TWI633115B - 加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供加成具有均一糖鏈構造之糖鏈之多胜肽中，具有干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽。依據本發明經由包含合成加成糖鏈之胜肽片段、至少2個胜肽片段之步驟，及連結加成糖鏈胜肽片段與至少2個胜肽片段之步驟之方法，即可製作具有均一糖鏈構造且具有干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽。

Description

加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物
本發明係有關加成糖鏈之多胜肽及含有該多胜肽之醫藥組成物。
天然之人類干擾素β(IFN-β)為包含166個胺基酸殘基之糖蛋白質。干擾素β為屬於細胞激素(cytokine)家族，已知參與免疫調整作用、抗病毒活性、細胞增殖抑制作用。又，人類干擾素β在該胺基酸序列之第17位、31位、141位具有3個Cys，在第80位之天冬醯胺具有1個複合型N結合型之寡糖。又，已知於第31位及141位之Cys具有二硫鍵。作為藥劑之干擾素β由利用細胞表現系製造，根據表現之宿主不同，分類為IFN-β-1a或IFN-β-1b。IFN-β-1a為糖蛋白質，另一者，IFN-β-1b未具有寡糖。而已知，具有糖鏈之IFN-β-1a與IFN-β-1b相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗腫瘤特性方面具有更強力之效能。
此處，糖蛋白質中所含之糖鏈構造已知對於藥物動態具有強的影響力。尤其，已知在糖鏈之非還原末端有無唾液酸存在，對於延長血中半衰期方面有影響。惟，有報告指出至今生合成之IFN-β-1a在其多胜肽中所具有糖鏈之構造為不均一(例如經由 CE-TOF-MS分析糖鏈構造不均一性之結果記載於非專利文獻1)。又，對於從合成之IFN-β或天然存在之IFN-β分離糖鏈構造實質性均一之IFN-β則均無報告。導致在推測何種糖鏈構造在生理活性上重要時有障礙。
近年來，利用細胞表現系之生物科技可製造含有干擾素，如胰島素、紅血球生成素(Erythropoietin)、G-CSF之生理活性蛋白質製劑。有報告指出對於該等蛋白質製劑中，蛋白質之糖化模型對於摺疊步驟、結構特性、安定性、免疫反應、血中半衰期及如生體系中蛋白質機能之蛋白質之物理特性或化學特性造成變化(非專利文獻2)。加成於該等蛋白質製劑之糖鏈之構造若考慮到經由非人類型糖鏈產生之重大免疫原性，則較好為人類型之糖鏈。
該等糖蛋白質製劑其唯一之方法係經由細胞表現系製造。惟，該等細胞表現系之技術，如上所述，不能控制到糖鏈之構造，其結果，所製造之糖蛋白質中糖鏈之構造產生不均一性(例如，非專利文獻3)。因此，有製造批號間之品質散亂或糖鏈不能最適化等之問題。因此，長期期待可容易調整糖鏈構造之均一糖蛋白質之調製方法，至今，對於經由化學合成，在生體內顯示生理活性之人類型均一糖蛋白質之合成尚無報告。
根據該等細胞表現系之技術製造之生理活性糖蛋白質有可能含有病毒或遺傳物質。又，在使用從源自生體試料所調製之糖鏈合成生理活性糖蛋白質時，該等遺傳物質等有可能混入。為了製造安全之蛋白質製劑，期待有可適用將該等遺傳物質崩解之加熱處理法。惟，現今對於生理活性糖蛋白質製劑之加熱處理會使糖蛋白質失去活性，對於適用之加熱處理法尚無報告。
[先行技術文獻] [非專利文獻]
[非專利文獻1]Anal Bioanall Chem (2011) 400 : 295-303
[非專利文獻2]Nat. Biotechnol., 2006, 24, 1241-1252
[非專利文獻3]J. Biotechnol, 42, 117-131 (1995)
本發明之目的係提供加成具有均一糖鏈構造之糖鏈之多胜肽，其係具有干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽。
本發明人等為了解決上述課題進行深入研究之結果，成功的製造加成具有均一糖鏈構造之糖鏈之多胜肽，其係具有干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽。
亦即，本發明係有關加成糖鏈之多胜肽，其係選自由(a)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽；(b)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽中，1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成之多胜肽；(c)干擾素β之類似物；及(d)相對於包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽，具有80%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽中，在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽；其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽具有實質上均一之糖鏈。
此處，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，其特徵為 上述加成糖鏈之多胜肽係經由化學合成製作者。
又，本發明之另一態樣為經由包含：合成加成糖鏈之胜肽片段、至少2個胜肽片段之步驟，以及將上述加成糖鏈之胜肽片段與上述至少2個胜肽片段連結之步驟之方法，獲得之加成糖鏈之多胜肽，且上述加成糖鏈之多胜肽係選自由(a)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽；(b)在包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽中，1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成之多胜肽；(c)干擾素β之類似物；及(d)相對於包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽，具有80%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，其中，在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性者。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，加成糖鏈之多胜肽為經由包含：合成加成糖鏈之胜肽片段、至少2個胜肽片段之步驟，及將上述加成糖鏈之胜肽片段與上述至少2個胜肽片段連結之步驟之方法獲得之加成糖鏈之多胜肽， 上述加成糖鏈之多胜肽係選自由(a)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽；(b)在包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽中，1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成之多胜肽；(c)干擾素β之類似物；及(d)相對於包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽，具有80% 以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，其中，在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性者。
此處，在本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈為天冬醯胺結合型糖鏈者。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈為下述式(a)表示之二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示之無唾液酸糖鏈者。
又，在本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，其特徵為上 述加成糖鏈之多胜肽在相當於干擾素β第31位及第141位之Cys形成二硫鍵。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽係經加熱處理。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽具有90%以上之純度。
又，本發明另一態樣係有關含有上述加成糖鏈之多胜肽之組成物，其特徵為上述組成物中加成糖鏈之多胜肽為實質上均一者。
此處，於本發明組成物之一實施態樣，其特徵為上述組成物中加成糖鏈之多胜肽為90%以上均一者。
又，於本發明組成物之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽具有90%以上之純度。
又，本發明之組成物為含有加成糖鏈之多胜肽之組成物，上述加成糖鏈之多胜肽係選自由以下(a)至(d)之多胜肽：(a)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽；(b)在包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽中，1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成之多胜肽；(c)干擾素β之類似物；及(d)相對於包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽，具有80%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，其中，在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈，且具有干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽， 上述組成物，其特徵為組成物中加成糖鏈之多胜肽為實質上均一者。
又，本發明另一態樣係有關含有(I)如申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述之加成糖鏈之多胜肽及/或藥學上容許之鹽，及(Ⅱ)藥理學上容許之載體之醫藥組成物。
此處，於本發明醫藥組成物之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽中糖鏈實質上為均一。
又，於本發明醫藥組成物之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽中糖鏈90%以上為均一。
又，於本發明醫藥組成物之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽係具有90%以上之純度。
又，於本發明醫藥組成物之一實施態樣，其特徵為用於治療或預防干擾素β關連之疾病。
又，於本發明醫藥組成物之一實施態樣，其特徵為上述干擾素β關連之疾病為至少1個選自由包含多膠芽腫、髓芽腫及星細胞腫之腦腫瘤、皮膚惡性黑色腫、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝變硬及多發性硬化症所成群組之疾病。
又，本發明另一態樣為有關干擾素β關連之疾病之治療或預防方法，其特徵為投予有效量之上述加成糖鏈之多胜肽。
此處，於本發明干擾素β關連之疾病之治療或預防方法之一實施態樣，其特徵為上述干擾素β關連之疾病為至少一種選自由包含多膠芽腫(glioblastoma multiforme)、髓芽腫及星細胞腫之腦腫瘤、皮膚惡性黑色腫、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝變硬及多發性硬化症所成群組之疾病。
又，本發明之另一態樣係有關選自由(a)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽；(b)在包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽中，1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成之多胜肽；(c)干擾素β之類似物；及(d)相對於包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽，具有80%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，其係在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈之加成糖鏈之多胜肽，且在相當於干擾素β第17位、31位及141位之Cys係經保護基保護之加成糖鏈之多胜肽。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽中，上述糖鏈為存在於下述式(c)表示之糖鏈非還原末端之唾液酸之羧基係經保護之二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示之無唾液酸糖鏈。
(式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或 -COOCH2Ph(NO2)2。又，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基、Me表示甲基、Ph表示苯基)。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，其特徵為上述加成糖鏈之多胜肽，在相當於上述干擾素β第17位、31位及141位之Cys為經由任一種選自由Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、第三丁基、苯甲基及β位經取代之乙基所成群組之任一種保護基保護者。
又，本發明之另一態樣係有關加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其特徵為包含在Cys經保護之上述加成糖鏈之多胜肽中，將在相當於經保護基保護之上述干擾素β第17位、31位及141位之Cys進行脫保護之步驟之加成糖鏈之多胜肽之製造方法。
此處，於本發明加成糖鏈之多胜肽製造方法之一實施態樣，其特徵為在將上述Cys進行脫保護步驟之前，另包含調製在相當於干擾素β第17位、31位及141位之Cys經由保護基保護之上述加成糖鏈之多胜肽之步驟。
又，於本發明加成糖鏈之多胜肽之製造方法之一實施態樣中，其特徵為在將Cys之保護基進行脫保護步驟之前，將加成糖 鏈之多胜肽進行加熱處理。
又，本發明之另一態樣係有關加成糖鏈之多胜肽，其係於選自由(a)包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽；(b)在包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽中，1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成之多胜肽；(c)干擾素β之類似物；及(d)相對於包含序列編號1表示之胺基酸序列之多胜肽，具有80%以上相同性之加成糖鏈之多胜肽；所成群組之多胜肽中，在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈之加成糖鏈之加成糖鏈之多胜肽，其特徵為上述糖鏈為下述式(c)表示之糖鏈非還原末端存在之唾液酸羧基係經保護之二唾液酸糖鏈。
(式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2。又，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基，Me 表示甲基，Ph表示苯基)。
又，本發明之另一樣係有關加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其特徵係於具有唾液酸之羧基經保護之糖鏈之上述加成糖鏈之多胜肽中，包含將存在於糖鏈非還原末端之唾液酸之羧基之保護基進行脫保護之步驟。
此處，於本發明加成糖鏈之多胜肽之製造方法之一實施態樣，其特徵為在上述唾液酸之羧基脫保護步驟之前，另包含調製具有唾液酸之羧基經保護之糖鏈之上述加成糖鏈之多胜肽之步驟。
又，本發明加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其特徵為更包含將上述加成糖鏈之多胜肽進行摺疊之步驟。
本發明加成糖鏈之多胜肽由於具有均一之糖鏈構造，可提供每批號之間之散亂少，具有品質安定之干擾素β活性之加成糖鏈之多胜肽。又，可將結合之糖鏈種類均一化，而可對應目的將糖鏈構造最適當化。
又，本發明加成糖鏈之多胜肽由於可進行熱處理，可防止混入病毒或未知之遺傳物質。
第1圖為在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，將具有干擾素β之胺基酸序列第68位至第88位之胺基酸之糖胜肽片段B與具有第89位至第166位之胺基酸之胜肽片段C接合之步驟之模式圖。
第2圖為在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，將具有干擾素β之胺基酸序列第1位至第67位之胺基酸之胜肽片 段A與具有第68位至第166位之胺基酸之糖胜肽片段(B+C)連結之步驟之模式圖。
第3圖為在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，將經由連結而製作之具有干擾素β之胺基酸序列第1位至第166位之胺基酸之糖胜肽片段(A+B+C)之特定半胱胺酸還原為丙胺酸之步驟之模式圖。
第4圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，為經由連結製作之具有干擾素β之胺基酸序列第1位至第166位之胺基酸之糖胜肽片段(A+B+C)，對於還原為丙胺酸步驟後之糖胜肽片段(A+B+C)進行半胱胺酸保護基之脫保護步驟之模式圖。
第5圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(11)之HPLC數值(A)及ESI-MS數據(B)。
第6圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(11)之胺基酸序列。
第7圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(12)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第8圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(12)之胺基酸序列。
第9圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(13)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第10圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(13)之胺基酸序列。
第11圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣 中製造之糖胜肽片段(14)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第12圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(14)之胺基酸序列。
第13圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(15)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第14圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(15)之胺基酸序列。
第15圖表示經由HPLC測定在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施形中製造之糖胜肽片段(15)之純度時之數據。
第16圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(5)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第17圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(5)之胺基酸序列。
第18圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(6)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第19圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(6)之胺基酸序列。
第20圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(7)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第21圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(7)之胺基酸序列。
第22圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(8)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第23圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣 中製造之糖胜肽片段(8)之胺基酸序列。
第24圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(9)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第25圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(9)之胺基酸序列。
第26圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(10)之HPLC數據。
第27圖表示在製造本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(10)之胺基酸序列。
第28圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(10)經由HPLC測定純度時之數據。
第29圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(18)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第30圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(19)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第31圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(20)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第32圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(21)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第33圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(22)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第34圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(23)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第35圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣 中製造之糖胜肽片段(24)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第36圖表示本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，在第17位、31位、141位之Cys經Acm基保護之加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之多胜肽(7)之胺基酸序列之模式圖，及將該加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之多胜肽(7)加熱處理前及加熱處理後經由HPLC及ESI-MS分析之數據。第36圖a及c表示加熱處理前之ESI-MS數據，第36圖b及e為加熱處理後之ESI-MS數據。又，第36圖d表示加熱處理前HPLC分析之數據，第36圖f表示加熱處理後HPLC分析之數據。
第37圖表示本發明加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣，在第17位、31位、141位之Cys加成無保護之二苯甲基二唾液酸糖鏈之多胜肽(8)之胺基酸序列之模式圖，及將該加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之多胜肽(8)加熱處理前及加熱處理後經由HPLC及ESI-MS分析之數據。第37圖a及c表示加熱處理前之ESI-MS數據，第37圖b及e為加熱處理後ESI-MS數據。又，第37圖d表示加熱處理前HPLC分析之數據，第37圖f表示加熱處理後HPLC分析之數據。
第38圖表示對本發明之一實施態樣之化學合成之加成糖鏈之多胜肽(未加熱處理)之IFN-α/β受體2之受體親和性分析之數據。
第39圖表示對本發明之一實施態樣之經化學合成之加成糖鏈之多胜肽(加熱處理)之IFN-α/β受體2之受體親和性分析之數據。
第40圖表示將本發明之一實施態樣之化學合成之加成糖鏈 之多胜肽投予老鼠時，藥物動態分析之數據。又，對照區使用經由生合成製作之IFN β mochida。於第40圖，A表示靜脈投予時之數據，B表示皮下投予時之數據。
第41圖表示本發明之一實施態樣之化學合成之加成糖鏈之多胜肽抗腫瘤活性之數據。又，對照區使用PBS(賦形劑群)及經由生合成製作之IFN β mochida。
第42圖表示對本發明之一實施態樣之化學合成之加成糖鏈之多胜肽，比較經加熱處理者與未加熱處理者抑制細胞増殖活性能之數據。
第43圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，將具有干擾素β之胺基酸序列第68位至第75位之胺基酸之胜肽片段B2與具有第76位至第88位之胺基酸之糖胜肽片段B1接合之步驟之模式圖。
第44圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，將經由接合製作之具有干擾素β之胺基酸序列第68位至第88位之胺基酸之糖胜肽片段(B1+B2)之特定半胱胺酸之硫醇基(-SH)甲基化為甲硫基(-SMe)步驟之模式圖。
第45圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中，在糖胜肽片段(B1+B2)上具有經甲基化之硫醇基(-SMe)之半胱胺酸轉換為絲胺酸之分子內醯基轉位化步驟之模式圖。
第46圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(25)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第47圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(26)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第48圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(27)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第49圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(28)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
第50圖表示在本發明製造加成糖鏈之多胜肽之一實施態樣中製造之糖胜肽片段(29)之HPLC數據(A)及ESI-MS數據(B)。
本說明書中，「干擾素β」或「IFN-β」為具有序列編號1表示之166個胺基酸序列之多胜肽。又，干擾素β在下述胺基酸序列中第31位與第141位之半胱胺酸(Cys)之間具有二硫鍵。又，於本說明書中，「干擾素β」較好具有下述胺基酸序列(序列編號1)且相當於具有糖鏈之人類型干擾素β-1a者。又，干擾素β-1a係於下述胺基酸序列中，在80位之天冬醯胺加成糖鏈。
Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln10-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys-Gln-Lys-Leu20-Leu-Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr30-Cys-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile40-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe50-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr60-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-Ala-Ile-Phe70-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn80-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-Ala-Asn90-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr100-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp110-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu120-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu130-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His140-Cys-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile150-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu160-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn166
於本說明書中，「胺基酸」係使用最廣義者，不僅是天然的胺基酸，亦包含如胺基酸變異體及衍生物之非天然胺基酸。只要是從業者，考慮該廣泛定義，可理解本說明書中之胺基酸可列舉例如天然蛋白質原性L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體及衍生物等經化學修飾之胺基酸；正白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等天然非蛋白質原性胺基酸及具有該業者公知之為胺基酸特徵之特性之經化學合成之化合物等。非天然胺基酸之例可列舉α-甲基胺基酸(α-甲基丙胺酸等)、D-胺基酸、組胺酸樣胺基酸(2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、α-氟甲基-組胺酸及α-甲基-組胺酸等)、在側鏈具有多餘之亞甲基之胺基酸(「高」胺基酸)及側鏈中之羧酸官能基胺基酸經磺酸基取代之胺基酸(半胱胺酸等)。於較佳之形式中，本發明化合物中所含之胺基酸僅包含天然胺基酸。
於本說明書中，胺基酸序列中1個或數個胺基酸係缺失、經取代或經加成時，經取代等之胺基酸個數只要能保持干擾素β活性即可，並無特別限制，例如1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個左右之胺基酸為差異者。亦包含在全體胺基酸序列長度20%以內，較好10%以內之胺基酸差異之情況。經取代或經加成之胺基酸可為天然胺基酸、非天然胺基酸或胺基酸類似物，較好為天然胺基酸。
於本說明書中，「胜肽片段」係指每次製造本發明加成糖鏈之多胜肽，最終具有加成糖鏈之多胜肽胺基酸序列之一部分序列之胜肽片段。又，於本說明書中，「加成糖鏈之胜肽片段」或「糖胜肽片段」為在該等胜肽片段之胺基酸序列中，含有加成糖鏈之胺基酸之胜肽片段。本發明加成糖鏈之多胜肽經由將加成糖鏈之胜 肽片段與至少2個胜肽片段連結而製造。
於本發明中，「干擾素β之類似物」為與干擾素β構造上類似之多胜肽及/或具有與干擾素β重複之構造之多胜肽，可列舉例如干擾素β之1個胺基酸或數個胺基酸係保存性經取代之多胜肽、干擾素β改變體、具有干擾素β活性之干擾素β之片段、具有干擾素β活性之延長干擾素β。
於本說明書中，「1個或數個胺基酸保存性經取代」為於胺基酸取代中，原來之胺基酸與取代之胺基酸之親水性指數及/或疏水性指數類似之取代，在該等取代之前後，干擾素β活性不會產生明顯降低或消失之取代。
於本說明書中，「干擾素β改變體」為干擾素β之改變體，包含干擾素β天然存在之變異體或將干擾素β人工改變之化合物，該等改變可列舉例如干擾素β之1個或複數胺基酸殘基烷基化、醯基化(例如乙醯基化)、醯胺化、羧基化、形成酯、形成二硫鍵、糖基化、脂化、磷酸化、羥基化、標識成分之結合等。
於本說明書中，「具有干擾素β活性之干擾素β之片段」為從干擾素β之N末端及/或C末端，1個或1個以上之胺基酸係缺失，且對干擾素β受體維持活性之胜肽。
於本說明書中，「具有干擾素β活性之延長干擾素β」為在干擾素β之N末端及/或C末端加成1個或1個以上之胺基酸且維持干擾素β活性之胜肽。
如上所述之干擾素β類似物可列舉例如已知之第1位之Met缺損、第17位之Cys以Ser取代之干擾素β-1b之胺基酸序列。
本發明加成糖鏈之多胜肽為包含具有與序列編號1表示之胺 基酸序列80%以上相同性之胺基酸序列之多胜肽，包含在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈之加成糖鏈之多胜肽，且具有干擾素β活性者。於本發明加成糖鏈之多胜肽中，與序列編號1具有80%以上相同性時，較好可具有85%以上、90%以上、95%以上、99%以上之相同性。
於本說明書中，「相當於干擾素β中特定位置之胺基酸」為在加成糖鏈之多胜肽中胺基酸之加成、缺失等為在對應干擾素β胺基酸序列之同一位置之胺基酸。又，於加成糖鏈之多胜肽之胺基酸序列內，胺基酸之加成、缺失存在時，考慮到因胺基酸之加成、缺失引起之胺基酸序列上之移動之位置之胺基酸。例如，於從第1位至第4位具有Met1-Ser2-Tyr3-Asn4-序列之加成糖鏈之多胜肽中，在第2位與第3位之胺基酸之間加成1個胺基酸(Trp)時(Met-Ser-Trp-Tyr-Asn-)，相當於第3位胺基酸(Tyr)之胺基酸係指在加成糖鏈之多胜肽中，經由插入Trp，向C末端側移動1個之胺基酸(Tyr)。
於本說明書中，「糖鏈」為由1個以上之單位糖(單糖及/或其衍生物)連結形成之化合物。由2個以上單位糖連結時，各個單位糖之間，經由糖苷結合引起脫水縮合而結合。該等糖鏈可列舉例如生體中所含之單糖類及多糖類(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙醯基葡糖胺、N-乙醯基半乳糖胺、唾液酸及該等之複合體及衍生物)，以及經分解之多糖、糖蛋白質、蛋白多糖、糖胺多糖、糖脂質等從複合生體分子分解或衍生之糖鏈等廣範圍之糖鏈，惟不只限於此等。糖鏈可為直鏈型，亦可為支鏈型。
又，於本說明書中，「糖鏈」亦包含糖鏈之衍生物，糖鏈之衍 生物可列舉例如構成糖鏈之糖為具有羧基之糖(例如C-1位為經氧化之羧酸所成之糖醛酸(例如D-葡萄糖經氧化之D-葡糖酸)、末端之C原子成為羧酸之糖醛酸(D-葡萄糖經氧化之D-葡糖醛酸))、具有胺基或胺基衍生物之糖(例如D-葡糖胺、D-半乳糖胺等)、具有胺基及羧基兩者之糖(例如N-乙醇醯神經糖胺酸、N-乙醯基胞壁酸等)、經脫氧化之糖(例如，2-脫氧-D-核糖)、含有硫酸基之硫酸化糖、含有磷酸基之磷酸化糖等之糖鏈，惟，不只限於此等。
於本發明中，較佳之糖鏈為加成於加成糖鏈之多胜肽中時，干擾素β活性不會消失之糖鏈。
該等本發明加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈並無特別限制，可為在生體內作為複合糖質(糖胜肽(或糖蛋白質)、蛋白多糖、糖脂質等)存在之糖鏈，亦可為在生體內不作為複合糖質存在之糖鏈。
在活體內作為複合糖質存在之糖鏈，從對活體內投予本發明加成糖鏈之多胜肽之觀點而言較佳。相關之糖鏈可列舉為在活體內作為糖胜肽(或糖蛋白質)結合於胜肽(或蛋白質)之糖鏈之N-結合型糖鏈、O-結合型糖鏈等。較好使用N-結合型糖鏈。N結合型糖鏈可列舉例如高甘露糖(high mannose)型、複合(complex)型、混成(hybride)型，較好為複合型。
於本發明較佳之一態樣中，本發明加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈為複合型糖鏈。複合型糖鏈係指含有2種以上之單糖，且具有以下表示之基本構造及Gal β 1-4GlcNAc表示之乳糖胺構造者。
本發明使用之較佳複合型糖鏈可列舉例如下述通式表示之糖鏈等： [式中，R1及R2為相同或不同，表示 。Ac表示乙醯基]。
又，於本發明，複合型糖鏈含有雙鏈複合糖鏈。雙鏈複合型糖鏈係指在基本構造末端之2個甘露糖分別結合包含0至3個糖之單鏈之糖鏈。雙鏈複合型糖鏈較好為例如以下表示之二唾液酸糖鏈、 單唾液酸糖鏈、 無唾液酸糖鏈、 二葡萄糖糖鏈、 二甘露糖糖鏈、 等。雙鏈複合型糖鏈更好為二唾液酸糖鏈或無唾液酸糖鏈，最好為二唾液酸糖鏈。
又，本發明之複合型糖鏈除了上述之雙鏈複合型糖鏈(2分支 型複合型糖鏈)之外，亦包含三鏈之複合型糖鏈(3分支型複合型糖鏈)、四鏈之複合型糖鏈(4分支型複合糖鏈)。例如，三鏈、四鏈之複合型糖鏈可列舉以下構造式表示之三唾液酸糖鏈 下述構造式表示之四唾液酸糖鏈 又，三鏈複合型糖鏈及四鏈複合型糖鏈可列舉從該等三唾液酸糖鏈及四唾液酸糖鏈之非還原末端失去1個或複數個糖之糖鏈。
另外，本發明之複合型糖鏈亦包含加成岩藻糖者。加成岩藻糖之複合型糖鏈可列舉以下構造式表示之含有岩藻糖之複合型糖鏈 又，可列舉從該等含有岩藻糖之複合型糖鏈之非還原末端失去1個或複數個糖之糖鏈。
又，於本說明書中，「雙鏈複合型糖鏈」、「二唾液酸糖鏈」、「單唾液酸糖鏈」、「無唾液酸糖鏈」、「二葡萄糖糖鏈」、「二甘露糖糖鏈」、「三鏈複合型糖鏈」、「四鏈複合型糖鏈」、「含有岩藻糖之複合型糖鏈」除了上述化學式表示之糖鏈外亦包含結合樣式與化學式表示之例不同者，該糖鏈亦較好作為本發明之糖鏈使用。相關之糖鏈可列舉例如在二唾液酸糖鏈或單唾液酸糖鏈中，唾液酸與半乳糖以(α 2→3)鍵結結合者等。
又，本發明之複合型糖鏈亦包含具有下述式表示之聚乳糖胺構造或唾液醯基(sialyl)聚乳糖胺構造之糖鏈。
(式中，n為2至3之整數)。
(式中，n為2至3之整數)。
又，本發明使用之高甘露糖型糖鏈為在上述複合型糖鏈之基本構造中更結合2個以上甘露糖之糖鏈。高甘露糖型糖鏈由於體積大，經由在胜肽中結合高甘露糖型糖鏈而血中之安定性更高。如哺乳類之高甘露糖型糖鏈，較好為含有5至9個甘露糖之糖鏈，亦可為如酵母之高甘露糖型糖鏈，亦可為含有更多甘露糖之糖鏈。本發明較佳使用之高甘露糖型糖鏈可列舉例如高甘露糖-5(M-5) 高甘露糖-9(M-9) 等。
於本發明，較佳之糖鏈可列舉例如於人體內作為與蛋白質結合之糖蛋白質存在之糖鏈(例如「FEBS LETTERS Vol.50,No.3,Feb.1975」中記載之糖鏈)、具有相同構造之糖鏈(構成糖之種類及該等之結合形式為相同之糖鏈)或從該等之非還原末端失去1個或複數個糖之糖鏈。具體而言，可列舉下述列舉之糖鏈。
又，於本發明一實施之態樣中，糖鏈位於非還原末端之唾液酸之羧基可被修飾。該等糖鏈可列舉如上述列舉之糖鏈中，在非 還原末端具有唾液酸之糖鏈，且該唾液酸之羧基(-COOH)之氫原子係經Bn、Et、Me、CH2COPh、CH2PhOMe、CH2Ph(OMe)2、CH2PhNO2或CH2Ph(NO2)2取代之糖鏈(亦即，該唾液酸之羧基以-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2表示者)。
又，於本發明之一態樣中，較佳之糖鏈為具有直鏈構造之糖鏈。相關之糖鏈可列舉例如低聚玻尿酸(oligo hyaluronic acid)。於本說明書中，低聚玻尿酸為N-乙醯基葡糖胺與葡糖醛酸在直鏈上交互結合2至32糖，較好2至16糖，更好4至8糖之糖鏈。
本發明使用之低聚玻尿酸中，更好者可列舉將包含N-乙醯基葡糖胺及葡糖醛酸之單位作為1單位時，為2單位(4糖)以上8單位(16糖)以下之糖鏈，更好為2單位(4糖)至4單位(8糖)，最好為2單位(4糖)。
本發明較佳使用之玻尿酸可列舉例如4糖之低聚玻尿酸、 8糖之低聚玻尿酸 等。
本發明加成糖鏈之多胜肽中，糖鏈加成之胺基酸較好與天然存在之干擾素β相同，加成於與干擾素β中相當於第80位之胺基酸。又，糖鏈加成之胺基酸較好為天冬醯胺。
於本發明之較佳一態樣中，本發明加成糖鏈之多胜肽之糖鏈較好為均一。於本說明書中，加成糖鏈之多胜肽中，糖鏈為均一係指在加成糖鏈之多胜肽間比較糖鏈時，胜肽中之糖鏈加成部位、構成糖鏈之各糖種類、結合順序及糖間之結合形式為相同。具體而言，於加成糖鏈之多胜肽間，至少有90%以上，較好95%以上，更好99%以上之糖鏈構造為均一。
於本說明書中，在含有加成糖鏈之多胜肽之組成物中，組成物中之加成糖鏈之多胜肽為均一係指在該組成物中所含之加成糖鏈之多胜肽間比較糖鏈及多胜肽部分時，胜肽中之糖鏈加成部位、構成之糖鏈各糖種類、糖鏈之結合順序、糖間之結合形式、構成多胜肽之胺基酸種類、胺基酸序列之順序為相同。具體而言，在組成物中所含之加成糖鏈之多胜肽間，至少有90%以上，較好95%以上，更好99%以上之糖鏈構造及多胜肽部分為均一。
尤其是含有糖胜肽間之糖鏈為均一之糖胜肽之組成物等，其品質一定，尤其在醫藥品之製造或分析等之領域較佳。均一糖鏈之比例或加成均一糖鏈之多胜肽之比例可經由例如使用HPLC、毛細電泳、NMR、質量分析等之方法測定。
本發明加成糖鏈之多胜肽係經由將加成糖鏈之胜肽片段與至少2個胜肽片段連結而製造。
(胜肽片段)
該等構成本發明加成糖鏈之多胜肽之加成糖鏈之胜肽片段及 胜肽片段為如上所述，分別具有干擾素β之胺基酸序列之一部分。亦即，各片段具有將干擾素β之166個胺基酸序列至少分成3組之各個胺基酸序列。
此處，片段之數及各片段之長度，考慮各片段因合成時之延長導致收率降低、將各片段連結時必要之胺基酸種類、因連結步驟之次數導致收率降低，較好在較佳之片段數及胺基酸位置選擇各片段之胺基酸序列。
各片段之長度依片段之調製方法而異，例如，較好作成9至84之長度，更好作成67至78之長度。
又，連結各片段之方法可以硫醇游離接合(Thiol-free ligation)、施陶丁格接合(Staudinger Ligation)、糖協助接合(Sugar-Assisted Ligation)、硫醇輔助接合(Thiol auxiliary ligation)(Chem.Commu.,2011,47,6201-6207)、(Chem.Commu.,2010,46,21-43)等公知之方法接合，較好可使用自然化學接合法(Native Chemical Ligation：NCL)接合。
使用自然化學接合法時，將從干擾素β之胺基酸序列選擇之各片段N末端必需為Cys。選擇Cys以外之胺基酸作為各片段N末端之胺基酸時，可選擇Ala、His、Lys、Phe、Ser、Thr、Val、Met。例如，片段之N末端為Ala時，可先合成導入Cys替代N末端之Ala之片段，與其他片段接合後，再將Cys還原為Ala。又，片段之N末端為Phe或Val時，作為導入之胺基酸，可使用在β位具有硫醇基之非天然型胺基酸進行接合，之後進行還原處理。設計Ser、Thr作為片段之N末端時，可導入半胱胺酸作為N末端，接合後將該半胱胺酸殘基之硫醇基甲基化，接著、經由溴化氰處 理，可轉換為Ser、Thr。又，設計His或Lys作為片段之N末端時，導入該等胺基酸作為N末端後，經由利用胺基親核攻擊(Nucleophilic attack)之接合反應，可形成期待之醯胺給合。將其他胺基酸作為片段之N末端時，經由公知之方法，使用自然化學接合法，可構成最終之加成糖鏈之多胜肽。
又，在干擾素β之胺基酸序列中，在所期待之位置不存在半胱胺酸時，最終生產物之糖鏈多胜肽只要具有干擾素β活性，亦可在所期待之位置導入半胱胺酸，作為片段之N末端。又，於期望中導入之半胱胺酸，可在各胜肽片段之間之接合步驟後，如上所述取代為Ala、Ser、Thr。
於製造本發明加成糖鏈之多胜肽中，選擇作為片段之N末端之胺基酸，從片段數或最終生成物收率之點而言，較好從Ala、Phe、Val、Ser、Thr選擇，更好從經由還原反應可取代之Ala、Phe、Val選擇。更具體之例為可將干擾素β中第1位至第67位作為第一片段，將在N末端具有第68位之Ala之第68位至第88位作為第二片段，將在N末端具有第89位之Ala之第89位至第166位作為第三片段。又，例如上述之第89位至第166位之第三片段可分為將第89位至第133位之片段及在N末端具有第134位之Ala之第134位至第166位之片段製造。
(片段之製造方法)
該等胜肽片段之製造方法可經由生合成、化學合成或無細胞合成等之方法製造。尤其是具有糖鏈之胜肽片段之合成，為了要將糖鏈作成均一，較好經由化學合成製造。經由化學合成之製造方法可使用藉由固相合成、液相合成等公知之胜肽合成方法製造 加成糖鏈之多胜肽之方法。又，選擇Ala作為各片段之N末端時，在將各片段接合後，由於需將替代Ala導入N末端之特定Cys還原為Ala，較好預先將未還原之Cys加以選擇性保護。如此，於該等情況，在經由化學合成製造胜肽片段更簡便，較佳。
本發明加成糖鏈之胜肽片段之製造方法中，糖鏈之構造為均一之加成糖鏈之多胜肽之安定製造方法之具體例，可使用加成糖鏈之Asn作為糖鏈加成之胺基酸，與胜肽片段相同，經由藉由固相合成、液相合成等公知之胜肽合成方法製造加成糖鏈之胜肽片段之方法。該等方法記載於例如Angew.Chem.Int.Ed.2008,47,6851-6855。又，例如於國際公開第2004/005330號說明書(US2005222382(A1))亦有記載，該揭示作為全體放入本說明書中參照。
加成糖鏈之多胜肽可經由例如以下概略表示之使用加成糖鏈之天冬醯胺之固相合成製造。
(1)將經脂溶性保護基保護胺基氮原子之胺基酸之羧基結合於樹脂(resin)。此時，由於胺基酸之胺基氮原子以脂溶性保護基保護，而可防止胺基酸之間之自己縮合，而樹脂與胺基酸進行反應產生結合。
(2)將獲得之反應物之脂溶性保護基脫離，形成游離胺基。
(3)將該游離胺基與經脂溶性保護基保護胺基氮原子之任意胺基酸之羧基進行醯胺化反應。
(4)將上述脂溶性保護基脫離，形成游離胺基。
(5)將上述(3)及(4)之步驟反覆操作1次以上，獲得在連結任意數之任意胺基酸之末端結合樹脂，另一端具有游離胺基之胜肽。
(6)最後，用酸將樹脂切斷，可獲得具有所期待之胺基酸序列之胜肽。
此處，於(1)中，使用以脂溶性保護基保護胺基氮原子之加成糖鏈之天冬醯胺替代以脂溶性保護基保護胺基氮原子之胺基酸，只要將該天冬醯胺部分之羧基與樹脂之羥基進行反應，即可獲得在C末端具有加成糖鏈之天冬醯胺之加成糖鏈之胜肽片段。
又，在(2)之後或將(3)及(4)反覆操作1次以上任意次數後，在(3)中只要使用以脂溶性保護基保護胺基氮原子之加成糖鏈之天冬醯胺替代以脂溶性保護基保護胺基氮原子之胺基酸，即可在任意部位加成糖鏈。又，經加成加成糖鏈之天冬醯胺後再將(3)及(4)反覆操作，即可將胜肽延長。
結合加成糖鏈之胺基酸後將脂溶性保護基脫離，形成游離胺基，之後進行步驟(6)，即可獲得在N末端具有加成糖鏈之天冬醯胺之胜肽。
於上述之合成方法中結合之糖鏈係使用具有相同構造之上述之糖鏈。該等糖鏈可經由任意之公知方法獲得。具體方法並無特別限制，可利用例如化學合成糖鏈(例如參照J.Seifert et al.Angew Chem Int.Ed.2000,39,p 531-534)或從天然或人工之糖鏈供給源分離者或市售品。於該方法，具有相同構造之糖鏈胺基酸並無特別限制，例如從天然或人工糖鏈供給源將相同構造之糖鏈分離可根據例如WO2004/058789記載之方法進行。具體而言，從鷄蛋等天然之糖鏈供給源以Seko et al.,Biochim Biophys Acta.1997；1335(1-2)：23-32等中記載之方法將含有糖鏈天冬醯胺之混合物(唾液酸糖胜肽(SGP))分離，在該糖鏈天冬醯胺中導入脂溶性之保護 基(例如Fmoc)，獲得糖鏈天冬醯胺衍生物混合物，供層析儀進行層析，可將該混合物中含有的種種構造之糖鏈對應其構造而分離。又，具有或未具有種種保護基之特定構造之糖鏈天冬醯胺可經由例如大塚化學(股)公司購得。
樹脂只要是通常固相合成使用之樹脂即可，可使用例如以氯原子官能化之2-氯三苯甲基氯樹脂(默克(merck)公司製造)、以胺基官能化之Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)、具有羥基之NovaSyn TGT醇樹脂(默克公司製造)、Wang樹脂(默克公司製造)、HMPA-PEGA樹脂(默克公司製造)等。又，Amino-PEGA樹脂與胺基酸之間可有連結基存在，該等連結基可列舉例如4-羥基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。亦可使用在C末端之胺基酸預先結合於樹脂之H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG樹脂(默克公司製造)等。
又，將C末端醯胺化時，例如可使用以胺基官能化之Rink-Amide-PEGA樹脂(默克公司製造)。經由以酸切斷該樹脂與胜肽，可將胜肽之C末端胺基酸醯胺化。
樹脂與以脂溶性保護基保護胺基氮原子之胺基酸之結合，例如在使用具有羧基之樹脂或以氯原子官能化之樹脂，則可將胺基酸之羧基與樹脂進行酯結合。又，使用以胺基官能化之樹脂時，胺基酸之羧基經由醯胺鍵結結合於樹脂。
又，2-氯三苯甲基氯樹脂於固相合成中將胜肽鏈延長時，以可防止在末端之Cys消旋化之點而言較佳。
胺基酸可使用所有之胺基酸，可列舉例如為天然胺基酸之絲胺酸(Ser)、天冬醯胺(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸 (Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺(Gln)、酥胺酸(Thr)、半胱胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、苯基丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)。
脂溶性保護基可列舉例如9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、第三丁基氧基羰基(Boc)、苯甲基、烯丙基、烯丙基氧基羰基、乙醯基等之碳酸酯系或醯胺系之保護基等。在胺基酸中導入脂溶性保護基，例如導入Fmoc基時，可經由加入9-芴基甲基-N-琥珀亞胺基碳酸酯及碳酸氫鈉，進行反應而導入。反應以於0至50℃，較好於室溫進行約1至5小時較佳。
以脂溶性保護基保護之胺基酸可使用市售品。可列舉例如Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH、Boc-Ser-OH、Boc-Asn-OH、Boc-Val-OH、Boc-Leu-OH、Boc-Ile-OH、Boc-Ala-OH、Boc-Tyr-OH、Boc-Gly-OH、Boc-Lys-OH、Boc-Arg-OH、Boc-His-OH、Boc-Asp-OH、Boc-Glu-OH、Boc-Gln-OH、Boc-Thr-OH、Boc-Cys-OH、Boc-Met-OH、Boc-Phe-OH、Boc-Trp-OH、Boc-Pro-OH。
又，作為以脂溶性保護基保護之胺基酸，在側鏈導入保護基者可列舉例如Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Boc-Met-OH、Boc-Thz-OH。又，於本說明書中，Thz表示Cys之噻唑烷型(Thiazolidine-4-carboxylic acid)。
又，經由固相合成等合成胜肽片段時，作成N末端以Boc基保護之胺基酸，從在胜肽片段合成後需要硫酯化時，可抑制因胺基引起之親核反應所導致之副反應之點而言較佳。
又，在加成糖鏈之多胜肽之胺基酸序列中，欲加成連結基時，在固相合成之過程中使用經脂溶性保護基保護之連結基替代上述以脂溶性保護基保護之胺基酸，即可在較佳位置插入連結基。
使用具有羥基之樹脂時，作為酯化觸媒可使用例如1-均三甲苯基磺醯基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二環己基碳二亞胺(DCC)、二異丙基碳二亞胺(DIPCDI)等公知之脫水縮合劑。又，使用2-氯三苯甲基氯樹脂時，可使用二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等鹼進行酯化。胺基酸與脫水縮合劑之使用比例對於胺基酸1重量份，脫水縮合劑通常為1至10重量份，較好為2至5重量份。
酯化反應較好經由例如在固相管柱放入樹脂，將該樹脂以溶劑洗淨後，加入胺基酸溶液進行。洗淨用溶劑可列舉例如二甲基甲醯胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。將胺基酸溶解之溶劑可列舉例如二甲亞碸(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反應以於0至50℃，較好於室溫進行約10分鐘至30小時，較好約15分鐘至24 小時較佳。
又，此時較好將固相上未反應之羥基使用乙酸酐等進行乙醯化覆蓋(capping)。
脂溶性保護基之脫離可經由例如用鹼處理進行。鹼可列舉例如哌啶、嗎啉等。此時，較好在溶劑存在下進行。溶劑可列舉例如DMSO、DMF、甲醇等。
游離胺基與胺基氮原子以脂溶性保護基保護之任意胺基酸之羧基之醯胺化反應較好在活化劑及溶劑存在下進行。
活化劑可列舉例如二環己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲胺基丙基)碳二亞胺．鹽酸鹽(WSC/HCl)、二苯基磷醯基疊氮化物(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、二乙基氰基膦酸鹽(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯啶基鏻(DIPCI)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯啶基鏻六氟磷酸鹽(PyBOP)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、羥基琥珀醯亞胺(HOSu)、二甲胺基吡啶(DMAP)、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)、羥基酞醯亞胺(HOPht)、五氟苯酚(pentafluorophenol)(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)、1-[雙(二甲胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三氮唑鎓3-氧化六氟磷酸鹽(HCTU)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓六氟磷酸鹽(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲鎓四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-羥基-4-氧雜-1,2,3-苯并三(Dhbt)等。
對於胺基氮原子以脂溶性保護基保護之任意胺基酸，活化劑之使用量為1至20當量，較好為1至10當量，更好為1至5當量較佳。
溶劑可列舉例如DMSO、DMF、二氯甲烷等。反應以於0至 50℃，較好於室溫進行約10至30小時，較好約15分鐘至24小時較佳。脂溶性保護基之脫離可與上述同樣進行。
從樹脂切斷胜肽鏈較好以酸進行處理。酸可列舉例如三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)、三氟乙酸(TFA)、氟化氫(HF)等。
胜肽片段係如上所述，經由固相合成等化學合成即可製作，亦可根據業者公知之生合成方法調製。例如，在重組載體(vector)中導入目的之基因，即可表現目的之胜肽片段。本發明使用之重組載體只要是可將宿主細胞轉形者即可，依宿主細胞而使用大腸菌用之質體、枯草菌用之質體、酵母用之質體、反轉錄病毒、疫苗(vaccin)病毒、桿狀病毒等之動物病毒載體等。該等較好為在該宿主細胞具有可將蛋白質適當表現之具有起動子(promotor)等控制序列者。又，宿主細胞只要是可在重組載體表現外來性基因者即可，通常使用大腸菌、枯草菌、酵母、昆蟲細胞、動物細胞等。
在宿主細胞移入重組載體之方法可使用通常常用之方法，例如為大腸菌時，可利用熱休克法、氯化鈣法或電穿孔法，為酵母時可利用氯化鋰法或電穿孔法。又，動物細胞之轉形可使用電穿孔等之物理方法、脂質體法或磷酸鈣法等之化學方法或反轉錄病毒等之病毒載體進行。又，導入載體後，較好經由業者周知之方法確認目的之DNA序列正確編入。轉形體之宿主細胞之培養形態只要考慮宿主之營養生理學性質，選擇培養條件即可。
又，經由生合成製作之胜肽較好經精製。胜肽之精製方法可經由通常之一般精製進行。例如，若為重組蛋白質，將表現本發明使用之重組蛋白質之菌體或細胞培養後以公知之方法收集菌體或細胞，懸濁於適當之緩衝液，經由超音波、溶菌酶及/或凍結融 解等將菌體或細胞破壞後經由離心分離或過濾，調製胜肽之粗萃取液。緩衝液中可含有尿素、鹽酸胍等之蛋白質變性劑或TritonX-100TM等之界面活性劑。由此操作獲得之萃取液或培養上清液中所含之胜肽之精製，可根據公知之精製方法進行。例如，可經由適當選擇親和層析法、離子交換層析法、過濾器、超過濾、凝膠過濾、電泳、鹽析、透析等組合，進行胜肽之分離、精製。
為了使重組蛋白質之精製容易，可先在表現載體中編入種種標識(tag)。標識之例可使用提昇表現效率之標識或提昇精製效率之標識等業者周知之標識，可列舉例如硫氧還蛋白(thioredoxin)、GST標識、Myc標識、FLAG標識、麥芽糖結合蛋白質(MBP)等。
在胜肽片段所期望之N末端不存在接合使用之半胱胺酸時，可在該部位導入半胱胺酸。例如，包含對宿主細胞中導入之核酸分子之易錯聚合酶鏈反應(error-prone PCR)、部位特異性變異導入、組合聚合酶鏈反應(assembly PCR)、DNA重排(DNA shuffling)、體內變異導入、盒式變異(cassette mutagenesis)導入、折回整體變異(recursive ensemble mutagenesis)導入及指數整體變異(exponential ensemble mutagenesis)導入，惟，不只限於此，經由於該技術領域周知之任意變異導入法可在所期望的位置變異為半胱胺酸。
又，於經由上述之生合成製作之胜肽片段中，胺基酸側鏈之保護為較佳時，可以業者周知之方法進行保護，例如保護半胱胺酸時，可以甲醛等將N末端之半胱胺酸保護，使用S-9-芴基甲基硫醚(S-9-Fluorenyl methyl thioether)(Fm-SR)等將胜肽中之Cys殘基側鏈硫醇基選擇性保護。
(各片段之連結)
將以上述之方法製作之加成糖鏈之胜肽片段與胜肽片段連結之步驟可使用如上所述，可將2個胜肽片段鏈連結之任意公知之方法，可列舉例如自然化學接合(NCL，參照日本特表2004-518621等)。NCL為將C末端具有硫酯之胜肽片段A與N末端具有半胱胺酸之胜肽片段B在緩衝溶液中混合，經由胜肽片段B之N末端具有之半胱胺酸之氫硫基之親核攻撃，將胜肽AC末端之硫酯基脫離，接著經由胺之親核攻撃，將2個胜肽之間藉由天然之胜肽鍵結進行連結之方法。
因此，如上所述，在連結步驟使用NCL時，將位於N末端側之多胜肽C末端硫酯化之步驟需要在連結步驟之前。相關之硫酯化可以例如將C末端之羧酸用PyBOP及DIPEA活化，並加入過剩量之烷基硫醇而達成。使用該方法時，為了抑制片段末端胺基酸之α碳原子之立體配置，烷基硫醇之添加較好於10℃至-80℃之低溫進行，更好於0℃至-40℃之溫度進行。尤其在上述硫酯化之反應，以使用苯硫酚替代烷基硫醇較佳。經由添加苯硫酚引起之硫酯化反應，反應速度快，可使反應大致完成。因此，於硫酯反應中，由於可抑制胜肽片段環化反應之副反應，較佳。
又，上述硫酯化亦可根據Yamamoto et al.,J.Am.Chem.Soc.2008,130(2),501-510記載之Fmoc法或Boc法等進行。
NCL較好將等莫耳量之結合糖鏈部分之多胜肽鏈與未結合糖鏈部分之多胜肽鏈在緩衝溶液中混合而進行。於較佳之態樣中，接合反應係在具有pH值為6至8之緩衝液中實施，較佳之pH範圍為6.5至7.5。該緩衝液可為水性、有機性或其混合物。接合反應可更含有1種或2種以上之觸媒及/或1種或2種以上之還原 劑、脂質、其他改性劑或可溶化劑等。較佳觸媒之例可列舉含有硫醇及膦之物質，可列舉例如苯硫酚、苯甲基硫醇、TCEP及烷基膦等。改性劑及/或可溶化劑之例包含胍、尿素水溶液或TFE、HFIP、DMF、NMP等有機溶劑溶液、水、或與胍及尿素水溶液混合之乙腈。接合反應之速度可經由溫度而調節，通常可於5至55℃、較好於15至40℃進行。尤其是IFN-β之接合反應較好以6至8M胍之條件進行，例如於使用含有6M胍，pH值為6.8至7.8之緩衝液及1至3%苯硫酚之反應系中可良好進行。
又，接合步驟後之生成物與原料之分離困難時，例如可利用過剩量之反應性高之C末端苯硫酯體，將成為接合連結點之半胱胺酸之硫醇基預先硫酯化。如此，將經由接合所生成之胜肽側鏈之硫醇基進行硫酯化，可提高生成物之脂溶性或水溶性，而容易分離。
又，經由該操作，生成過剩硫酯化之硫醇基時，使用巰基乙磺酸鈉等，可容易的回復為硫醇基。
又，設計將Ala作為N末端之各片段時，經由上述之方法可製造在N末端之Ala之位置具有替代之Cys之加成糖鏈之多胜肽。因此，於該等情況，於所製作之加成糖鏈之多胜肽中，將必需還原之胺基酸(Cys)經由還原反應回復為Ala較佳。
該等將Cys還原為Ala之方法可使用自由基還原、氫化物還原等方法，尤其以自由基還原較佳。
自由基還原反應例如可經由在含有胜肽片段之TCEP等溶劑中添加tBuSH、2-巰基乙磺酸鈉或麩胱甘肽進行。自由基還原反應中使用之溶劑可使用水、有機溶劑(乙腈等)、緩衝液(磷酸緩衝 液等)等，具體而言可列舉例如三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)。又，溶劑中可含有可溶化劑，例如較好為含有6M至8M胍者。又，自由基還原反應較好在pH7.5至pH8.0之範圍進行，反應溫度較好於-15至40℃進行。pH若低於7.5，則由於反應不能完全，不佳。又，反應時間可為2至6小時。若超過6小時，則波峰開始衰減，不佳。自由基還原反應之例可使用7M胍、0.25M TCEP，在pH值為7.5、20℃、4小時之條件下進行。
又，於自由基還原反應中，不宜被還原之Cys可經由保護基保護。該等保護基可使用Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、第三丁基、苯甲基及β位經取代之乙基等公知之保護基。
自由基還原反應為了使反應完全，較好採用放入反應溶液之死體積變小之反應容器。
又，上述還原步驟之後、有以Acm基等保護之Cys時，進行Cys之脫保護。
脫保護之步驟例如於Cys之保護基為Acm基時，經由在水、甲醇、乙酸或該等之混合溶液中使用碘、乙酸汞(Ⅱ)、硝酸銀(I)或乙酸銀(I)等進行反應即可脫保護。又，保護基為烷氧基甲基時，使用酸水解或銀鹽、汞鹽等即可脫保護。保護基為三苯基甲基時，使用汞(Ⅱ)鹽等即可脫保護。
上述反應通常於0至80℃，較好於5至60℃，最好於10至35℃進行。反應時間較好通常為約5分鐘至24小時。其他保護基亦可經由業者所周知之方法脫保護。又，反應完成後經由二硫酥糖醇(dithiothreitol)(DTT)或鹽酸等處理後以適當之公知方法(例如，高效液體管柱層析法(HPLC)精製較佳。
又，設計將Ser作為N末端之各片段時，經由上述之方法，製造具有在N末端Ser之位置以Cys替代之加成糖鏈之多胜肽。因此，於該等情況，在製作之加成糖鏈之多胜肽中，將必需轉換為Ser之胺基酸(Cys)在接合後轉換為Ser。
該等轉換步驟可經由例如Cys上之-SH基之甲基化反應、氰化反應及接著的分子內醯基重排反應進行。
具體而言，上述轉換步驟包含：(1)於含有Cys之胜肽中，使甲基化劑與Cys之-SH基進行反應，形成-SMe基(甲基化)步驟、(2)將(1)步驟獲得之胜肽上之-SMe基與氰化劑進行反應(氰化反應)、該反應之後將該胜肽在鹼性條件下將-SMe基經由反應中間體轉換為-OH基(分子內醯基重排反應)步驟。又，該等轉換步驟記載於例如國際公開2009/017154，該揭示作為全體，編入本說明書作為參照。
作為Cys之-SH基甲基化反應中使用之甲基化劑只要可將-SH基轉換為-SMe基者即可，並無特別限制，可列舉例如碘甲烷、甲基-4-硝基苯磺酸酯等。
對於原料胜肽或原料糖胜肽之半胱胺酸殘基1殘基，甲基化劑之使用量為1至1000當量。較好為10至100當量。更好為15至30當量。甲基化反應以於0至50℃、較好於20至30℃進行約10分鐘至30小時，較好15分鐘至1小時較佳。
溶劑可為緩衝溶液，其pH值為7至9者，較好為8至9者。可列舉例如6M胍鹽酸液、0.25M Tris鹽酸液、3.3mM EDTA溶液經調整pH值為8.6之緩衝溶液等。
氰化劑例如從安定性等之觀點而言，可使用溴化氰、苯基氰 酸酯等，較好可使用容易取得之溴化氰。
對於-SMe基1殘基，氰化劑之使用量可為1至1000當量，較好為10至100當量。更好為15至30當量。氰化劑之反應以於0至50℃、較好於30至40℃進行約30分鐘至100小時，較好宜為12小時至50小時。
與氰化劑之反應在酸性條件下進行，較好於pH值為2至3進行。酸性水溶性物質具體而言可依使用甲酸、三氟乙酸、甲磺酸等之使用，即可使反應在酸性條件下進行。此時使用之酸性水溶性物質為了防止硫原子氧化，以經脫氣者較佳。又，從氰化劑安定性之觀點而言，反應較好在遮光下進行。
溶劑可適當使用上述之pH值為2至3之水溶性溶劑，例如80%甲酸溶液、70%甲酸溶液、含有2%三氟乙酸/39%乙腈之水溶液等。
又，於胜肽中含有甲硫胺酸殘基作為胺基酸時，較好將甲硫胺酸殘基之-SMe基與甲基化反應獲得之-SMe基區別。該區別可經由例如導入保護基進行。於本說明書中，導入保護基之甲硫胺酸(保護甲硫胺酸)只要為在氰化反應中不會與氰化劑產生反應之化合物即可，並無特別限制，可列舉例如亞碸型甲硫胺酸(Met(O)：-CH2-CH2-S(=O)-CH3)。氰化反應後或分子內醯基重排反應後，保護甲硫胺酸殘基可轉換為甲硫胺酸殘基。又，脫保護之方法可經由業者周知之方法適當進行。
分子內醯基重排反應可在與氰化反應時相較更為鹼性之條件下進行。經由此，可獲得包含具有-OH基之胺基酸殘基之胜肽。
分子內醯基重排反應中之鹼性條件只要與氰化反應比較為更 鹼性之條件即可，可為酸性或中性，更特定而言只要在鄰接氰化反應獲得之反應中間體之酯鍵結之C原子上之-NH2基不會被質子化之條件即可。從可效率佳的進行將反應中間體轉換為具有-OH基之胜肽之觀點而言，可使用弱鹼性條件或強鹼性條件。
鹼性條件可經由添加業者公知之pH調整劑之鹼性化合物(胍、磷酸二鈉、Tris、碳酸氫鈉、肼含水物、50mM氫氧化鈉水溶液等)進行。此時，鹼性化合物之使用量對於原料胜肽可為0.5至1000當量，較好為10至100當量，更好為15至30當量。
分子內醯基重排以在0至50℃，較好在20至30℃進行約5分鐘至30小時，較好約5分鐘至1小時，更好約5分鐘至10分鐘較佳。
反應之完成可經由降低pH值進行。又，亦可在不變更pH值下移至經由HPLC之精製步驟。
又，選擇酥胺酸(Thr)作為胜肽片段之N末端時，可將具有-SH基之酥胺酸(Thr)衍生物(或該-SH基經由二硫鍵等保護之酥胺酸衍生物)殘基替代Cys，導入胜肽片段之N末端。導入酥胺酸衍生物之胜肽片段接合後經由供給上述之甲基化反應、氰化反應及分子內醯基重排反應，可將該胜肽片段中之酥胺酸衍生物置換為酥胺酸。
又，在胜肽片段中導入具有唾液酸之糖鏈時，較好使用導入之糖鏈上唾液酸之羧基經由包含苯甲基(Bn)之芳基、包含乙基(Et)或甲基(Me)等之烷基、二苯基甲基、苯醯甲基、烷氧基或硝基等形成環構造之碳原子側鏈經取代之以苯醯甲基等保護之含有唾液酸之糖鏈。更具體而言，例如唾液酸之羧基較好為如-COOBn、 -COOEt、-COOMe、-COOCH(Ph)2、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2PH(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2表示的經保護之保護基。如此，將唾液酸之羧基以苯甲基等保護，可防止對酸為不安定之唾液酸脫離。尤其是於進行後述之加熱處理時，亦可防止唾液酸從糖鏈非還原末端脫離。又，在唾液酸之羧基導入保護基使製造步驟中經由HPLC等之分離/精製步驟變容易。
糖鏈上唾液酸之羧基之保護反應可經由業者周知之方法進行。例如經由苯甲基、二苯基甲基、苯醯甲基保護之唾液酸之羧基保護基之脫保護亦可經由業者周知之方法進行。例如，脫保護之反應不只限於以下者，可在鹼性條件下經由水解進行。脫保護之反應通常於0至50℃，較好於0至40℃，更好於0至30℃進行。反應時間較好通常為約5分鐘至5小時。反應完成後經由磷酸或乙酸等弱酸中和後以適當、公知之方法(例如，高效液體管柱層析法(HPLC))精製較佳。又，唾液酸羧基之保護基之脫保護步驟可在摺疊步驟之前或摺疊步驟之後進行。
又，於製造上述表示之干擾素β之各步驟，可作成1鍋法(one-pot)合成。例如，作成複數個片段，經由複數次之接合步驟製造干擾素β時，可將複數之接合步驟作成1鍋法合成。另，於片段接合後半胱胺酸之還原步驟為必要時，除了複數之接合步驟之外，之後之半胱胺酸還原步驟亦可以1鍋法合成。
另，接合步驟(必要時，半胱胺酸之還原步驟等)之後必要之半胱胺酸之脫保護步驟及糖鏈唾液酸之脫保護步驟亦可作成1鍋法合成。例如，經由將本專利申請說明書中實施例2及3中記載之第1步驟之接合及第2步驟之接合作成1鍋化，可將收率提昇 約1.6倍。
如此，經由將製造步驟1鍋化，減少HPLC之步驟，可縮短製造步驟之時間及簡便化，更可提昇收率，較佳。
(摺疊步驟)
可包含經由上述方法加成糖鏈之胜肽片段與胜肽片段結合必要之胺基酸之取代步驟，或於脫保護步驟之後將所有部分連結之加成糖鏈之多胜肽進行摺疊之步驟。摺疊步驟可使用種種公知之方法，惟，不只限於此，例如可包含在摺疊緩衝液中之透析。摺疊緩衝液並無限制，可含有例如麩胱甘肽、胱胺酸-半胱胺酸、胍等具有胍基之化合物或其鹽，pH值為6.0至9.0。透析可進行複數次，又，各透析處理之摺疊緩衝液之組成或pH值可相同，亦可不同。
更具體而言，例如經由3次透析進行摺疊步驟時，可將第1次之透析在含有8M胍，pH值為8.0至9.0之溶液中進行0.5至6小時，第2次之透析條件為在含有2M至4M胍，pH值為8.0至9.0之溶液中進行6至24小時，第3次之透析在含有1mM至20mM乙酸水溶液，pH值為2.0至4.0之溶液中進行6至24小時。
又，摺疊步驟中使用之摺疊緩衝液中含有氧化型及還原型之麩胱甘肽時，較好將氧化型及還原型之濃度比根據加成於多胜肽之糖鏈種類適當變更。例如，糖鏈為二唾液酸糖鏈時，摺疊緩衝液中所含之麩胱甘肽氧化型與麩胱甘肽還原型之比，較好在1：1至4：1之範圍內，更好為1：1至3：1，最好為2：1。又，糖鏈為無唾液酸糖鏈時，麩胱甘肽氧化型與麩胱甘肽還原型之比，較好在4：1至16：1之範圍內，更好在6：1至10：1之範圍內， 最好為8：1。
又，在摺疊前將原料溶解時藉由將原料作成低濃度，可抑制在不期待之部位形成二硫鍵或凝集等。
多胜肽摺疊可以解析多胜肽之立體構造之任意方法確認，惟，不只限於此，包含二硫鍵映對法(mapping)、立體構造抗原決定部位(epitope)對特異性抗體之結合性之評估、X射線解析等。
(加熱處理)
經由上述方法製造之加成糖鏈之多胜肽可進行加熱處理。加熱處理較好在摺疊步驟之前進行。又，於糖鏈多胜肽中，在糖鏈之非還原末端具有唾液酸時，較好在唾液酸之羧基以苯甲基等保護之狀態進行加熱處理。
加熱處理可在例如在含有6M至10M之胍(Gn)，pH值為3.5至7之緩衝溶液中，於40℃至60℃之溫度條件進行約24至72小時。進行加熱處理可將有污染之慮之HIV、HCV、HBV等有包膜病毒鈍化。因此，本發明加成糖鏈之多胜肽即使加上加熱處理，亦可維持其干擾素β活性。
又，半胱胺酸之硫醇基由於經由加熱處理產生副反應之可能性高，在加熱處理步驟中較好先將半胱胺酸之硫醇基以Acm基等保護。
(活性)
本發明加成糖鏈之多胜肽具有干擾素β活性。於本說明書中，「干擾素β活性」係指具有免疫調整作用、抗病毒活性、抗腫瘤活性等公知之活性中之至少1種活性。
例如，加成糖鏈之多胜肽之干擾素β活性可使用實施例12記 載之抗腫瘤活性測定試驗等測定。
抗腫瘤活性之測定試驗例如對具有腫瘤之老鼠，皮下投予作為對象之加成糖鏈之多胜肽，經由測定經時性腫瘤體積即可進行研究。
又，本發明加成糖鏈之多胜肽可提供具有90%以上之純度者。本發明加成糖鏈之多胜肽更好具有95%、97%、98%、99.0%、99.5%以上之純度。
於本說明書中，加成糖鏈之多胜肽之純度係指將從製作目的之加成糖鏈之多胜肽時之總收量(g)扣除未反應物等不純物之收量(g)，除以製作加成糖鏈之多胜肽時之總收量之值乘以100之值。又，製作加成糖鏈之多胜肽時之總收量，更具體而言係指在摺疊步驟之後，經由HPLC之生成物分離步驟獲得之目的加成糖鏈之多胜肽區分之收量。又，不純物等亦包含糖鏈構造不相同之加成糖鏈之多胜肽。
又，作成含有本發明加成糖鏈之多胜肽之組成物時，加成糖鏈之多胜肽之純度係指與組成物中所含之其他成分區別，在組成物中作為1成分之含有加成糖鏈之多胜肽本體之純度。
該等含有高純度之加成糖鏈之多胜肽之組成物品質一定，尤其是在醫藥品之製造或分析等領域較佳。
又，加成糖鏈之多胜肽之純度可經由HPLC分析測定。經由HPLC測定之加成糖鏈之多胜肽之純度可以HPLC區域面積%表示。
(醫藥組成物)
接著，對含有本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫藥 組成物加以說明。
含有本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫藥組成物在干擾素β關連之疾病之治療或預防上有效。如上所述，干擾素β已知有種種作用，關連該等作用之疾病亦有種種。例如，干擾素β關連之疾病包含例如膠芽腫、髓芽腫及星細胞腫等之腦腫瘤，皮膚惡性黑色腫、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝硬變及多發性硬化症等。含有本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫藥組成物在上述疾病之治療或預防上有效。
又，含有本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫藥組成物之投予對象為任意之生物個體，較好為動物，更好為哺乳動物，最好為人類之個體。
上述醫藥組成物為使用通常使用之填充劑、增量劑、結合劑、濕潤劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等之稀釋劑或賦形劑，製劑成通常醫藥組成物之形態。
該等醫藥組成物可列舉例如錠劑、丸劑、散劑、液劑、懸濁劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、吸入劑、點眼劑、注射劑等。
醫藥組成物中所含之本發明加成糖鏈之多胜肽之量並無特別限制，可在廣範圍內適當選擇，通常，在醫藥組成物中，本發明加成糖鏈之多胜肽以含有1至90重量%較佳，更好含有1至70重量%。
含有本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫藥組成物亦可另含有其他有效成分，亦可與含有其他有效成分之醫藥組成物組合使用。又，含有本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫 藥組成物亦可含有將加成糖鏈之多胜肽作成藥學上容許之鹽者，另，亦可含有不同之1種以上本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分。又，亦可與含有不同之1種以上本發明加成糖鏈之多胜肽作為有效成分之醫藥組成物組合使用。又，醫藥組成物中可含有之其他成分可列舉業者周知之藥學上容許之載體等。
本發明相關之醫藥組成物之投予方法並無特別限制，可以對應各種製劑形態、病患之年齢、性別、疾病之狀態、其他條件之方法投予。為錠劑、丸劑、液劑、懸濁劑、乳劑、顆粒劑及膠囊劑時之投予方法可列舉例如經口投予。又，為注射劑時，可單獨或與葡萄糖、胺基酸等通常之補助液混合，在靜脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹腔內投予。為栓劑時，可在直腸內投予。為點眼劑時，適用於結膜嚢等之眼組織。為吸入劑時，適用於支氣管或肺。
上述醫藥組成物之投予量只要對應用法、病患之年齢、性別、疾病之程度、其他條件適當選擇即可，例如，對於體重1公斤，本發明加成糖鏈之多胜肽之投予量可為0.001至9nmol，較好為0.01至0.2nmol。
上述醫藥組成物之投予次數只要對應用法、病患之年齢、性別、疾病之程度、其他條件適當選擇即可，例如3次/1日、2次/1日、1次/1日，另對應其血中安定性，可選擇更少頻率之投予次數(例如，1次/週、1次/月等)。較好，上述醫藥組成物之投予次數為1次以下/1日。
本發明加成糖鏈之多胜肽中加成之糖鏈在體內之代謝系容易分解。又，於本發明之一態樣中，該糖鏈具有在生體內作為糖胜 肽(或糖蛋白質)結合存在之構造。因此，含有本發明加成糖鏈之多胜肽及該胜肽作為有效成分之醫藥組成物具有即使在生體內投予，亦未顯示副作用或抗原性，亦無因過敏反應或產生抗體而導致不能得到藥效之慮之利點。
另，本發明加成糖鏈之多胜肽安定，可簡便的大量供給，從提供品質安定之高品質醫藥品之觀點而言，非常有用。
本發明之另一特徵係投予有效量之本發明加成糖鏈之多胜肽，而提供干擾素β關連之疾病之治療或預防方法。
又，本說明書中使用之用語為用於說明特定之實施態樣，並不是意圖限制發明。
又，本說明書中使用之「包含」之用語除了文意上明顯不同理解之情況，意指所敍述之事項(材料、步驟、要素、數字等)存在，而並未排除該等以外之事項(材料、步驟、要素、數字等)存在。
只要是不同之定義，此處使用之所有用語(包含技術用語及科學用語)具有與本發明所屬技術之業者可廣泛理解之相同意義。此處使用之用語只要未明示不同之定義，可解釋為具有與本說明書及相關技術領域中之意義整合之意義者，並非解釋為理想化或過度形式化之意。
雖有參照模式圖對本發明之實施態樣加以說明之情形，惟，為模式圖時，為了明確的說明，有誇張表現之情形。
為了表現種種之要素，使用第一、第二等之用語，惟，應理解該等要素不只限於該等用語。該等用語僅係用於將1個要素與其他要素區別，例如將第一要素以第二要素記載，同樣的，第二 要素以第一要素記載，亦為不脫離本發明之範圍。
以下，參照實施例對本發明作更詳細之說明。惟，本發明可根據種種形式更具體化，不只限於此處記載之實施例。
[實施例]
於下述之實施例中例示將干擾素β之胺基酸序列中第1-166個之胺基酸分為具有第1位至第67位之胺基酸之胜肽片段A、具有第68位至第88位之胺基酸之糖胜肽片段B、具有第89位至166位之胺基酸之胜肽片段C之3個片段而製造之方法。
更具體而言，例示包含下述步驟之製造方法：
(I)製作下述式(d)表示之胜肽片段A、下述式(e)表示之糖胜肽片段B及下述式(f)表示之胜肽片段C之步驟。
(Ⅱ)將片段B及片段C經由接合連結，作成片段(B+C)，將片段(B+C)N末端之噻唑烷型半胱胺酸轉換為半胱胺酸之步驟(參照第1圖)。
(Ⅲ)將片段A及片段(B+C)經由接合連結，作成片段(A+B+C)之步驟(參照第2圖)、
(Ⅳ)於片段(A+B+C)中，將用於接合之半胱胺酸還原為丙胺酸之步驟(參照第3圖)。
(Ⅳ)將半胱胺酸之保護基脫保護之步驟(參照第4圖)
又，於各片段中，於經由接合之連結所使用之C末端為經硫酯化，經由接合之連結所使用之N末端具有半胱胺酸。又，上述式(Ⅱ)表示之糖胜肽片段B於C末端側中之接合步驟，為了避免副反應，係將N末端側之半胱胺酸作成噻唑烷型。
上述片段B及片段C之N末端之胺基酸成為干擾素β中第68位及第89位之丙胺酸。惟，由於接合需要半胱胺酸，於上述製造例中，將片段B及片段C之N末端胺基酸以半胱胺酸替代丙胺酸而合成，接合後再還原為丙胺酸。
又，於本說明書中，例如片段(A+B)係指片段A與片段B連結者。
實施例1 各胜肽片段之合成
(1-1.胜肽片段A-SPh之合成)
於固相合成用管柱中放入Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨後以DMF充分膨潤。將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啉(0.25 mmol)溶解於DMF(2mL)，放 入管柱中，於室溫攪拌4小時。以DMF及DCM將樹脂充分洗淨，獲得HMPB-PEGA樹脂，作為固相合成之固相使用。
將Fmoc-Phe(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，後續胜肽鏈之延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基及Boc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。
依序使用Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Met，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ile，Fmoc-Leu-Thr(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Ala，Fmoc-Ala，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Phe，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ile，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Pro，Fmoc-IleFmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Met，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)， Fmoc-Leu，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Phe，Fmoc-GlyFmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Boc-Met，作為以Fmoc基及Boc基保護之胺基酸連結於固相樹脂。其結果，在固相樹脂獲得Phe-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Thr(Ψ Me，MePro)-Leu-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Phe-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Pro-Ile-Asp(OtBu)-Phe-Asn(Trt)-Met-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Gln(Trt)-Phe-Asn(Trt)-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Leu-Phe-Gly-Leu-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Met-BocNH之67殘基胜肽(1)(序列編號2)。
將上述獲得之胜肽(1)以DCM及DMF洗淨後，以能將樹脂充分浸泡之程度加入三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與胜肽1切割分離。過濾除去經切割分離之樹脂，反應溶液在減壓下濃縮。將獲得之殘渣濃縮，獲得胺基酸之側鏈經保護之胜肽(1)(序列編號3)：Phe-Ile-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ile-Thr(Ψ Me，MePro)-Leu-Ala-Ala-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Phe-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Lys(Boc)-Ile-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Pro-Ile-Asp(OtBu)-Phe-A sn(Trt)-Met-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Lys(Boc)-Leu-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Leu-Arg(Pbf)-Gly-Asn(Trt)-Leu-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Lys(Boc)-Gln(Trt)-Cys(Acm)-Gln(Trt)-Phe-Asn(Trt)-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Leu-Phe-Gly-Leu-Leu-Asn(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Met-BocNH。
將具有67殘基之胺基酸，且胺基酸側鏈經保護之胜肽(1)相當100μmol移至茄形燒瓶，溶解於DMF(3.0mL)後在氮氣大氣下冷卻至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)後加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接著加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後加入三氟乙酸(0.1mL)，緩緩回到室溫。回到室溫後在減壓下將反應溶液濃縮。獲得之殘渣加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌。2小時後再次將該溶液加入另外準備之二乙醚(150mL)中，沈澱後離心分離，除去溶液部分，獲得含有目的胜肽硫酯體之殘渣。獲得之殘渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等梯度洗提(isocratic elution)5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得C末端為苯硫酯之胜肽片段A-SPh(1)(序列編號4)：H2N-Met-Ser-Tyr-Asn-Leu-Leu-Gly-Phe-Leu-Gln-Arg-Ser-Ser-Asn-Phe-Gln-Cys(Acm)-Gln-Lys-Leu-Leu-Trp-Gln-Leu-Asn-Gly-Arg-Leu-Glu-Tyr-Cys(Acm)-Leu-Lys-Asp-Arg-Met-Asn-Phe-Asp-Ile-Pro-Glu-Glu-Ile-Lys-Gln-Leu-Gln-Gln-Phe-Gln-Lys-Glu-Asp-Ala-Ala-Leu-Thr-Ile-Tyr-Glu-Met-Leu-Gln-Asn-Ile-Phe-SPh。
ESI-MS：C378H581N97O106S6：計算值[M+4H]4+ 2094.16、[M+5H]5+ 1675.53、[M+6H]6+ 1396.44，實測值2094.06、1675.43、1396.17
(1-2.加成二唾液酸糖鏈之胜肽片段B-SPh之合成)
於固相合成用管柱中放入Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨後，以DMF充分膨潤。將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啉(0.25mmol)溶解於DMF(2mL)，放入管柱中，於室溫攪拌4小時。以DMF及DCM將樹脂充分洗淨，獲得HMPB-PEGA樹脂，作為固相合成之固相使用。
將Fmoc-Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序縮合胺基酸。
依序使用以Fmoc基保護之胺基酸，Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)， Fmoc-Glu(OtBu)，在固相樹脂上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)之8殘基胜肽。對於該8殘基胜肽，將Fmoe基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護，以DMF洗淨後在另外準備之離心沉澱管中將二苯甲基二唾液酸糖鏈天冬醯胺(g)(547.8mg，200μmol)及DEPBT(59.9mg，200μmol)溶解於DMF/DMSO(1：1混合溶液，3.33mL)，放入固相合成用管柱中，加入DIPEA(52.3μL，300μmol)，於室溫攪拌18小時。以DMF及DCM洗淨，在固相上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖(dibenzyl-disialooligosaccharide)-FmocNH之9殘基糖鏈胜肽(序列編號5)。
之後，糖胜肽鏈之延長係將上述獲得之固相樹脂上之9殘基糖鏈胜肽之脂溶性保護基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)進行脫保護後，使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸及HOBt(67.6mg，0.50 mmol)、DIPCI(73.1μL，0.475mmol)溶解於DMF(6.3mL)，進行15分鐘活性化後放入固相合成用管柱中，於室溫攪拌1小時後將Fmoc基以 20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理20分鐘進行脫保護。反覆進行該操作，依序將胺基酸縮合。依序使用Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸作為以Fmoc基及Boc基保護之胺基酸，連結於固相樹脂。其結果，在固相樹脂上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN之21殘基之加成糖鏈之胜肽片段(2)(序列編號6)。
之後，以DCM及DMF洗淨後以能將樹脂充分浸泡之程度加入三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與加成糖鏈之胜肽片段切割分離。過濾除去經切割分離之樹脂，反應溶液在減壓下濃縮。將獲得之殘渣濃縮，獲得胺基酸之側鏈經保護之21殘基之糖鏈胜肽(2)(序列編號7)：Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN。
將具有21殘基之胺基酸，胺基酸側鏈經保護之加成糖鏈之胜肽片段(2)相當100μmol移至茄形燒瓶，溶解於DMF(3.0mL)後在氮氣大氣下冷卻至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)後加入PyBOP(260.0mg，0.50 mmol)，接著加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後加入三氟乙酸(0.1mL)，緩緩回到室溫。回到室溫後在減壓下將反應溶液濃縮。獲得之殘渣 加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌。2小時後再次將該溶液加入另外準備之二乙醚(150mL)，沈澱後離心分離，除去溶液部分，獲得含有目的之加成糖鏈之胜肽硫酯體之殘渣。獲得之殘渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→52：48(26分鐘)→5：95(28分鐘)，線性梯度]精製，獲得C末端為苯硫酯(thiophenyl ester)之加成二唾液酸糖鏈之胜肽片段B-SPh(2)(序列編號8)：HN-Thz-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-SPh。 ESI-MS：C209H314N34O96S2：計算值[M+3H]3+ 1635.34、[M+4H]4+ 1226.76、實測值1635.04、1226.51
(1-3.加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B-SPh之合成)
於固相合成用管柱中放入Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨以DMF充分膨潤。將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啉(0.25mmol)溶解於DMF(2mL)，放入管柱中，於室溫攪拌4小時。以DMF及DCM將樹脂充分洗淨，獲得HMPB-PEGA樹脂，作為固相合成之固相使用。
將Fmoc-Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜 肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。
依序使用Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，將以Fmoc基保護之胺基酸連結於固相樹脂上。其結果，在固相樹脂上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)之8殘基胜肽片段(序列編號9)。對於該8殘基之胜肽片段，將Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護，以DMF洗淨後在另外準備之離心沉澱管中將無唾液酸糖鏈天冬醯胺衍生物(h)(547.8mg，200μmol)及DEPBT(59.9mg，200μmol)溶解於DMF/DMSO(1：1混合溶液，3.33mL)，放入固相合成用管柱中，加入DIPEA(52.3μL，300μmol)，於室溫攪拌18小時。以DMF及DCM洗淨，在固相上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(無唾液酸寡糖(Asialooligosaccharide)-FmocNH之9殘基加成糖鏈之胜肽片段(序列編號10)。
之後，糖胜肽鏈之延長係將上述獲得之固相樹脂上之9殘基糖鏈胜肽之脂溶性保護基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)進行脫保護後，使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。將胺基經Fmoc基保護之胺基酸及HOBt(67.6mg，0.50 mmol)、DIPCI(73.1μL，0.475mmol)溶解於DMF(6.3mL)，進行15分鐘活性化後放入固相合成用管柱中，於室溫攪拌1小時後將Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理20分鐘進行脫保護。反覆進行該操作，依序將胺基酸縮合。依序使用Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸，將以Fmoc基及Boc基保護之胺基酸連結於固相樹脂上。其結果，在固相樹脂上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(無唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN之21殘基之胺基酸側鏈經保護之加成糖鏈之胜肽片段(3)(序列編號11)。
以DCM及DMF洗淨後以能將樹脂充分浸泡之程度加入三氟 乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與加成糖鏈之胜肽片段(3)切割分離。過濾除去經切割分離之樹脂，反應溶液在減壓下濃縮。將獲得之殘渣濃縮，獲得胺基酸之側鏈經保護之加成糖鏈之胜肽片段(3)(序列編號12)：Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(無唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN。
將21殘基之胺基酸側鏈經保護之加成糖鏈之胜肽片段(3)相當100μmol移至茄形燒瓶，溶解於DMF(3.0mL)後在氮氣大氣下冷卻至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)後加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接著加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後加入三氟乙酸(0.1mL)，緩緩回到室溫。回到室溫後在減壓下將反應溶液濃縮。獲得之殘渣加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌。2小時後再次將該溶液加入另外準備之二乙醚(150mL)，沈澱後離心分離，除去溶液部分，獲得含有目的之加成糖鏈之胜肽硫酯體之殘渣。獲得之殘渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→52：48(26分鐘)→5：95(28分鐘)，線性梯度]精製，獲得C末端為苯硫酯之加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B-SPh(3)(序列編號13)：HN-Thz-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Trp-Asn(無唾液酸寡糖)-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-SPh。
ESI-MS：C173H268N32O80S2：計算值[M+3H]3+ 1381.09、[M+4H]4+ 1036.07、實測值1380.90、1035.92
(1-4.胜肽片段C之合成)
於固相合成用管柱中放入Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨並以DMF充分膨潤。將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啉(0.25mmol)溶解於DMF(2mL)，放入管柱中，於室溫攪拌4小時。以DMF及DCM將樹脂充分洗淨，獲得HMPB-PEGA樹脂，作為固相合成之固相使用。
將Fmoc-Asn(Trt)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。依序使用Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Tyr(tBu)， Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Met，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe-Thr(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Val，Fmoc-Lys(Boc)-Thr(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asn(Trt)，Boc-Cys(Trt)作為以Fmoc基及Boc基保護之胺基酸，連結於固相樹脂上。其結果，在固相樹脂上獲得Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Ile-Phe-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Ile-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Ala-Cys(Acm)-His(Trt)-Ser(Ψ Me，MePro)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Lys(Boc)-Leu-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Ile-Arg(Pbf)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Leu-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Met-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Thr(Ψ Me，MePro)-Phe-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu) -Leu-Val-Thr(Ψ Me，MePro)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Asn(Trt)-Ile-Gln(Trt)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Cys(Trt)-BocNH之78殘基之胜肽片段(4)(序列編號14)。
將上述獲得之胜肽片段(4)加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌3.5小時，將樹脂與胜肽片段(4)切割分離後加入另外準備之二乙醚(150mL)中，沈澱後離心分離，將含有作為目的之胜肽片段(4)之沉澱物與溶液部分分開，除去溶液部分後目的物以HPLC確認後以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→65：35(5分鐘)→30：70(35分鐘)→5：95(45分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得作為目的之胜肽片段C(4)(序列編號15)：H2N-Cys-Asn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-Ala-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys(Acm)-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn。
ESI-MS：C441H688N124O114S3：計算值[M+8H]8+ 1206.89,[M+9H]9+ 1072.90,[M+10H]10+ 965.71，[M+11H]11+ 804.93，實測值1206.85，1072.87，965.58，877.90，804.90
實施例2 無唾液酸IFN-β之合成
具有無唾液酸糖鏈之活性IFN-β係依以下表示之5個步驟合成。
(2-1.第1步驟 加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B與胜肽片段C之連結)
將21殘基之C末端為硫苯酯體之加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B(3)(1.8mg)與78殘基之胜肽片段C(4)(2.5mg)二種類放入同一茄形燒瓶中，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.26mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)調製)後加入苯硫酚(7.8μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，在反應溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(0.39mL)(在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液調製)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有糖胜肽片段之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09% TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→65：35(5分鐘)→30：70(35分鐘)→5：95(45分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得目的之干擾素β相當於第80位之位置具有無唾液酸糖鏈之胜肽片段(11)(序列編號16)(第5圖及第6圖)。
ESI-MS：C607H950N156O194S4：計算值[M+10H]10+ 1367.52,[M+11H]11+ 1243.29,[M+12H]12+ 1139.77，[M+13H]13+ 1052.17，[M+14H]14+ 977.09，[M+15H]15+ 912.02，[M+16H]16+ 855.08，[M+17H]17+ 804.84，[M+18H]18+ 760.18，實測值1367.64，1243.33，1139.80，1052.20，977.10，912.03，855.09，804.84，760.18
(2-2.第2步驟 胜肽片段A與加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C) 之連結)
將上述第1步驟獲得之67殘基之C末端為硫苯酯胜肽(1)(2.3mg)及在干擾素β相當於第80位之位置具有無唾液酸糖鏈之胜肽片段(11)(加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C))(68-166)(1.9mg)二種類放入同一茄形燒瓶，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.14mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP溶液調製)後加入苯硫酚(4.2μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，加入巰基乙磺酸鈉(1.1mg)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TEA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(12)(序列編號17)(第7圖及第8圖)。
ESI-MS：C979H1525N253O300S9：計算值[M+17H]17+ 1290.86，[M+18H]18+ 1219.20，[M+19H]19+ 1155.09，[M+20H]20+ 1097.38，[M+21H]21+ 1045.18，[M+22H]22+ 997.71，[M+23H]23+ 954.38，[M+24H]24+ 914.65，[M+25H]25+ 878.11，[M+26H]26+ 844.37，[M+27H]27+ 813.14，[M+28H]28+ 784.13，[M+29H]29+ 757.13，實測值1219.21、1155.11、1097.43、1045.23、997.71、954.43、914.67、878.11、844.37、813.17、784.13、757.16
(2-3.第3步驟 Cys還原為Ala)
將上述第2步驟獲得之第68、89位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(12)(1.0mg)放入茄形燒瓶，溶解於pH值為7.5之緩衝溶液(0.10mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液調製)後加入pH值為7.5之0.5M三乙基羧基膦溶液(TCEP溶液)(0.10mL)(TECP，以6M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺調製)、tBuSH(4.2μL)、0.1MVA-044溶液(4.2μL)(將VA-044溶解於水調製)，於室溫進行反應。4小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取tBuSH後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89位Cys轉換為Ala，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(13)(序列編號18)(第9圖及第10圖)。
ESI-MS：C979H1525N253O300S7：計算值[M+17H]17+ 1287.09，[M+18H]18+ 1215.64，[M+19H]19+ 1151.71，[M+20H]20+ 1094.18，[M+21H]21+ 1042.12，[M+22H]22+ 994.80，[M+23H]23+ 951.59，[M+24H]24+ 911.98，[M+25H]25+ 875.54，[M+26H]26+ 841.91，[M+27H]27+ 810.76，[M+28H]28+ 781.84，[M+29H]29+ 754.92，實測值1287.05、1215.71、1151.76、1094.23、1042.17、994.88、951.64、911.99、875.61、841.95、810.77、781.85、754.94
(2-4.第4步驟 Acm基之脫保護)
將上述第3步驟獲得之第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(13)(0.3mg)放入微量離心管(Eppendorf Tube)中，於90%乙酸水溶液(0.03mL)中溶解後加入乙酸銀(0.10mg)，於室溫及遮光下進行反應。3.5小時後用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。在反應溶液中加入二硫蘇糖醇(1.0mg)，於室溫攪拌5分鐘後離心分離，除去沈澱物，回收上清液。將回收之上清液以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=50：50→50：50(5分鐘)→20：80(35分鐘)→5：95(35.5分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得第17位、31位及141位之半胱胺酸之Acm基經脫保護，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之加成糖鏈之多胜肽(14)(序列編號19)(第11圖及第12圖)。
ESI-MS：Calcd for C970H1510N250O297S7：計算值[M+17H]17+ 1274.55，[M+18H]18+ 1203.80，[M+19H]19+ 1140.49，[M+20H]20+ 1083.52，[M+21H]21+ 1031.97，[M+22H]22+ 985.11，[M+23H]23+ 942.32，[M+24H]24+ 903.10，[M+25H]25+ 867.01，[M+26H]26+ 833.70，[M+27H]27+ 802.86，[M+28H]28+ 774.23，[M+29H]29+ 747.56，實測值1274.62、1203.82、1140.53、1083.55、1032.01、985.15、942.38、903.12、867.05、833.72、802.91、774.29、747.55
(2-5.第5步驟 摺疊步驟)
將上述第4步驟獲得之第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之加成 糖鏈之多胜肽(14)(0.32mg)放入離心沉澱管，溶解於pH值為8.5之緩衝溶液(3.5mL)(以8M胍鹽酸液、0.1mM Tris溶液調製)後於室溫靜置。1小時後將該溶液移至透析膜(Spectra/Pro、MWCO；8000)。將該透析膜放入透析外液A(以3M胍鹽酸液、0.1mM Tris溶液、8mM還原型麩胱甘肽溶液、1mM麩胱甘肽溶液調製)中，於4℃進行透析。12小時後將該透析膜放入透析外液B(以1M胍鹽酸液、0.1mM Tris溶液調製)中，於4℃進行透析。12小時後將該透析膜放入透析外液C(10mM乙酸溶液)中，於4℃進行透析。24小時後將該透析膜從透析外液取出，將透析膜內液移至離心沉澱管。透析膜內液以HPLC分析時，主要高峰之溶出時間從階段透析操作開始時間之17.4分縮短到階段透析操作完成後之11.6分，以ESI-MS測定該高峰時，確認從階段透析操作開始前分子量減少2Da之分子量，此處，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=50：50→50：50(5分鐘)→20：80(35分鐘)→5：95(35.5分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得加成糖鏈之多胜肽(15)(序列編號20)(第13圖及第14圖)。又，以HPLC確認該分取液之純度時，具有99.00%(HPLC區域面積%)之純度(第15圖)。之後，將獲得之加成糖鏈之多胜肽(15)凍結乾燥。對於該凍結乾燥品，在以10mM乙酸水溶液再溶解時用分光光度計(紫外線吸收法)進行糖蛋白質定量及濃度規定，作為體外活性用試樣。又，體內活性用試樣由將含有加成糖鏈之多胜肽(15)，糖蛋白質濃度經規定之10mM乙酸水溶液溶解於作為製劑化用另外準備之緩衝液(以人血清白蛋白 (30mg)、氯化鈉(24.4mg)、磷酸氫鈉水合物(7.53mg)、結晶磷酸二氫鈉(1.41mg))，再次凍結乾燥後用日本藥典注射用水溶解調製。階段透析後HPLCE精製後ESI-MS：Calcd for C970H1508N250O297S7：計算值[M+9H]9+ 2406.37、[M+10H]10+ 2165.83，[M+11H]11+ 1969.03，[M+12H]12+ 1805.03，[M+13H]13+ 1666.25，[M+14H]14+ 1547.31，[M+15H]15+ 1444.22，[M+16H]16+ 1354.02，[M+17H]17+ 1274.43，[M+18H]18+ 1203.68，實測值2406.21、2165.68、1968.85、1804.85、1666.09、1547.16、1444.05、1353.93、1274.39、1203.63
實施例3. 二唾液酸IFN-β之合成
具有二唾液酸糖鏈之活性IFN-β係依以下表示之6個步驟合成。
(3-1.第1步驟 加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B與胜肽片段C之連結)
將21殘基之C末端為硫苯酯體之加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B(2)(2.2mg)與78殘基之胜肽片段C(4)(2.5mg)二種類放入同一茄形燒瓶中，溶解於pH值為7.3之緩衝溶液(0.21mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)調製)後加入苯硫酚(6.2μL)加，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，在反應溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(0.31mL)(在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液調製)，於室溫進行反應。12小時後使用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有糖胜肽片段之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、 A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得目的之干擾素β相當於第80位之位置具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C)(5)(序列編號21)(第16圖及第17圖)。
ESI-MS：C643H996N158O210S4：計算值[M+10H]10+ 1443.10，[M+11H]11+ 1312.63，[M+12H]12+ 1203.33，[M+13H]13+ 1110.84，[M+14H]14+ 1031.57，[M+15H]15+ 962.87，[M+16H]16+ 902.75，[M+17H]17+ 849.70，[M+18H]18+ 802.55，[M+19H]19+ 760.37，實測值1443.78，1312.66，1203.36，1110.84，1031.58，962.86，902.76，849.70，802.55，760.36
(3-2.第2步驟 胜肽片段A與加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C)之連結)
將67殘基之C末端為硫苯酯之胜肽片段A(1)(2.9mg)及上述第1步驟獲得之於干擾素β相當於第80位之位置具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C))(5)(3.3mg)二種類放入同一茄形燒瓶，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.22mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP溶液調製)後加入苯硫酚(7.0μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，加入巰基乙磺酸鈉(2.0mg)，於室溫進行反應。12小時後使用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55： 45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(6)(序列編號22)(第18圖及第19圖)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S9：計算值[M+16H]16+ 1419.15，[M+17H]17+ 1335.73，[M+18H]18+ 1261.58，[M+19H]19+ 1195.23，[M+20H]20+ 1135.52，[M+21H]21+ 1081.50，[M+22H]22+ 1032.38，[M+23H]23+ 987.54，[M+24H]24+ 946.44，[M+25H]25+ 908.62，[M+26H]26+ 873.71，[M+27H]27+ 841.39，[M+28H]28+ 811.37，[M+29H]29+ 783.43，[M+30H]30+ 757.35，實測值1419.12，1335.73，1261.55，1195.21，1135.48，1081.49，1032.35，987.51，946.42，908.61，873.70，841.39，811.36，783.42，757.36
(3-3.第3步驟 Cys還原為Ala)
將上述第2步驟獲得之第68、89位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(6)(4.0mg)放入茄形燒瓶中，溶解於pH值為7.5之緩衝溶液(0.28mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液調製)後加入pH值為7.5之0.5M三乙基羧基膦溶液(TCEP溶液)(0.28mL)(TECP，以6M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺調製)、加入tBuSH(28μL)、0.1MVA-044溶液(28μL)(將VA-044溶解於水調製)，於室溫進行反應。4小時後使用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取tBuSH後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液 A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89位Cys轉換為Ala，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(7)(序列編號23)(第20圖及第21圖)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S7：計算值[M+18H]18+ 1258.02，[M+19H]19+ 1191.86，[M+20H]20+ 1132.32，[M+21H]21+ 1078.44，[M+22H]22+ 1029.47，[M+23H]23+ 984.75，[M+24H]24+ 943.76，[M+25H]25+ 906.05，[M+26H]26+ 871.24，[M+27H]27+ 839.01，[M+28H]28+ 809.08，[M+29H]29+ 781.22，實測值1258.02，1191.86，1132.31，1078.39，1029.43，984.73，943.76，906.04，871.25，839.01，809.06，781.17
(3-4.第4步驟 Acm基之脫保護)
將上述第3步驟獲得之第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(7)(2.9mg)放入微量離心管中，於90%乙酸水溶液(0.13mL)中溶解後加入乙酸銀(0.43mg)，於室溫及遮光下進行反應。3.5小時後使用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。在反應溶液中加入二硫蘇糖醇(3.0mg)，於室溫攪拌5分鐘後離心分離，除去沈澱物，回收上清液。將回收之上清液以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=50：50→50：50(5分鐘)→20：80(35分鐘)→5：95(35.5分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得第17位、31位及141位之Acm基經脫保護，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈 之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(8)(序列編號24)(第22圖及第23圖)。
ESI-MS：Calcd for C1006H1556N252O313S7：計算值[M+18H]18+三氟乙酸：水：+ 1246.17，[M+19H]19+ 1180.64，[M+20H]20+ 1121.65，[M+21H]21+ 1068.29，[M+22H]22+ 1019.78，[M+23H]23+ 975.48，[M+24H]24+ 934.88，[M+25H]25+ 897.52，[M+26H]26+ 863.04，[M+27H]27+ 831.11，[M+28H]28+ 801.47，[M+29H]29+ 773.86，實測值1246.16，1180.60，1121.62，1068.27，1019.74，975.44，934.85，897.49，863.00，831..08，801.45，773.81
(3-5.第5步驟 苯甲基之脫保護)
將上述第4步驟獲得之第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(8)(1.9mg)放入茄形燒瓶中，溶解於8M胍鹽溶液(0.17mL)(以胍鹽酸鹽、20mM TCEP調製)後於室溫攪拌。於冰水中冷卻後緩緩加入50mM氫氧化鈉水溶液(0.85mL)。於冰水中進行反應20分鐘後使用緩衝液(2.1mL)(以8M胍溶液、0.2M乙酸鈉水溶液調製)中和。用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液原狀以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=50：50→50：50(5分鐘)→20：80(35分鐘)→5：95(35.5分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得第80位Asn具有二唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(9)(序列編號25)(第24圖及第25圖)。
ESI-MS：Calcd for C992H1544N252O313S7：計算值[M+17H]17+ 1308.81， [M+18H]18+ 1236.16，[M+19H]19+ 1171.15，[M+20H]20+ 1112.64，[M+21H]21+ 1059.71，[M+22H]22+ 1011.58，[M+23H]23+ 967.64，[M+24H]24+ 927.37，[M+25H]25+ 890.31，[M+26H]26+ 856.11，[M+27H]27+ 824.44，[M+28H]28+ 795.03，[M+29H]29+ 767.65，[M+30H]30+ 742.09，實測值1308.80，1236.17，1171.12，1112.63，1059.67，1011.56，967.63，927.34，890.29，856.09，824.42，795.01，767.63，742.08
(3-6.第6步驟 摺疊步驟)
將上述第5步驟獲得之第80位Asn具有二唾液酸糖鏈之加成糖鏈之多胜肽(9)(1.3mg)放入離心沉澱管，溶解於pH值為8.5之緩衝溶液(13mL)(以8M胍鹽酸液、0.1mM Tris溶液調製)後於室溫靜置。1小時後將該溶液移至透析膜(Spectra/Pro、MWCO；8000)。將該透析膜放入透析外液A(以3M胍鹽酸液、0.1mM Tris溶液、2mM還原型麩胱甘肽溶液、1mM麩胱甘肽溶液調製)中，於4℃進行透析。12小時後將該透析膜放入透析外液B(以1M胍鹽酸液、0.1mM Tris溶液調製)中，於4℃進行透析。12小時後將該透析膜放入透析外液C(10mM乙酸溶液)中，於4℃進行透析。24小時後將該透析膜從透析外液取出，將透析膜內液移至離心沉澱管。透析膜內液以HPLC分析時，主要高峰之溶出時間從階段透析操作開始時間之28.0分，縮短到階段透析操作完成後之26.1分，以ESI-MS測定該高峰時，確認從階段透析操作開始前分子量減少2Da之分子量，此處，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=46：54→46：54(5分鐘)→34.5：65.5(28分鐘)→5：95(28.5分鐘)、等位沖提5 分鐘，然後線性梯度]精製，獲得加成糖鏈之多胜肽(10)(序列編號26)(第26圖及第27圖)。又，以HPLC確認該分取液之純度時，具有99.36%(HPLC區域面積%)之純度(第28圖)。之後，將獲得之加成糖鏈之多胜肽(10)凍結乾燥。對於該凍結乾燥品，在以10mM乙酸水溶液再溶解時用分光光度計(紫外線吸收法)進行糖蛋白質定量及濃度規定，作為體外活性用試樣。
又，體內活性用試樣由將含有加成糖鏈之多胜肽10，糖蛋白質濃度經規定之10mM乙酸水溶液溶解於作為製劑化用另外準備之緩衝液(以人血清白蛋白(30mg)、氯化鈉(24.4mg)、磷酸氫鈉水合物(7.53mg)、結晶磷酸二氫鈉(1.41mg)調製)，再次凍結乾燥後用日本藥典注射用水溶解調製。
階段透析後HPLCE精製後ESI-MS：C992H1542N252O313S7：計算值[M+10H]10+ 2224.08，[M+11H]11+ 2021.98，[M+12H]12+ 1853.57，[M+13H]13+ 1711.06，[M+14H]14+ 1588.92，[M+15H]15+ 1483.05，[M+16H]16+ 1390.43，[M+17H]17+ 1308.69，[M+18H]18+ 1236.05，實測值2223.88，2021.80，1853.43，1710.91，1588.77，1482.92，1390.35，1308.61，1236.01
於上述實施例2及3表示將干擾素β之胺基酸序列分為3個片段製造之例，於下述實施例4至6表示將干擾素β之胺基酸序列分為4個片段製造之例。
又，於實施例4至6，係將具有干擾素β第89位至第166位之胺基酸之胜肽片段C，另分為第89位至第134位之片段C1及於N末端具有第134位之Ala之第135位至第166位之片段C2，從合計4個之胜肽片段製造加成糖鏈之多胜肽。
實施例4. 胜肽片段(C1+C2)之合成
(4-1.胜肽片段C1-SPh之合成)
於固相合成用管柱中放入Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨後以DMF充分膨潤。將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啉(0.25 mmol)溶解於DMF(2mL)，放入管柱中，於室溫攪拌4小時。以DMF及DCM將樹脂充分洗淨，獲得HMPB-PEGA樹脂，作為固相合成之固相使用。
將Fmoc-Lys(Boc)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。
作為以Fmoc基或Boc基保護之胺基酸依序使用Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Gly，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Tyr(tBu)， Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ser(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Met，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe-Thr(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Lys(Boc)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Leu，Fmoc-Val，Fmoc-Lys(Boc)-Thr(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Leu，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Asn(Trt)，以Boc基保護之胺基酸為Boc-L-噻唑烷-4-羧酸，連結於固相樹脂上。其結果，在固相樹脂上獲得Lys(Boc)-Leu-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Ile-Arg(Pbf)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Leu-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser(tBu)-Met-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Thr(Ψ Me，MePro)-Phe-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Thr(Ψ Me，MePro)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Asn(Trt)-Ile-Gln(Trt)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Thz-BocN之46殘基之胜肽片段(16)(序列編號27)。
將具有上述獲得之胜肽片段(16)之固相樹脂以DCM及DMF洗淨後以能將樹脂充分浸泡之程度加入三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與胜肽片段(16)切割分離。過濾除去經切割分離之樹脂，反應溶液在減壓下濃縮。將獲得之殘渣濃縮，獲得胺基酸之側鏈經保護之胜肽片段(16)(序列編號28)：Lys(Boc)-Leu-Tyr(tBu)-His(Trt)-Leu-Ile-Arg(Pbf)-Gly-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Leu-Ser(Ψ Me，MePro)-Ser (tBu)-Met-Leu-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Thr(Ψ Me，MePro)-Phe-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Val-Thr(Ψ Me，MePro)-Lys(Boc)-Leu-His(Trt)-Asn(Trt)-Ile-Gln(Trt)-His(Trt)-Tyr(tBu)-Val-Asn(Trt)-Thz-BocN。
將64殘基之保護胜肽片段(16)相當100μmol移至茄形燒瓶，溶解於DMF(3.0mL)後在氮氣大氣下冷卻至-15℃至-20℃，加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)後加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接著加入DIPEA(85.0μL，0.5 mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後加入三氟乙酸(0.1 mL)，緩緩回到室溫。回到室溫後在減壓下將反應溶液濃縮。獲得之殘渣加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌。2小時後再次將該溶液加入另外準備之二乙醚(150mL)，沈澱後離心分離，除去溶液部分，獲得含有目的之胜肽硫酯體之殘渣。獲得之殘渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→65：35(5分鐘)→30：70(35分鐘)→5：95(45分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得C末端為苯硫酯之胜肽片段C1-SPh(16)(序列編號29)：HN-Thz-Asn-Val-Tyr-His-Gln-Ile-Asn-His-Leu-Lys-Thr-Val-Leu-Glu-Glu-Lys-Leu-Glu-Lys-Glu-Asp-Phe-Thr-Arg-Gly-Lys-Leu-Met-Ser-Ser-Leu-His-Leu-Lys-Arg-Tyr-Tyr-Gly-Arg-Ile-Leu-His-Tyr-Leu-Lys-SPh。
ESI-MS：C263H412N72O67S3：計算值[M+4H]4+ 1438.68，[M+5H]5+ 1151.14，[M+6H]6+ 959.45，[M+7H]7+ 822.53，[M+8H]8+ 719.84，實測值1438.51，1151.00，959.34，822.43，719.74
(4-2.胜肽片段C2之合成)
於固相合成用管柱中放入Amino-PEGA樹脂(默克公司製造)(100μmol)，以二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨後以DMF充分膨潤。將4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基嗎啉(0.25 mmol)溶解於DMF(2mL)，放入管柱中，於室溫攪拌4小時。以DMF及DCM將樹脂充分洗淨，獲得HMPB-PEGA樹脂，作為固相合成之固相使用。
將Fmoc-Asn(Trt)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。作為以Fmoc基或Boc基保護之胺基酸依序使用Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Ile，Fmoc-Phe，Fmoc-Tyr(tBu)，Fmoc-Phe，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Leu，Fmoc-Ile，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Arg (Pbf)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Ala，Fmoc-Cys(Acm)，Fmoc-His(Trt)，Fmoc-Tyr(tBu)-Ser(Ψ Me，MePro)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Lys(Boc)，Boc-Cys(Trt)，連結於固相樹脂上。其結果，在固相樹脂上獲得Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Tyr(tBu)-Gly-Thr(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Ile-Phe-Tyr(tBu)-Phe-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Leu-Ile-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Ile-Thr(tBu)-Trp(Boc)-Ala-Cys(Acm)-His(Trt)-Ser(Ψ Me，MePro)-Tyr(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-BocNH之32殘基之胜肽片段(17)(序列編號30)。
將上述獲得之胜肽片段(17)加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌3.5小時，將樹脂與胜肽片段(17)切割分離後加入另外準備之二乙醚(150mL)，沈澱後離心分離，將含有作為目的之胜肽之沉澱物與溶液部分分開，除去溶液部分後目的物以HPLC確認後以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→65：35(5分鐘)→30：70(35分鐘)→5：95(45分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得作為目的之胜肽片段C2(17)(序列編號31)：H2N-Cys-Lys-Glu-Tyr-Ser-His-Cys(Acm)-Ala-Trp-Thr-Ile-Val-Arg-Val-Glu-Ile-Leu-Arg-Asn-Phe-Tyr-Phe-Ile-Asn-Arg-Leu-Thr-Gly-Tyr-Leu-Arg-Asn。
ESI-MS：C185H282N52O47S2：計算值[M+3H]3+ 1351.22，[M+4H]4+ 1013.67，[M+5H]5+ 811.13，實測值1351.02，1013.51，811.01
實施例5. 胜肽片段C1與胜肽片段C2之連結
將46殘基之C末端為硫苯酯之胜肽片段C1-SPh(16)(8.7mg) 及32殘基之胜肽片段C2(17)(3.5mg)二種類放入同一茄形燒瓶，溶解於pH值為6.8之緩衝溶液(1.0mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)調製)後加入苯硫酚(30μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，在反應溶液中加入甲氧基胺溶液(1.5mL)(在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP調製)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物片段之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→65：35(5分鐘)→30：70(35分鐘)→5：95(45分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得作為目的之胜肽片段(18)(序列編號32)(胜肽片段(C1+C2))(89-166)(第29圖)。
ESI-MS：C441H688N124O114S4：計算值[M+8H]8+ 1210.90，[M+9H]9+ 1076.47，[M+10H]10+ 968.92，[M+11H]11+ 880.93，[M+12H]12+ 807.60，[M+13H]13+ 745.55，[M+14H]14+ 692.37，實測值1210.77，1076.46，968.91，880.92，808.50，745.47，692.37
實施例6. 無唾液酸IFN-β合成法2
(6-1.加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B與胜肽片段(C1+C2)之連結)
將21殘基之C末端為硫苯酯體之加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B(3)(1.5mg)與78殘基之胜肽片段(18)(胜肽片段C1．C2)(2.4mg)二種類放入同一茄形燒瓶中，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.25mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM三羧基乙基膦 溶液(TCEP溶液)調製)後加入苯硫酚(7.4μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，在反應溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(0.37mL)(在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液調製)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有糖胜肽片段之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=65：35→65：35(5分鐘)→30：70(35分鐘)→5：95(45分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得目的之干擾素β相當於第80位之位置具有無唾液酸糖鏈之胜肽片段(19)(序列編號33)(加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C1+C2))(68-166)(第30圖)。
ESI-MS：C607H950N156O194S5：計算值[M+10H]10+ 1370.73，[M+11H]11+ 1246.21，[M+12H]12+ 1142.44，[M+13H]13+ 1054.64，[M+14H]14+ 979.38，[M+15H]15+ 914.15，[M+16H]16+ 857.08，[M+17H]17+ 806.72，[M+18H]18+ 761.96，[M+19H]19+ 721.91，實測值1370.66，1246.14，1142.38，1054.56，979.38，914.08，856.99，806.65，761.92，721.86
(6-2.胜肽片段A與糖胜肽片段B+C1+C2之連結)
將67殘基之C末端為硫苯酯之胜肽片段A(1)(3.0mg)及於上述6-1.獲得之相當於干擾素β第80位之位置具有無唾液酸糖鏈之胜肽片段(19)(加成無唾液酸糖鏈之胜肽片段B+C1+C2)(68-166)(3.3mg)二種類放入同一茄形燒瓶，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.24mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP 溶液調製)後加入苯硫酚(7.2μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，加入巰基乙磺酸鈉(2.1mg)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89、135位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(20)(序列編號34)(第31圖)。
ESI-MS：C979H1525N253O299S11：計算值[M+17H]17+ 1293.69，[M+18H]18+ 1221.88，[M+19H]19+ 1157.62，[M+20H]20+ 1099.79，[M+21H]21+ 1047.47，[M+22H]22+ 999.90，[M+23H]23+ 956.47，[M+24H]24+ 916.66，[M+25H]25+ 880.03，[M+26H]26+ 846.22，[M+27H]27+ 814.92，[M+28H]28+ 785.85，實測值1292.75，1221.01，1156.79，1098.99，1046.71，999.19，955.78，916.00，879.39，845.63，814.34，785.29
(6-3. Cys還原為Ala)
將上述6-2獲得之第68、89、135位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(20)(1.1mg)放入茄形燒瓶，溶解於pH值為7.5之緩衝溶液(0.20mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液調製)後加入pH值為7.5之0.5M三乙基羧基膦溶液(TCEP溶液)(0.20mL)(TECP，以6M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺調製)、tBuSH(20μL)、 0.1MVA-044溶液(20μL)(將VA-044溶解於水調製)，於室溫進行反應。4小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取tBuSH後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89、135位Cys轉換為Ala，第80位Asn具有無唾液酸糖鏈之166殘基之加成糖鏈之多胜肽(21)(序列編號35)(第32圖)。
ESI-MS：C979H1525N253O300S7：計算值[M+17H]17+ 1287.09，[M+18H]18+ 1215.64，[M+19H]19+ 1151.71，[M+20H]20+ 1094.18，[M+21H]21+ 1042.12，[M+22H]22+ 994.80，[M+23H]23+ 951.59，[M+24H]24+ 911.98，[M+25H]25+ 875.54，[M+26H]26+ 841.91，[M+27H]27+ 810.76，[M+28H]28+ 781.84，[M+29H]29+ 754.92，實測值1287.11，1215.69，1151.72，1094.20，1042.16，994.83，951.61，911.98，875.57，841.93，810.80，781.88，754.88
上述6-3.獲得之加成糖鏈之多胜肽(21)經由與2-4.及2-5.中記載之步驟相同條件之Acm基脫保護及摺疊步驟，可獲得加成糖鏈之多胜肽(15)。
實施例7. 二唾液酸IFN-β合成法2
(7-1.加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B與胜肽片段(C1+C2)之連結)
將21殘基之C末端為硫苯酯體之加成二苯甲基二唾液酸糖鏈 之胜肽片段B(2)(17.9mg)與78殘基之胜肽片段(18)(胜肽片段(C1+C2))(22.9mg)二種類放入同一茄形燒瓶中，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(2.37mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)調製)後加入苯硫酚(71.1μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，在反應溶液中加入0.2M甲氧基胺溶液(3.55mL)(在0.2M甲氧基胺溶液中加入20mM TCEP溶液調製)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有糖胜肽片段之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)，等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得目的之干擾素β相當於第80位之位置具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(22)(序列編號36)(第33圖)。
ESI-MS：C643H996N158O210S4：計算值[M+11H]11+ 1315.55，[M+12H]12+ 1206.00，[M+13H]13+ 1113.31，[M+14H]14+ 1033.86，[M+15H]15+ 965.00，[M+16H]16+ 904.75，[M+17H]17+ 851.59，[M+18H]18+ 804.34，[M+19H]19+ 762.06，實測值1315.59，1205.97，1113.28，1033.83，964.98，904.74，851.57，804.32，762.02
(7-2.胜肽片段A與加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(B+C1+C2))
將67殘基之C末端為硫苯酯之胜肽片段A(1)(4.7mg)及於上述7-1.獲得之相當於干擾素β第80位之位置具有二苯甲基二唾液 酸糖鏈之胜肽片段(22)(5.2mg)二種類放入同一茄形燒瓶，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.35 mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM TCEP溶液調製)後加入苯硫酚(11μL)，於室溫進行反應。24小時後以HPLC確認反應後，加入巰基乙磺酸鈉(3.3mg)，於室溫進行反應。12小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89、135位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之胜肽片段(23)(序列編號37)(第34圖)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S10：計算值[M+16H]16+ 1421.16，[M+17H]17+ 1337.62，[M+18H]18+ 1263.36，[M+19H]19+ 1196.92，[M+20H]20+ 1137.13，[M+21H]21+ 1083.02，[M+22H]22+ 1033.84，[M+23H]23+ 988.93，[M+24H]24+ 947.77，[M+25H]25+ 909.90，[M+26H]26+ 874.94，[M+27H]27+ 842.57，[M+28H]28+ 812.52，[M+29H]29+ 784.53，實測值1421.13，1337.57，1263.35，1196.90，1137.08，1082.99，1033.80，988.89，947.73，909.87，874.92，842.55，812.51，784.50
(7-3. Cys還原為Ala)
將上述7-2.獲得之第68、89、135位Cys具有游離硫醇基，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之胜肽片段(23)(6.1mg)放入茄形燒瓶，溶解於pH值為7.5之緩衝溶液 (0.27mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液調製)後加入pH值為7.5之0.5M三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)(0.27mL)(TECP，以6M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、三乙胺調製)、tBuSH(100μL)、0.1MVA-044溶液(100μL)(將VA-044溶解於水調製)，於室溫進行反應。4小時後以HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液移至離心沉澱管，用二乙醚萃取苯硫酚後將含有目的物之水層以膜濾器過濾，含有目的物之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=55：45→55：45(5分鐘)→25：75(35分鐘)→5：95(36分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得在第68、89、135位Cys轉換為Ala，第80位Asn具有二苯甲基二唾液酸糖鏈之166殘基之胜肽片段(24)(序列編號38)(第35圖)。
ESI-MS：C1015H1571N255O316S7：計算值[M+18H]18+ 1258.02，[M+19H]19+ 1191.86，[M+20H]20+ 1132.32，[M+21H]21+ 1078.44，[M+22H]22+ 1029.47，[M+23H]23+ 984.75，[M+24H]24+ 943.76，[M+25H]25+ 906.05，[M+26H]26+ 871.24，[M+27H]27+ 839.01，[M+28H]28+ 809.08，[M+29H]29+ 781.22，實測值1258.05，1191.87，1132.37，1078.47，1029.51，984.77，943.79，906.05，871.25，839.04，809.05，781.24
上述7-3.獲得之加成糖鏈之多胜肽(24)經由與3-4、3-5及3-6中記載之步驟相同條件之Acm基脫保護、苯甲基之脫保護及摺疊步驟，可獲得加成糖鏈之多胜肽(10)。
於上述實施例1至3，設計在N末端具有Ala之胜肽片段，用於接合。因此，於實施例1至3，合成在位於該胜肽片段N末 端之Ala位置導入Cys之胜肽片段，接合後將Cys還原為Ala。
於以下之實施例，設計在N末端具有Ser之胜肽片段。亦即，表示合成在Ser之位置導入Cys之胜肽片段，接合後將Cys轉換為Ser之例。又，更具體而言，例示將具有在干擾素β之胺基酸序列第68位至第88位之胺基酸之糖胜肽片段B分為第68位至75位之片段B2及在N末端具有第76位以Cys替代Ser之第76位至88位之片段B1而進行合成，經過將與干擾素β第76位相當之位置之胺基酸為Cys之胜肽片段(B1+B2)-SR(以下，稱為胜肽片段(B1+B2)-SR(Cys體))經由接合合成之接合步驟及將在胜肽片段(B1+B2)-SR(Cys體)中於與干擾素β第76位相當之位置之Cys轉換為Ser之轉換步驟，合成在干擾素β第76位相當之位置之胺基酸為Ser之胜肽片段(B1+B2)-SR之例。
亦即，更具體而言，例示包含下述步驟之製造方法：
(I)製作下述式(i)表示之胜肽片段B1之步驟。
(Ⅱ)製作下述式(j)表示之糖胜肽B2之步驟
(Ⅲ)經由將胜肽B1與糖胜肽B2連結，製作下述式(k)表示之糖胜肽，之後將該胜肽上特定之半胱胺酸轉換為絲胺酸之步驟(參照第43至第45圖)
實施例8. 加成二唾液酸糖鏈之胜肽片段(B1+B2)-SR之合成(8-1胜肽片段B1-SR之合成)
在固相合成用管柱中放入HMPB-ChemMatrix(Biotage公司製造)(0.10mmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨後用DCM充分膨潤。
將Fmoc-Leu(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮 (NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。
依序使用Fmoc-Leu，Fmoc-Leu，Fmoc-Asn(Trt)，Fmoc-Glu(OtBu)，Fmoc-Val，Fmoc-Ile，Fmoc-Thr(tBu)，Fmoc-Glu(OtBu)作為以Fmoc基保護之胺基酸，在固相樹脂上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)之8殘基胜肽。對於該8殘基胜肽，將Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護，以DMF洗淨後在另外準備之離心沉澱管中將二苯甲基二唾液酸糖鏈天冬醯胺衍生物(g)(547.8mg，200μmol)及DEPBT(59.9 mg，200μmol)溶解於DMF/DMSO(1：1混合溶液，3.33mL)，放入固相合成用管柱中，加入DIPEA(52.3μL，300μmol)，於室溫攪拌18小時。以DMF及DCM洗淨，在固相上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-FmocNH之9殘基糖鏈胜肽(序列編號39)。
之後之胜肽鏈之延長為將上述獲得之固相樹脂上之9殘基糖鏈胜肽之脂溶性保護基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)進行脫保護後，使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸及HOBt(67.6mg，0.50 mmol)、DIPCI(73.1μL，0.475mmol)溶解於DMF(6.3 mL)，進行15分鐘活化後放入固相合成用管柱中，於室溫攪拌1小時後將Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理20分鐘進行脫保護。反覆進行該操作，依序將胺基酸縮合。依序使用Fmoc-Trp(Boc)，Fmoc-Gly，Fmoc-Thr(tBu)，Boc-Cys(Trt)作為以Fmoc基及Boc基保護之胺基酸，連結於固相樹脂。其結果，在固相樹脂上獲得Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-BocNH之13殘基之加成糖鏈之胜肽片段(25)(序列編號40)。
之後，以DCM及DMF洗淨後以能將樹脂充分浸泡之程度加入三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與加成糖鏈之胜肽片段切割分離。過濾除去經切割分離之樹脂，反應溶液在減壓下濃縮。將獲得之殘渣濃縮，獲得胺基酸之側鏈 經保護之加成糖鏈之胜肽(25)(序列編號41)：Leu-Leu-Asn(Trt)-Glu(OtBu)-Val-Ile-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Trp(Boc)-Gly-Thr(tBu)-Cys(Trt)-BocNH。
將具有13殘基之胺基酸，胺基酸側鏈經保護之加成糖鏈之胜肽片段(25)相當100μmol移至茄形燒瓶，溶解於DMF(3.0mL)後在氮氣大氣下冷卻至-15℃至-20℃，加入2-巰基乙磺酸鈉(492.5mg，3.0mmol)後加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接著加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後加入三氟乙酸(0.1mL)，緩緩回到室溫。回到室溫後在減壓下將反應溶液濃縮。獲得之殘渣加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌。2小時後再次將該溶液加入另外準備之二乙醚(150mL)，沈澱後離心分離，除去溶液部分，獲得含有目的之胜肽硫酯體之殘渣。獲得之殘渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=72：28→59：41(26分鐘)，線性梯度]精製，獲得C末端為烷基硫酯之加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B1-SR(25)(序列編號42)：H2N-Cys-Thr-Gly-Trp-Asn(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-Glu-Thr-Ile-Val-Glu-Asn-Leu-Leu-SR(第46圖)。又，-SR表示磺酸乙硫酯。
(8-2胜肽片段B2-SPH之合成)
在固相合成用管柱中放入HMPB-ChemMatrix(Biotage公司製造)(0.10mmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗淨後用DCM充分膨潤。
將Fmoc-Ser(tBu)(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑 (0.375mmol)溶解於DCM(2mL)，放入固相合成用管柱中，於25℃攪拌4小時。
攪拌後以DCM、DMF將樹脂洗淨。Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。以DMF洗淨後，其後之胜肽鏈延長係使用以下表示之方法依序將胺基酸縮合。
將胺基經Fmoc基保護之胺基酸溶解於N-甲基吡咯啶酮(NMP)(1mL)，加入0.45M HCTU．HOBT/NMP(0.4mmol)後加入固相合成用管柱中，接著，將0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入固相合成用管柱中。於室溫攪拌20分鐘後以DCM及DMF將樹脂洗淨，Fmoc基以20%哌啶/DMF溶液(2mL)處理15分鐘，進行脫保護。反覆進行該操作，使用以Fmoc基保護之胺基酸(0.5mmol)，依序將胺基酸縮合。
依序使用Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Ser(tBu)，Fmoc-Asp(OtBu)，Fmoc-Gln(Trt)，Fmoc-Arg(Pbf)，Fmoc-Phe，Fmoc-Ile，Boc-L-噻唑烷-4-羧酸作為以Fmoc基保護之胺基酸，連結於固相樹脂。其結果，在固相樹脂上獲得Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN之8殘基之胜肽片段(26)(序列編號43)。
之後，以DCM及DMF洗淨後以能將樹脂充分浸泡之程度加入三氟乙醇與乙酸之混合溶液(1：1)，於室溫攪拌18小時，將樹脂與胜肽片段切割分離。過濾除去經切割分離之樹脂，反應溶液在減壓下濃縮。將獲得之殘渣濃縮，獲得胺基酸之側鏈經保護之胜肽(26)(序列編號44)：Ser(tBu)-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Phe-Ile-Thz-BocN。
將具有8殘基之胺基酸，胺基酸側鏈經保護之胜肽片段(26) 相當100μmol移至茄形燒瓶，溶解於DMF(3.0mL)後在氮氣大氣下冷卻至-15℃至-20℃。加入苯硫酚(308μL，3.0mmol)後加入PyBOP(260.0mg，0.50mmol)，接著加入DIPEA(85.0μL，0.5mmol)。於-15℃至-20℃攪拌2小時後加入三氟乙酸(0.1mL)，緩緩回到室溫。回到室溫後在減壓下將反應溶液濃縮。獲得之殘渣加入三氟乙酸：水：TIPS(=95：2.5：2.5)，於室溫攪拌。2小時後再次將該溶液加入另外準備之二乙醚(150mL)，沈澱後離心分離，除去溶液部分，獲得含有目的之胜肽硫酯體之殘渣。獲得之殘渣以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=78：22→68：32(20分鐘)，線性梯度]精製，獲得C末端為硫苯酯之胜肽片段B2-SPh(26)(序列編號45)：HN-Thz-Ile-Phe-Arg-Gln-Asp-Ser-Ser-SPh(第47圖)。
(8-3.加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B1-SR與胜肽片段B2-SPh之連結)
將13殘基之C末端為烷基硫酯體之加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B1-SR(0.60mg)及8殘基之胜肽片段B2-SPh(0.16mg)二種類放入同一茄形燒瓶，溶解於pH值為7.2之緩衝溶液(0.15mL)(以8M胍鹽酸液、0.2mM磷酸溶液、20mM三羧基乙基膦溶液(TCEP溶液)調製)，於室溫進行反應。14.5小時後用HPLC及ESI-MS確認生成目的物。將反應溶液以膜濾器過濾，含有糖胜肽片段之濾液部分以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=78：22→56：44(22分鐘)、 等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得目的之具有二苯甲基二唾液酸糖鏈，C末端為加成經烷基硫酯化之糖鏈之胜肽片段(B1+B2)-SR(Cys體)(27)(序列編號46)(第48圖)。
(8-4 Cys之甲基化)
將獲得之21殘基之胜肽烷基硫酯(27)(5.3mg)(1.03μmol)放入微量離心管中，溶解於pH值為8.6之緩衝溶液(1.09mL)(以8M胍鹽酸液、0.25Tris鹽酸液、3.3mM EDTA溶液調製)及乙腈(0.36mL)後於25℃加入甲基-4-硝基苯磺酸酯(5.1mg)。30分鐘後加入10%TFA溶液(0.2mL)，使pH值為4後，反應溶液以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=72：55→55：45(34分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得具有原料中所含之半胱胺酸殘基之硫原子經甲基化之二苯甲基二唾液酸糖鏈，且C末端加成經烷基硫酯化之糖鏈之胜肽片段(B1+B2)-SR(Cys體)(28)(序列編號47)(第49圖)。
(8-5經甲基化之Cys之氰基化及氰基化後續之分子內醯基轉移反應)
將獲得之具有半胱胺酸殘基之硫原子經甲基化之二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段(28)放入微量離心管中，溶解於0.1mM 80%甲酸溶液(3.3mL)後，於25℃加入溴化氰23.2mg(219μmol)。將反應容器遮光後於37℃進行反應，26.5小時後，將反應溶液在減壓下濃縮。
獲得之殘渣以pH值為8.0之緩衝溶液(以8M胍鹽酸液及0.2M磷酸溶液調製)(0.33mL)溶解後於37℃進行反應。1小時後添加20% 哌啶/DMF溶液(3.3μL、1%v/v)，以HPLC確認反應完成後，以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、A：B=72：55→55：45(34分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]精製，獲得具有反應中間體之21殘基之二苯甲基二唾液酸糖鏈，C末端加成經烷基硫酯化之糖鏈之胜肽片段(B1+B2)-SR(29)(序列編號48)(第50圖)。又，-SR表示磺酸乙基硫酯。
以實施例3中加成二苯甲基二唾液酸糖鏈之胜肽片段B替代上述8-5.獲得之加成糖鏈之多胜肽(29)使用，進行與實施例3相同之操作，可合成二唾液酸IFN-β。
實施例9 加熱處理方法
(9-1. 17,31,141Cys(Acm)-80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β之加熱處理)
在10mL之茄形燒瓶中放入上述3-3.獲得之加成糖鏈之多胜肽(7)(17，31，141Cys(Acm)-80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β)(3.7mg)，放入pH值為7.0之0.2M磷酸緩衝液(含有8M胍)(3.3mL；基質濃度：50mM)。在茄形燒瓶蓋上玻璃栓後在油浴，於60℃加溫。10小時後回復到室溫，進行HPLC分析。經由HPLC，ESI-MS確認未分解後(第36圖)以HPLC[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=50：50→50：50(5分鐘)→20：80(35分鐘)→5：95(35.5分鐘)]進行脫鹽，獲得加熱處理試樣(4.0mg)。
(9-2. 80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β之加熱處理)
在0.5mL之微量離心管中放入上述3-4.獲得之加成糖鏈之多胜肽(8)(80N(二苯甲基-二唾液酸寡糖)-IFN-β(30μg))，放入pH值為7.0之0.2M磷酸緩衝液(含有8M胍)(30μL；基質濃度：50mM)。蓋上蓋子後在油浴，於60℃加溫。10小時後回到室溫，進行HPLC分析[管柱：SHISEIDO proteonavi(C4，5μM)、φ 20x250mm、流速：7.0mL/分鐘、洗提液A液：0.1%TFA水、B液：0.09%TFA/10%水/90%AN、梯度A：B=50：50→50：50(5分鐘)→20：80(35分鐘)→5：95(35.5分鐘)、等位沖提5分鐘，然後線性梯度]，經由HPLC、ESI-MS確認純度(第37圖)。
HPLC及ESI-MS之值與上述9-1.加熱試驗使用之Cys經保護之加成糖鏈之多胜肽(7)比較，半胱胺酸無保護之加成糖鏈之多胜肽(8)經由加熱處理之回收量降低。
實施例10 受體親和性解析
相對於IFN-α/β受體2，進行未加熱或經加熱處理之化學合成IFN-β之受體親和性解析。
相對於IFN-α/β受體2，未加熱或經加熱處理之化學合成IFN-β之結合親和性係使用ProteOn XPR36(Bio-rad)以SPR(Surface Plasmon Resonance；表面電漿共振技術)測定。
具體而言，邊將0.005% Tween20/PBS以流速30μL/分鐘流動，邊使用胺基偶合試劑盒(Bio-rad)，根據說明書在GLM晶片(Bio-rad)上將10μg/mL之IFN-α/β受體2(10 mM乙酸緩衝液，pH4.5)固定化。將實施例3製作之未加熱之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽(10)、於上述9-1.經加熱處理之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽 供給上述3-4.至3-6.記載之脫Acm步驟、苯甲基之脫保護步驟及摺疊步驟，獲得之經加熱處理之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽以0.1% BSA,2mM EDTA/PBS調整為0.31-25nM，以流速50μL/分鐘添加於晶片。又，加成糖鏈之多胜肽(10)使用0.31nM、0.93 nM、2.8nM、8.3nM、25nM之5種濃度分別實施。偶合常數(ka)、離解常數(kd)及偶合離解常數(kd)使用proteOn管理軟體進行解析。其結果表示於第38圖、第39圖及表1。
第38圖表示解析對於IFN-α/β受體2，未加熱之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽(10)結合親和性之曲線圖。又，第39圖表示解析對於IFN-α/β受體2，經加熱處理之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽結合親和性之曲線圖。如第38圖、第39圖及表1所示，本發明經化學合成之加成糖鏈之多胜肽即使在加熱處理後，亦具有與未加熱處理之加成糖鏈之多胜肽同等之接容體親和性。
實施例11 藥物動態解析
將上述實施例製作之本發明相關加成糖鏈之多胜肽靜脈內及皮下投予時，藥物動態解析之實施例於下述表示。
(11-1.投予液、試藥之調製)
使用實施例2製作之加成無唾液酸糖鏈之多胜肽(15)(無唾液酸IFN-β)及實施例3製作之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽(10)(二唾 液酸IFN-β)作為化學合成之IFN-β，添加BSA及磷酸緩衝溶液，凍結乾燥。投予前用超純水(Milli Q水)60μL溶解，用磷酸鹽緩衝鹽水溶液(PBS、和光純藥工業公司製造)將投予液調製成50萬IU/mL。又，使用經由生合成製作之IFN β mochida注射用(持田製藥)作為對照之IFN-β，使用附上之注射用水溶解成1200萬IU/mL，用PBS調製成50萬IU/mL。EDTA-PBS為將EDTA-2Na(和光純藥工業公司製造)加入PBS中使成為2mM。又，本實施例藥物動態解析中使用之加成經化學合成之糖鏈之多胜肽係使用未經加熱處理者。又，IFN β mochida為源自人類纖維芽細胞經由生合成製作之IFN β-1a。
(11-2.投予及採血)
對於小鼠(BALB/c小鼠、雄性、體重20.45至25.28g)以200萬IU/公斤之用量在飽食下從眼窩靜脈或背部皮下使用胰島素用注射筒Myjector 29G×1/2(Terumo公司製造)以容量4mL/公斤投予。為靜脈內投予時於投予前及投予後2、10、30分鐘、1、3、6、8小時，為皮下投予時於投予前及投予後10、30分鐘、1、2、4、6、8小時從眼窩靜脈，使用經肝素處理之血球容積比毛細管(HIRSHMANN LABORGERATE)採血75μL。將採取之血液與同體積之EEDTA-PBS快速混合，離心分離(15000rpm，4℃，10分鐘)。採取上清液90μL，作為血漿試樣。血漿試樣冷凍保存至測定使用時。晶片及管係使用BM機器公司之低吸附性者。
(11-3.血中濃度測定)
加成糖鏈之多胜肽(IFN-β)之血中濃度測定係使用人類干擾素-β ELISA組件(鎌倉科技公司製造)。亦即，血漿試樣係使用同 一組件附上的稀釋液，必要時稀釋360、120、12倍，調製作為測定試樣。用於作成校正曲線之標準品使用與投予時使用者為同一批號之化學合成IFN-β、IFN β mochida注射用，以組盒附上之稀釋液調製，使成為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125 IU/mL。校正曲線對應血漿試樣之稀釋率，添加空白血漿使成為相同量。獲得之結果乘以稀釋率，另，乘以作為抗凝固處理之EDTA-PBS之稀釋率2算出血中濃度。獲得之血漿中IFN-β濃度推移表示於第40圖。
(11-4.藥物速度論參數之計算)
從獲得之IFN-β濃度推移使用動差分析法，將血漿中濃度曲線下面積(AUC)經由梯形法算出。又，根據外插法，從靜脈內投予時之預測初期濃度(CO)、血漿中半衰期(t1/2)、平均滯留時間(MRT)及皮下投予時之實測值尋求最高血漿中濃度(Cmax)。獲得之藥物速度論參數表示於表2。
根據第40圖，經由本發明相關之化學合成製作之加成糖鏈之多胜肽與經由生合成製作之IFN-β比較，顯示同等之血中動態。
實施例12 抗腫瘤活性測定試驗
(12-1.細胞培養、試藥之調製)
抗腫瘤活性試驗係使用人類/勃氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)之Daudi細胞。培養基使用在RPMI 1640(萊富生命科技(invitrogen)公司製造)中加入經56℃鈍化處理30分鐘之10%加有盤尼西林/鏈黴素(SIGMA公司製造)之胎牛血清(Fetal Bovine Serum)(GIBCO)。培養皿使用Non-treat dish(IWAKI)，於37℃、CO濃度5%條件下培養，以2至3日進行1次繼代。
(12-2.罹癌小鼠之作成法)
將上述12-1.培養之Daudi細胞回收於試管中，離心分離(1300rpm、4℃、3分鐘)。用吸氣器除去上清液，加入HBSS(Nacalai公司製造)，將細胞懸濁。接著再次離心分離，除去上清液。該細胞之洗淨處理共進行3次。使用血球計算板計算細胞數，用HBSS作成2×108細胞/mL之細胞懸濁液。在接種Daudi細胞前加入與細胞懸濁液同體積之基質膠(matrigel)(BD)，稀釋2倍，作成接種用細胞懸濁液。將接種用細胞懸濁液保存於冰上至接種前。麻醉藥為將戊巴比妥(共立製藥公司製造)用PBS稀釋為5mg/mL使用。在SCID老鼠(C.B-17/Icr-scid/scidJcl老鼠，雄性)(日本克雷雅公司)用胰島素用注射筒Myjector 29G×1/2(Terumo公司製造)腹腔內投予麻醉藥250至300μL。確認麻醉導入後使用電動理髮器剃除老鼠右側腹之毛。用26G1/2之注射針(Terumo公司製造)及1mL之注射筒(Terumo公司製造)皮下接種接種用細胞懸濁液100μL。
(12-3.抗腫瘤活性之測定方法及評估方法)
從上述11-3.之細胞接種處理起約30日後用游尺(Mitsutoyo公司製造)測定所形成腫瘤組織之長徑(mm)及短徑(mm)。用獲得之數 值尋求腫瘤體積(mm3)。腫瘤體積以腫瘤體積(mm3)=長徑(mm)×短徑(mm)×短徑(mm)×0.5之公式算出。經時算出腫瘤體積，標繪成曲線，作為抗腫瘤活性能進行評估。
(12-4.投予液之調製法及投予方法)
將實施例2合成之加成無唾液酸糖鏈之多胜肽(15)及實施例3合成之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽(10)用PBS調製成500萬IU/mL。對照之IFN-β使用經由生合成製作之IFN β mochida注射用(持田製藥公司製造)，用附上之注射用水溶解成1200萬IU/mL，用PBS調製成500萬IU/mL。投予液於投予前調製。使用上述12-3.測定之腫瘤體積，將罹癌老鼠分成4群(n=4/群)。分群時之腫瘤體積約為800mm3。使用調製之投予液在背部皮下以4mL/公斤之容量，使用胰島素用注射筒Myjector 29G×1/2以成為2000萬IU/公斤之用量投予。賦形劑投予群係將投予液調製時使用之PBS以4mL/公斤之容積投予。分群及將投予第1次作為day 0，至day 9連日10次背部皮下投予。
(12-5.抗腫瘤活性能之評価)
使用12-3.表示之方法，於第3、6、8、10、13、15、17天算出腫瘤體積，經時性腫瘤體積之變化表示於第41圖。
根據第41圖，本發明相關經由化學合成製作之加成糖鏈之多胜肽與經由生合成製作之IFN-β比較，顯示同等或優越之抗腫瘤活性。尤其是實質均一加成二唾液酸糖鏈之本發明加成糖鏈之多胜肽(10)與經由生合成製作之IFN-β比較，顯示優越之抗腫瘤活性。
實施例13 加熱處理後之細胞增殖抑制能之評価
又，將於上述9-1.經加熱處理之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽供給上述3-4.至3-6.記載之脫Acm步驟、苯甲基之脫保護步驟及摺疊步驟，評估獲得之經加熱處理之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽之細胞增殖抑制能。
具體之細胞增殖抑制能評価係依以下敍述之方法進行。
將人類．勃氏淋巴腫細胞株Daudi用含有10%胎牛血清、100U/mL盤尼西林、100μg/mL鏈黴素之RPMI 1640培養基(10% FCS-RPMI 1640)懸濁使成為1.25×105個/mL。將細胞懸濁液以1×104/80μL/洞播種於96洞平底盤中，另將用10%FCS-RPMI 1640稀釋之完全化學合成IFN-β以20μL/洞添加，於CO2濃度調整為5%之CO2保溫箱中，於37℃培養3日。細胞增殖抑制能係以培養第3日之粒線體脫氫酵素活性作為指標，使用細胞計數套組(cell counting kit)-8(同仁化學公司製造)，根據套組附上之操作手冊進行測定。
使用未加熱處理之加成二唾液酸糖鏈之多胜肽(10)作為對照。其結果表示於第42圖。如第42圖所示，即使為加熱處理後之加成糖鏈之多胜肽，顯示與未加熱處理之加成糖鏈之多胜肽同等之細胞增殖抑制能。
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<212> PRT
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (10)..(10)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (12)..(12)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> Me,Mepro
<220>
<221> 結合
<222> (14)..(14)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> Trt
<220>
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<221> 結合
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<221> 結合
<222> (38)..(38)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (40)..(40)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (43)..(43)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (44)..(44)
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<220>
<221> 結合
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<221> 結合
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<212> PRT
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<220>
<223> 化學合成
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<223> Acm
<220>
<221> 結合
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<223> Acm
<220>
<221> 結合
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<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (141)..(141)
<223> Acm
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<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
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<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
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<220>
<223> 化學合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
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<223> Acm
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<221> CARBOHYD
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<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
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<212> PRT
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<223> 化學合成
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<223> 化學合成
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<212> PRT
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<223> 化學合成
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<212> PRT
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<220>
<223> 化學合成
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<221> MISC_FEATURE
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<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<223> Trt
<220>
<221> 結合
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<223> Trt
<220>
<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (35)..(35)
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (37)..(37)
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<220>
<221> 結合
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<223> tBu
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<221> 結合
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<220>
<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
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<221> 結合
<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 結合
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<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (15)..(15)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (16)..(16)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (19)..(19)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (20)..(20)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (21)..(21)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (22)..(22)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (24)..(24)
<223> Me,MePro
<220>
<221> 結合
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<223> Pbf
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<221> 結合
<222> (27)..(27)
<223> Boc
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
<222> (44)..(44)
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<221> 結合
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<223> Boc
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
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<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
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<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> Boc
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<221> 結合
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<223> Boc
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<221> 結合
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<223> Pbf
<220>
<221> 結合
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<221> 結合
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<223> Pbf
<220>
<221> 結合
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<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (21)..(21)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
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<223> Trt
<220>
<221> 結合
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<223> Pbf
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<221> 結合
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<220>
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<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 化學合成
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
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<223> Acm
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (141)..(141)
<223> Acm
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<221> CARBOHYD
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<223> 無唾液酸寡糖
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
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<221> CARBOHYD
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<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 結合
<222> (141)..(141)
<223> Acm
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<221> CARBOHYD
<222> (80)..(80)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<400> 37
<210> 38
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (17)..(17)
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<221> 結合
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<220>
<221> 結合
<222> (141)..(141)
<223> Acm
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (80)..(80)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<400> 38
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (1)..(1)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (3)..(3)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (9)..(9)
<223> Resin
<400> 39
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> Boc
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (10)..(10)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> Resin
<400> 40
<210> 41
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (2)..(2)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> Boc
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (10)..(10)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (11)..(11)
<223> Trt
<400> 41
<210> 42
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 結合
<222> (13)..(13)
<223> -SCH2-CH2-SO3H
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (5)..(5)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<400> 42
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> 1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> Resin
<400> 43
<210> 44
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> 結合
<222> (1)..(1)
<223> Boc
<220>
<221> 結合
<222> (4)..(4)
<223> Pbf
<220>
<221> 結合
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 結合
<222> (6)..(6)
<223> OtBu
<220>
<221> 結合
<222> (7)..(7)
<223> tBu
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> tBu
<400> 44
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> 結合
<222> (8)..(8)
<223> SPh
<400> 45
<210> 46
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
-
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (13)..(13)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (21)..(21)
<223> -SCH2-CH2-SO3H
<400> 46
<210> 47
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> Methyl
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (13)..(13)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (21)..(21)
<223> -SCH2-CH2-SO3H
<400> 47
<210> 48
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 1C具有噻唑烷基
<220>
<221> CARBOHYD
<222> (13)..(13)
<223> 經二苯甲基保護之二唾液酸寡糖
<220>
<221> 結合
<222> (21)..(21)
<223> -SCH2-CH2-SO3H
<400> 48

Claims (23)

  1. 一種含有複數個加成糖鏈之多胜肽的組成物，其中，該複數個加成糖鏈之多胜肽係選自由(a)由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽；及(b)相對於由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽而具有90%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，並為其中在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈且為具有干擾素β活性者；上述加成糖鏈之多胜肽為經由化學合成製作者；上述加成糖鏈之多胜肽不為經由細胞表現系而得之加成糖鏈之多胜肽；上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈是下式所示之複合型糖鏈
    Figure TWI633115B_C0001
    式中，R1及R2為相同或不同，表示
    Figure TWI633115B_C0002
    ；Ac表示乙醯基；並且，上述組成物中的複數個加成糖鏈之多胜肽之間，糖鏈90%以上為均一。
  2. 一種含有複數個加成糖鏈之多胜肽的組成物，其中，該複數個加成糖鏈之多胜肽係經由包含將加成糖鏈之胜肽片段與至少2個胜肽片段合成之步驟、以及將上述加成糖鏈之胜肽片段與上述至少2個胜肽片段連結之步驟之方法獲得者，而上述加成糖鏈之多胜肽係選自由(a)由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽；及(b)相對於由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽而具有90%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，並為其中在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈且為具有干擾素β活性者；上述加成糖鏈之多胜肽不為經由細胞表現系而得之加成糖鏈之多胜肽；上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈是下式所示之複合型糖鏈
    Figure TWI633115B_C0003
    式中，R1及R2為相同或不同，表示
    Figure TWI633115B_C0004
    ；Ac表示乙醯基；並且，上述組成物中的複數個加成糖鏈之多胜肽之間，糖鏈90%以上為均一。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之組成物，其中，上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈為天冬醯胺結合型糖鏈。
  4. 如申請專利範圍第3項所述之組成物，其中，上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈為下述式(a)表示之二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示之無唾液酸糖鏈者，
    Figure TWI633115B_C0005
    Figure TWI633115B_C0006
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之組成物，其中，在相當於干擾素β第31位及第141位之Cys形成二硫鍵者。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之組成物，其係經加熱處理者。
  7. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之組成物，其係具有90%以上之純度者。
  8. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之組成物，其中，上述組成物中的複數個加成糖鏈之多胜肽為具有90%以上之純度者。
  9. 一種醫藥組成物，其特徵為含有：(I)如申請專利範圍第1項或第2項所述之複數個加成糖鏈之多胜肽及/或其藥學上容許之鹽；以及(Ⅱ)藥理學上容許之載體。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之醫藥組成物，其中，於上述複數個加成糖鏈之多胜肽之間，糖鏈90%以上為均一。
  11. 如申請專利範圍第9項或第10項所述之醫藥組成物，其中，上述複數個加成糖鏈之多胜肽為具有90%以上之純度者。
  12. 如申請專利範圍第9項或第10項所述之醫藥組成物，係用於治療干擾素β參予之疾病。
  13. 如申請專利範圍第12項所述之醫藥組成物，其中，上述干擾素β關連之疾病為至少1種選自由包含多膠芽腫、髓芽腫及星細胞腫之腦腫瘤、皮膚惡性黒色腫、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝變硬及多發性硬化症所成群組之疾病。
  14. 一種申請專利範圍第1項或第2項所述之含有複數個加成糖鏈之多胜肽的組成物的用途，係用以製造干擾素β關連之疾病之治療劑。
  15. 如申請專利範圍第14項所述之用途，其中，上述干擾素β關連之疾病為至少一種選自由包含多膠芽腫、髓芽腫及星細胞腫之腦腫瘤、皮膚惡性黒色腫、B型慢性活動性肝炎、C型慢性肝炎、亞急性硬化性全腦炎、C型代償性肝變硬及多發性硬化症所成群組之疾病。
  16. 一種加成糖鏈之多胜肽，上述加成糖鏈之多胜肽係選自由(a)由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽；及(b)相對於由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽而具有90%以上相同性之多胜肽；所成群組之多胜肽，其係在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈之加成糖鏈之多胜肽，且在相當於干擾素β第17位、31位及141位之Cys係經保護基保護，且上述加成糖鏈之多胜肽不為經由細胞表現系而得之加成糖鏈之多胜肽；上述加成糖鏈之多胜肽中之糖鏈是下式所示之複合型糖鏈
    Figure TWI633115B_C0007
    式中，R1及R2為相同或不同，表示
    Figure TWI633115B_C0008
    ；Ac表示乙醯基。
  17. 如申請專利範圍第16項所述之加成糖鏈之多胜肽，其中，上述糖鏈為下述式(c)表示之二唾液酸糖鏈或下述式(b)表示之無唾液酸糖鏈：
    Figure TWI633115B_C0009
    式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2，又，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基、Me表示甲基、Ph表示苯基；
    Figure TWI633115B_C0010
  18. 如申請專利範圍第16項或第17項所述之加成糖鏈之多胜肽，其中，在相當於上述干擾素β第17位、31位及141位之Cys係經由任一種選自由Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、第三丁基、苯甲基及β位經取代之乙基所成群組之保護基保護者。
  19. 一種加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其特徵為包含：在如申請專利範圍第16項至第18項中任一項所述之加成糖鏈之多胜肽中，對經保護基保護之相當於上述干擾素β第17位、31位及141位之Cys進行脫保護之步驟。
  20. 如申請專利範圍第19項所述之加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其中，在將Cys之保護基進行脫保護步驟之前，將加成糖鏈之多胜肽進行加熱處理者。
  21. 一種加成糖鏈之多胜肽，上述加成糖鏈之多胜肽係選自由(a)由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽；及(b)相對於由序列編號1表示之胺基酸序列所組成之多胜肽而具有90%以上相同性之加成糖鏈之多胜肽；所成群組之多胜肽，並為其中在相當於干擾素β中第80位之胺基酸具有糖鏈之加成糖鏈之多胜肽；上述加成糖鏈之多胜肽不為經由細胞表現系而得之加成糖鏈之多胜肽；且上述糖鏈係下述式(c)表示之存在於糖鏈非還原末端之唾液酸之羧基係經保護之二唾液酸糖鏈：
    Figure TWI633115B_C0011
    式中，R表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph(OMe)2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph(NO2)2，又，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基，Me表示甲基，Ph表示苯基。
  22. 一種加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其特徵為包含：在如申請專利範圍第21項所述之加成糖鏈之多胜肽中，對存在於糖鏈非還原末端之唾液酸之羧基之保護基進行脫保護之步驟者。
  23. 如申請專利範圍第19項、第20項及第22項中任一項所述之加成糖鏈之多胜肽之製造方法，其更包含將上述加成糖鏈之多胜肽進行摺疊之步驟者。
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