ES2305258T3 - Glicopeptidos, su preparacion y su uso en el diagnostico o tratamiento terapeutico de esclerosis multiple. - Google Patents
Glicopeptidos, su preparacion y su uso en el diagnostico o tratamiento terapeutico de esclerosis multiple. Download PDFInfo
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Abstract
Glicoproteínas constituidas por 11 a 24 aminoácidos que contienen un tetrapéptido de fórmula (I): X-Asn(G)-Y-Z (I) en la que X = aminoácido que porta un grupo amino o carboxílico en la cadena lateral; Y = Pro, Gly; G = azúcar Z = Ala, Val, Ile, His.
Description
Glicopéptidos, su preparación y su uso en el
diagnóstico o tratamiento terapéutico de esclerosis múltiple.
\global\parskip0.930000\baselineskip
La presente invención se refiere a glicopéptidos
formados por 11 a 24 aminoácidos capaces de identificar anticuerpos
de esclerosis múltiple y por tanto útiles como herramientas de
diagnóstico o para el tratamiento de dicha patología.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad
desmielinizante inflamatoria del sistema nervioso central, de gran
poder invalidante y por tanto de gran impacto social. Provoca la
degradación de la materia blanca del sistema nervioso central
(mielina) que conlleva serios daños en la transmisión de señales
nerviosas.
La etiopatogénesis de la enfermedad aún no ha
sido definida claramente, pero se ha planteado la hipótesis de que
un procedimiento autoinmune dirigido contra las principales
proteínas de la mielina es un importante mecanismo patogénico de la
enfermedad. Lo más probablemente el daño en la mielina es debido a
la acción sinérgica de la respuesta de células T y la respuesta del
anticuerpo contra proteínas y glicoproteínas de la mielina. De
forma particular los anticuerpos pueden jugar un papel clave en la
activación de macrófagos, en la desmielinización y en el bloqueo de
la conducción nerviosa.
En un estudio previo [A. M. Papini y col.,
Proceedings of the 10th International Congress of Immnulogy,
Monduzzi Editore, International Proceeding Division Bologna, Italia
(1998), páginas 1239 a 1244] se ha demostrado la posibilidad de
identificar anticuerpos específicos de EM mediante un péptido
glicosilado constituido por una secuencia de 21 aminoácidos de la
glicoproteína oligodendrocita de la mielina (MOG) (de posiciones 30
a 50), e indicada con la fórmula
Asn^{31}(Glc)hMOG(30-50).
Es evidente el interés en el desarrollo de
nuevos péptidos glicosilados capaces de llevar a cabo la función de
identificar dichos anticuerpos con mayor eficiencia y por tanto
útiles tanto para el diagnóstico como para el tratamiento de
esclerosis múltiple.
La presente invención se refiere a glicopéptidos
de 11 a 24 aminoácidos que contienen un tetrapéptido de fórmula
(I):
(I)X-Asn(G)-Y-Z
en la
que
- X
- = aminoácido que porta un grupo amino o carboxílico en la cadena lateral;
- Y
- = Pro, Gly;
- G
- es un azúcar
- Z
- = Ala, Val, Ile, His
Se ha encontrado ahora de forma sorprendente, y
es objeto de la presente invención, que glicopéptidos cortos,
constituidos por 11 a 24 aminoácidos, que contienen el tetrapéptido
anteriormente definido juega un papel muy eficiente en el
reconocimiento de los anticuerpos típicos de EM y por tanto son
útiles en su diagnóstico o su tratamiento terapéutico. De acuerdo
con la presente invención se prefieren glicopéptidos de fórmula
(II):
(II)A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D
en la
que:
Y y G son como se definieron
anteriormente;
- A
- = 2 a 5 aminoácidos o su ausencia;
B y C = aminoácidos trifuncionales
que forman un puente de lactama uno y otro por medio de las
respectivas cadenas laterales, o ausencia de
ambos;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- D
- = 5 a 15 aminoácidos;
- X
- = Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
- Z
- = Ala, Val, Ile, His.
Con aminoácidos trifuncionales que forman un
puente de lactama entre uno y otro como se definió anteriormente,
se entiende, por ejemplo, el par Dap-Asp o
Asp-Dap, Dab-Glu o
Glu-Dab, Orn-Asp o
Asp-Orn, y el par formado por otros aminoácidos,
por ejemplo, aminoácidos no naturales, que tengan características
análogas.
Con azúcar se entiende preferiblemente: mono- y
disacáridos del tipo Glc, GlcNAc,
\beta-D-Glcp(1\rightarrow4)-D-Glc
(celobiosa) etc.
Con aminoácidos, cuando no se defina otra cosa,
se entiende aminoácidos naturales o no naturales.
Obviamente residuos A, si está presente, y D
pueden contener un espaciador de alquilo apropiado para prolongar
la cadena, donde con espaciador de alquilo, en el sentido usado en
esta invención, se entiende w-aminoácidos con
cadenas de alquilo lineales
(H_{2}N-(CH_{2})_{n}-CO_{2}H donde n
es 2 a 6.
La presencia del tetrapéptido de fórmula (I)
como se definió anteriormente, puede inducir un plegamiento en la
conformación del péptido que, por esta razón, puede asumir una forma
"tipo gancho" (cuando está presente el tetrapéptido en la
parte terminal del péptido) o una forma "tipo horquilla"
(cuando está presente el tetrapéptido en la parte central del
péptido). Estas conformaciones permiten una unión óptima de los
anticuerpos del paciente; este hecho es esencial para las
propiedades inesperadas de los péptidos de acuerdo con la
invención.
Son particularmente preferidos, de acuerdo con
la invención, los péptidos representados por las siguientes
secuencias:
Los péptidos como se definieron anteriormente
pueden contener también un grupo
-HN-(CH_{2})_{n}-CO_{2}H en el término
C (donde n = 2 a 6) de modo que permita la unión a una resina según
se requiera para su uso práctico en diagnóstico o en tratamientos
terapéuticos.
Los péptidos de acuerdo con la invención se
pueden preparar de acuerdo con procedimientos conocidos para
síntesis en fase sólida o líquida.
El procedimiento en fase sólida es
particularmente útil, bien conocido por los expertos en la técnica,
cuya base es que el residuo del terminal C está unido de forma
covalente a un soporte sólido apropiado, por ejemplo, poliestireno
(resina de Wang), poliestireno-polioxietileno
(resina TentaGel o PEG-PS) o copolímeros de
polietilenglicol y poliacrilamida (resina PEGA), y se añaden de
forma secuencial los aminoácidos sucesivos, mediante acilación del
grupo amino del residuo unido a la resina, por ejemplo, por medio
del anhídrido simétrico del siguiente aminoácido, protegido de
forma apropiada, cuando sea necesario, en la cadena lateral. Tras
completarse la síntesis se obtiene el péptido bruto mediante
tratamiento de la resina con un ácido apropiado, por ejemplo, ácido
fluorhídrico o ácido trifluoroacético, y se separa por precipitación
en etiléter y liofilización sucesiva. El péptido se purifica
finalmente usando técnicas cromatográficas tales como, por ejemplo,
HPLC preparativa. Es también posible mantener el péptido sintético
unido al soporte sólido (por ejemplo, resina TentaGel de
poliestireno-polioxietileno o
PEG-PS), que lleva a cabo la desprotección selectiva
de las cadenas laterales con un reactivo apropiado.
De forma alternativa, también de acuerdo con las
técnicas conocidas, se consigue la unión del péptido al soporte
apropiado de modo que formen los conjugados correspondientes, útiles
en diagnósticos o en terapia. Los soportes preferidos para este fin
incluyen resinas, insolubles en agua, y completamente compatibles
con líquidos orgánicos, tales como: gel de sílice, celulosa,
poliacrilato, sefarosa y análogos, así como también las mismas
resinas usadas normalmente por expertos en el campo de la
preparación de péptidos sintéticos como, por ejemplo, resina de
Wang, poliestireno-polioxietileno (resina TentaGel o
PEG-PS) o copolímeros de polietilenglicol y
poliacrilamida (completamente compatibles con agua) tales como
resina PEGA y resinas análogas más estables tales como POEPS
(polioxietileno-poliestireno), POEPOP
(polioxietileno-polioxipropileno), así como también
resinas macroporosas descritas por su interés para la glicosilación
de fase sólida de péptidos, tales como SPOCC (PEG sustituido con
oxetano) Rademann, J; Grøtli, M; Meldal, M.; y Bock, K. J. Am. Chem.
Soc. 1999, 121, 5459 a 5466o derivados de los mismos como
EXPO_{3000} (copolímero con
tetraquis-(3-metil-oxetano-3-ilmetil)-fenil]-silano)
[Tornøe, C.W.; y Meldal M. en: Peptides 2000, J. Martinez y J.A.
Fehrentz (Eds.) EDK, París, Francia 2001].
Se proporcionan a continuación ejemplos que
describen la preparación de algunos péptidos de acuerdo con la
invención a título ilustrativo no limitativo.
Ejemplo
1
Se hizo que se hinchase la resina
Fmoc-Lys(Boc)-NovaSyn (0,5 g,
0,11 mmol/g) en DMF durante 1 hora a temperatura ambiente y se
empaquetó en la columna de vidrio (150 x 15 mm) de un sintetizador
de flujo continuo, semiautomatizado. Después de la desprotección
del grupo amino presente en la resina con una solución de piperidina
al 20% en DMF, para la inserción de cada aminoácido se cargó la
columna con una solución que contiene
F-moc-aminoácido (2,5 eq., 0,137
mmol) disuelto en DMF (1,3 ml) y como reactivo de activación HOBt
(2,5 eq, 0,137 mmol), TBTU (2,5 eq, 0,137 mmol) y NMM (3,75 eq,
0,205 mmol).
Se usaron los siguientes aminoácidos en
orden:
1)
Fmoc-Val-OH
2)
Fmoc-Met-OH
3)
Fmoc-Trp(Boc)-OH
4)
Fmoc-Gly-OH
5)
Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6)
Fmoc-Pro-OH
7)
Fmoc-Ala-OH
8)
Fmoc-Leu-OH
9)
Fmoc-Phe-OH
10)
Fmoc-Val-OH
11)
Fmoc-Ser(tBu)-OH
12)
Fmoc-His(Trt)-OH
13)
Fmoc-Gly-OH
14)
Fmoc-Asn(Glc)-OH
(N^{\alpha}-Fmoc-N^{\gamma}-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-\beta-D-blucopiranosil)-L-Asn-OPfp)
15)
Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16)
Fmoc-Glu(OtBu)-OH
17)
Fmoc-Val-OH
18)
Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19)
Fmoc-Pro-OH
20)
Fmoc-Thr(tBu)-OH
Tras completarse la síntesis se desprotegió la
resina con piperidina al 20% en DMF, se filtró, se lavó con DMF,
DCM y éter, y finalmente se secó a vacío. Se obtuvo el péptido bruto
mediante tratamiento de la resina con una mezcla de
TFA/fenol/anisol/etanoditiol (94:2:2:2) (10 ml), se mantuvo con
agitación durante 30 minutos a 0ºC y a temperatura ambiente durante
1,5 horas. Se filtró la resina y se lavó con TFA y se concentró el
filtrado hasta la mitad del volumen a vacío. Se precipitó el péptido
mediante tratamiento con éter frío. Se liofilizó el precipitado
obtenido recuperando 112 mg de péptido bruto.
Se logró la desacetilación mediante adición gota
a gota de una solución de NaOMe 0,1 M en MeOH, alcanzando un pH =
12, a una solución del péptido en MeOH anhidro (15 ml) mantenida con
agitación en una atmósfera de nitrógeno. Se preparó la solución de
NaOMe añadiendo sodio metálico (270 mg en ligroína (éter de
petróleo), 117 mmol) a MeOH destilado (11 ml) en una atmósfera de
nitrógeno. Después de 1 hora se añadió hielo seco a la mezcla hasta
que se neutralizó. Se concentró la solución dando el péptido bruto,
que se purificó mediante HPLC semi-preparativa
(pureza por HPLC mayor de 97%).
Caracterización: ESI-EM:
encontrado: [M+3H]3 + m/z = 969,9, [M+2H]2 + m/z =
1304,2; calculado: PM monoisotópico = 2605,38.
Se prepararon los otros péptidos lineales
siguiendo el mismo procedimiento, pero usando los aminoácidos
necesarios en las secuencias apropiadas.
Ejemplo
2
Se trató resina TentaGel
SPHB-Lys(Boc)-Fmoc (1,00 g,
0,22 mmol/g) como se describió en el ejemplo 1. Para cada
acoplamiento se usaron 4 eq de Fmoc-aminoácidos
(0,88 mmol) disueltos en DMF (1,3 ml), y como reactivos de
activación se usaron HOBt (4 eq, 0,88 mmol) y TBTU (4 eq., 0,88
mmol) y NMM (6 eq, 1,68 mmol).
Se usaron los siguientes aminoácidos en el
siguiente orden:
1)
Fmoc-Val-OH
2)
Fmoc-Met-OH
3)
Fmoc-Trp(Boc)-OH
4)
Fmoc-Gly-OH
5)
Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6)
Fmoc-Pro-OH
7)
Fmoc-Ala-OH
8)
Fmoc-Leu-OH
9)
Fmoc-Phe-OH
10)
Fmoc-Val-OH
11)
Fmoc-Asp(OAII)-OH
12)
Fmoc-His(Trt)-OH
13)
Fmoc-Gly-OH
14)
Fmoc-Asn(Glc)-OPfp)
15)
Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16)
Fmoc-Dap(Alloc)-OH
17)
Fmoc-Val-OH
18)
Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19)
Fmoc-Pro-OH
20)
Fmoc-Thr(tBu)-OH
Tras completarse la síntesis se eliminaron de
forma selectiva los grupos protectores alílicos de las cadenas
laterales Dap y Asp mediante tratamiento con una solución de
Pd(PPh3)4 (3 eq) en 7,5 ml de CHCl3/AcOH/NMM 37:2:1
en atmósfera de argon. Se agitó la mezcla de reacción usando un
brazo mecánico durante 3 horas a temperatura ambiente. Se filtró
luego la resina y se lavó tres veces con una solución de DIPEA al
0,5% en DMF, tres veces con una solución de dietilcarbamato de
sodio al 0,05%, tres veces con DMF y tres veces con DCM.
Para la reacción de ciclación subsiguiente se
hizo que se hinchase la resina en un matraz en DMF durante 1 hora.
Se añadió luego NMM (4 eq.) y después de 10 minutos ByBOP (4 eq.).
Se agitó la mezcla de reacción usando un brazo mecánico durante
tres días a temperatura ambiente. Se filtró la resina y se lavó
varias veces con DMF, DCM y Et2O y finalmente se secó a vacío.
Después de esto se desprotegió la resina de Fmoc
mediante piperidina al 20% en DMF, seguido de desprendimiento del
péptido y su aislamiento exactamente como se describió en el ejemplo
1.
Ejemplo
3
Se hizo que se hinchase la resina base
PEG-PS, en forma amino (1 g, 0,09 eq), en DMF
durante 1 hora a temperatura ambiente y se empaquetó en la columna
de vidrio (150 x 15 mm) de un sintetizador de flujo continuo
semiautomático. Para el acoplamiento del primer aminoácido se cargó
la columna con una solución que contiene
Fmoc-\betaAla-OH (4 eq., 0,36
mmol) disuelto en DMF (1,5 ml) y como reactivos de activación HOBt
(4 eq., 0,36 mmol), TBTU (4 eq., 0,36 mmol) y NMM (6 eq, 0,54
mmol). Se llevó a cabo la reacción durante hora y luego, tras los
lavados apropiados, siguió la desprotección de los grupos amino,
mediante tratamiento con piperidina al 20% en DMF. Se repitió el
ciclo de acoplamiento para \betaAla unas dos veces más, y luego se
continuó del mismo modo para el acoplamiento de un residuo de
Fmoc-Lys(Boc)-OH. Luego se
continuó la construcción de toda la secuencia de péptido,
exactamente como se indicó en el ejemplo 1. Tras el tratamiento
final con piperidina, se desprotegió la
resina-péptido mediante tratamiento con una mezcla
de TFA/fenol/anisol/etanoditiol (94:2:2:2) (10 ml), con agitación
durante 30 minutos a 0ºC y a temperatura ambiente durante 1,5 horas,
se lavó escrupulosamente y se secó a presión reducida.
Ejemplo
4
Se conjugó un péptido libre, lineal o cíclico,
preparado como se describió en los ejemplos 1 y 2, respectivamente
con resina sefarosa activada previamente con CNBr, de acuerdo con
los protocolos de reacción habituales recomendados por los
fabricantes con el fin de obtener un conjugado
resina-péptido. El producto así obtenido es útil,
por ejemplo, para la preparación de placas para el diagnóstico o
tratamiento de pacientes afectados por EM [véase también lo
siguiente].
La presente invención se refiere por tanto a un
kit que comprende los glicopéptidos de acuerdo con la invención y
son útiles para fines de diagnóstico.
De acuerdo con una realización preferida de la
invención un kit como el citado anteriormente comprende:
- -
- una microplaca
- -
- una solución tampón para adhesión del péptido a la placa;
- -
- un péptido modificado de acuerdo con la invención (liofilizado);
- -
- tampón FCS (FCS al 10%, 9 g/l de NaCl, Tween 20 al 0,05%);
- -
- solución de lavado concentrada (concentrada 20 veces);
- -
- suero de control positivo;
- -
- suero de control negativo;
- -
- un anticuerpo que reacciona con el anticuerpo de esclerosis múltiple [conjugado - (conjugado AP con anti-lgm)];
- -
- un sustrato (sal disódica de p-nitrofenilfosfato);
- -
- un tampón sustrato (tampón de dietanolamina 1 M, pH 9,8);
- -
- una solución de parada (sodio hidratado 1 M).
Si se prefiere la solución tampón para adhesión
del péptido a la placa y el péptido modificado de acuerdo con la
invención se pueden incorporar directamente en la microplaca.
Para uso en diagnóstico los glicopéptidos de la
invención se diluyeron y absorbieron en plástico de unión en los
pocillos de placas de microtítulos (sistemas ELISA). Se añadió luego
suero o plasma del paciente en una serie de diferentes
concentraciones (series de dilución). El autoanticuerpo específico
de nuestros productos se unió al péptido al péptido absorbido sobre
el plástico. De acuerdo con la técnica conocida por expertos en la
técnica, ELISA (ensayo inmunosorbente unido a enzimas), las
moléculas de autoanticuerpo unidas al glicopéptido se evidencian
luego mediante la unión de anticuerpos secundarios apropiados,
añadidos a las placas ELISA, que reconocen el fragmento constante
de inmunoglobulina. Estos anticuerpos secundarios, conjugados con
enzimas apropiados, se pueden visualizar mediante una reacción
colorimétrica: la absorbancia desarrollada es proporcional a la
cantidad de autoanticuerpo unido de forma específica. De forma
cuantitativa se expresa el resultado como el título de anticuerpos,
definido como el recíproco del factor de dilución en el que no se
observa reacción adicional.
El título de anticuerpos, como se definió
anteriormente, se midió en diferentes pacientes afectados por
esclerosis múltiple; las glicoproteínas de acuerdo con la invención
han mostrado mayores títulos de anticuerpos en comparación con los
medidos con glicopéptidos conocidos.
Los péptidos de acuerdo con la invención, en
forma libre o unida a resinas apropiadas, se pueden usar para el
tratamiento de pacientes afectados por esclerosis múltiple ya que
gracias a su elevada especificidad de reconocimiento de anticuerpo,
se pueden usar para neutralizar y/o eliminar de forma selectiva los
autoanticuerpos.
\global\parskip0.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Università degli Studi di
Firenze
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Glicopéptidos, su preparación y uso
en el diagnóstico o tratamiento terapéutico de esclerosis
múltiple
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<170> PatentIn versión 3.1
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<210> 1
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> glicopéptido
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<220>
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<221> HID DE CARBONO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) .. (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 21
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> GLICOPÉPTIDO
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<220>
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<221> HID DE CARBONO
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<222> (7) .. (7)
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<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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<222> (5) .. (5)
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<223> Xaa es un ácido
diaminopropanoico
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<400> 2
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<210> 3
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Glicopéptido
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<220>
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<221> HID DE CARBONO
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<222> (7) .. (7)
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<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (10) .. (10)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es Orn
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<400> 3
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<210> 4
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Glicopéptido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> HID DE CARBONO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (6) .. (6)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 5
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<211> 17
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<213> Secuencia artificial
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<223> Glicopéptido
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<221> HID DE CARBONO
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<222> (2) .. (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 11
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Glicopéptido
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<220>
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<221> HID DE CARBONO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) .. (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Glicopéptido
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<220>
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<221> HID DE CARBONO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (7) .. (7)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11) .. (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es ácido
7-aminoheptanoico
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Glicopéptido
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> HID DE CARBONO
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2) .. (2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> el hidrato de carbono es
beta-D-glucopiranosilo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> MISC_FEATURE
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13) .. (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa es beta-Ala
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (20)
1. Glicoproteínas constituidas por 11 a 24
aminoácidos que contienen un tetrapéptido de fórmula (I):
(I)X-Asn(G)-Y-Z
en la
que
- X
- = aminoácido que porta un grupo amino o carboxílico en la cadena lateral;
- Y
- = Pro, Gly;
- G
- = azúcar
- Z
- = Ala, Val, Ile, His.
2. Los glicopéptidos de acuerdo con la
reivindicación 1, en los que los aminoácidos son los aminoácidos
naturales o no naturales.
3. Los glicopéptidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1 y 2, de fórmula (II):
(II)A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D
en la
que:
Y y G son como se definieron
anteriormente;
- A
- es un grupo de 2 a 5 aminoácidos o está ausente;
B y C son aminoácidos
trifuncionales que pueden formar un puente de lactama uno con otro
por medio de las cadenas laterales respectivas, o ausencia de
ambos;
- D
- representa un grupo de 5 a 15 aminoácidos;
- X
- es un aminoácido seleccionado del grupo comprendido por: Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
- Z
- es un aminoácido seleccionado del grupo comprendido por: Ala, Val, Ile, His.
4. Los glicopéptidos de acuerdo con la
reivindicación 3, en los que B y C representan los pares:
Dap-Asp o Asp-Dap,
Dab-Glu o Glu-Dab,
Orn-Asp o Asp-Orn y los pares
formados por otros aminoácidos que tienen características
análogas.
5. Los glicopéptidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 4, en los que el azúcar se selecciona del grupo
constituido por mono- y disacáridos tales como
\beta-D-glucopiranosilo (Glc),
2-acetilglucosamina (GlcNAc), celobiosa y
análogos.
6. Los glicopéptidos de acuerdo con la
reivindicación 5, en los que el azúcar es
\beta-D-glucopiranosilo
(Glc).
7. Los glicopéptidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 6, representados por las siguientes
fórmulas:
8. Los glicopéptidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 7, que contienen un espaciador de alquilo en
posiciones no terminales.
\global\parskip0.930000\baselineskip
9. Los glicopéptidos de acuerdo con al
reivindicación 8, en los que dicho espaciador de alquilo es un grupo
de fórmula -HN-(CH_{2})_{n}-CO_{2}- en
la que n está comprendido entre 2 y 6.
10. Los glicopéptidos de acuerdo con las
reivindicaciones 1 a 9, que contienen un grupo
-HN-(CH_{2})_{n}-CO_{2}H- en terminal
C adicional en el que n está comprendido entre 2 y 6.
11. Procedimiento para la preparación en fase
sólida de glicopéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10,
en el que:
- a)
- el residuo del terminal C está unido de forma covalente a un soporte sólido apropiado;
- b)
- los aminoácidos sucesivos se añaden secuencialmente, por medio de acilación del grupo amino del residuo unido a la resina;
- c)
- el péptido bruto se recupera mediante tratamiento de la resina con un ácido apropiado;
- d)
- el péptido se purifica recurriendo a técnicas cromatográficas;
- e)
- el péptido se une de forma eventual a un soporte sólido apropiado.
12. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que el soporte sólido de la fase (a) se
selecciona del grupo constituido por gel de sílice, celulosa,
poliacrilato, sefarosa y análogos, poliestireno (resina de Wang),
poliestireno-polioxietileno (resina TentaGel o
PEG-PS), copolímeros de polietilenglicol y
poliacrilamida (resina PEGA), POEPS
(polioxietileno-poliestireno), POEPOP
(polioxietileno-polioxipropileno), SPOCC (PEG
sustituido con oxetano) o derivados de los mismos.
13. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 12, en el que el soporte sólido de la fase (e), si
está presente, se selecciona del grupo constituido por gel de
sílice, celulosa, poliacrilato y sefarosa.
14. Conjugados constituidos por una resina,
insoluble en agua y completamente compatible con fluidos orgánicos,
y un glicopéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10.
15. Los conjugados de acuerdo con la
reivindicación 14, en los que la resina se selecciona del grupo
constituido por sefarosa, celulosa y gel de sílice.
16. Placas para diagnóstico que contienen los
glicopéptidos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10.
17. Procedimientos de diagnóstico en los que se
usan los glicopéptidos libres de acuerdo con las reivindicaciones 1
a 10.
18. Procedimientos de diagnóstico en los que se
usan los conjugados de acuerdo con las reivindicaciones 14 y
15.
19. Un kit para el diagnóstico de esclerosis
múltiple que comprende:
- -
- una microplaca
- -
- una solución tampón para adhesión del péptido a la placa;
- -
- un péptido modificado de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 10 (liofilizado);
- -
- tampón FCS (FCS al 10%, 9 g/l de NaCl, Tween 20 al 0,05%);
- -
- solución de lavado concentrada (concentrada 20 veces);
- -
- suero de control positivo;
- -
- suero de control negativo;
- -
- un anticuerpo que reacciona con el anticuerpo de esclerosis múltiple [conjugado - (conjugado AP con anti-lgm)];
- -
- un sustrato (sal disódica de p-nitrofenilfosfato);
- -
- un tampón sustrato (tampón de dietanolamina 1 M, pH 9,8);
- -
- una solución de parada (hidrato de sodio 1 M).
20. Un kit de acuerdo con la reivindicación 19
en el que dicha solución tampón para adhesión del péptido a la
placa y dicho péptido modificado se incorporan directamente a la
microplaca.
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