) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
3) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서， 항체는 IgG인 것을 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서， 상기 단계 1)의 항체의 결합은 pH 6.5 내지 pH 8.0에서 수행하는 것이 바람직하다. 상기 방법에 있어서， 상기 단계 2)의 세척은 pH 5.5 내지 pH 6.5의 완층용액을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에 있어서， 상기 단계 3)의 항체의 용출은 pH 구배 완층용액 또는 일정 pH 완층액을 이용하여 수행하는 것이 바람직하나 상기 방법에 한정되지 않는다. pH 구배 완충용액을 사용하는 경우， pH 2.5 내지 pH 5.0의 용출 완충용액을 사용하여 항체를 용출시키는 것이 바람직하다.
본 발명의 FcBP를 이용하여 제작된 흡착 칼럼은 인간 IgG에 대한 결합능력이 우수하고， 단백질 A 및 G를 이용한 칼럼에 비교하여 보다 온화한 조건에서 항체를 용출시킬 수 있으며， 95% 이상의 순도를 가진 항체 정제 효과를 보였으며， 칼럼의 내구성 실험에서 100번 이상 재사용하는 동안에도 항체 정제 효과가 저하되지 않는 것을 확인함으로써， 항체 정제용 흡착 칼럼으로 유용하게 이용될 수 있다.
【발명의 실시를 위한 형태】
■ 이하， 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> N 말단에 링커가 도입된 FcBP 1의 제조
상기 [표 1]에서 나타난 FcBP들 중에서 FcBP-l, FcBPᅳ 2， FcBP-3, 그리고 FcBP-Ser의 고체상 합성 방법과 이들 펩티드의 N-말단에 아미노 -dPEG6- 산 (Peptide International, 미국) 링커가 도입된 아미노 -dPEG6_FcBP-l， 아미노 -dPEG6-FcBP-2, 아미노 -dPEG6-FcBP-3, 아미노 -dPEG6-FcBP_Ser의 고체상 합성법을 나타내었다. 명세서에 언급된 다른 펩티드 및 그 유도체의 합성에도 실시예에 나타난 고체상 펩티드 합성방법을 사용하였다. 펩티드 합성에 사용된 시약은 DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2-(1Η- 벤조티라졸 (benzotriazole)-l-yl)-l,l,3,34테트라메틸우로늄 핵사플로포포스페이트 (hexafluorophosphate, HBTU) 함유 DMF, 0.5 M 하이드록시벤조티라졸 (hydroxybenzotirazole, HOBt)) 함유 DMF, 20% 피페리딘 함유 DMF이며， 열거된 Fmoc 아미노산 블록 및 링커를 사용하여 C-말단 아미노산부터 고체상 펩티드 합성법에 따라 순차적으로 진행하였다.
<1-1>아미노 -dPEG6-FcBP-l
(i) 리간드 구조
환원： Ai no-dPEG6ᅳ Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly— Glu-Leu-Va卜 Trp-Cys-
Thr-NH2 산화:
o
H 2N '^^0^^0^^'0^/^O ^^0^/^0'^^^Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu- al-Trp-Cys-Thr- H2
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록 '
Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-L-
Val-OH, Fmoc-L-Leu-0H, Fmoc-L-Glu(0tBu)-0H, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala-0H, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-Asp(tBu)— OH 및 Fmoc—N-amid으 dPEG6-acid
(iii) 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조
(a) 아미노산 도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 画 ole에 기초하였다. 0.5 g의 클리어 아미드 수지 (Clear amide resin, 0.5 mmole/g, Peptide International , 미국)를 합성반응기에 넣고， 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 隱 ole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다. 클리어 아미드 수지로부터 Fmoc 보호를 제거하고， Fmoc-아미노산을 활성화하며 클리어 아미드 수지에 활성화된 잔기를 부착하는 반웅을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M H0BT 함유 DMF용액, 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 흔합한 다음 수지가 담긴 반웅기에 부어 2 시간 동안 흔합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반웅으로 확인되면 도입 반응을 1 회 더 반복하거나 20% Ac20 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반웅과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-1의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 합성이 끝난 후에， 보호기로 보호된 FcBPᅳ 1가 부착된 수지를 펩티드 반웅기에서 건조하였고 중량을 측정하였다 (H-Asp^BLO-Cys TrU-Ala- Tr p (Boc' ) -H i s (Tr t ) -Leu-G ly-Glu(tBu) -Leu-Va 1 -Trp (Boc ) -Cys (Trt) -Thr ( t Bu ) - 순수 아미드 레진은 1.20 g). - (b) 링커의 도입
상기 <실시예 1〉의 (a)과정에서 완성한 보호기로 보호된 FcBP-1가 부착된 수지에서 펩티드의 N-말단에 링커를 도입하는 과정을 실시하였다. 이때 사용한 링커는 아미노 -dPEG6-acid를 사용하였다. 아미노 -dPEG6-ac i d의 도입은 일반적인 고체상 펩티드 합성법에 따라 진행하였다. <실시예 1>의 a에서 완성한 펩티드가 부착된 수지 중에서 250 mg을 덜어내어 반웅기에 넣고 DCM을 붓고 10 분 이상 정치하여 충분히 불렸다. 0.2 隱 ole의 Fmoc-amido-dPEG6- acid와 0.4 ml 0.5 M H0BT 함유 DMF용액， 0.4 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 34.8 ul DIPEA와 5 분간 흔합한 다음 수지가 담긴 반웅기에 부어 2 시간 동안 흔합하였다. 도입 반응의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반웅을 1 회 더 반복하거나 20% Ac20 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 링커의 도입을 확인한 다음 20% 피페리딘 (piperidine) 함유 DMF 용액 (3 x 5 min)으로 처리하고 DMF와 DCM으로 수지를 충분히 세척한 다음 진공에서 건조하였다 (1ᅳ Amin으 3,6，9，12，15，18- hexaoxahenicosan-21-oyl-Asp(tBu)-Cys(Trt )-Ala~Trp(Boc)-Hi s(Trt )-Leu-Gly- Glu(tBu)— Leu— Val— Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)ᅳ순수 아미드 레진은 249 mg).
(c) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 1>의 (b)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 및 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 흔합액 2 ml과 함께 실은에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 '펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다. 농축액을 ACN:0.1 M 아세트산암모늄 (a讓 onium acetate) 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 시간 교반하였다. 이황화 결합 (Disulfide) 형성 반웅의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반웅액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (29mg).
(d) 정제
상기 <실시예 1>의 (c)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물을 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-IX 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며， 합성한 펩티드의 분자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다 (아미노— dPEG6— FcBP— 1은 20 mg 얻었고 MW = 1865.08 및 M+1 1866.51'이였다).
[표 2】 prep-LC 1차 정제조건
Figure imgf000020_0001
【표 3】
prep-LC 2차 정제조건
Figure imgf000020_0002
<l-2> 아미노 -dPEG6-FcBP-2
(i) 리간드 구조
환원： 아미노ᅳ dPEG6-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly— Glu-Leu-Valᅳ Trpᅳ Cys-Thr-NH2
산화:
0
ᅢ^^^ᄋ^^^ᄋ ^ᄋ^^^^ᄋ^^ᄋ^^^ᄋ^^^^^^^ ^^^！^^^^！^^^^-丁 - !^
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목톡
Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-L-Phe-0H , Fmocᅳ L-Val-0H Fmoc-L-Leu-OH , Fmoc-L-G 1 u ( Ot Bu ) -OH , Fmoc-Gly-0H, Fmocᅳ느 Leucine, Fmocᅳ Lᅳ His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc- Asp(tBu)— OH 및 i½oc-N-amick)-dPEG6-acid
(iii) 아미노 -dPEG6-FcBP— 2의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 1_1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과， H-Asp ( t Bu ) -Cy s ( Tr t ) - A 1 a-Phe-H i s ( Tr t ) - Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)— Cys(Trt)-ThrCtBu)-순수 아미드 레진 1.22 g으로측정되었다.
(b) 링커의 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 링커의 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과， 1-아미노 -3， 6, 9 ,12, 15,18- 핵사옥사헤니코산 (hexaoxahen i cos an )-21-oy 1 -Asp (tBu) -Cys(Tr t ) -A 1 a— Tr p ( Boc ) - His(Trt) -Leu-G ly-Glu(tBu)— Leu-Va 1 -Tr p (Boc ) -Cys (Trt) -Thr ( t Bu ) -순수 아미드 레진 251 mg을 얻었다.
(c) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 1-1>의 아미노 dPEG6— FcBP-1의 제조에 따른 보호기의 제거와 수지를 분리한 동일한 방법으로 수행한 결과， 31 mg을 얻었다.
(d) 정제
상기 <실시예 1— 1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따라 정제한 동일한 방법으로 수행한 결괴ᅳ， 아미노ᅳ dPEG6-FcBP-2는 23 mg 얻었고， MW = 1826.04 및 M+1 1827.21로 확인되었다.
<1-3>아미노 dPEG6-FcBP-3
(i) 리간드 구조
환원: 아미노 dPEG6-Asp-Cys— Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu— Val-Trp- Cys-Thr-NH2
산화:
o
H 2N ^^/°^^"0'^/0^^O'^/0'^^O^^^Asp-Cys-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu- al-Trp-Cys-T r- H2
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목톡
Fmoc-L— Thr(tBu ) -OH, Fmoc-Cys(Trt)-0H, Fmoc-L-Tyr-OH , Fmoc-L-Val-OH
Fmoc-L-Leu-OH , Fmoc-L-G 1 u ( Ot Bu ) -OH , Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L- His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt )~0H, Fmoc- Asp(tBu)-0H 및 i½oc-N-amido-dPEG6-acicl
(iii) 아미노 -dPEG6— FcBP-3의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 1— 1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과， H-Asp(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Tyr(tBu)- His(Trt) -Leu-G ly-Glu(tBu) -Leu-Va l-Trp(Boc) -Cys (Trt) -Thr ( t Bu )—순수 아미드 레진 1.17.g으로 측정되었다.
(b) 링커의 도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노 _dPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 링커의 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, 1-아미노 -3，6,9,12，15，18- 핵사옥사헤니코산-21-0y卜Asp(tBu) -Cys (Trt)-Al a-Tyr (tBu)-His(Trt) -Leu-G 1 y- Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc) Cys (Trt)ᅳ Thr (tBu)-순수 아미드 레진 246 mg을 얻었디-.
(c) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 1-1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 보호기의 제거와 수지를 분리한 동일한 방법으로 수행한 결과， 29 mg을 얻었다.
(d) 정제 상기 <실시예 1_1>의 아미노 dPEG6-FcBP-l의 제조에 따라 정제한 동일한 방법으로 수행한 결과， 아미노 dPEG6-FcBP-3은 22 mg 얻었고， 丽 = 1842.04 및 M+1 1843.36로 확인되었다. <1-4>아미노 -dPEG6-FcBP-Ser
(i) 리간드 구조
아미노ᅳ dPEG6-Asp-Serᅳ Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Ser-Thr-
NH2
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-L— Trp(Boc ) -OH, Fmoc-L-
Val-0H, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc_L— Glu(OtBu)— OH, Fmoc—Gly— OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala~0H, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-0H및 Fmoc^N-am i do-dPEG6~ac i d
(iii) 아미노 dPEG6-FcBP-Ser의 제조
(a) 아미노산도입
상기 <실시예 1-1>의 아미노 -clPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과 ,H-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Ala-Trp(Boc)- 3( 0-?16ᅳ^ ᅦ1 1 )- -¥31ᅳ ( 0)-5^ ¾)- 1ᅳ^ 1)-순수 아미드 레진 1.23 g으로 측정되었다.
(b) 링커의 도입
상기 <실시예 1— 1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따른 링커의 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과， 1-아미노 -3，6，9，12，15，18ᅳ 핵사옥사헤니코산 -2l-0yl-Asp(tBu)— Cys(Trt)-Alaᅳ Tri Bo^-HisCrr -Ple-Gly- Glu Bu Leu-Val-TrpiBoc)ᅳ Cys(Trt)-Thr(tBu)-순수 아미드 레진 247 mg을 얻었다. (C) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 1>의 (b)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 흔합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 반웅액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (33 mg).
(d) 정제
상기 <실시예 1-1>의 아미노 -dPEG6-FcBP-l의 제조에 따라 정제한 동일한 방법으로 수행한 결과, 아미노 -dPEG6-FcBP-Ser는 23 mg 얻었고， N = 1834.96 및 M+1 1836.11으로 확인되었다.
<실시예 2> C-말단에 링커가 도입된 FcBP의 제조
상기 [표 1]에서 나타난 FcBP 들 증에서 FcBP-l, FcBP-2, FcBP-3 및
FcBP-Ser의 고체상 합성 방법과 이들 펩티드의 N-말단은 아세틸화 (Acetylation)시키고 C-말단에 1,8-diamino— 3，6_ 디옥사옥탄 (dioxaoctane) 링커가 도입된 Ac-(FcBP-l)-NHC¾C¾0CH2CH20C¾CH2NH2 Ac-(FcBP-2)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2, Ac-(FcBP-3)- NHCH2CH20 CH2CH20CH2CH2NH2및 Ac— (FcBP-Ser)ᅳ NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2N¾의 고체상 합성법을 나타낸다. 명세서에 언급된 다른 펩티드 및 그 유도체의 합성에도 실시예에 나타난 고체상 펩티드 합성방법을 사용하여 조달하였다.
펩티드 합성에 사용된 시약은 DMF, DCM, DIPEA, 0.5 M 2-(1Η- 벤조트리아졸 (benzotriazole)-l-yl)-l,l,3,3
테트라메틸우료늄 (tetramethyluronium)핵사플루로로인산염 (hexafluorophosphat e, HBTU) 함유 DMF, 0.5 M hydroxybenzot i razole(H0Bt ) 함유 DMF, 20% 피페리딘 함유 DMF이며， 열거된 Fnioc 아미노산 블특 및 링커를 사용하여 C- 말단 아미노산부터 고체상 펩티드 합성법에 따라 순차적으로 진행하였다.
<2-1> Ac-(FcBP— 1)-NHCH2CH20CH2(¾0CH2CH2NH2
(i) 리간드 구조
H
환원； Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-C^
, 1 H
산화: Ac-Asp-Cys-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Τφ^
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록 Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-L-
Val-0H, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(OtBu)ᅳ OH, Fmoc-Gly-0H, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala-0H, Fmoc-Cys(Trt )一 OH, Fmoc-Asp(tBu)-0H 및 Ac20
(iii) Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20CH2CH20C¾(¾NH2의 제조
(a) 아미노산 도입 하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole을 기초하였다. 0.5 g의 으 bis- (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진 (0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반웅기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다. Fmoc—아미노산을 활성화하여으 bis- (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진에 활성화된 잔기를 부착하는 반웅을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M H0BT 함유 DMF용액， 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 흔합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 흔합하였다. 도입 반웅의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반응으로 확인되면 도입 반웅을 1 회 더 반복하거나 20% Ac20 함유 이 «F 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반응과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 층분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-l의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 아세틸을 도입하기 위하여 20% Ac20 in DMF 용액 (3xl0mlxl( in)으로 처리하였다. 합성이 끝난 후에， 보호기로 보호된 Ac-FcBP-1가 부착된 수지를 펩티드 반웅기에서 건조하였고 중량을 측정하였다 (Ac-Asp(tBu)ᅳ CysCTrO-Ala-TrpiBo^-HisiTr -Leu-Gly—GlL tBi - Leu-Val-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-NHC¾:CH2OCH2CH20^ 레진， 1.30 g).
(b) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 2-1>의 (a)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 흔합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 ACN:0.1 M 아세트산 암모늄 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 시간 교반하였다. 이황화 결합 형성 반웅의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반웅액을 동결 건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (31 mg).
(c) 정제
상기 <실시예 2— 1>의 (b)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물을 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며, 합성한 펩티드의 분자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다 (Ac— (FcBP-1)- NHCH2CH20CH2C¾0CH2CH2NH2는 24 mg 얻었고 MW = 1702.91 및 M+1 1704.01으로 확인되었다 .).
【표 4】
； rep-LC 1차 정제조건
Figure imgf000027_0001
【표 5】
rep-LC 2차 정제조건
Figure imgf000027_0002
<2-2> Ac-(FcBP— 2)-NHCH2CH2( 2CH20C¾CH2NH2
(i) 리간드 구조
환원: Ac-Asp-Cys-Ala-Phe-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-Thr
Figure imgf000028_0001
Figure imgf000028_0002
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr (tBu)-OH , Fmoc-Cys (Trt )-0H， Fmoc -L-Phe-OH, Fmoc-L-Val-OH
Fmoc-L-Leu-OH , Fmo c -L-G 1 u ( 01 Bu ) -OH , Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L- His(Trt)-0H, Fmoc-L— Trp(Boc)— OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys (Trt )-0H, Fmoc- Asp(tBu)-0H 및 Ac20
(iii) Ac-(FcBP-2)-NHCH2CH20CH2CH20CH2(¾NH2의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 2-l>에 Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2의 제조에서 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, kAc— Asp BuXysOTr -Ala- Phe-H i s ( Tr t ) -Leu-G 1 y-G 1 u ( t Bu ) -Leu-Va l-Trp(Boc)ᅳ Cy s (Trt)— Thr (tBu)- NHCH2CH20CH2CH20C¾CH2NH-트리틸 레진 1.28 g으로 측정되었다.
(b) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 2— 1>에 Ac-(FcBP— 1)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2N¾의 제조에서 보호기의 제거와 수지의 분리와 동일한 방법으로 수행한 결과, 29 mg을 얻었다.
(c) 정제 ^
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20C¾CH20CH2CH2NH2의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과， Ac— (FcBP-2)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2는 23 mg 얻었고 MW = 1663.87 및 M+1 1665.07으로 확인되었다.
<2-3> Ac-(FcBP-3)— NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2
(i) 리간드 구조 H
산회—: Ac-Asp-Cys-Ala-Tyr-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Cys-T r^N^^0^^°x^ NH2
H
환원: Ac-Asp-Cys-Ala-Tyr-His-Leu— Gly-Giu-Leu-Val-T^
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록 ;
Fmoc-L-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-L-Tyr-OH, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH , Fmoc-L-G 1 u ( Ot Bu ) -OH , Fmoc-Gly-OH, Fmocᅳ Lᅳ Leucine, Fmoc-L- His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, FmocAla-OH, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc- Asp(tBu)-0H 및 Ac20
(iii) Ac-(FcBP-3)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2의 제조
(a) 아미노산도입
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2N¾의 제조에서 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-Asp (tBu)-Cys (Trt)-Al a- Tyr(tBu)-His(Trt) -Leu~G ly-Glu(t Bu ) -Leu-Va l-Trp(Boc) -Cys (Trt) -Thr ( t Bu ) - NHCH2CH20CH2CH20C¾CH2NH-트리틸 레진 1.33 g으로 측정되었다.
(b) 보호기와 제거와수지의 분리
상기 <실시예 2ᅳ1>에. Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2N¾의 제조에서 보호기의 제거와 수지의 분리와 동일한 방법으로 수행한 결과， 29 mg을 얻었다.
(c) 정제
상기 <실시예 2ᅳ: 에 Ac-(FcBP-l)-NHC¾CH20CH2CH20C¾CH2NH^ 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과, Ac-(FcBP-3)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2N¾는 22 mg 얻었고 MW = 1679.87 및 M+1 1680.78으로 확인되었다.
<2-4> Ac— (FcBP-Ser )-NHCH2C¾0C¾(¾0CH2CH2NH2
(i) 리간드 구조 H
Ac-Asp-Ser-Ala-Trp-His-Leu-Gly-Glu-Leu-Val-Trp-Ser-T r^ O 지 NH2
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Ser(tBu)-0H, Fmoc— L— Trp(Boc)-0H, Fmoc-L- Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L— Glu(OtBu) -OH, Fmoc— Gly—OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc— L-His(Trt)— OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu)-OH, Fmoc-Asp(tBu)-OH 및 Ac20
(iii) Ac-(FcBP-Ser )-NHCH2CH20CH2CH20CH2(¾NH2의 제조
(a) 아미노산 도입
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-l)-NHCH2C¾0CH2CH20CH2C¾NH2의 제조에서 아미노산 도입과 동일한 방법으로 수행한 결과， Ac-Asp(tBu)-Ser(tBu)-Ala- Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly-Glu(tBu)-Leu-Val-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Thr(tBu)- NHCH2C¾0C¾CH20CH2C¾NH-트리틸 레진 1.21 g으로 측정되었다.
(b) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 1>의 a 과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 흔합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰디-. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 반웅액을 동결건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (33 mg).
(c) 정제
상기 <실시예 2-1>에 Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20C¾C¾0CH2CH2N¾의 제조에서 정제와 동일한 방법으로 수행한 결과， Ac-(FcBP-Ser)- NHCH2CH20C¾C¾0CH2C¾NH2은翻 = 1672.79 및 M+1 1674.31으로 확인되었다. <2-5> Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHmNHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2 (i) 리간드 구조
환원:
Figure imgf000031_0001
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
N¾C¾C¾0CH2(¾0CH2CH2NH2， Fmoc-L-Thr(tBu)-OH， Fmoc-Cys (Trt )-0H， Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-L-Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH , Fmoc-L-Glu(0tBu)-0H, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc— L—His(Trt )一 OH, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-Asp(tBu)-0H 및 Ac20
(iii) Ac-(FcBP-l)-NHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NHmNHCH2CH20CH2CH20CH2CH2NH2^ 제조
(a) 아미노산도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 mmole을 기초하였다. 0.5 g의 0-bis— (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진 (0.5 睡 ole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반웅기에 넣은 다음 DMF를 충분히 붓고 30 분 기다린다. 반응용기에 di (N-succinimidyl )carbonate를 640 nig을 넣고 2시간 동안 흔합한다. 반웅액을 여과하여 제거하고 DMF와 DCM을 교대로 사용하여 충분히 세척한다ᅳ 반웅용기에 0.25M 1 , 2-bi s(2-aminoethoxy ) ethane in DMF 용액 10 ml을 붓고 2 시간 동안 흔합한다. 반응액을 여과하여 제거하고 DMF와 DCM을 교대로 사용하여 층분히 세척한다. 그러고 나서 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N- 말단까지 준비하였다. Fmocᅳ아미노산을 활성화하여 준비한 레진에 활성화된 잔기를 부착하는 반웅을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M H0BT 함유 DMF용액， 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 흔합한 다음 수지가 담긴 반웅기에 부어 2 시간 동안 흔합하였다. 도입 반웅의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반웅으로 확인되면 도입 반웅을 1 회 더 반복하거나 20% Ac20 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반웅과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 층분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-l의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 아세틸올 도입하기 위하여 20% Ac20 in DMF 용액 (3xl0mbd( in)으로 처리하였다. 합성이 끝난 후에, 보호기로 보호된 Ac-FcBP-1가 부착된 수지를 펩티드 반웅기에서 건조하였고 중량을 측정하였다( 3^1 ) 3^^)-^3-¾ (80^- 3( 0-1 11-( ^-( 1 811)- Leu-Va 1 -Trp (Boc)-Cys(Trt)ᅳ Thr (tBu)
NHC¾C¾0C¾CH20CH2CH2NHC0NHC¾CH20CH2C¾0CH2CH2NH-트리틸 레진， 1.41 g).
(b) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 2-5>의 (a)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 흔합액 2 ml과 함께 실온에 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 ACN:0.1 M 아세트산 암모늄 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 사간 교반하였다. 이황화 결합 형성 반웅의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 관단되면 반웅액을 동결 건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (21 mg).
(c) 정제
상기 <실시예 2-5>의 (b)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물을 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98¾ 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며， 합성한 펩티드의 분자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다 ( Ac- ( FcBP- 1 )ᅳ NHC¾C¾OCH2CH2OC¾CH2NHCONHC¾C¾OCH2CH2OCH2C¾NH2는 18 mg 얻었고丽 = 1875.88및 M+1 1878.16으로 확인되었다 .).
<2-6> Suc-(FcBP-l)-NHC CH2(X¾CH20CH2CH2NH2
(i) 리간드 구조
환원:
Figure imgf000033_0001
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록
Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-L- Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L— Glu(0tBu)—0H, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)ᅳ OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt )-0H, Fmoc-Asp(tBu)-0H 및 Succinic anhydride
(iii) Suc-(FcBP-l)-NHCH2C¾(X:H2CH20CH2CH2NH2의 제조
(a) 아미노산도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 瞧 ole을 기초하였다. 0.5 g의 0-bis- (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진 (0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반웅기에 넣고, 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다. Fmoc-아미노산을 활성화하여 0-bis- (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진에 활성화된 잔기를 부착하는 반웅을 C-말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fnrac의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M H0BT 함유 DMF용액， 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 흔합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 흔합하였다. 도입 반웅의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반웅으로 확인되면 도입 반웅을 1 회 더 반복하거나 20% Ac20 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반웅과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 층분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-1의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 숙신닐을 도입하기 위하여 10% succinic anhydride in DMF 용액 (3xl0mlxl0min)으로 처리하였다. 합성이 끝난 후에， 보호기로 보호된 Sueᅳ FcBPᅳ 1가 부착된 수지를 펩티드 반웅기에서 건조하였고 중량을 측정하였다 (Suc-Asi)(tBu)-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)- Leu-G ly-Glu(t Bu ) -Leu-Va l-Trp(Boc) -Cys (Trt )~Thr (tBu)- NHC¾CH20CH2CH20C¾C¾NH-트리틸레진， 1.13 g ) .
(b) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 2-6>의 (a)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 혼합액 2 ml과 함께 실은에서 120분간 교반하여 수지에서 펩:티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 O.W» TFA— 30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 ACN:0.1 M 아세트산 암모늄 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 시간 교반하였다. 이황화 결합 형성 반응의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반웅액을 동결 건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (35 mg).
(c) 정제
상기 <실시예 2ᅳ6>의 (b)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물을 prep— LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98% 이상의 순도임을 분석용 HPLC로 확인하였으며， 합성한 펩티드의 자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다 (Suc-(FcBP— 1)-NHC¾C¾0C¾CH2()CH2CH2NH2는 26 mg 얻었고 1759.79 및 M+1 1761.01으로 확인되었다 .).
<2-7> Suc-CA亂 GELWCT-NHCH2C¾0CH2Oi20CH2(¾NH2
(i) 리간드 구조 환원
Figure imgf000036_0001
(ii) 사용된 아미노산 전구체 목록ᅵ
Fmoc-L-Thr(tBu)-0H, Fmoc-Cys(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-L- Val-OH, Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Glu(0tBu)-0H, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-L- Leucine, Fmoc-L-His(Trt)-0H, Fmoc-L-Trp(Boc)-0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Cys(Trt)-0H 및 Succinic anhydride
(iii) Suc-(CA亂 GELVWCT NHCHzCHz HzCifeOCIfeCifeNife의 제조
(a) 아미노산도입
하기 과정에서 사용된 시약의 양은 0.25 瞧 ole을 기초하였다. 0.5 g의 으 bis- (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진 (0.5 mmole/g, Novabiochem, 미국)를 합성반웅기에 넣고， 각각의 Fmoc-아미노산 블록 1 mmole의 무게를 달아 펩티드 아미노산 서열 순서대로 C-말단에서부터 N-말단까지 준비하였다. Fmocᅳ아미노산을 활성화하여 으 bis- (아미노에틸)에틸렌 글리콜 트리틸 레진에 활성화된 잔기를 부착하는 반응을 Cᅳ말단 아미노산부터 순차적으로 진행하였다. Fmoc의 제거는 20% 피페리딘 함유 DMF에서 수행하였고 잔기의 활성화 및 도입은 서열에 맞추어 준비한 아미노산을 2 ml 0.5 M H0BT 함유 DMF용액 , 2 ml 0.5 M HBTU 함유 DMF 용액 그리고 174 ul DIPEA와 5분간 흔합한 다음 수지가 담긴 반응기에 부어 2 시간 동안 흔합하였다. 도입 반웅의 확인은 카이저 시험법으로 수행하였으며 미반웅으로 확인되면 도입 반응을 1 희 더 반복하거나 20% Ac20 함유 DMF 용액으로 캡핑을 실시하였다. 각 도입 반웅과 Fmoc 제거 과정에서 다음 단계로 넘어가기 전에 DMF와 DCM으로 수지를 층분히 세척하였다. 이러한 과정은 FcBP-1의 펩티드 서열이 완성될 때까지 반복하였다. 아미노산 도입이 모두 끝난 다음에 N-말단에 숙신닐을 도입하기 위하여 10% Succinic anhydride in DMF 용액 (3xl0mlxl0niin)으로 처리하였다. 합성이 끝난 후에， 보호기로 보호된 Sue— CAWHLGELVWCT가 부착된 수지를 펩티드 반웅기에서 건조하였고 중량을 측정하였다 (Suc-Cys(Trt)-Ala-Trp(Boc)-His(Trt)-Leu-Gly- Glu(tBu) -Leu-Va 1 -Trp (Boc) -Cys (Trt) -Thr (tBu)— NHC¾C¾0CH2CH20CH2(¾NH-트리틸 레진， 1.41 g).
(b) 보호기의 제거와수지의 분리
상기 <실시예 2-7>의 (a)과정에서 준비한 펩티드가 부착된 수지 100 mg을 TFA, TIS, 물 그리고 EDT(94:1.0:2.5:2.5)의 흔합액 2 ml과 함께 실온에서 120분간 교반하여 수지에서 펩티드를 절단하였다. 절단 흔합물을 여과하고 여과액을 질소 가스로 절반 가량 농축한 다음 에테르를 부어 펩티드를 침전시켰다. 침전된 펩티드를 에테르로 3회 더 세척하고 질소 가스로 건조시켰다. 건조된 침전을 0.1% TFA-30% AcCN 함유 물에 녹인 다음 6시간 동안 교반한 다음 농축하였다.
농축액을 ACN:0.1 M 아세트산 암모늄 1:1 용액에 0.1 mg/ml 농도로 녹인 다음 공기에 노출된 상태로 24 시 :간 교반하였다. 이황화 결합 형성 반웅의 진행은 HPLC로 관측하였으며 더 이상 진행하지 않는 것으로 판단되면 반웅액을 동결 건조하여 펩티드 침전물을 얻었다 (34 mg).
(c) 정제 9
36 상기 <실시예 2-7>의 (b)과정에서 동결건조하여 얻은 펩티드 침전물올 prep-LC 1차 정제조건에서 분리한 다음 prep-LC 2차 정제조건으로 추가 정제하고 동결 건조하였다. 얻어진 펩티드는 각각 98% 이상의 순도임올 분석용 HPLC로 확인하였으며, 합성한 펩티드의 분자량을 말디 토프 질량 분석기로 확인하였다 (Sueᅳ CAWHLGELV T-NHCH2CH20C¾C¾0C¾C¾N¾ 25 mg 얻었고 MW = 1644.76 및 M+1 1646.이으로 확인되았다.)
<실시예 3> FcBP 친화성 레진의 제작
상기 <실시예 1〉 및 <실시예 2>에서 제조한 각각의 FcBPᅳ링커 흔성체를 이용한 친화성 레진을 제조사의 프로토콜에 따라 제작하였다. 구체적으로, 5 mL의 N一히드록시숙신이미드 (N-hydroxysuccinimide, NHS)(Sigma-Aldr ich, USA])-activated Sepharose™ 4 Fast FlowCGE 헬스케어， Uppsala, Sweden)를 30 mg FcBP가 포함된 0.2 M NaHC03(pH 8.5； 10 mL)과 함께 4 °C에서 하루 동안 반웅시켰다. 펩타이드 용액을 제거한 후에， 비드 (bead)를 블로킹 완충용액 (blocking buffer )(150 niM NaCl)을 포함하는 0.5 M 에탄을아민 (ethanolaniine, H 8.5)으로 세척한 후 상기 동일한 완충용액으로 한 시간 동안 반웅시켰다. 그런 다음, 증류수로 세척한 후 비드 (bead)를 4 °C에 보관하였다. 레진에 '고정된 펩타이드의 양은 대략 2.5 土 0.5 mg/mL 습식 레진이었으며， 이는 회복된 펩타이드의 차감에 의해 계산되었다. 펩타이드는 몰 흡광 계수 펩타이드는 몰 흡광 계수 ( ε = 12,863 Μ— ^πΓ1 (FCBP- 1), 5930 M' (FCBPᅳ 2) 및 7210 M— 1 (FCBP-3))를 이용하여 UV-VIS 분광 광도계 (spectrophotometer)에서 280 nm 흡광도를 측정하여 정량하였다. 상기 계수는 실험으로 결정되었다.
<실시예 4> FcBP 친화성 칼럼의 제작 상기 <실시예 3>에서 제작된 각각의 FcBP 친화성 레진을 이용하여 칼럼을 제작하였다.
한편, FcBP는 내부에 이황화 결합을 가지고 있는 FcBP (비특허문헌 16)로서， 상기 이황화 결합이 IgG 결합에 필수적인지 아닌지를 조사하기 위하여， 추가적으로 하기 두 개의 펩타이드 칼럼을 제작하였다. FcBP-Ser 칼럼은 FcBP의 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인 잔기를 세린 (serine)으로 치환시킨 다음， 변형된 펩타이드를 칼럼에 적재하여 제작하였다. 또다른 하나인 FcBP-Red 칼럼은 FcBP 칼럼을 사용하기 전에 이황화 결합을 감소시키기 위해 50 mM의 DTT로 처리하여 제작하였다 (비특허문헌 17).
<실험예 1> FCBP 친화성 칼럼의 IgG에 대한 정제능력 분석
상기 제작된 FcBP 칼럼， FcBP-Ser 칼럼， FcBP-Red 칼럼， 단백질 A 칼럼 및 단백질 G 칼럼의 IgG에 대한 결합 친화성을 비교분석하기 위해, 허셉틴 (Herceptin, Roche)에 대한 결합력을 측정하였다.
이때, 사용된 FcBP 칼럼은 NH2(C¾CH20)6CH2CH2C0-DCAWHLGELVWCT-NH2
[N¾(C¾CH20)6CH2C¾C0-AspCys*Al aTrpHi
Figure imgf000039_0001
이황화ᅳ결합된 시스테인은 특수기호 (*)로 표시하였음)를 사용하였고， FcBP- Ser 칼럼은 NH2(C¾C¾0)6CH2C¾C(H)SAWHLGELVWST-NH2 [NH2(CH2C¾0)6C¾CH2C()- 八3 -3^ᅳ^3ᅳ了 -^3-1^ᅳ6^ᅳ^ -1 11 31-¾ 3^¾ ^2]를 사용하였다.
상기 허셉틴은 인간 Ig¾ 타입의 치료용 항체로서 알려져 있기 때문에
IgG의 모델로 선택하였다.
IgG에 대한 결합 친화성은 다음과 같이 측정하였다. 흡착 칼럼을 이용한 IgG 정제 능력을 측정하기 위하여， 칼럼을 ACTA FPLC(GE Healthcare)에 부착한 후 허셉틴 정제 실험을 수행하였다. 100 mM 인산염 (phosphate) 완충용액 (pH 8.0)으로 평형화시킨 후， 상기의 완충용액 5 mL에 36.5 mg 및 20 mg의 허셉틴을 각각 용해시켜 항체 시료를 제조한 다음， 칼럼에 흡착시켰다. 항체를 pH 구배 완층용액로 pH 8.0에서 pH 2.0으로 순차적으로 녹여서 분리하였고， 인산염 및 구연산 (citrate)()H 2.0 및 50 mM) 완충용액의 비를 조절하여 완성하였다. 용출액은 1 niL씩 분취하였으며， UV 흡광도 254 nm에서 관찰하면서 UV 흡광도를 보이는 분획을 취한 다음 바로 붕산계 완층용액 (1 M 및 pH 8.5)으로 중화시킨 후， SDS-PAGE로 단백질을 분석하였다. 단백질 양은 브레드포드 분석 (Bradford assay)으로 측정하였다.
그 결과， 각각의 친화성 칼럼에 허솁틴을 대량으로 적재하였을 때 (36.5 mg), FcBP 칼럼이 단백질 A 및 단백질 G 칼럼에 비하여 눈에 띄게 높은 결합력을 나타내었다 (도 la). 단백질 A 칼럼은 용출 완층용액이 pH 2.3일 때 결합된 항체가 최대로 용출되기 시작되었고， 단백질 G 및 FcBP 칼럼은 pH 2.1에서 결합 항체가 최대로 용출되기 시작하였다. FcBP의 결합은 단백질 A/허셉틴 결합보다 단백질 G/허셉틴 결합과 더 유사함을 확인하였다 (도 lb 참조).
한편, FcBP 칼럼 중에서， 상기 실시예 <2ᅳ3> 및 <2ᅳ4>에서 제작된 흔성체를 이용한 칼럼은 각각 항체 결합 후 해리속도가 빨라서 pH 3.0 ~ 4.0의 완층용액으로 항체의 용출이 가능하였다. 또한， 상기 실시예 <2ᅳ1> 및 <2ᅳ 4>에서 제작된 2개의 시스테인이 분자 내에 이황화 결합을 한 FcBP를 포함하는 흔성체를 이용한 칼럼은 각각 pH 2.5 ~ 3.0의 완층용액으로 항체의 용출이 가능한 반면에， 2개의 시스테인이 분자내 이황화 결합이 없는 FcBP를 포함하는 흔성체를 이용한 칼럼은 pH 3.0 ~ 5.0의 완충용액으로 항체의 용출이 가능하였다.
하기 표 2에서 보는 바와 같이， FcBP 칼럼의 결합력이 단백질 A 칼럼 및 G 칼럼에 비해 인간 IgG에 대한 결합력이 우수하였다. 이는 FcBP가 인간 IgG에서 단백질 G (Kd = 20 nM) 보다 더 낮은 결합 친화성 ( = 85 nM)을 가졌음에도 불구하고 (Y. Jung, H.J. Kangl J.M. Lee, S.O. Jung, W.S. Yun, S.J. Chung, B.H. Chung, Anal .288 Biochem. 374 (2008) 99)ᅳ 레진 표면에서 FcBP의 높은 분자 밀도를 보여주며， 이는 단백질 친화성 리간드와 비교해서 FcBP의 작은 분자량， 레진에서 단백질 G의 낮은 밀도뿐만 아니라 IgG의 결합 효율성의 증가에 기인할 수 있는 것이다. 친화성 칼럼에서 회수율을 비교하였을 때 최대 결합력보다 낮은 허셉틴의 양 (20 mg)을 적용하였다. 하기 표 2에서 주어진 바와 같이 FcBP 칼럼은 단백질 칼럼보다 더 높은 회수율을 나타내었다. 게다가 FcBP-Red 칼럼도 단백질 A 칼럼 및 G 칼럼에 비해 회수율이 높았다.
【표 6】
FcBP의 IgG 회수율
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
a각각의 리간드를 1 습식 레진에 고정시켰다. 단백질 G 및 단백질 A의 분자량은 각각 17,000 Da 및 42,000 Da이다 (GE Healthcare). b허셉틴의 최대 초과량 (36.5 nig)을 칼럼에 적용하였다. c허셉틴의 분자량은 148,000 Da이다 (비특허문헌 18).
<실험예 2> FcBP에서 이황화 결합의 IgG결합에 대한 영향 분석 상기 <실험예 1>에서 분석한 허섭틴에 대한 친화도를 이용하여 FcBP에서 이황화 결합의 IgG결합에 미치^ 영향을 분석하였다.
그 결과， FcBP-Red는 이황화 결합이 없음에도 불구하고 IgG에 대한 상당한 결합력이 있었다. FcBP-red 칼럼은 단백질 A 또는 FcBP 칼럼을 사용했을 때 나타나는 결과 보다 높은 pH에서 항체가 용출되기 시작하였고， 단백질 A 또는 단백질 G보다 더 순조롭게 IgG가 분리되었다 (도 lc). 한편， FcBP에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환되면 결합력이 감소하였으며 , 이에 시스테인 잔기는 FcBP가 IgG결합을 하는데 필수적인 것을 확인하였다 (도 Id).
<실험예 3 FcBP칼럼의 돼지 혈청 유래 IgG의 정제능 분석
미생물에 감염된 돼지가 생산한 항체는 해당 미생물에 의한 질병의 진단에 상업적으로 널리 사용될 수 있기 때문에 (J. Yang, M. Jin, J. Chen, Y. Yang, P. Zheng , A. Zhang , Y. Song, H. Zhou, H. Chen, J. Vet . Diagn. Invest . 19 (2007) 355), 돼지 혈청으로부터 분리된 IgG을 사용하여 정제 수준을 분석하였다. 돼지의 혈청으로부터 얻은 IgG 정제하기 위하여 돼지 혈청을 6배의 100 mM 인산염 완충용액 (pH 8.0)에 희석하였고， 상기 완충용액이 평형이 되게 칼럼에 직접 주입하였다. 주입하는 양은 2 ~ 5 mL 사이로 다양하게 하였고， 전체 혈청 단백질 양의 10 ~ 50 mg을 포함하였다. 친화성 칼럼에 내린 다음에 pH 구배 완충용액으로 용출.정제하였다. 정제된 IgG는 웨스턴 블랏으로 확인하였다. FcBP 칼럼의 안정성올 측정하기 위해, 전체 혈청 단백질의 40 mg을 포함하는 100개의 샘플 (sample)을 순차적으로 정제하였다. IgG의 순도를 확인하기 위하여， SDS— PAGE를 수행하였고 상기의 결과를 멀티 게이지 (Multi Guage, LAS-3000 소프트웨어 푸지 필름)로.평가하였다.
그 결과， FcBP 칼럼 및 단백질 G 칼럼의 용출 크로마토그램 (elution chromatograms)은 인간 IgG를 정제할 때와 유사하였고， FcBP 및 단백질 A 칼럼의 용출 크로마토그램도 유사한 모양을 나타내었다 (도 2).
돼지 IgG 항체를 상기 3가지 칼럼으로 정제하였고 SDS-PAGE 분석 및 브레드포드 분석으로 정량화한 결과 순도 및 회수율이 모두 매우 유사하였다. SDS-PAGE 분석의 도면을 확인한 결과 정제된 IgG는 친화성 칼럼의 종류에 상관없이 95% 이상의 순도로 정제되었다. FcBP 칼럼으로 정제한 것은 돼지 IgG 항체를 사용하여 웨스턴 블랏으로 시각화하였다 (도 3).
또한, FcBP 칼럼으로부터 돼지 IgG의 회수량을 측정하였다. 총 혈청 단백질의 10 내지 50 mg은 FcBP 칼럼에 적재할 때 용출 크로마토그램 (chromatogram)과 유사하였다 (도 4). 그러나 적재한 단백질의 총량이 늘어날수록 IgG 회수율은 감소하였으나 (표 3), 칼럼에서 항체의 용출시간은 그대로 유지되었다 (도 4). 1차 정제에서 결합하지 않고 홀러나온 샘플은 다시 동일 칼럼에 적용하여 추가로 IgG를 다시 정제할 수 있었다.
FcBP 흡착 칼럼의 재사용에 따른 IgG의 회수량을 확인함으로써 흡착칼럼의 내구성을 실험하였다. FcBP 친화성 칼럼을 5， 10， 15， 20， 25 및 30회를 반복하여 항체정제에 사용한 후 그 결과를 분석하였다. 그 결과， FcBP 칼럼에 돼지 혈청 샘폴을 사용하여 30번을 사용하는 동안에도 전체 분리 능력이 유지되는 것으로 나타났다 (도 5). 상기 실험을 그 이후 100회 이상 반복되었으며， 비슷한 효과를 관찰하였다.
【표 7】
적재한 단백질 총량에 따른 FcBP흡착 칼럼의 회수율
Figure imgf000044_0001
<실험예 4> FcBP의 돼지 IgG에 대한 결합 친화성 분석
FcBP와 돼지 IgG의 결합 친화성을 확인하기 위하여, 표면 플라즈마 공명 (Surface Plasma Resonance, SPR) 분석으로 돼지의 IgG에서 FcBP 결합 해리 상수를 측정하였다.
SPR 칩 표면에 돼지 IgG를 코팅한 후， 50， 100， 200 및 400 nM의 다양한 농도의 FcBP 용액을 처리하여 해리 상수 (dissociation constant)를 측정하였다. 돼지의 IgG는 비아코어 (Biacore AB, Uppsala, Sweden)에서 공급하고 있는 덱스트란 기질 (dextran matrix)이 결합되어있는 CM5 센서 칩 (sensor chip, CM-5 Au) 상에서 진행되었으며， 제조자의 프로토콜에 따라 실험을 진행하였고 SPR 분석은 비아코어 X(Biacore X)를 사용하여 진행하였다. 카르복시메틸화 텍스트란 표면에 200 mM 1ᅳ에틸ᅳ3ᅳ 3ᅳ디메틸아미노 프로필카르보디이미드 ( 1-ethy 1 -3-3-d i methyl아미노 propyl carbodi imide, EDC)(Sigma-Aldrich, USA) 및 50 mM NHS의 흔합수용액을 7 / /min의 유속으로 7분 동안 주입하였다. FcBP-아세테이트완충액 (FcBP 25 igl 아세테이트 완충액 1 ml (pH 4.5, 10 mM))을 상기 활성화된 SPR칩에 주입한 후， 1 M 에탈올아민 염산염 (ethanolai ne hydrochloride, pH 8.5) 수용액으로 7분 동안 처리하여 잔존하는 NHS 에스테르를 불활성화 시킴으로써 FcBP 칩을 제작하였다. 돼지에서 유래한 IgG를 50， 100, 200, 400 및 800 nM의 농도로 25 °C에서 30 /min의 유속으로 칩 표면에 주입하였: , 각각의 분석 사이클 마지막에서 칩의 표면을 20 mM NaOH로 1분간 세척함으로써 칩표면을 재생시켰다. 상기의 보정 (background) 자료를 뺀 후에， 결합 상수는 칩 제조자로부터 제공된 비아이밸류에이션 (BIAevaluation) 소프트웨어를 사용하여 랭뮤어 (Langmuir)(l:l) 모델에서 측정한 결과 해리 상수 (Kd)가 79 ±2 nM임을 밝혀내었다. 홍미롭게도 결과의 해리 상수의 값은 토끼의 IgG(Kd = 305 nM)보다 인간 IgG Kd = 85 nM)의 FcBP결합과 더 유사하였다 (도 6).
<실험예 5> FcBP흡착칼럼을 이용한 간편한 항체정제 방법
상기 방법으로 제조된 FcBP 흡착 레진을 내경 1 cm 및 길이 10 mL 칼럼에 충진하여 흡착칼럼을 제작하였다.
흡착칼럼을 0.1 M, pH 8.0 인산완충액 (50 mL)으로 씻어 주었고 인산완층액으로 희석한 항체용액 (또는 혈청)을 0.5 ml/min의 속도로 칼럼에 흘려주어 항체를 흡착시켰다 (상기 조건에서 항체배양액의 경우 최대 44 mg의 항체가 1 ml의 레진에 흡착된다. ) . 샘플의 적용이 끝난 후， pH 6.0 MES 완충액 (100 ml)으로 칼럼을 씻어주었다. 그런 다음 pH 3.0구연산 완충액이나， pH 2.5 글리신 완충액으로 항체를 용출하였다. 이때 용출되는 항체 분액은 바로 pH 8.0 1. 0 M Tris 완충액으로 중화하여 변성을 방지하였다. 정제된 항체분액은 SDS PAGE방법과 Bradford 시험법으로 확인 정량한 후， 그 자체로 혹은 적절한 완충액으로 투석한 후 동결건조하여 보관 하였다. 상기 사용된 완충액은 필요에 따라 유사한 pH를 가진 다른 완충액으로 변경하여도 동일한 정제효과를 얻을 수 있었다

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
항체의 Fc 부위와 결합하는 펩타이드 (Fc binding peptide, FcBP) 유도체가 고정된 레진이 장착된 항체 정제용 흡착 칼럼.
【청구항 2】
계 1항에 있어서， 상기 FcBP 유도체는 면역글로불린 G(I隱 unoglobulin G, IgG)의 Fc 부위 (domain)에 결합하고， 7 내지 17개의 아미노산으로 구성된 올리고펩타이드인 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
【청구항 3】
제 2항에 있어서， 상기 FcBP 유도체는 하기 1) 또는 2)의 아미노산 서열로 구성된 을리고펩타이드인 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼: 1) 서열번호 1 내지 13중 어느 하나의 아미노산 서열; 및
2) 서열번호 1 내지 13중 어느 하나의 아미노산 서열에서 한 개 또는 두 개의 아미노산이 첨가, 결실 또는 치환된 아미노산서열.
【청구항 4】
제 3항에 있어서， 상기 FcBP 유도체는 서열번호 1 내지 13의 아미노산 서열에서 두 개의 시스테인이 세린으로 처환된 아미노산 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
【청구항 5】
제 1항에 있어서， 상기 FcBP 유도체는 펩타이드 Nᅳ말단 또는 C-말단에 링커 (linker)7} 결합된 흔성체인 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼 . 2014/010813
46
【청구항 6] 제 5항에 있어서, 상기 링커 (linker)는 하기 1) 내지 3)으로,구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼： 1) NH2(CH2CH20)nCH2CH2C(0)-, 여기서 n은 1 ~ 30임 ;
2) -NH(CH2CH20)n(CH2)aNH2, 여기서 n은 1 ~ 50이고， a는 2 10임; 및
3) -NH(CH2CH20)ra(C¾) (CH2C¾())n(C¾)hN¾, 여기서 m 및 n은 각각 1 ~ 30이고， a와 b는 각각 2 ~ 10이며， Y는 링커이고, 알킬， 산소 (-0-), 아민 (-NH— ), 유레아 (-NHC0NH -)， 아미드 -C0NH-, 에스테르 (-CO)-) 및 아릴로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나임 .
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 링커 (linker)는 말단의 아민 (N¾)기가 말레이미드 (maleimide), 아지드 (azide) 및 알¾( 1¾0 )으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 기능단으로 치환된 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼 .
【청구항 8】
제 5항에 있어서， 상기 FcBP 유도체는 하기 구조들로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼： '¾N¾3¾30¾3¾30¾3¾DHN03HN¾3¾30¾3¾30¾3¾3HN-13M 301HAV3-3nS ( QZ ¾ <.¾N¾0¾30¾3¾30¾3¾3HN00HN¾0¾30¾3¾30¾3¾3HN-I0Mia01HdV3-3nS
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【청구항 9]
제 1 항에 있어서， 상기 레진은 아가로스, 세파로스， 셀를로스， 텍스트란， 폴리아크릴 레이트 및 폴리스틸렌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 정제용 흡착 칼럼.
【청구항 10]
1) 제 1항의 흡착 칼럼에 항체를 포함하는 시료를 처리하여 상기 흡착 칼럼에 항체를 결합시키는 단계;
2) 세척하여 결합된 항체만 남기는 단계; 및
3) 세척된 흡착 칼럼으로부터 부착된 항체를 분리 용출시켜 항체를 회수하는 단계를 포함하는 항체의 정제 방법 .
【청구항 111
제 10항에 있어서, 상기 단계 1)의 항체의 결합은 pH 6.5 내지 pH
8.0에서 수행하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
【청구항 12]
제 10항에 있어서， 상기 단계 2)의 세척하여 결합된 항체만 남긴 단백질의 세척은 pH 5.5 내지 pH 6.5의 완충용액을 사용하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법 .
【청구항 13】
제 10항에 있어서， 상기 단계 3)의 항체의 용출은 pH 구배 완충용액 또는 일정 pH 완충액을 이용하는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법 . 【청구항 14]
제 10항에 있어서, 상기 단계 3)의 항체의 용출은 pH 2.5 내지.0에서 용출되는 것을 특징으로 하는 항체의 정제 방법.
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