PL207174B1 - Glikopeptydy, sposób ich wytwarzania, koniugaty glikopeptydów, płytki do diagnozy, metody diagnostyczne i zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego - Google Patents

Glikopeptydy, sposób ich wytwarzania, koniugaty glikopeptydów, płytki do diagnozy, metody diagnostyczne i zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego

Info

Publication number
PL207174B1
PL207174B1 PL368158A PL36815802A PL207174B1 PL 207174 B1 PL207174 B1 PL 207174B1 PL 368158 A PL368158 A PL 368158A PL 36815802 A PL36815802 A PL 36815802A PL 207174 B1 PL207174 B1 PL 207174B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
val
pro
gly
asn
arg
Prior art date
Application number
PL368158A
Other languages
English (en)
Other versions
PL368158A1 (pl
Inventor
Anna Maria Papini
Mario Chelli
Paolo Rovero
Francesco Lolli
Original Assignee
Univ Firenze
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=11442221&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL207174(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Firenze filed Critical Univ Firenze
Publication of PL368158A1 publication Critical patent/PL368158A1/pl
Publication of PL207174B1 publication Critical patent/PL207174B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis wynalazku
Dziedzina wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku są glikopeptydy, tworzone z 11 - 24 aminokwasów, zdolne do rozpoznawania przeciwciał stwardnienia rozsianego, a więc przydatne jako narzędzia diagnostyczne lub do leczenia takiej patologii. Wynalazek obejmuje także sposób otrzymywania glikopeptydów, koniugaty glikopeptydów, płytki do diagnozy, metody diagnostyczne i zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego.
Stan techniki
Stwardnienie rozsiane (MS) jest zapalną demielinującą chorobą centralnego układu nerwowego powodującą liczne przypadki inwalidztwa, a więc mającą znaczne społeczne skutki. Powoduje degradację centralnego układu nerwowego istoty białej (mieliny), prowadząc do poważnego uszkodzenia przewodzenia sygnałów nerwowych.
Etiopatogeneza choroby nie została wyraźnie zdefiniowana, lecz sądzi się, że autoalergiczny proces skierowany przeciwko głównym białkom mieliny jest ważnym patogennym mechanizmem choroby. Uszkodzenie mieliny jest najprawdopodobniej spowodowane synergicznym działaniem reakcji komórek T i reakcji przeciwciała wobec białek i glikoprotein mieliny. W szczególności autoprzeciwciała mogą grać kluczową rolę w aktywacji makrofagów, w demielinizacji i w blokowaniu przewodzenia nerwowego.
W poprzednim studium [A.M. Papini i in., Proceedings of the 10th International Congress of Immunology, Monduzzi Editore, International Proceeding Division Bologna, Italy (1998), str. 1239-1244] wykazano możliwość identyfikacji specyficznych dla MS przeciwciał przez glikozylowany peptyd złożony z sekwencji 21 aminokwasów oligodendrocytycznej glikoproteiny mieliny (MOG) (z pozycji 30 do 50) i okreś lany wzorem Asn31(Glc)hMOG(30-50).
Zainteresowanie opracowaniem nowych glikozylowanych peptydów zdolnych do przenoszenia funkcji rozpoznawania tych przeciwciał z większą skutecznością, a więc przydatnych do diagnozy i do leczenia stwardnienia rozsianego jest oczywiste.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem niniejszego wynalazku są glikopeptydy mające 11-24 aminokwasy zawierające tetrapeptyd o wzorze (I):
X-Asn(G)-Y-Z (I) w którym:
X = aminokwas niosą cy grupę aminową lub karboksylową w ł a ń cuchu bocznym;
Y = Pro, Gly;
G oznacza cukier
Z = Ala, Val, Ile, His
Szczegółowy opis wynalazku
Niespodziewanie odkryto obecnie, i jest to przedmiotem niniejszego wynalazku, że krótkie glikopeptydy, złożone z 11 - 24 aminokwasów, zawierające powyżej zdefiniowany tetrapeptyd, grają bardzo skuteczną rolę w rozpoznawaniu przeciwciał typowych dla MS i są więc przydatne w jego diagnozowaniu lub leczeniu.
Według niniejszego wynalazku, korzystne są glikopeptydy o wzorze (II):
A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II) w którym:
Y i G są takie, jak zdefiniowano powyż ej;
A = 2 - 5 aminokwasów lub jest nieobecna;
B i C = trójfunkcyjne aminokwasy tworzące mostek laktamowy pomiędzy sobą za pomocą odpowiednich łańcuchów bocznych, lub nieobecne;
D = 5 - 15 aminokwasów;
X = Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
Z = Ala, Val, Ile, His.
Przez trójfunkcyjne aminokwasy tworzące mostek laktamowy pomiędzy sobą, jak zdefiniowano powyżej, rozumie się, np.: parę Dap-Asp lub Asp-Dap, Dab-Glu lub Glu-Dab, Orn-Asp lub Asp-Orn, i parę tworzoną przez inne aminokwasy, np. nienaturalne aminokwasy, mające analogiczne cechy.
Cukier korzystnie oznacza: mono i disacharydy typu Glc, GlcNAc. |i-D-Glcp-(1 >4)-D-GIc (celobiozę), itp.
PL 207 174 B1
Przez aminokwasy, gdy nie są inaczej zdefiniowane, rozumie się naturalne lub nienaturalne aminokwasy.
Oczywiście reszty A, jeśli są obecne, i D mogą zawierać odpowiednią alkilową grupę dystansującą przedłużającą łańcuch, gdzie alkilowa grupa dystansująca, w sensie użytym w wynalazku, oznacza ω-aminokwasy z liniowymi alkilowymi łańcuchami (H2N-(CH2)n-CO2H, gdzie n wynosi 2-6.
Obecność tetrapeptydu o wzorze (I) jak zdefiniowano powyżej, może indukować składanie się w konformacji peptydu, który może z tego powodu przyjąć postać haka (gdy tetrapeptyd jest obecny w terminalnej części peptydu) lub szpilki do włosów (gdy tetrapeptyd jest obecny w centralnej części peptydu). Te konformacje pozwalają na optymalne wiązanie autoprzeciwciał pacjentów; jest to fakt istotny dla niespodziewanych właściwości peptydów według wynalazku.
Szczególnie korzystne, według wynalazku, są peptydy reprezentowane następującymi sekwencjami:
1. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
2. H-Thr-Pro-Arg-Val-cykliczne[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
3. H-Thr-Pro-Arg-Val-cykliczne[Asp-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Orn]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
4. H-Ala-Lys-Thr-Ala-Lys-Asn(Glc)-Gly-His-Val-Glu-Ala-Ser-Gly-OH
5. H-Glu-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH
6. H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Glu-Ala-Phe-Lys-Gly-Ile-Ser-OH
7. H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-HN-(CH2)6-CO-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
8. H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-(eAla)3-OH
Peptydy jak zdefiniowano powyżej mogą również zawierać grupę -HN-(CH2)n-CO2H w końcu C (gdzie n = 2-6), aby pozwolić na przyłączenie do żywicy, jak to jest wymagane dla ich praktycznego zastosowanie w diagnostyce lub zabiegach leczniczych.
Peptydy według wynalazku można wytwarzać zgodnie ze znanymi sposobami syntezy w stałej lub ciekłej fazie.
Sposób w fazie stałej jest szczególnie przydatny, dobrze znany ekspertom w dziedzinie, oparty na tym, że C-terminalna reszta jest kowalencyjnie związana z odpowiednim stałym nośnikiem, np. polistyrenem (żywica Wanga), polistyrenem-polioksyetylenem (żywica TentaGel lub PEG-PS) lub poli-(glikolem etylenowym) i poliakryloamidowymi ko-polimerami (żywica PEGA), i kolejne aminokwasy dodaje się po kolei, przez acylowanie grupy aminowej reszty związanej z żywicą, np. przez symetryczny bezwodnik następnego aminokwasu, odpowiednio zabezpieczony, gdzie to konieczne, na łańcuchu bocznym. Po zakończeniu syntezy surowy peptyd otrzymuje się przez potraktowanie żywicy odpowiednim kwasem, np. kwasem fluorowodorowym lub trifluorooctowym, i oddziela przez strącenie w eterze etylowym i dalszą liofilizację. Peptyd na koniec oczyszcza się stosując techniki chromatograficzne, takie jak np. preparatywna HPLC. Jest również możliwe utrzymanie syntetycznego peptydu związanego ze stałym nośnikiem (np. żywicą polistyreno-polioksyetylenową TentaGel lub PEG-PS), prowadząc selektywne odbezpieczanie łańcuchów bocznych odpowiednim reagentem.
Alternatywnie, wciąż zgodnie ze znanymi technikami, uzyskuje się przyłączenie peptydu do odpowiedniego nośnika otrzymując odpowiednie koniugaty, przydatne w diagnostyce lub w terapii. Korzystne nośniki do tego celu obejmują żywice, nierozpuszczalne w wodzie i w pełni kompatybilne z organicznymi cieczami ustrojowymi, takimi jak krew lub surowica krwi. Jako nośnik korzystnie stosuje się żywice takie jak: żel krzemionkowy, celuloza, poliakrylan, Sepharose i analogi, jak też takie same żywice normalnie stosowane przez specjalistów w dziedzinie wytwarzania syntetycznych peptydów, jak np. żywica Wanga, polistyren-polioksyetylen (żywica TentaGel lub PEG-PS) lub kopolimery poli-(glikol etylenowy) i poliakryloamid (zupełnie zgodny z wodą) taki jak żywica PEGA i bardziej trwałe analogiczne żywice, takie jak POEPS (polioksyetylen-polistyren), POEPOP (polioksyetylenpolioksypropylen), jak też makroporowate żywice opisane ze względu na zainteresowanie glikozylowaniem w fazie stałej peptydów, takie jak SPOCC (PEG podstawiony oksetanem) [Rademann, J; Gr0tli, M; Meldal, M; i Bock, K. J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5459-5466] lub jego pochodne, jak EXPO3000 (kopolimer z tetrakis-[4-(3-metylo-oksetan-3-ylometylo)-fenylo]-silanem) [Torn0e, C.W.; i Meldal M. In: Peptides 2000, J. Martinez i J.A. Fehrentz (red.) EDK, Paris, Francja 2001].
PL 207 174 B1
Wynalazek obejmuje również płytki do diagnozy pacjentów dotkniętych MS, zawierające glikopeptydy według wynalazku oraz metody diagnostyczne, z wyłączeniem metod in vivo, w których stosuje się wolne glikopeptydy według wynalazku.
Niniejszy wynalazek dotyczy także zestawu zawierającego glikopeptydy według wynalazku przydatnego do celów diagnostycznych.
Zgodnie z korzystną odmianą wynalazku zestaw jak powyżej wspomniano obejmuje:
- mikropł ytkę
- roztwór buforowy do przywierania peptydu do płytki;
- zmodyfikowany peptyd wedł ug wynalazku (liofilizowany);
- bufor FCS (10% FCS, 9 g/l NaCl, Tween 20 0,05%);
- stężony roztwór przemywają cy (zatężony 20x);
- surowicę pozytywnej kontroli;
- surowicę negatywnej kontroli;
- przeciwciało reagujące z przeciwciałem stwardnienia rozsianego [koniugat-(AP sprzężone z anty-Igm)];
- substrat (p-nitrofenylofosforan, sól disodowa);
- bufor substratu (bufor 1M dietanolaminy, pH 9,8);
- roztwór zatrzymują cy (1M wodorek sodu).
Jeśli to właściwe, roztwór buforowy do przywierania peptydu do płytki i zmodyfikowany peptyd według wynalazku można włączać bezpośrednio w mikropłytkę.
Przykłady ujawniające wytwarzanie pewnych peptydów według wynalazku przedstawiono poniżej dla zilustrowania, a nie ograniczenia wynalazku.
P r z y k ł a d 1. Synteza liniowego peptydu
Wytwarzanie H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-VaI-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
Żywicę Fmoc-Lys(Boc)-NovaSyn (0,5 g, 0,11 mmol/g) spęczniano w DMF przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i upakowano w szklanej kolumnie (150 x 15 mm) półautomatycznego syntezatora z ciągłym przepływem. Po odbezpieczeniu grupy aminowej obecnej na żywicy roztworem 20% piperydyny w DMF, dla wstawienia każdego aminokwasu, kolumnę napełniano roztworem zawierającym Fmoc-aminokwas (2,5 równoważnika, 0,137 mmol) rozpuszczonego w DMF (1,3 ml), i jako aktywujący reagent HOBt (2,5 równoważnika, 0,137 mmol), TBTU (2,5 równoważnika, 0,137 mmol) i NMM (3,75 równoważnika, 0,205 mmol).
Następujących aminokwasów użyto w kolejności:
1) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
11) Fmoc-Ser(tBu)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OH (Wa-Fmoc-WY-(2,3,4,6-tetra-O-acetylo-e-D-glukopiranozylo)-L-Asn-OPfp)
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Glu(OtBu)-OH
17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OH
20) Fmoc-Thr(tBu)-OH
Po zakończeniu syntezy, żywicę odbezpieczono 20% piperydyny w DMF, przesączono, przemyto DMF, DCM i eterem, i na koniec osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy peptyd otrzymano przez traktowanie żywicy mieszaniną TFA/fenol/anizol/etanoditiol (94:2:2:2) (10 ml), trzymaną
PL 207 174 B1 z mieszaniem przez 30 minut w temperaturze 0°C i w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny. Żywicę przesączono i przemyto TFA i przesącz zatężono do połowy objętości pod zmniejszonym ciśnieniem. Peptyd strącono traktując zimnym eterem. Otrzymany osad liofilizowano odzyskując 112 mg surowego peptydu.
Deacetylowanie osiągnięto dodając kroplami 0,1 M roztwór NaOMe w MeOH, do uzyskania pH = 12, do roztworu peptydu w bezwodnym MeOH (15 ml) utrzymując mieszanie w atmosferze azotu. Roztwór NaOMe wytworzono dodając metaliczny sód (270 mg w ligroinie (eter naftowy), 117 mmol) do destylowanego MeOH (11 ml) w atmosferze azotu. Po 1 godzinie suchy lód dodano do mieszaniny do zobojętnienia. Roztwór zatężono otrzymując surowy peptyd, który oczyszczono metodą półpreparatywnej HPLC (czystość HPLC większa niż 97%).
Właściwości: ESI-MS: znalezione: [M+3H]3+ m/z = 869,9, [M+2H]2+ m/z = 1304,2; obliczone: PM monoizotopowa = 2605,38.
Inne liniowe peptydy wytworzono tym samym sposobem, lecz stosując niezbędne aminokwasy w odpowiednich sekwencjach.
P r z y k ł a d 2. Synteza cyklicznego peptydu.
Wytwarzanie H-Thr-Pro-Arg-Val-cykliczny[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-ProTyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
Żywicę TentaGel SPHB-Lys(Boc)-Fmoc (1,00 g, 0,22 mmol/g) potraktowano jak opisano w przykładzie 1. Dla każdego sprzęgania użyto 4 równoważniki Fmoc-aminokwas (0,88 mmol) rozpuszczonego w DMF (1,3 ml), i jak reagenty aktywujące HOBt (4 równoważniki, 0,88 mmol) i TBTU (4 równoważniki, 0,88 mmol) i NMM (6 równoważniki, 1,68 mmol).
Następujących aminokwasów użyto w następującym porządku:
1) Fmoc-Val-OH
2) Fmoc-Met-OH
3) Fmoc-Trp(Boc)-OH
4) Fmoc-Gly-OH
5) Fmoc-Tyr(tBu)-OH
6) Fmoc-Pro-OH
7) Fmoc-Ala-OH
8) Fmoc-Leu-OH
9) Fmoc-Phe-OH
10) Fmoc-Val-OH
11) Fmoc-Asp(OAll)-OH
12) Fmoc-His(Trt)-OH
13) Fmoc-Gly-OH
14) Fmoc-Asn(Glc)-OPfp
15) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
16) Fmoc-Dap(Alloc)-OH
17) Fmoc-Val-OH
18) Fmoc-Arg(Pmc)-OH
19) Fmoc-Pro-OH
20) Fmoc-Thr(tBu)-OH
Po zakończeniu syntezy, allilowe grupy zabezpieczające łańcuchów bocznych Dap i Asp selektywnie usunięto traktując roztworem Pd(PPh3)4 (3 równoważniki) w 7,5 ml CHCI3/AcOH/ NMM 37:2:1 w atmosferze argonu. Mieszaninę reakcyjną mieszano stosując mechaniczne ramię przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Żywicę następnie przesączono i przemyto trzy razy roztworem 0,5% DIPEA w DMF, trzy razy roztworem 0,05% dietylokarbaminianu sodu w DMF, trzy razy DMF i trzy razy DCM.
Do dalszej reakcji cyklizacji, żywicę spęczniano w kolbie w DMF przez 1 godzinę. Następnie dodano NMM (4 równoważniki) i po 10 minutach PyBOP (4 równoważniki). Mieszaninę reakcyjną mieszano, stosując ramię mechaniczne, przez trzy dni w temperaturze pokojowej. Żywicę przesączono i przemyto kilka razy DMF, DCM i Et2O i na koniec osuszono pod zmniejszonym ciś nieniem.
Następnie żywicę odbezpieczono od Fmoc 20% piperydyna w DMF, a następnie odłączono peptyd i wydzielono dokładnie jak opisano w przykładzie 1.
P r z y k ł a d 3. Synteza związanego z żywicą peptydu.
Wytwarzanie H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-(eAla)3-PEG-PS
PL 207 174 B1
Zasadową żywicę PEG-PS, w postaci aminy (1 g, 0,09 równoważnika) spęczniano w CdDM przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i upakowano w szklanej kolumnie (150 X 15 mm) półautomatycznego syntezatora z ciągłym przepływem. Dla sprzęgania pierwszego aminokwasu kolumnę napełniono roztworem zawierającym Fmoc-eAla-OH (4 równoważniki, 0,36 mmol) rozpuszczony w DMF (1,5 ml), i jako reagenty aktywujące HOBt (4 równoważniki, 0,36 mmol), TBTU (4 równoważniki, 0,36 mmol) i NMM (6 równoważników, 0,54 mmol). Reakcję prowadzono przez 1 godzinę i później, po odpowiednich przemywaniach, a następnie odbezpieczeniu grup aminowych, traktując 20% piperydyna w DMF. Cykl sprzęgania dla eAla przeprowadzono jeszcze dwukrotnie, a następnie kontynuowano w ten sam sposób dla sprzężenia reszty Fmoc-Lys(Boc)-OH. Później kontynuowano budowę całej sekwencji peptydu, dokładnie jak wskazano w przykładzie 1. Po końcowym traktowaniu piperydyna, żywicę-peptyd odbezpieczono traktując mieszaniną TFA/fenol/anizol/etanoditiol (94:2:2:2) (10 ml), z mieszaniem przez 30 minut w temperaturze 0°C i w temperaturze pokojowej przez 1,5 godziny, dokładnie przemyto i osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem.
P r z y k ł a d 4. Sprzęganie peptydu z żywicą.
Wolny peptyd, liniowy lub cykliczny, wytworzono jak opisano w przykładach 1 i 2, odpowiednio, sprzężono z żywicą Sepharose wcześniej aktywowaną CNBr, zgodnie ze zwykłymi protokołami reakcji zalecanym przez producentów dla wytworzenia koniugatu żywica-peptyd. Otrzymany produkt jest przydatny np. dla wytwarzania płytek do diagnozy lub terapii pacjentów dotkniętych MS.
Zastosowanie diagnostyczne
Do diagnostycznego zastosowania glikopeptydy według wynalazku rozcieńczano i absorbowano na wiążącym tworzywie w dołkach płytek do mikromiareczkowania (systemy ELISA). Surowicę lub osocze pacjenta dodano następnie w serii różnych stężeń (serii rozcieńczeń). Autoprzeciwciało specyficzne wobec naszych produktów związane z peptydem absorbowało na tworzywie. Zgodnie z teclmiką znaną specjalistom w dziedzinie, ELISA (testu związanego z enzymem immunosorbentu [Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay]), cząsteczki autoprzeciwciała związane z glikopeptydem następnie ujawniają się przez wiązanie odpowiednich drugorzędowych przeciwciał, dodanych do płytek ELISA, które rozpoznają stały fragment immunoglobuliny. Te drugorzędowe przeciwciała, sprzężone z odpowiednimi enzymami, można wizualizować w reakcji kolorymetrycznej: powstała absorbancja jest proporcjonalna do ilości specyficznie związanego autoprzeciwciała. Ilościowo, wynik wyraża się jako miano przeciwciała, zdefiniowane jako odwrotność współczynnika rozcieńczenia, przy którym nie następuje już reakcja.
Miano przeciwciała, jak zdefiniowano powyżej, mierzono u różnych pacjentów dotkniętych stwardnieniem rozsianym; glikoproteina według wynalazku wykazała wyższe miana przeciwciała w porównaniu z mierzonymi znanymi glikopeptydami.
Zastosowanie terapeutyczne
Peptydy według wynalazku, w postaci wolnej lub związanej z odpowiednimi żywicami, można stosować do leczenia pacjentów dotkniętych stwardnieniem rozsianym, ponieważ dzięki ich wysokiej specyficzności rozpoznawania przeciwciała, można je stosować do neutralizacji i/Iub selektywnego usuwania autoprzeciwciał.
PL 207 174 B1
LISTING SEKWENCJI <110> Universita elegii Studi di Firenze <120> Glikopeptydy, ich wytwarzanie i zastosowanie w diagnozie lub leczeniu stwardnienia rozsianego <130> 2784 PTWO <140> PCT/EP 02/06767 <141> 2002-06-19 <150> FI2001A000114 <151> 2001-06-22 <160> 8 <170> Patentln wersja 3.1 <210> 1 <211> 21 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> glikopeptyd <220>
<221> CARBOHYD <222> (7)..(7) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranozyl <400> 1
Thr Pro Arg Val Glu Arg Asn Gly His Ser Val Phe Leu Ala Pro Tyr 1 5 10 15
Gly Trp Met Val Lys 20 <210> 2 <211> 21 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> GLIKOPEPTYD <220>
<221> CARBOHYD <222> (7)..(7) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (5).. (5) <223> Xaa oznacza kwas diaminopropanowy
PL 207 174 B1 <400> 2
Thr Pro Arg Val Xaa Arg Asn Gly His Asp Val Phe Leu Ala Pro Tyr 15 10 15
Gly Trp Met Val Lys 20 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> glikopeptyd <220>
<221> CARBOHYD <222> (7)..(7) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (10).. (10) <223> Xaa oznacza Orn <400> 3
Thr Pro Arg Val Asp Arg Asn Gly His Xaa Val Phe Leu Ala Pro Tyr 15 10 15
Gly Trp Met Val Lys 20
<210> <211> <212> <213> 4 13 PRT Sztuczna sekwencja
<220> <223> glikopeptyd
<220> <221> <222> <223> CARBOHYD (6)..(6) węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl
<400> 4
Ala Lys Thr Ala Lys Asn Gly His Val Glu Ala Ser Gly 1 .5 10
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> Sztuczna sekwencja
PL 207 174 B1 <220>
<223> glikopeptyd <220>
<221> CARBOHYD <222> (2) . .(2) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl <400> 5
Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr 15 10 15
Pro <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> glikopeptyd <220>
<221> CARBOHYD <222> (2) .. (2) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl <400> 6
Asp Asn Pro Val Glu Ala Phe Lys Gly Ile Ser
10 <210> 7 <211> 22 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> glikopeptyd <220>
<221> CARBOHYD <222> (7)..(7) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> Xaa oznacza kwas 7-aminoheptanowy <400> 7
Thr Pro Arg Val Glu Arg Asn Gly His Ser Xaa Val Phe Leu Ala Pro 15 10 15
Tyr Gly Trp Met Val Lys 20
PL 207 174 B1 <210> 8 <211> 15 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>
<223> glikopeptyd <220>
<221> CARBOHYD <222> (2) . . (2) <223> węglowodanem jest beta-D-glukopiranosyl <220>
<221> MISC_FEATURE <222> (13)..(15) <223> Xaa oznacza beta-Ala <400> 8
Asp Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Xaa Xaa Xaa 15 10 15

Claims (19)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Glikopeptydy składające się z 11 - 24 aminokwasów zawierających tetrapeptyd o wzorze (I) X-Asn(G)-Y-Z (I) w którym:
    X = aminokwas niosą cy grupę aminową lub karboksylową na ł a ńcuchu bocznym;
    Y = Pro, Gly;
    G = cukier
    Z = Ala, Val, Ile, His
  2. 2. Glikopeptydy według zastrz. 1, znamienne tym, że mają wzór (II):
    A-B-X-Asn(G)-Y-Z-C-D (II) w którym:
    Y i G są takie, jak zdefiniowano powyż ej;
    A oznacza grupę mającą 2 - 5 aminokwasów lub nie występuje;
    B i C oznaczają trójfunkcyjne aminokwasy zdolne do tworzenia mostka laktamowego pomiędzy sobą za pomocą odpowiednich łańcuchów bocznych lub obie nie występują;
    D oznacza grupę 5 - 15 aminokwasów;
    X oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmującej: Glu, Asp, Lys, Arg, Orn, Dap;
    Z oznacza aminokwas wybrany z grupy obejmują cej: Ala, Val, Ile, His.
  3. 3. Glikopeptydy według zastrz. 2, znamienne tym, że B i C oznaczają pary: Dap-Asp lub Asp-Dap, Dab-Glu lub Glu-Dab, Orm-Asp lub Asp-Orm i pary tworzone przez inne aminokwasy, mające analogiczne cechy.
  4. 4. Glikopeptydy według zastrz. 1 - 3, znamienne tym, że cukier wybiera się z grupy obejmującej mono- i disacharydy, takie jak β-D-glukopiranozyl (Glc), 2-acetyloglukozamina (GlcNAc), celobioza i analogi.
  5. 5. Glikopeptydy według zastrz. 4, znamienne tym, że cukrem jest β-D-glucopiranozyl (Glc).
  6. 6. Glikopeptydy według zastrz. 1 - 5, znamienne tym, że są reprezentowane następującymi wzorami:
    H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-Val-Phe-Leu-AIa-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    H-Thr-Pro-Arg-Val-cykliczny[Dap-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Asp]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    PL 207 174 B1
    H-Thr-Pro-Arg-Val-cykliczny[Asp-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Orn]-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    H-Ala-Lys-Thr-Ala-Lys-Asn(Glc)-Gly-His-Val-Glu-Ala-Ser-Gly-OH
    H-Glu-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr-Pro-OH
    H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Glu-Ala-Phe-Lys-Gly-Ile-Ser-OH
    H-Thr-Pro-Arg-Val-Glu-Arg-Asn(Glc)-Gly-His-Ser-HN-(CH2)6-CO-Val-Phe-Leu-Ala-Pro-Tyr-Gly-Trp-Met-Val-Lys-OH
    H-Asp-Asn(Glc)-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-VaI-(eAla)3-OH
  7. 7. Glikopeptydy według zastrz. 1 - 6, znamienne tym, że zawierają alkilową grupę dystansującą w pozycjach nieterminalnych.
  8. 8. Glikopeptydy według zastrz. 7, znamienne tym, że alkilowa grupa dystansująca jest grupą o wzorze -HN-(CH2)n-CO2-, w której n jest zawarte pomiędzy 2 i 6.
  9. 9. Glikopeptydy według zastrz. 1 - 8, znamienne tym, że zawierają ponadto C-terminalną grupę -HN-(CH2)n-CO2H, w której n jest zawarte pomiędzy 2 i 6.
  10. 10. Sposób wytwarzania w fazie stałej glikopeptydów określonych w zastrz. 1 - 9, znamienny tym, że:
    a) C-terminalną resztę wiąże się kowalencyjnie z odpowiednim stałym nośnikiem;
    b) kolejne aminokwasy dodaje się po kolei, przez acylowanie grupy aminowej reszty związanej z żywicą;
    c) surowy peptyd odzyskuje się przez traktowanie żywicy odpowiednim kwasem;
    d) peptyd oczyszcza się technikami chromatograficznymi;
    e) peptyd na koniec wiąże się z odpowiednim stałym nośnikiem.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, że stały nośnik z etapu (a) wybiera się z grupy obejmującej żel krzemionkowy, celulozę, poliakrylan, Sepharose i analogi, polistyren, polistyrenpolioksyetylen, kopolimery poli(glikolu etylenowego) i poliakryloamidu, polioksyetylen-polistyren, polioksyetylen-polioksypropylen, polioksyetylen podstawiony oksetanem lub jego pochodne.
  12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że stały nośnik z etapu (e), jeśli występuje, wybiera się z grupy obejmującej żel krzemionkowy, celulozę, poliakrylan i Sepharose.
  13. 13. Koniugaty, znamienne tym, że składają się z żywicy nierozpuszczalnej w wodzie i w pełni zgodnej z organicznymi płynami ustrojowymi i glikopeptydu określonego w zastrz. 1 - 9.
  14. 14. Koniugaty według zastrz. 13, znamienne tym, że żywicę wybiera się z grupy obejmującej
    Sepharose celulozę i żel krzemionkowy.
  15. 15. Płytki do diagnozy pacjentów dotkniętych MS, znamienne tym, że zawierają glikopeptydy określone w zastrz. 1 - 9.
  16. 16. Metody diagnostyczne, z wyłączeniem metod in vivo, znamienne tym, że stosuje się wolne glikopeptydy określone w zastrz. 1 - 9.
  17. 17. Metody diagnostyczne, z wyłączeniem metod in vivo, znamienne tym, że stosuje się koniugaty określone w zastrz. 13 i 14.
  18. 18. Zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego, znamienny tym, że zawiera:
    - mikropłytkę
    - roztwór buforowy do przywierania peptydu do płytki;
    - zmodyfikowany peptyd według wynalazku (liofilizowany);
    - bufor FCS (10% FCS, 9 g/l NaCl, Tween 20 0,05%);
    - stężony roztwór przemywający (zatężony 20x);
    - surowicę pozytywnej kontroli;
    - surowicę negatywnej kontroli;
    - przeciwciało reagujące z przeciwciałem stwardnienia rozsianego [koniugat-(AP sprzężone z anty-Igm)];
    - substrat (p-nitrofenylofosforan, sól disodowa);
    - bufor substratu (bufor 1M dietanolaminy, pH 9,8);
    - roztwór zatrzymujący (1M wodorek sodu).
  19. 19. Zestaw według zastrz. 18, znamienny tym, że roztwór buforowy do przywierania peptydu do płytki i zmodyfikowany peptyd włącza się bezpośrednio w mikropłytkę.
PL368158A 2001-06-22 2002-06-19 Glikopeptydy, sposób ich wytwarzania, koniugaty glikopeptydów, płytki do diagnozy, metody diagnostyczne i zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego PL207174B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
IT2001FI000114A ITFI20010114A1 (it) 2001-06-22 2001-06-22 Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla
PCT/EP2002/006767 WO2003000733A2 (en) 2001-06-22 2002-06-19 Glycopeptides, their preparation and use in the diagnosis or therapeutic treatment of multiple sclerosis

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL368158A1 PL368158A1 (pl) 2005-03-21
PL207174B1 true PL207174B1 (pl) 2010-11-30

Family

ID=11442221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL368158A PL207174B1 (pl) 2001-06-22 2002-06-19 Glikopeptydy, sposób ich wytwarzania, koniugaty glikopeptydów, płytki do diagnozy, metody diagnostyczne i zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego

Country Status (15)

Country Link
US (1) US7037893B2 (pl)
EP (1) EP1406927B1 (pl)
AT (1) ATE393785T1 (pl)
AU (1) AU2002316989B2 (pl)
CA (1) CA2451347C (pl)
CZ (1) CZ2004122A3 (pl)
DE (1) DE60226324T2 (pl)
DK (1) DK1406927T3 (pl)
ES (1) ES2305258T3 (pl)
HU (1) HUP0400262A3 (pl)
IL (2) IL159479A0 (pl)
IT (1) ITFI20010114A1 (pl)
PL (1) PL207174B1 (pl)
PT (1) PT1406927E (pl)
WO (1) WO2003000733A2 (pl)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ITFI20010114A1 (it) 2001-06-22 2002-12-22 Univ Firenze Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla
ITFI20010144A1 (it) * 2001-07-25 2003-01-25 Univ Firenze Colonne per immunoassorbimento per sottrazione di autoanticorpi dal sangue con tecniche di plasmafiltrazione selettiva
WO2004015420A1 (en) * 2002-08-02 2004-02-19 Glycominds Ltd. Method for diagnosing multiple sclerosis
US7572592B2 (en) 2005-01-31 2009-08-11 Glycominds Ltd Method for diagnosing multiple sclerosis
US8216791B2 (en) 2005-01-31 2012-07-10 Glycominds Ltd. Method for diagnosing multiple sclerosis
US20080267988A1 (en) * 2007-04-11 2008-10-30 Enteron Limited Partnership Myelin specific IgE unencumbered by corresponding blocking antibodies as a causative factor in multiple sclerosis
CA2683865A1 (en) 2007-04-12 2008-10-23 Apitope International Nv Biomarkers for multiple sclerosis
ATE514711T1 (de) 2007-10-16 2011-07-15 Toscana Biomarkers S R L Galactosylierte peptide, deren zubereitung und verwendung zur diagnose von autoimmunerkrankungen
US20100203569A1 (en) 2009-02-12 2010-08-12 Glycominks LTD Method for Evaluating Risk in Multiple Sclerosis
ITFI20120164A1 (it) 2012-06-05 2013-12-06 Azienda Ospedaliera Universitaria S Enese 50 Nuovi peptidi glicosilati.

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997035879A1 (en) 1996-03-28 1997-10-02 Immulogic Pharmaceutical Corporation Myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides and uses thereof
EP1080185A4 (en) 1998-05-05 2005-01-26 Corixa Corp BASIC PROTEIN PEPTIDES OF MYELIN AND THE USE THEREOF.
US6333033B1 (en) 1998-08-26 2001-12-25 The Regents Of The University Of California Autoantibody inhibitors
ITFI20010114A1 (it) 2001-06-22 2002-12-22 Univ Firenze Glicopeptidi,loro preparazione e loro uso nella diagnosi o nel trattamento terapeutico della sclerosi multipla
ITRM20010408A1 (it) * 2001-07-10 2003-01-10 Univ Napoli Federico Ii Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2.

Also Published As

Publication number Publication date
EP1406927B1 (en) 2008-04-30
AU2002316989B2 (en) 2006-10-26
HUP0400262A2 (hu) 2004-08-30
IL159479A (en) 2010-12-30
PL368158A1 (pl) 2005-03-21
US7037893B2 (en) 2006-05-02
WO2003000733A2 (en) 2003-01-03
PT1406927E (pt) 2008-07-31
US20040235713A1 (en) 2004-11-25
WO2003000733A3 (en) 2003-11-13
CA2451347C (en) 2011-07-19
EP1406927A2 (en) 2004-04-14
IL159479A0 (en) 2004-06-01
ITFI20010114A1 (it) 2002-12-22
CZ2004122A3 (cs) 2004-07-14
HUP0400262A3 (en) 2008-05-28
CA2451347A1 (en) 2003-01-03
DE60226324T2 (de) 2009-07-09
ATE393785T1 (de) 2008-05-15
DE60226324D1 (de) 2008-06-12
DK1406927T3 (da) 2008-08-18
ES2305258T3 (es) 2008-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0929567B1 (en) Solid-phase peptide synthesis
US8470963B2 (en) Multifunctional compounds for pharmaceutical purposes
KR20170026326A (ko) Amg 416의 제조 방법
JP2000512633A (ja) チオエーテル結合を含む環状ポリペプチドおよびそれらの調製方法
JP2011016763A (ja) 疎水性ペプチドに対する抗体の製造方法
PL207174B1 (pl) Glikopeptydy, sposób ich wytwarzania, koniugaty glikopeptydów, płytki do diagnozy, metody diagnostyczne i zestaw do diagnozowania stwardnienia rozsianego
AU2002316989A1 (en) Glycopeptides, their preparation and use in the diagnosis or therapeutic treatment of multiple sclerosis
CN102124024A (zh) 糖蛋白质的制造方法以及筛选方法
NO844123L (no) Fremgangsmaate for fremstilling av nonapeptider og dodekopeptider
Otvos et al. Development of chemically modified peptides
TWI633115B (zh) 加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物
GB2282813A (en) Annular antigen scaffolds comprising thioether linkages
Teruya et al. Fmoc‐based chemical synthesis and selective binding to supercoiled DNA of the p53 C‐terminal segment and its phosphorylated and acetylated derivatives
Paulsen et al. Chemical synthesis of glycopeptides
JP3741495B2 (ja) 新規複合糖ペプチドおよびその製造法
CA2828688C (en) Method for preparing multiple antigen glycopeptide carbohydrate conjugates
Sidorova et al. Synthesis and properties of a new conformational antigen which models an extracellular region of β1-adrenoreceptor
Borgia et al. Difficulties encountered during glycopeptide syntheses
WO2010111910A1 (zh) 一种合成肽及其应用
Paulsen et al. J. Montreuil, H. Schachter and JFG Vliegenthart (Eds.), Glycoproteins 87© 1995 Elsevier Science BV All rights reserved
Bowerman et al. Aromatic Versus Hydrophobic Contributions to Amyloid Peptide Self-Assembly
JPH0625287A (ja) ポリペプチドおよびそれを用いた抗血小板抗体吸着材
JP2002060399A (ja) 糖鎖カルシトニン誘導体
JPH0654906A (ja) ポリペプチドおよびそれを用いた抗血小板抗体吸着材

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20120619