CN102015761A - 附加糖链的glp-1肽 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及附加糖链的GLP-1肽，所述附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血中半衰期长，且优选显示高的血糖值抑制活性。本发明涉及一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-1的类似物中，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。

Description

附加糖链的GLP-1肽
技术领域
本发明涉及一种附加糖链的GLP-1肽。
背景技术
GLP-1(胰高血糖素样肽-1：glucagon-like peptide-1)为与糖的体内平衡的控制有很深的关系的起源于肠的肽。GLP-1在胰高血糖素前体胰高血糖素前原的组织特异性翻译后，通过加工处理在肠的L细胞中合成，并响应进食而被释放到循环中。这些肽为肠-胰岛轴的主要介质，其通过与特定的受体结合而起作用。
已知，GLP-1主要与胰脏作用，葡萄糖浓度依赖性地促进由β细胞的胰岛素释放。另外，具有抑制胰高血糖素的分泌、使胃的空洞化延迟、提高末梢的葡萄糖处理的可能性。
通过给药GLP-1，可以使胰岛素非依赖型糖尿病患者的餐后的葡萄糖水平正常化，因此提示，GLP-1具有作为治疗药的可能性。另外，GLP-1也具有改善胰岛素依赖型糖尿病患者的血糖控制的作用。此外，由于GLP-1的胰岛素释放促进作用依赖于血浆葡萄糖浓度，因此，在低的血浆葡萄糖浓度下，GLP-1介导的胰岛素释放少，有不会导致严重的低血糖症的优点。因此认为，通过根据需要控制血中GLP-1量，可以进行安全性高的糖尿病治疗。但存在如下问题：GLP-1在血中的半衰期非常短，为2～6分钟，这限定了其作为治疗剂的可能性。
作为解决这样的问题的方法，进行了改变GLP-1的尝试。例如，在专利文献1中公开了一种聚乙二醇化GLP-1化合物，其为含有共价结合在至少1个聚乙二醇(PEG)分子上的GLP-1化合物的聚乙二醇化GLP-1化合物，其中，各PEG通过Cys或Lys氨基酸与GLP-1化合物结合，或与羧基末端氨基酸结合，聚乙二醇化GLP-1化合物具有至少1小时的排出半衰期。
根据专利文献1，与未聚乙二醇化(unPEGylated)肽相比，可得到半衰期延长、清除延迟化的生物活性肽。另外，公开有这些聚乙二醇化(PEGylated)GLP-1化合物及组合物对糖尿病、肥胖、肠易激综合征以及血糖降低、抑制胃和/或肠运动性及抑制胃和/或肠内容物排出或抑制食物摄取等健康状态的治疗是有用的(例如非专利文献1)。
但是，PEG为在生物体内不代谢的化合物，因此，持续给药聚乙二醇化GLP-1化合物时，存在PEG蓄积在生物体内、对生物体产生药害的危险性(非专利文献1)。
另外，作为为类似于GLP-1的结构、具有同样的活性且血中稳定性高的化合物，从毒蜥蜴(Heloderma)的唾液发现的艾塞那肽-4(exendin-4)(非专利文献2)在美国上市，但艾塞那肽-4为非人型序列，长期给药时，担心会出现中和抗体或随之的药效减弱(非专利文献3～5)。
另一方面，可知糖链在生物体内担负着各种各样的作用，虽然认识到其研究的重要性，但因其结构的复杂性及多样性而导致研究落后。也尝试了用于得到组成一定的糖肽的方法(专利文献2)，但从简便性或大量生产的观点考虑，不能说是充分的制造方法，另外，特别是对于存在于生物体内的长的糖链，不能说是实用的制造方法。
专利文献1：日本特表2006-520818号公报
专利文献2：日本再表2005-095331号公报
非专利文献1：Toxicological Science，42，152-157(1998)。
非专利文献2：J Biol Chem.267.402-5(1992)
非专利文献3：Vascular Health and Risk Management 2，69-77(2006)
非专利文献4：JAMA.298.194-206(2007)
非专利文献5：Endocrine Reviews 28，187&#8211；218(2007)
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明的课题在于，提供一种附加糖链的GLP-1肽，所述附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血中稳定性增大，更理想的是显示高的血糖值抑制活性。
解决课题的技术方案
为了解决以上的课题，本发明可以具有以下的特征。
即，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-1的类似物中，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；或(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具有GLP-1活性的肽中，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1的C末端(37位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附加的氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1的N末端(7位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附加的氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)GLP-1的选自18、20、22、26、30、34及36位中的1个以上部位的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或(c)GLP-1的类似物中，至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；或(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽中，至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
另外，本发明可以为一种具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在(a)GLP-1；或(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸且具有GLP-1活性的肽中，至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
在本发明中，根据实施方式，附加糖链的氨基酸优选可以为附加糖链的Asn或附加糖链的Cys，但并不限定于这些。
另外，在本发明中，在附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸可以通过接头结合，也可以不通过接头结合，根据实施方式，优选不通过接头(直接)结合。
另外，在本发明中，糖链一般优选为由4个以上糖构成的糖链，进而，根据实施方式，有时优选为由5个～11个糖构成的糖链。
另外，在本发明中，根据实施方式，糖链有时优选为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链，但并不限定于这些。
另外，在本发明中，根据实施方式，糖链有时优选下式表示的糖链，但并不限定于这些。
[化1]
Figure G2008800253949D00051
[式中，R1及R2相同或不同，表示化2所示的基团。Ac表示乙酰基。]
[化2]
在本发明中，糖链优选基本上均一，另外，在本发明中，可以这样调整。例如，按照本发明的内容，可以实现90％以上均一或99％以上均一。
本发明的附加糖链的GLP-1肽优选具有比GLP-1大的血中稳定性。
本发明的附加糖链的GLP-1肽可以具有与GLP-1相比优选为5倍以上、进一步优选10倍以上、更优选20倍以上的在OGTT(口服葡萄糖耐量实验)中的血糖值抑制活性。
本发明的附加糖链的GLP-1肽可以具有与GLP-1相比优选为30倍以上、进一步优选50倍以上的DPP-IV耐受性。
可以将本发明的附加糖链的GLP-1肽作为新型的有效成分用于医疗用途。作为这种医疗用途，包含GLP-1相关疾病的治疗或预防。这种疾病的代表例例如为糖尿病。
不言而喻，任意地组合有以上叙述的本发明的特征之一或多个特征的附加糖链的GLP-1肽也为本发明的附加糖链的GLP-1肽。
发明效果
本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血中稳定性增大，另外，在本发明的一实施方式中，与GLP-1相比，血糖值抑制活性增大。因此，本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，可以减少其给药量及给药次数。
另外，由于附加到本发明的附加糖链的GLP-1肽的糖链在生物体内容易被分解，因此，其蓄积不会对生物体产生药害。
另外，附加到本发明的附加糖链的GLP-1肽的糖链的一部分或全部为存在于包含人在内的哺乳类、鸟类等生物体内的糖链，即使向体内给药，也不显示副作用或抗原性，不担心因过敏反应或产生抗体而不能获得药效。
而且，目前为止，关于糖链、尤其是长链的糖链，难以大量且以一定的品质得到附加有具有均一的结构的糖链的肽(或蛋白)，但根据本发明的制造方法，可以稳定、简便且大量地供给作为附加糖链的肽的本发明的化合物，从医药品的制造的观点考虑也是非常有用的。
附图说明
图1是实施例43中的HPLC图的一例，表示18AsnGLP-1-去唾液酸及18Asn GLP-1-二唾液酸的峰。
图2是实施例44中的HPLC图的一例，表示22AsnGLP-1-去唾液酸及22Asn GLP-1-二唾液酸的峰。
图3是实施例45中的HPLC图的一例，表示30AsnGLP-1-去唾液酸及30Asn GLP-1-二唾液酸的峰。
图4是实施例47中的HPLC图的一例，表示36AsnGLP-1-去唾液酸及36Asn GLP-1-二唾液酸的峰。
图5是表示试验例1(血浆中的稳定性试验)中的由实施例7的附加糖链的GLP-1肽的HPLC得到的分析结果的图。
图6是表示试验例1(血浆中的稳定性试验)中的由比较例1的GLP-1的HPLC得到的分析结果的图。
图7是表示试验例2(db/db小鼠中的血糖值降低作用试验)中的给予实施例1～5的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1化合物后的血糖值的变化的图。
图8是表示试验例3(db/db小鼠中的血糖值降低作用试验)中的给予实施例5的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图9是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-1中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图10是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-1中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图11是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-1中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图12是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的糖链结构对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-2中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图13是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的糖链结构对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-2中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图14是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的糖链结构对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-2中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图15是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的给药量对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-3中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图16是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的给药量对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-3中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图17是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的给药量对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-3中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图18是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的给药量对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-3中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图19是表示为了研究Asn附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-4中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图20是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的附加糖链数对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-5中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图21是表示为了研究附加糖链的GLP-1肽的附加糖链数对附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用的影响而实施的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)即试验例7-5中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
图22是表示为了研究糖尿病模型小鼠中附加糖链的GLP-1肽的血糖值降低作用而实施的试验例8中的添加实施例的附加糖链的GLP-1肽及比较例1的GLP-1后的血糖值的变化的图。
具体实施方式
在本说明书中，所谓“GLP-1”，表示胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1)，是指GLP-1(7-37)。
GLP-1(7-37)具有下述氨基酸序列。
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly(序列2)
在本发明中，所谓“GLP-1的类似物”，是指与GLP-1结构上类似的肽和/或具有与GLP-1重复的结构的肽，可列举例如：GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；GLP-1的保守性地取代1或数个氨基酸的肽；GLP-1变异体；具有GLP-1活性的GLP-1的片段；具有GLP-1活性的延长GLP-1以及艾塞那肽-4及其类似物(Curr.Opin.Investig.Drugs 8，842-8(2007)，J.Pharmacol.Exp.Ther.307，490-496(2003)，Diabetes 50，2530-9(2001)等)。
在本说明书中，所谓“氨基酸”，以其最广泛的意义使用，不仅包含天然的氨基酸，而且包含氨基酸变异体及衍生物之类的非天然氨基酸。如果是本领域技术人员，则考虑该广泛的定义，可以理解作为本说明书中的氨基酸，可列举例如：天然蛋白原性L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体及衍生物等经化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等天然非蛋白原性氨基酸及具有作为氨基酸的特征的本领域技术人员公知的特性的化学合成的化合物等。作为非天然氨基酸的实例，可列举：α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(2-氨基组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸、α-氟甲基-组氨酸及α-甲基-组氨酸等)、侧链上具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)及侧链中的羧酸官能团氨基酸被磺酸基取代的氨基酸(半胱氨酸等)。已知几种具有GLP-1活性的GLP-1类似物包括非天然氨基酸。在优选的方式中，本发明的化合物中所含的氨基酸仅由天然氨基酸构成。
在本说明书中，“缺失、取代或附加1或数个氨基酸”的情况，只要保持GLP-1活性，被取代等的氨基酸的个数就没有特别限定，为1～9个、优选1～5个、更优选为1～3个或为总体长度的20％以内、优选10％以内。被取代或附加的氨基酸可以为天然的氨基酸、非天然的氨基酸或氨基酸类似物，优选为天然的氨基酸。
在本说明书中，所谓“保守性地取代1或数个氨基酸”，是在氨基酸取代中，原来的氨基酸和取代的氨基酸的亲水性指数和/或疏水性指数类似的取代，是指在这种取代的前后不产生GLP-1活性的明显降低或消失的取代。
在本说明书中，所谓“GLP-1变异体”，是指天然或人工地改变GLP-1而得的化合物，作为这种改变，可列举例如：GLP-1的1或多个氨基酸残基的烷基化、酰基化(例如乙酰基化)、酰胺化、羧基化、酯形成、二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化、氢氧化、标记成分的结合等。
在本说明书中，所谓“具有GLP-1活性的GLP-1的片段”，是从GLP-1的N末端和/或C末端缺失1个或其以上的氨基酸、且维持GLP-1活性的肽。
在本说明书中，所谓“具有GLP-1活性的延长GLP-1”，是从GLP-1的N末端和/或C末端附加1个或其以上的氨基酸、且维持GLP-1活性的肽(例如参照Endocrinology，125，3109-14(1989))。
在本说明书中，“在GLP-1的C末端(37位)进一步附加有1或数个氨基酸的肽”的情况，从附加于GLP-1的C末端的氨基酸依次称为38位的氨基酸、39位的氨基酸...等，另外，“在GLP-1的N末端(7位)进一步附加有1或数个氨基酸的肽”的情况，从附加于GLP-1的N末端的氨基酸依次称为6位的氨基酸、5位的氨基酸...等。例如，作为“在GLP-1的C末端(37位)进一步附加有1个氨基酸的肽”，可列举在GLP-1的37位的Gly上结合有Asn或Cys的肽。
本发明的“附加糖链的GLP-1肽”的特征在于，至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代。
在本说明书中，“附加糖链的GLP-1肽”包括GLP-1的至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的肽、上述GLP-1类似物中至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的肽，即使各自进一步缺失、取代或附加附加糖链的氨基酸以外的1个或数个氨基酸，也包括在附加糖链的GLP-1肽中。这些肽的C末端酰胺化的肽(例如，具有His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2(序列3)的氨基酸排列的GLP-1(7-36)NH2的至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的肽)也包括在附加糖链的GLP-1肽中。进而，这些肽的盐也包括在附加糖链的GLP-1肽中。
在本说明书中，所谓盐，为本领域技术人员公知的盐，可以是酸加成盐或碱加成盐的任一种。通常用于形成酸加成盐的酸为盐酸、溴化氢酸、碘化氢酸、硫酸、磷酸等无机酸及对甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、对溴苯基磺酸、羧酸、琥珀酸、柠檬酸、安息香酸、醋酸等有机酸。作为碱加成盐，可列举氢氧化铵或碱金属氢氧化物、或者碱土金属氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等由无机碱衍生的盐。特别优选药学上允许的盐。
在本说明书中，所谓“附加糖链的氨基酸”，为结合有糖链的氨基酸，在此，糖链和氨基酸可以通过接头结合。糖链和氨基酸的结合部位没有特别限制，优选在糖链的还原末端结合氨基酸。
结合糖链的氨基酸的种类没有特别限定，也可以使用天然氨基酸、非天然氨基酸的任一种。从附加糖链的氨基酸与作为糖肽(糖蛋白)存在于生物体内的物质具有相同或类似的结构的观点考虑，附加糖链的氨基酸优选N-联糖链那样的附加糖链的Asn、O-联糖链那样的附加糖链的Ser及附加糖链的Thr，特别优选附加糖链的Asn。
另外，糖链和氨基酸通过接头结合的情况，从与接头的结合的容易性的观点考虑，附加糖链的氨基酸的氨基酸优选天冬氨酸或谷氨酸等在分子内具有2个以上羧基的氨基酸；赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸等在分子内具有2个以上氨基的氨基酸；丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等在分子内具有羟基的氨基酸；半胱氨酸等在分子内具有巯基的氨基酸；天冬酰胺、谷氨酰胺等在分子内具有酰胺基的氨基酸。从反应性的观点考虑，特别优选天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺。
需要说明的是，在后述的试验例7-4中，关于本发明的附加糖链的GLP-1肽，在糖链结构、糖链以外的结构、糖链的附加部位及糖链的附加数相同时，在附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn(不通过接头)的情况和附加糖链的Cys(通过接头)的情况下，本发明的附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制活性没有大的差异。
糖链和氨基酸通过接头结合的情况，作为接头，可以广泛使用该领域中采用的接头，可以列举例如：-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-(式中，a为整数，只要不阻碍作为目的的接头功能，就没有限定，优选表示0～4的整数。)、C1-10聚亚甲基、-CH2-R-(在此，R为从选自烷基、被取代的烷基、链烯基、被取代的链烯基、炔基、被取代的炔基、芳基、被取代的芳基、碳环基、被取代的碳环基、杂环基及被取代的杂环基的基团脱去1个氢原子而生成的基团)等。
在附加糖链的GLP-1肽的附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合的情况与糖链和氨基酸通过接头结合的情况相比，附加糖链的GLP-1肽的抗原性可以变低。在附加糖链的GLP-1肽的附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸通过接头结合的情况与糖链和氨基酸不通过接头结合的情况相比，附加糖链的GLP-1肽的血中稳定性可以升高。
需要说明的是，根据记载(例如“氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽”这样的记载)，本发明的附加糖链的GLP-1肽的制造方法不受任何限定，即使为用后述的A法及B法中的任一种方法制造的附加糖链的GLP-1肽，也包含在“氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽”中。另外，例如，将未结合氨基酸的糖链直接或通过接头结合在肽上的氨基酸上的附加糖链的GLP-1肽、在附加糖链的GLP-1肽中通过在附加的糖链上进一步附加糖或糖链而使已经附加的糖链延长的附加糖链的GLP-1肽、使1或数个氨基酸与附加糖链的氨基酸的氨基和/或羧基结合而使其进一步与1或多个GLP-1片段连结的附加糖链的GLP-1肽等，只要最终的结构一致，则均包含在本发明的附加糖链的GLP-1肽中。
GLP-1的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的取代数根据血中稳定性及血糖值抑制活性等生理活性、存在于最终的附加糖链的GLP-1肽中的氨基酸的个数及附加糖链前后的附加糖链的GLP-1肽的分子量等适当调节即可。例如，优选取代1～5个，更优选取代1～3个。从简便性的观点考虑，只要是通过1个取代可得到期望的活性，就优选选择1个取代。一般而言，在GLP-1的1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽中，进一步用附加糖链的氨基酸取代附加糖链的氨基酸以外的1个以上氨基酸时，血中稳定性增大，血糖值抑制活性减少(但是，通过血中稳定性增大，可以补偿减少的血糖值抑制活性)。
在本发明的附加糖链的GLP-1肽中，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位可以根据血中稳定性及血糖值抑制活性适当调节。
在本发明的一实施方式中，附加糖链的氨基酸取代GLP-1氨基酸的部位可以根据期望的活性选择GLP-1的任意的部位，例如为选自GLP-1的8、9、12、18、19、20、22、26、30、34、36及38位(＝在37位的氨基酸上附加了附加糖链的氨基酸)中的1个以上部位，优选为选自18、20、22、26、30、34、36及38位中的1个以上部位，例如为选自26、30、34及36位中的1个以上部位，特别为选自30及36位中的1个以上部位。
在本发明的一实施方式中，从附加糖链的GLP-1肽的血中稳定性的观点考虑，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位可以选择GLP-1的任意的部位，例如为选自GLP-1的9、10、11、12、14、16、18、19、20、22、24、25、26、27、28、30、32、34、36及38位(＝在37位的氨基酸上附加了附加糖链的氨基酸)中的1个以上部位，优选为选自9、10、11、12、14及28位中的1个以上部位，特别优选为选自9、10、11及12中的1个以上部位。也特别优选靠近GLP-1的N末端的部位的氨基酸的取代。特别是作为附加糖链的氨基酸取代GLP-1的2个氨基酸的部位的实例，可以列举例如GLP-1的18位和36位的取代、26位和34位的取代等。
在本发明的一实施方式中，从附加糖链的GLP-1肽的血糖值抑制作用的观点考虑，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位例如为选自GLP-1的18、20、22、26、30、34、36及38位(＝在37位的氨基酸上附加了附加糖链的氨基酸)中的1个以上部位，优选为选自26、30、34及36位中的1个以上部位，特别优选为选自30及36位中的1个以上部位。特别是作为附加糖链的氨基酸取代GLP-1的2个氨基酸的部位的实例，从附加糖链的GLP-1肽的血糖值抑制作用的观点考虑，可以列举例如GLP-1的18位和36位的取代、26位和34位的取代等。
在本发明的一实施方式中，从附加糖链的GLP-1肽的GLP-1活性中与cAMP合成能力有关的观点考虑，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位优选为选自22、26、27、30、34、36及38位(＝在37位的氨基酸上附加了附加糖链的氨基酸)中的1个以上部位，更优选为选自22、26、30、34、36及38位中的1个以上部位。
在本发明的一实施方式中，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位为选自GLP-1的8、9及12位以外的部位中的1个以上部位。
在本发明的一实施方式中，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位为选自GLP-1的7、10、13、15、19、21、28及29位以外的部位中的1个以上部位，特别为选自7、10、15及28位以外的部位中的1个以上部位。
在本发明的一实施方式中，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位也可以由GLP-1与GLP-1受体的结合部位确定。
在本发明的一实施方式中，2个以上的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代时，附加糖链的氨基酸取代氨基酸的部位也可以采用上述任一种的组合，但并不限定于此。例如，1个部位选自上述优选的部位、其它部位选自GLP-1的任意的部位的组合；1个部位选自上述优选的部位、其它部位选自在GLP-1的C末端(37位)进一步附加的1或数个氨基酸的任意的部位的组合等，也包含在本发明的优选的一实施方式中。
在本发明的一实施方式中，附加糖链的氨基酸以外的1或数个氨基酸的缺失、取代或附加优选为GLP-1中的：
8位的Ala被由Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
9位的Glu被由Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
11位的Thr被由Ala、Gly、Ser、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
12位的Phe被由Trp或Tyr构成的组中的任一种氨基酸取代；
13位的Thr被Ser取代；
14位的Ser被由Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
15位的Asp被Glu取代；
16位的Val被由Phe、Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Tyr、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
17位的Ser被由Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
18位的Ser被由Ala、Gly、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
19位的Tyr被由Phe、Trp、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
20位的Leu被由Ala、Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
21位的Glu被由Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
22位的Gly被由Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
23位的Gln被由Asn、Arg、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
24位的Ala被由Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Arg、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
25位的Ala被由Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
26位的Lys被由Arg、Gln、Glu、Asp或His构成的组中的任一种氨基酸取代；
27位的Glu被由Asp、IIe或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
28位的Phe被Trp取代；
29位的Ile被由Leu、Val或Ala构成的组中的任一种氨基酸取代；
30位的Ala被由Gly、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
31位的Trp被由Phe、Tyr、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
32位的Leu被由Gly、Ala、Ser、Thr、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
33位的Val被由Gly、Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
34位的Lys被由Arg、Glu、Asp或His构成的组中的任一种氨基酸取代；
35位的Gly被由Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；
36位的Arg被由Lys、Glu、Asp或His构成的组中的任一种氨基酸取代；和/或
37位的Gly被由Ala、Ser、Thr、Leu、Ile、Val、Glu、Asp或Lys构成的组中的任一种氨基酸取代；但并不限定于这些。
在本发明的一实施方式中，附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的缺失、取代或附加发生的部位优选为选自GLP-1的7、10、13、15、19、21、28及29位以外的部位中的1个以上部位、例如选自7、10、15及28位以外的部位中的1个以上部位(Structure-Activity Studies ofGlucagon-likePeptide-1，THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMlSTRY Vol.269，No.9，lssue of March 4，pp.6276-6278.1994)。
作为本发明的附加糖链的GLP-1肽，可列举例如下述通式(1)表示的附加糖链的GLP-1肽。
通式(1)
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Xaa19-Leu-Glu-Xaa22-Gln-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Xaa36-Xaa37                                (1)
[式中，Xaa18表示Ser、附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
Xaa19表示Tyr、附加糖链的Cys、或附加糖链的Asn。
Xaa22表示Gly、附加糖链的Cys、或附加糖链的Asn。
Xaa26表示Lys、附加糖链的Cys、或附加糖链的Asn。
Xaa36表示Arg、附加糖链的Cys、或附加糖链的Asn。
Xaa37表示Gly、NH2、Gly-附加糖链的Cys或Gly-附加糖链的Asn。
Xaa18为Ser、Xaa19为Tyr、Xaa22为Gly、Xaa26为Lys且Xaa36为Arg时，Xaa37表示Gly-附加糖链的Cys或Gly-附加糖链的Asn。]
在本说明书中，用序列1表示通式(1)表示的肽。
具体而言，作为本发明的附加糖链的GLP-1肽，可列举例如：
(a1)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Cys、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列4)；
(a2)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Cys、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列5)；
(a3)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示附加糖链的Cys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列6)；
(a4)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示附加糖链的Cys且Xaa37表示Gly的肽(序列7)；
(a5)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly-附加糖链的Cys的肽(序列8)；
(a6)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示附加糖链的Cys、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列9)；
(a7)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Asn、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列10)；
(a8)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Asn、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列11)；
(a9)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示附加糖链的Asn、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列12)；
(a10)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示附加糖链的Asn且Xaa37表示Gly的肽(序列13)；
(a11)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly-附加糖链的Asn的肽(序列14)；
(a12)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示附加糖链的Asn、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列15)；
(a13)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Cys、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列16)；
(a14)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Cys、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列17)；
(a15)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示附加糖链的Cys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列18)；
(a16)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示附加糖链的Cys且Xaa37表示NH2的肽(序列19)；
(a17)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示附加糖链的Cys、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列20)；
(a18)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Asn、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列21)；
(a19)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Asn、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列22)；
(a20)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示附加糖链的Asn、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列23)；
(a21)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示附加糖链的Asn且Xaa37表示NH2的肽(序列24)；
(a22)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示附加糖链的Asn、Xaa22表示Gly、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列25)；
(a23)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Cys、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Cys、Xaa26表示Lys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly-附加糖链的Cys的肽(序列26)；
(a24)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Cys、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Cys、Xaa26表示附加糖链的Cys、Xaa36表示Arg且Xaa37表示Gly的肽(序列27)；
(a25)在上述通式(1)中，Xaa18表示Ser、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示Gly、Xaa26表示附加糖链的Asn、Xaa36表示附加糖链的Asn且Xaa37表示Gly-附加糖链的Asn的肽(序列28)；
(a26)在上述通式(1)中，Xaa18表示附加糖链的Asn、Xaa19表示Tyr、Xaa22表示附加糖链的Asn、Xaa26表示附加糖链的Asn、Xaa36表示Arg且Xaa37表示NH2的肽(序列29)等。
在本说明书中，所谓“糖链”，是指1个以上的单元糖(单糖和/或其衍生物)连接的化合物。2个以上的单元糖连结时，各个单元糖彼此之间通过利用糖苷键的脱水缩合来结合。作为这种糖链，除例如生物体中含有的单糖类及多糖类(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及它们的复合体及衍生物)之外，可列举由被分解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、葡萄糖胺聚糖、糖脂等复合生物体分子分解或衍生的糖链等广范围的糖链，但并不限定于这些。糖链可以为直链型，也可以为支链型。
另外，在本说明书中，“糖链”也包含糖链的衍生物，作为糖链的衍生物，可列举例如构成糖链的糖为具有羧基的糖(例如，C-1位被氧化而形成羧酸的醛糖酸(例如，D-葡萄糖氧化得到的D-葡萄糖酸)、末端的C原子形成羧酸的糖醛酸(D-葡萄糖氧化得到的D-葡萄糖醛酸))、具有氨基或氨基的衍生物(例如，乙酰基化的氨基)的糖(例如，N-乙酰基-D-葡萄糖胺、N-乙酰基-D-半乳糖胺等)、兼有氨基及羧基两者的糖(例如，N-乙酰神经氨酸(唾液酸)、N-乙酰胞壁酸等)、脱氧化的糖(例如，2-脱氧-D-核糖)、含有硫酸基的硫酸化糖、含有磷酸基的磷酸化糖等的糖链，但并不限定于这些。
在本发明中，优选的糖链为在附加于GLP-1时(以附加糖链的氨基酸的形式取代了GLP-1的氨基酸时)使血中稳定性增大、且更优选不使血糖值抑制活性消失的糖链。在本发明的某实施方式中，优选的糖链为在附加于GLP-1时(以附加糖链的氨基酸的形式取代了GLP-1的氨基酸时)使血糖值抑制活性增大的糖链。
从给予生物体本发明的附加糖链的GLP-1肽的观点考虑，本发明的附加糖链的GLP-1肽中的糖链为在生物体内以复合糖质(糖肽(或糖蛋白)、蛋白聚糖、糖脂等)存在的糖链，优选为在生物体内作为糖肽(或糖蛋白)与肽(或蛋白)结合的糖链即N-联糖链、O-联糖链等。
本发明中使用的糖链优选为N联糖链。作为N联糖链，可以列举例如高甘露糖(高甘露糖)型、复合(络合)型、混成(混合)型，特别优选复合型。
在本发明的一实施方式中，本发明的附加糖链的GLP-1肽中的糖链优选由4个以上、例如5个以上、7个以上、特别是9个以上、11个以上的糖构成的糖链。
在本发明的优选的一实施方式中，本发明的附加糖链的GLP-1肽中的糖链为由5～11个、9～11个或11个糖构成的糖链。
在本发明的优选的一实施方式中，本发明的附加糖链的GLP-1肽中的糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链，更优选为二唾液酸糖链。
作为本发明中使用的优选的糖链，可列举例如下述通式表示的糖链等。
[化3]
Figure G2008800253949D00221
[式中，R1及R2相同或不同，表示化4所示的基团。Ac表示乙酰基。]
[化4]
Figure G2008800253949D00222
在本发明中，作为优选的糖链，可以列举例如在人体内以与蛋白结合的糖蛋白存在的糖链(例如“FEBS LETTERS Vol.50，No.3，Feb.1975”中记载的糖链)和具有相同的结构的糖链(构成糖的种类及它们的结合方式相同的糖链)或从其非还原末端失去1或多个糖的糖链即下述表1～4记载的糖链。
[表1]
Figure G2008800253949D00231
[表2]
Figure G2008800253949D00251
[表3]
[表4]
Figure G2008800253949D00291
在本发明的优选的一实施方式中，本发明的附加糖链的GLP-1肽中的糖链结构均一。在本说明书中，所谓糖链结构均一，是指构成糖链的各糖的种类、结合顺序及糖间的结合方式相同，是指在至少90％以上、优选95％以上、更优选99％以上的附加糖链的GLP-1肽中，糖链结构均一。糖链均一的附加糖链的GLP-1肽，其品质一定，在医药品的制造等领域中尤其优选。
在本发明中，优选的附加糖链的GLP-1肽例如为在后述的实施例1～49中制造的附加糖链的GLP-1肽(序列103～151)。即，为在以下的GLP-1序列：
His7-Ala8-Glu9-Gly10-Thr11-Phe12-Thr13-Ser14-Asp15-Val16-Ser17-Ser18-Tyr19-Leu20-Glu21-Gly22-Gln23-Ala24-Ala25-Lys26-Glu27-Phe28-Ile29-Ala30-Trp31-Leu32-Val33-Lys34-Gly35-Arg36-Gly37(序列2)中，
(b1)18位的Ser被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例1)(序列103)；
(b2)22位的Gly被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例2)(序列104)；
(b3)26位的Lys被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例3)(序列105)；
(b4)36位的Arg被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例4)(序列106)；
(b5)在37位的Gly上附加有附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例5)(序列107)；
(b6)在37位的Gly上附加有附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例6)(序列108)；
(b7)19位的Tyr被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例7)(序列109)；
(b8)在7位的His上附加有附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例8)(序列110)；
(b9)8位的Ala被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例9)(序列111)；
(b10)9位的Glu被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例10)(序列112)；
(b11)10位的Gly被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例11)(序列113)；
(b12)11位的Thr被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例12)(序列114)；
(b13)12位的Phe被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例13)(序列115)；
(b14)14位的Ser被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例14)(序列116)；
(b15)16位的Val被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例15)(序列117)；
(b16)20位的Leu被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例16)(序列118)；
(b17)24位的Ala被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例17)(序列119)；
(b18)25位的Ala被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例18)(序列120)；
(b19)27位的Glu被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例19)(序列121)；
(b20)28位的Phe被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例20)(序列122)；
(b21)30位的Ala被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例21)(序列123)；
(b22)32位的Leu被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例22)(序列124)；
(b23)34位的Lys被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例23)(序列125)；
(b24)22位的Gly被取代为附加去唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例24)(序列126)；
(b25)26位的Lys被取代为附加去唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例25)(序列127)；
(b26)30位的Ala被取代为附加去唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例26)(序列128)；
(b27)34位的Lys被取代为附加去唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例27)(序列129)；
(b28)36位的Arg被取代为附加去唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例28)(序列130)；
(b29)22位的Gly被取代为附加二N-乙酰葡萄糖胺糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例29)(序列131)；
(b30)30位的Ala被取代为附加二N-乙酰葡萄糖胺糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例30)(序列132)；
(b31)34位的Lys被取代为附加二N-乙酰葡萄糖胺糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例31)(序列133)；
(b32)22位的Gly被取代为附加二甘露糖糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例32)(序列134)；
(b33)30位的Ala被取代为附加二甘露糖糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例33)(序列135)；
(b34)34位的Lys被取代为附加二甘露糖糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例34)(序列136)；
(b35)12位的Phe被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例35)(序列137)；
(b36)18位的Ser被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例36)(序列138)；
(b37)22位的Gly被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例37)(序列139)；
(b38)26位的Lys被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例38)(序列140)；
(b39)27位的Glu被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例39)(序列141)；
(b40)28位的Phe被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例40)(序列142)；
(b41)30位的Ala被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例41)(序列143)；
(b42)36位的Arg被取代为附加去唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例42)(序列144)；
(b43)18位的Ser被取代为附加二唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例43)(序列145)；
(b44)22位的Gly被取代为附加二唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例44)(序列146)；
(b45)30位的Ala被取代为附加二唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例45)(序列147)；
(b46)30位的Ala被取代为附加二唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例46)(序列148)；
(b47)36位的Arg被取代为附加二唾液酸糖链的Asn的附加糖链的GLP-1肽(实施例47)(序列149)；
(b48)26位的Lys及34位的Lys被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例48)(序列150)；
(b49)18位的Ser及36位的Arg被取代为附加二唾液酸糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(实施例49)(序列151)。
本发明的附加糖链的GLP-1肽可以通过在本领域技术人员公知的肽合成方法中插入附加糖链工序来制造。在附加糖链时，也可以使用利用以转谷氨酰胺酶为代表的酶的逆反应的方法，此时，由于存在需要大量附加的糖链、最终工序后的纯化繁杂、糖链的附加位置及可以附加的糖链受到限制等问题，因此，即使可以用于测定用等的少量的合成，有时也不能说为在医药品制造等大规模制造上实用的方法。
作为为本发明的附加糖链的GLP-1肽的简便的制造方法、且糖链结构均一的附加糖链的GLP-1肽的稳定的制造方法的具体例，例示以下方法：通过使用附加糖链的Asn作为附加糖链的氨基酸并应用固相合成、液相合成等公知的肽合成方法来制造附加糖链的GLP-1肽的方法(A法)；及按照公知的肽合成方法制造用Cys取代GLP-1的任意的氨基酸的肽，其后，通过化学合成在Cys上附加糖链，从而制造附加糖链的GLP-1肽的方法(B法)。以这些制造方法为参考，只要是本领域技术人员，就可以制造各种附加糖链的GLP-1肽，得到的附加糖链的GLP-1肽及其制造方法尤其在医药品制造的领域中是非常有用的。另外，所述A法及B法也可以组合进行。如果为用于测定等的少量的合成，则也可以在上述方法中进一步组合利用转移酶的糖链延长反应。需要说明的是，关于A法，可以参考国际公开号WO2004/005330的记载，关于B法，可以参考国际公开号WO2005/010053的记载，另外，关于在各个方法中使用的糖链，可以参考国际公开号WO03/008431、WO2004/058984、WO2004/058824、WO2004/070046、WO2007/011055等。这些文献作为参考被编入到本说明书中。
制造附加糖链的GLP-1肽的方法(A法)
首先，(1)使具有羟基的树脂的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的氨基酸的羧基进行酯化反应。此时，由于用脂溶性保护基保护了氨基酸的氨基氮，因此，防止氨基酸彼此之间的自缩合，树脂的羟基与氨基酸的羧基反应而发生酯化。
接着，(2)脱去由上述得到的酯的脂溶性保护基，形成游离氨基，
(3)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的任意的氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(4)脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(5)通过将上述(3)及(4)工序重复1次以上，可得到连结有任意数的任意氨基酸的末端上结合树脂、另一端具有游离氨基的肽。
(6)接着，使氨基氮被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺(附加糖链的天冬酰胺)的天冬酰胺部分的羧基与上述游离氨基进行酰胺化反应，
(7)进一步脱去上述脂溶性保护基，形成游离氨基，
(8)使该游离氨基与氨基氮被脂溶性保护基保护的任意氨基酸的羧基进行酰胺化反应，
(9)将上述(7)及(8)工序重复1次以上，
(10)通过脱去上述脂溶性保护基而形成游离氨基，可得到连结有任意数的任意氨基酸的末端上结合树脂、另一端具有游离氨基、中间具有糖链天冬酰胺的糖肽。
(11)而且，通过用酸切断树脂，可以制造在肽链的任意位置上具有糖链天冬酰胺的糖肽。
进而，通过适当追加上述(6)的使氨基氮被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺的天冬酰胺部分的羧基与上述游离氨基进行酰胺化反应的工序，可以制造在肽链的任意位置具有至少2个以上的糖链天冬酰胺的糖肽。另外，此时，通过使用不同的糖链天冬酰胺，也可以制造在肽链的任意位置具有2种以上的糖链天冬酰胺的糖肽。
另外，也可以在肽链的端部导入该糖链天冬酰胺。
作为具有羟基的树脂，通常，为在固相合成中使用的具有羟基的树脂即可，可以使用例如A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)、Wang树脂(默克公司制)、HMPA-PEGA树脂(默克公司制)等。
作为氨基酸，可以使用所有的氨基酸，可以列举例如作为天然氨基酸的丝氨酸(Ser)、天冬酰胺(Asn)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)、甘氨酸(Gly)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)、组氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、苏氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)、脯氨酸(Pro)。
作为脂溶性保护基，可以列举例如9-芴甲氧羰(Fmoc)基、叔丁氧羰(Boc)基、苄基、烯丙基、烯丙基氧基羰基、乙酰基等碳酸酯系或酰胺系保护基等。为了导入脂溶性保护基，可以通过例如在导入Fmoc基时加入9-芴甲基-N-琥珀酰亚胺碳酸酯和碳酸氢钠进行反应来导入。反应在0～50℃、优选室温下进行约1～5小时即可。
作为用脂溶性保护基保护的氨基酸，可以用上述方法制造上述氨基酸。另外，也可以使用市售的氨基酸。可以列举例如：Fmoc-ser、Fmoc-Asn、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Ile、Fmoc-Ala、Fmoc-Tyr、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys、Fmoc-Arg、Fmoc-His、Fmoc-Asp、Fmoc-Glu、Fmoc-Gln、Fmoc-Thr、Fmoc-Cys、Fmoc-Met、Fmoc-Phe、Fmoc-Trp、Fmoc-Pro。
作为酯化催化剂，可以使用例如1-均三甲苯基磺酰基-3-硝基-1，2，4-三唑(MSNT)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIPCDI)等公知的脱水缩合剂。氨基酸和脱水缩合剂的使用比例相对前者1重量份，后者通常为1～10重量份，优选为2～5重量份。
酯化反应优选通过例如在固相柱中加入树脂、用溶剂洗涤该树脂、其后加入氨基酸溶液来进行。作为洗涤用溶剂，可以列举例如二甲基甲酰胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。作为溶解氨基酸的溶剂，可以列举例如二甲基亚砜(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反应在0～50℃、优选室温下进行约10分钟～30小时、优选15分钟～24小时即可。
此时，也优选使用醋酸酐等使固相上的未反应的羟基进行乙酰化而加帽(Capping)。
脂溶性保护基的脱去可以通过例如用碱进行处理来进行。作为碱，可以列举例如哌啶、吗啉等。此时，优选在溶剂的存在下进行。作为溶剂，可以列举例如DMSO、DMF、甲醇等。
游离氨基和氨基氮被脂溶性保护基保护的任意的氨基酸的羧基的酰胺化反应优选在活化剂及溶剂的存在下进行。
作为活化剂，可以列举例如二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(WSC/HCl)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基磷酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鎓(DIPCI)、六氟磷酸苯并三唑-1-基氧基-三吡咯烷基鎓(PyBOP)、1-羟基苯并三唑(HOBt)、羟基琥珀酰亚胺(HOSu)、二甲氨基吡啶(DMAP)、1-羟基-7-偶氮苯并三氮唑(HOAt)、羟基邻苯二甲酰亚胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、O-(7-偶氮苯并三氮唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)、O-苯并氮三唑-1-基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、3，4-二氢-3-羟基-4-氧代-1，2，3-苯并三嗪(Dhbt)等。
活化剂的使用量相对氨基氮被脂溶性保护基保护的任意的氨基酸为1～20当量，优选为1～10当量，进一步优选为1～5当量。
作为溶剂，可以列举例如DMSO、DMF、二氯甲烷等。反应在0～50℃、优选室温下进行约10～30小时、优选15分钟～24小时即可。脂溶性保护基的脱去可以与上述同样地进行。
由树脂切断肽链时优选用酸进行处理。作为酸，可以列举例如三氟醋酸(TFA)、氟化氢(HF)等。
通过适当追加上述(6)的与氨基氮被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应、(7)的脱去上述脂溶性保护基而形成游离氨基的工序，可以制造在肽链的任意位置具有至少2个以上的糖链天冬酰胺的糖肽。
另外，通过最终进行上述(6)的与氨基氮被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺的天冬酰胺部分的羧基进行酰胺化反应、(7)的脱去上述脂溶性保护基而形成游离氨基的工序，可以制造在肽链上具有至少1个以上的糖链天冬酰胺的糖肽。
代替上述(6)的工序或在(6)的工序的基础上进行(1)使具有羟基的树脂的羟基与氨基氮被脂溶性保护基保护的糖链天冬酰胺的天冬酰胺部分的羧基进行酯化反应，由此，可以制造在端部具有糖链天冬酰胺的糖肽。
这样，可以得到被附加糖链的Asn取代的附加糖链的GLP-1肽。
制造附加糖链的GLP-1肽的方法(B法)
首先，利用固相合成法、液相合成法、细胞的合成、分离提取天然存在的物质的方法等制造含有Cys的肽。
接着，通过使卤代乙酰胺化复合型糖链衍生物与由上述得到的含有Cys的肽反应来制造。上述反应在通常0～80℃、优选10～60℃、进一步优选15～35℃下进行即可。反应时间优选为通常30分钟～5小时左右。反应结束后，益用公知的方法[例如高效液相色谱法(HPLC)]适当纯化。
卤代乙酰胺化复合型糖链衍生物为例如用-NH-(CO)-(CH2)a-CH2X(X为卤原子，a为整数，只要不阻碍作为目的的接头的功能，就没有特别限定，但优选表示0～4的整数。)取代结合在复合型天冬酰胺联糖链的1位碳上的羟基的化合物。
具体而言，使卤代乙酰胺化复合型糖链衍生物与含Cys肽在磷酸缓冲液中、室温下反应。反应结束后，用HPLC进行纯化，由此，可以得到被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽。
本发明的附加糖链的GLP-1肽具有GLP-1活性。
在本说明书中，所谓“GLP-1活性”，是指GLP-1的公知的生理活性的一部分或全部。已知，GLP-1除具有血糖值抑制作用之外，还具有例如作为胰岛作用的伴有cAMP合成衍生的胰岛素分泌、胰岛保护(凋亡抑制)、胰岛增殖；作为胰腺外作用的食欲抑制、消化道运动抑制、降钙素分泌促进、缺血时的心脏保护作用等。因此，所谓GLP-1活性，是指与这些作用相关的生理活性的一部分或全部，其可以分别使用本领域技术人员公知的方法进行测定。
例如，在GLP-1活性中，血糖值抑制活性可以使用糖尿病小鼠(db/db小鼠)中的血糖值降低作用的测定或口服葡萄糖耐量试验(OGTT：oral glucose tolerance test)中的血糖值上升抑制作用的测定等进行测定。需要说明的是，在本说明书中，所谓“血糖值抑制”，包含抑制血糖值的上升及使血糖值降低中的任一种概念。尤其在本说明书中，有时将db/db小鼠中的血糖值抑制作用称为“血糖值降低作用”，将OGTT中的血糖值抑制作用称为“血糖值上升抑制作用”。
利用OGTT的血糖值抑制活性可以通过测定使小鼠强制饮糖时的血糖值上升的抑制来判断。例如，使用后述的试验例7的方法时，首先，对绝食了一晚上的小鼠给予被检测化合物，30分钟后，经口给予葡萄糖溶液。通过给予葡萄糖，小鼠血糖值上升，在给药后约30分钟后达到最大并缓慢地减少。测定给予葡萄糖后30分钟的血糖值，与给予GLP-1时的血糖值进行比较，由此可以测定附加糖链的GLP-1肽的血糖值抑制作用。将该30分钟后的血糖值与给予GLP-1的情况比较时，本发明的附加糖链的GLP-1肽显示优选80％以下、更优选60％以下、进一步优选40％以下、特别优选20％以下的血糖值。另外，通过比较在OGTT中确认有同程度的血糖值上升抑制作用时的给药量，可以判断本发明的附加糖链的GLP-1肽的血糖值抑制活性的强度。例如，在给予10次GLP-1的情况和给予1次某种附加糖链的GLP-1肽的情况下得到相同的血糖值抑制作用时，该附加糖链的GLP-1肽的血糖值抑制活性为GLP-1的10倍。本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，具有优选5倍以上、更优选10倍以上、进一步优选20倍以上、特别优选50倍或其以上的血糖值抑制活性。
使用db/db小鼠的血糖值抑制活性可以通过对糖尿病小鼠给予被检测化合物后的血糖值进行测定来判断。使用例如后述的试验例8中记载的方法时，经时测定给予被检测化合物后的血糖值，例如，如果给药后120分钟的血糖值与给药时相比降低，则可以确认血糖值降低作用。另外，通过测定例如给药后300分钟的血糖值，还可以判断血糖值降低作用的持续性。使用后述的试验例8的方法将给药后120分钟的血糖值与给予GLP-1的情况进行比较时，本发明的附加糖链的GLP-1肽显示优选80％以下、更优选70％以下、特别优选60％以下的血糖值。另外，将给药后120分钟的血糖值与给药时的血糖值比较时，本发明的附加糖链的GLP-1肽显示优选70％以下、更优选60％以下、特别优选50％以下(例如45％以下)的血糖值。将给药后300分钟的血糖值与给予GLP-1的情况比较时，本发明的附加糖链的GLP-1肽显示优选70％以下、更优选50％以下的血糖值。另外，将给药后300分钟的血糖值与给药时的血糖值比较时，本发明的附加糖链的GLP-1肽显示优选70％以下、更优选50％以下的血糖值。
需要说明的是，即使血糖值抑制活性与GLP-1相比低，也由于血中稳定性增大来补偿该活性的低下。
例如，在GLP-1活性中，胰岛素分泌活性可以使用体外的cAMP合成能力试验等进行测定。GLP-1通过与GLP-1受体结合，使细胞内的cAMP浓度上升，促进胰岛素分泌。因此，例如用附加糖链的GLP-1肽刺激小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞，测定在细胞内合成的cAMP量，将EC50值与GLP-1比较，由此，可以测定附加糖链的GLP-1肽的胰岛素分泌活性。
本发明的附加糖链的GLP-1肽具有比GLP-1大的血中稳定性。血中稳定性可以使用本领域技术人员公知的方法进行测定，例如，测定血浆中的稳定性或对DPP-IV(二肽基肽酶IV)的耐受性，可以以半衰期、AUC(药物血中浓度-时间曲线下面积)等为指标进行判断。另外，肾清除率的增大也有助于血中稳定性的增大。
血浆中的稳定性可以使用例如后述的试验例1那样的方法进行判断。本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血浆中的稳定性增大。
如例如后述的试验例4那样，对DPP-IV的耐受性可以通过DPP-IV溶液中的半衰期的测定来判断。本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，对DPP-IV的耐受性增大，使用例如后述的试验例4的方法测定对DPP-IV的耐受性时，其半衰期比GLP-1大1.2倍以上(例如2倍以上)、优选5倍以上、更优选10倍以上、特别优选20倍以上。
另外，本发明的附加糖链的GLP-1肽具有优选至少1小时、更优选至少3、5、7、10、15、20小时及进一步优选至少24小时的血中半衰期。
下面，对含有本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分的医药组合物进行说明。
含有本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分的医药组合物对GLP-1相关疾病的治疗或预防是有效的。如上所述，已知GLP-1具有各种作用，与这些作用相关的疾病也多种多样。例如发现，GLP-1通过刺激胰岛素释放，引起细胞的葡萄糖摄取及血糖值的降低。另外还发现，抑制胃和/或肠运动性、抑制胃和/或肠内容物排出以及抑制食物摄取。因此，GLP-1相关疾病包含例如非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)、胰岛素依赖性糖尿病、脑溢血(参照由Efendic的WO00/16797)、心肌梗塞(参照由Efendic的WO98/08531)、肥胖(参照由Efendic的WO98/19698)、功能性消化不良、肠易激综合征(参照由Efendic的WO99/64060)、胰岛移植。含有本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分的医药组合物对糖尿病的治疗或预防是特别有效的，如果进一步特定，则对1型糖尿病的预防、II型糖尿病的治疗是有效的。
上述医药组合物采用通常使用的填充剂、增量剂、粘合剂、加湿剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂等稀释剂或赋形剂，制成通常的医药组合物的形式。
作为这种医药组合物，可列举例如片剂、丸剂、散剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、颗粒剂、胶囊剂、栓剂、注射剂等。
医药组合物中所含的本发明的附加糖链的GLP-1肽的量没有特别限定，可以从广泛的范围中适当选择，通常优选在医药组合物中含有1～70重量％本发明的附加糖链的GLP-1肽。
含有本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分的医药组合物既可以进一步含有其它有效成分，也可以与含有其它有效成分的医药组合物组合使用。另外，含有本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分的医药组合物既可以进一步含有不同的1种以上的本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分，也可以与含有不同的1种以上的本发明的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分的医药组合物组合使用。
作为本发明所述的医药组合物的给药方法，没有特别限制，可用根据各种制剂形态、患者的年龄、性别、疾病的状态、其它条件选择方法进行给药。作为片剂、丸剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂、颗粒剂及胶囊剂的给药方法，可列举例如经口给药。另外，为注射剂的情况下，可以单独或与葡萄糖、氨基酸等通常的补液混合，在静脉内、肌肉内、皮内、皮下或腹腔内给药。栓剂的情况，则直肠内给药。
上述医药组合物的给药量根据用法、患者的年龄、性别、疾病的程度、其它条件适当选择即可，通常相对体重1kg，本发明的附加糖链的GLP-1肽的给药量为0.1～900nmol、优选1～90nmol。本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血中稳定性非常高，另外，在一实施方式中，本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血糖值抑制活性非常高，因此，具有可以减少给药量的优点。
上述医药组合物的给药次数根据用法、患者的年龄、性别、疾病的程度、其它条件适当选择即可，也可以根据例如3次/1日、2次/1日、1次/1日、进而根据其血中稳定性选择频率更少的给药次数(例如1次/周、1次/月等)。优选上述医药组合物的给药次数为1次以下/1日。本发明的附加糖链的GLP-1肽与GLP-1相比，血中稳定性非常高，因此，具有可以减少给药次数的优点。
附加于本发明的附加糖链的GLP-1肽的糖链在体内的代谢系统中容易被分解。另外，在本发明的一实施方式中，该糖链具有在生物体内作为糖肽(或糖蛋白)结合而存在的结构。因此，本发明的附加糖链的GLP-1肽及含有该肽作为有效成分的医药组合物具有如下优点：即使向生物体内给药，也不显示副作用或抗原性，因过敏反应或产生抗体而不能获得药效的担心少等。
而且，本发明的附加糖链的GLP-1肽可以稳定、简便且大量地供给，从提供品质稳定的高品质的医药品的观点考虑也是非常有用的。
本发明还提供一种GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于，给予有效量的本发明的附加糖链的GLP-1肽。
实施例
下面，基于实施例对本发明进行具体说明，但不受这些实施例任何限定。需要说明的是，在图7～22中，有时将例如GLP-1的22位的氨基酸被附加二唾液酸糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽即“22Cys GLP-1-二唾液酸”根据需要记载为“22Cys-二唾液酸GLP-1”、“C22”或“C22-二唾液酸”。关于其它糖链及氨基酸部位也同样。
实施例1 18位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列30)。需要说明的是，Fmoc法的性质上，从C末端侧以37→7方向记载序列。
使用DCM及DMF洗涤后，将相当于5μmol 31残基的肽的树脂移到微量离心管。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的18位的丝氨酸被Cys取代的肽。
使3mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00441
化学株式会社制)
[化5]
Figure G2008800253949D00451
和上述合成的肽链1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、170μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的18位的Ser被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(1)(18Cys GLP-1-二唾液酸)1mg。
实施例2～5
除变更氨基酸的缩合顺序之外，与实施例1同样地操作，得到GLP-1的22位的Gly被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(2)(22Cys GLP-1-二唾液酸)、GLP-1的26位的Lys被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(3)(26Cys GLP-1-二唾液酸)、GLP-1的36位的Arg被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(4)(36Cys GLP-1-二唾液酸)、及在GLP-1的37位的Gly上进一步结合附加糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(5)(38Cys GLP-1-二唾液酸)。将结果示于表5。
比较例1
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(100μmol)，用DCM、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)和MSNT(0.50mmol)、N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于NMP(1ml)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列31)。
使用DCM及DMF洗涤后，将相当于5μmol 31残基的肽的树脂移到微量离心管。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC(Cadenza柱C18100×10mm展开溶剂A：0.1％TFA水溶液B：0.1％TFA乙腈∶水＝90∶10梯度A∶B＝95∶5&#10141；5∶9515分钟 流速3.0ml/分钟)纯化，得到GLP-1。将结果示于表5。
表5
  MALDI-TOF质谱(Bluker Daltonics，AutoFLEX)
 实施例1   18Cys GLP-1-二唾液酸   计算C237H367N47O108S[M+H]+5631.47，测得5632.0
 实施例2   22Cys GLP-1-二唾液酸   计算C238H369N47O109S[M+H]+5661.44，测得5662.1
 实施例3   26Cys GLP-1-二唾液酸   计算C234H360N46O109S[M+H]+5590.38，测得5591.7
 实施例4   36Cys GLP-1-二唾液酸   计算C234H360N44O109S[M+H]+5562.37，测得5562.9
 实施例5   38Cys GLP-1-二唾液酸   计算C240H372N48O110S[M+H]+5718.47，测得5719.1
 比较例1   GLP-1
实施例6 38位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(100μmol)，用DCM、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)和MSNT(0.50mmol)、N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于NMP(1ml)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。(最后的氨基酸使用Boc-His(Trt)-OH。缩合方法与Fmoc-His(Trt)-OH同样地进行。)
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，用Boc基保护的氨基酸使用Boc-His(Trt)-OH，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列32)。
使用DCM及DMF洗涤后，以树脂充分浸没的程度添加三氟乙醇和醋酸的混合溶液(1∶1)，在室温下搅拌18小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣浓缩，得到保护肽Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Boc(序列33)。将相当于2μmol 31残基的保护肽的树脂移到茄形烧瓶，使其溶解于DMF(0.03ml)。使去唾液酸糖链天冬酰胺(胺游离体)(4.9mg、1μmol)、PyBOP(1mg、1.9μmol)、HoBt(0.3mg、2μmol)溶解于DMF(0.04ml)，将其加入另外准备好的微量离心管中，最后加入DIPEA(0.00052ml、3μmol)。将该微量离心管的混合溶液加入刚才准备好的茄形烧瓶中，在室温下搅拌2.5小时。反应结束后，将溶液浓缩，在得到的残渣中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下进行搅拌。2小时后，在另外准备好的二乙醚(150ml)中加入该溶液并进行晶析，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标附加糖链的GLP-1肽的残渣。将该得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的38位被附加糖链的Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(38Asn-GLP-1-去唾液酸)。
ESI-MS：计算C217H336N46O94:[M+3H]3+1697.8，测得1697.9。
实施例7 19位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(100μmol)，用DCM、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)和MSNT(0.50mmol)、N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于NMP(1ml)，加入0.45MHCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu的18残基肽(序列34)。
使用DCM及DMF洗涤后，将相当于5μmol 18残基的肽的树脂移到微量离心管。
使(18mg，10μmol)糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D00501
化学株式会社制)
[化6]
Figure G2008800253949D00502
和DEPBT(4.5mg，15μmol)溶解于DMF(0.34ml)，放入微量离心管中。加入DIPEA(2.6μl，15μmol)，在室温下搅拌24小时。用DMF和DCM洗涤时，在固相上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Asn(寡糖链)的19残基的糖链肽(序列35)。其后，通过HOBt(3.4mg，0.025mmol)、DIPCI(3.8μl，0.025mmol)、DMF(0.1ml)使氨基被Fmoc保护的氨基酸缩合，在固相上形成Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Asn(寡糖链)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基的糖链肽(序列36)。
取一部分得到的形成有糖链肽的树脂并加入到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的19位被附加糖链的Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(19Asn-GLP-1-去唾液酸)。
ESI-MS：计算C214H331N45O92:[M+3H]3+1668.8，测得1668.1。
表6
  EMI-MS
 实施例6   38Asn GLP-1-去唾液酸   计算C217H336N46O94S[M+3H]3+1697.8，测得1697.9
 实施例7   19Asn GLP-1-去唾液酸   计算C214H331N45O92S[M+3H]3+1668.8，测得1668.1
实施例8 6位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Cys(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-Cys(Trt)的32残基肽(序列37)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到在GLP-1的6位上附加有Cys的肽。
使34mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00531
化学株式会社制)和上述合成的肽链9.6mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到在GLP-1的6位上附加有附加糖链的Cys的附加糖链的GLP-1肽(6Cys GLP-1-二唾液酸)9.9mg。
实施例9 8位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-His(Trt)的31残基肽(序列38)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的8位的Ala被Cys取代的肽。
使25mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大化学株式会社制)和上述合成的肽链7.3mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、730μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的8位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(8Cys GLP-1-二唾液酸)9.3mg。
实施例10 9位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列39)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的9位的Glu被Cys取代的肽。
使50mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00561
化学株式会社制)和上述合成的肽链16.4mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1.7ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的9位的Glu被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(9Cys GLP-1-二唾液酸)7.3mg。
实施例11 10位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列40)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的10位的Gly被Cys取代的肽。
使16.8mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00571
化学株式会社制)和上述合成的肽链5.6mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、560μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的10位的Gly被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(10Cys GLP-1-二唾液酸)3.0mg。
实施例12 11位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Cys(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列41)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的11位的Thr被Cys取代的肽。
使41mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00591
化学株式会社制)和上述合成的肽链12.8mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1.3ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的11位的Thr被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(11Cys GLP-1-二唾液酸)11.9mg。
实施例13 12位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列42)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的12位的Phe被Cys取代的肽。
使33mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00611
化学株式会社制)和上述合成的肽链9.5mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的12位的Phe被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(12Cys GLP-1-二唾液酸)10.0mg。
实施例14 14位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列43)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的14位的Ser被Cys取代的肽。
使32mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00621
化学株式会社制)和上述合成的肽链8.8mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的14位的Ser被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(14Cys GLP-1-二唾液酸)8.4mg。
实施例15 16位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列44)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的16位的Val被Cys取代的肽。
使36mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00641
化学株式会社制)和上述合成的肽链12mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1.2ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的16位的Val被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(16Cys GLP-1-二唾液酸)11.2mg。
实施例16 20位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列45)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的20位的Leu被Cys取代的肽。
使36.9mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00661
化学株式会社制)和上述合成的肽链12.3mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1.5ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的20位的Leu被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(20Cys GLP-1-二唾液酸)13.4mg。
实施例17 24位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列46)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的24位的Ala被Cys取代的肽。
使6.6mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大化学株式会社制)和上述合成的肽链2.2mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、250μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的24位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(24Cys GLP-1-二唾液酸)1.8mg。
实施例18 25位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列47)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的25位的Ala被Cys取代的肽。
使28mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00691
化学株式会社制)和上述合成的肽链8.3mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、830μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的25位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(25Cys GLP-1-二唾液酸)5.6mg。
实施例19 27位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列48)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的27位的Glu被Cys取代的肽。
使34mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00701
化学株式会社制)和上述合成的肽链10.8mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1.1ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的27位的Glu被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(27Cys GLP-1-二唾液酸)8.7mg。
实施例20 28位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列49)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的28位的Phe被Cys取代的肽。
使30.6mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大化学株式会社制)和上述合成的肽链10.2mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1.2ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的28位的Phe被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(28Cys GLP-1-二唾液酸)10.3mg。
实施例21 30位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列50)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被Cys取代的肽。
使21.3mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00741
化学株式会社制)和上述合成的肽链7.1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、0.7ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(30Cys GLP-1-二唾液酸)6.6mg。
实施例22 32位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列51)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的32位的Leu被Cys取代的肽。
使20mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00751
化学株式会社制)和上述合成的肽链5.6mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、600μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的32位的Leu被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(32Cys GLP-1-二唾液酸)3.5mg。
实施例23 34位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列52)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被Cys取代的肽。
使33mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D00771
化学株式会社制)和上述合成的肽链10.0mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、1ml，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(34Cys GLP-1-二唾液酸)7.9mg。
实施例24 22位Cys-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列53)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被Cys取代的肽。
使15mg溴乙酰基化了的去唾液酸糖链(c)(大
Figure G2008800253949D00791
化学株式会社制)
[化7]
Figure G2008800253949D00792
和上述合成的肽链3.4mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、340μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(22Cys GLP-1-去唾液酸)0.7mg。
实施例25 26位Cys-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列54)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的26位的Lys被Cys取代的肽。
使13mg溴乙酰基化了的去唾液酸糖链(c)(大化学株式会社制)和上述合成的肽链3.9mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、400μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的26位的Lys被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(26Cys GLP-1-去唾液酸)1.0mg。
实施例26 30位Cys-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列55)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被Cys取代的肽。
使9.0mg溴乙酰基化了的去唾液酸糖链(c)(大
Figure G2008800253949D00821
化学株式会社制)和上述合成的肽链4.1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、410μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC [柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(30Cys GLP-1-去唾液酸)2.4mg。
实施例27 34位Cys-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列56)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被Cys取代的肽。
使10mg溴乙酰基化了的去唾液酸糖链(c)(大
Figure G2008800253949D00841
化学株式会社制)和上述合成的肽链3.5mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、350μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(34Cys GLP-1-去唾液酸)2.2mg。
实施例28 36位Cys-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列57)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的36位的Arg被Cys取代的肽。
使3.0mg溴乙酰基化了的去唾液酸糖链(c)(大
Figure G2008800253949D00851
化学株式会社制)和上述合成的肽链0.5mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、100μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的36位的Arg被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(36Cys GLP-1-去唾液酸)0.2mg。
实施例29 22位Cys-附加二N-乙酰葡萄糖胺糖链的GLP-1肽的 合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列58)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被Cys取代的肽。
使8.4mg溴乙酰基化了的二N-乙酰葡萄糖胺糖链(d)(大
Figure G2008800253949D00871
化学株式会社制)
[化8]
Figure G2008800253949D00881
和上述合成的肽链3.4mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、340μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(22Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺)2.2mg。
实施例30 30位Cys-附加二N-乙酰葡萄糖胺糖链的GLP-1肽的 合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列59)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被Cys取代的肽。
使9.3mg溴乙酰基化了的二N-乙酰葡萄糖胺糖链(d)(大
Figure G2008800253949D00891
化学株式会社制)和上述合成的肽链4.1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、410μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(30Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺)2.2mg。
实施例31 34位Cys-附加二N-乙酰葡萄糖胺糖链的GLP-1肽的 合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列60)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被Cys取代的肽。
使12mg溴乙酰基化了的二N-乙酰葡萄糖胺糖链(d)(大化学株式会社制)和上述合成的肽链3.9mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、390μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(34Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺)1.5mg。
实施例32 22位Cys-附加二甘露糖糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列61)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被Cys取代的肽。
使7.2mg溴乙酰基化了的二甘露糖糖链(e)(大
Figure G2008800253949D00931
化学株式会社制)
[化9]
Figure G2008800253949D00932
和上述合成的肽链3.4mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、340μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(22Cys GLP-1-二甘露糖)1.6mg。
实施例33 30位Cys-附加二甘露糖糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Cys(Trt)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列62)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被Cys取代的肽。
使10.2mg溴乙酰基化了的二甘露糖糖链(e)(大
Figure G2008800253949D00951
化学株式会社制)和上述合成的肽链4.1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、410μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(30Cys GLP-1-二甘露糖)2.4mg。
实施例34 34位Cys-附加二甘露糖糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列63)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被Cys取代的肽。
使10mg溴乙酰基化了的二甘露糖糖链(e)(大
Figure G2008800253949D00961
化学株式会社制)和上述合成的肽链3.9mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、390μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的34位的Lys被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(34Cys GLP-1-二甘露糖)1.3mg。
实施例35 12位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Ala(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)，在固相树脂上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)的12残基的肽(序列64)。将该12残基的肽7.0μmol分转移到另外准备好的固相合成用柱，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟，用DMF洗涤后，在另外准备好的离心管中使去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(27.7mg，14.0μmol)和DEPBT(6.3mg，21.1μmol)溶解于DMF/DMSO(4∶1混合溶液、0.35ml)，将其加入到固相合成用柱中，加入DIPEA(2.4μl，14.1μmol)，在室温下搅拌18小时。用DMF和DCM洗涤时，在固相上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(寡糖链)的13残基的糖链肽(序列65)。
其后，将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt(4.7mg，0.03mmol)、DIPCI(5.4μl，0.03mmol)溶解于DMF(0.875ml)，使其活化15分钟后，将其加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使氨基酸氨基酸依次缩合。用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala，用Boc基保护的氨基酸使用Boc-His(Trt)，在固相树脂上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(寡糖链)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的18残基的糖链肽(序列66)。
使用DCM和DMF洗涤后，在树脂充分浸没三氟醋酸乙醇和醋酸的混合溶液(1∶1)的程度的基础上，在室温下搅拌18小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣浓缩，得到保护糖链肽Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Asn(寡糖链)-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NH-Boc(序列67)。
将相当于2.45μmol 18残基的保护糖链肽转移到茄形烧瓶，使其溶解于DMF(0.1ml)后，在氩气氛围下冷却至-15～-20℃。在其中加入苄基硫醇(8.7μl，73.6μmol)后，加入另外准备好的PyBOP(6.4mg，12.3μmol)的DMF溶液(0.231ml)，接着，加入DIPEA(2.1μl，12.3μmol)。在-15～-20℃下搅拌2小时后，加入到冷却好的二乙醚(150ml)，使肽成分沉淀，然后，用膜滤器除去溶液部分。在得到的残渣中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌。2小时后，再次将该溶液加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到2.1mg C末端为苄基硫酯的肽PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Asn(寡糖链)-Thr-Gly-Glu-Ala-His(序列68)。
另一方面，在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)，用Boc基保护的氨基酸使用Boc-Cys(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)的13残基的肽(序列69)。在该肽中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌3.5小时。其后，加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该得到的残渣用HPLC [柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标肽Gly-Arg-Gly-Lys-Val-Leu-Trp-Ala-Ile-Phe-Glu-Lys-Cys(序列70)。
将这样制备成的18残基的C末端为苄基硫酯肽(2.1mg)和13残基的肽(2.6mg)两种放入相同的离心管，使其溶解于pH6.8的缓冲溶液(0.58ml)(用6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)后，在室温下加入硫代苯酚(2.9μl)，在室温下进行反应。24小时后，用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到31残基的糖链肽1.5mg。
将得到的糖链肽放入离心管，使其溶解于pH7.0的缓冲溶液(用35mM TCEP溶液、6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)。在室温下在该反应溶液中加入活化的兰尼镍，26小时后，用HPLC确认反应结束后，用膜滤器过滤反应溶液，将含有目标附加糖链的GLP-1肽的滤液部分用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的GLP-1的12位的Phe被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(12Asn GLP-1-去唾液酸)0.8mg。
实施例36 18位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(50μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.125mmol)、TBTU(0.125mmol)及N-乙基吗啉(0.125mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.25mmol)、MSNT(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.175mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.25mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.25mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.25mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)的19残基的肽(序列71)。
使198mg(100μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D01021
化学株式会社制)和DEPBT30.0mg(100μmol)溶解于NMP/DMSO(2.4/0.6ml)，将其加入到固相合成用柱中。加入DIPEA26μl(150μmol)，在室温下搅拌24小时。用DMF和DCM洗涤时，在固相上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Asn(寡糖链)的20残基的糖链肽(序列72)。其后，通过HOBt34mg(0.25mmol)、DIPCI 38μl(0.25mmol)、DMF(1ml)使氨基被Fmoc保护的氨基酸缩合，形成Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Asn(寡糖链)-Ser(tBu)-yal-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基的糖链肽(序列73)。
将得到的形成有糖链肽的树脂以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的18位的Ser被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(18Asn GLP-1-去唾液酸)8.2mg。
实施例37 22位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(50μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.125mmol)、TBTU(0.125mmol)及N-乙基吗啉(0.125mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.25mmol)、MSNT(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.175mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.25mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.25mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.25mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)的15残基的肽(序列74)。
使198mg(100μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大化学株式会社制)和DEPBT30mg(100μmol)溶解于NMP/DMSO(2.4/0.6ml)，将其加入到固相合成用柱中。加入DIPEA(26μl，150μmol)，在室温下搅拌24小时。用DMF和DCM洗涤时，在固相上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Asn(寡糖链)的16残基的糖链肽(序列75)。其后，通过HOBt34mg(0.25mmol)、DIPCI 38μl(0.25mmol)、DMF(1ml)使氨基被Fmoc保护的氨基酸缩合，形成Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Asn(寡糖链)-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基的糖链肽(序列76)。
将得到的形成有糖链肽的树脂以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的22位的Gly被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(22Asn GLP-1-去唾液酸)12.2mg。
实施例38 26位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Ala(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala，用Boc保护的氨基酸使用Boc-His(Trt)，在固相树脂上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)(序列77)的18残基的肽。
使用DCM及DMF洗涤后，以树脂充分浸没的程度添加三氟乙醇和醋酸的混合溶液(1∶1)，在室温下搅拌18小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣浓缩，得到保护肽Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc(序列78)。
将相当于35μmol 18残基的保护肽移到茄形烧瓶，使其溶解于DMF(3.7ml)后，在氩气氛围下冷却至-15～-20℃。在其中加入苄基硫醇(125μl，1.06mmol)后，加入另外准备好的PyBOP(94.7mg，182μmol)的DMF溶液(1.0ml)，接着，加入DIPEA(29.8μl，175μmol)。在-15～-20℃下搅拌2小时后，加入到冷却好的二乙醚(150ml)，使肽成分沉淀，然后，用膜滤器除去溶液部分。在得到的残渣中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌。2小时后，再次将该溶液加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到C末端为苄基硫酯的18残基的肽PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His(序列79)。
另一方面，在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt(67.6mg，0.50mmol)、DIPCI(77.0μl，63.1mg，0.50mmol)溶解于DMF(2ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)，在固相树脂上得到Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)的11残基的肽(序列80)。将该11残基的肽10μmol分转移到另外准备好的固相合成用柱，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟，用DMF洗涤后，在另外准备好的离心管中使40.0mg(20.0μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D01071
化学株式会社制)和DEPBT9.0mg(30.0μmol)溶解于DMF/DMSO(4∶1混合溶液、0.5ml)，将其加入到固相合成用柱中，加入DIPEA 3.4μl(20μmol)，在室温下搅拌16小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，使Boc-Cys(Trt)、HoBt 6.8mg(0.05mmol)、DIPC I7.7μl(0.05mmol)溶解于DMF(1ml)，使其活化15分钟后，将其加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用DCM、DMF洗涤树脂，由此，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Asn(寡糖链)-Cys(Trt)的13残基的糖链肽(序列81)。在该肽中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌3.5小时。其后，加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，进行离心分离操作，将含有目标糖肽的沉淀物和溶液部分分开。其后，除去该溶液部分，用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标糖链肽7.1mg。
将这样制备成的18残基的C末端为苄基硫酯肽(1.6mg)和13残基的糖链肽(2.5mg)两种放入相同的离心管，使其溶解于pH6.8的缓冲溶液(0.8ml)(用6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)后，在室温下加入硫代苯酚(8.0μl)，在室温下进行反应。24小时后，用HPLC确认反应结束后，将反应溶液直接用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C18 5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的31残基的糖链肽2.0mg。
将得到的糖链肽(1.0mg)放入离心管，使其溶解于pH7.0的缓冲溶液(用35mM TCEP溶液、6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)。在室温下在该反应溶液中加入活化的兰尼镍，18小时后，用HPLC确认反应结束后，用膜滤器过滤反应溶液，将含有目标糖链肽的滤液部分用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18 5μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的GLP-1的26位的Lys被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(26Asn GLP-1-去唾液酸)0.2mg。
实施例39 27位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Ala(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala，用Boc保护的氨基酸使用Boc-His(Trt)，在固相树脂上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的18残基的肽(序列82)。
使用DCM及DMF洗涤后，以树脂充分浸没的程度添加三氟乙醇和醋酸的混合溶液(1∶1)，在室温下搅拌18小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣浓缩，得到18残基的保护肽Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc(序列83)。
将相当于35μmol 18残基的保护肽移到茄形烧瓶，使其溶解于DMF(3.7ml)后，在氩气氛围下冷却至-15～-20℃。在其中加入苄基硫醇125μl(1.06mmol)后，加入另外准备好的PyBOP 94.7mg(182μmol)的DMF溶液(1.0ml)，接着，加入DIPEA29.8μl(175μmol)。在-15～-20℃下搅拌2小时后，加入到冷却好的二乙醚(150ml)，使肽成分沉淀，然后，用膜滤器除去溶液部分。在得到的残渣中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌。2小时后，再次将该溶液加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到C末端为苄基硫酯的18残基的肽PhS-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His(序列84)。
另一方面，在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt 67.6mg(0.50mmol)、DIPCI 77.0μl(63.1mg，0.50mmol)溶解于DMF(2ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe的10残基的肽(序列85)。将该10残基的肽10μmol分转移到另外准备好的固相合成用柱，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟，用DMF洗涤后，在另外准备好的离心管中使37.2mg(18.8μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D01101
化学株式会社制)和DEPBT 8.5mg(28.4μmol)溶解于DMF/DMSO(4∶1混合溶液、1.0ml)，将其加入到固相合成用柱中，加入DIPEA 3.2μl(18.8μmol)，在室温下搅拌16小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的糖链肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt 6.8mg(0.05mmol)、DIPCI 7.7μl(0.05μmol)溶解于DMF(1ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使氨基酸依次缩合。用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Lys(Boc)，用Boc基保护的氨基酸使用Boc-Cys(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Asn(寡糖链)-Lys(Boc)-Cys(Trt)的13残基的糖链肽(序列86)。在该肽中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌3.5小时。其后，加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，进行离心分离操作，将含有目标糖链肽的沉淀物和溶液部分分开。其后，除去溶液部分后，用HPLC确认目的物后，用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到13残基的糖链肽6.1mg。
将这样制备成的18残基的C末端为苄基硫酯肽(1.3mg)和13残基的糖链肽(2.0mg)两种放入相同的离心管，使其溶解于pH6.8的缓冲溶液(0.64ml)(用6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)后，在室温下加入硫代苯酚(6.4μl)，在室温下进行反应。24小时后，用HPLC确认反应结束后，将反应溶液直接用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的31残基的糖链肽1.0mg。
将得到的糖链肽(1.0mg)放入离心管，使其溶解于pH7.0的缓冲溶液(用35mMTCEP溶液、6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)。在室温下在该反应溶液中加入活化的兰尼镍，18小时后，用HPLC确认反应结束后，用膜滤器过滤反应溶液，将含有糖链肽的滤液部分用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的GLP-1的27位的Glu被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(27Asn GLP-1-去唾液酸)0.5mg。
实施例40 28位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Ala(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala，用Boc保护的氨基酸使用Boc-His(Trt)，在固相树脂上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的18残基的肽(序列87)。
使用DCM及DMF洗涤后，以树脂充分浸没的程度添加三氟乙醇和醋酸的混合溶液(1∶1)，在室温下搅拌18小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣浓缩，得到18残基的保护肽Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc(序列88)。
将相当于35μmol 18残基的保护肽移到茄形烧瓶，使其溶解于DMF(3.7ml)后，在氩气氛围下冷却至-15～-20℃。在该溶液中加入苄基硫醇125μl(1.06mmol)后，加入另外准备好的PyBOP 94.7mg(182μmol)的DMF溶液(1.0ml)，接着，加入DIPEA 29.8μl(175μmol)。在-15～-20℃下搅拌2小时后，加入到冷却好的二乙醚(150ml)，使肽成分沉淀，然后，用膜滤器除去溶液部分。在得到的残渣中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌。2小时后，再次将该溶液加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到C末端为苄基硫酯的18残基的肽Phs-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His(序列89)。
另一方面，在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt 67.6mg(0.50mmol)、DIPCI 77.0μl(63.1mg，0.50mmol)溶解于DMF(2ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile的9残基的肽(序列90)。将该9残基的肽11μmol分转移到另外准备好的固相合成用柱，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟，用DMF洗涤后，在另外准备好的离心管中使82.6mg(41.8μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D01141
化学株式会社制)和DEPBT 18.7mg(62.5μmol)溶解于DMF/DMSO(4∶1混合溶液、1.4ml)，将其加入到固相合成用柱中，加入DIPEA 7.0μl(41.2μmol)，在室温下搅拌16小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的糖链肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt 6.8mg(0.05mmol)、DIPCI 7.7μl(0.05μmol)溶解于DMF(1ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使氨基酸依次缩合。用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)，用Boc基保护的氨基酸使用Boc-Cys(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Asn(寡糖链)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)的13残基的糖链肽(序列91)。在该肽中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌3.5小时。其后，加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，进行离心分离操作，将含有目标糖链肽的沉淀物和溶液部分分开。其后，除去溶液部分后，用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到13残基的糖链肽10.1mg。
将这样制备成的18残基的C末端为苄基硫酯肽(3.6mg)和13残基的糖链肽(5.6mg)两种放入相同的离心管，使其溶解于pH6.8的缓冲溶液(1.8ml)(用6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)后，在室温下加入硫代苯酚(18μl)，在室温下进行反应。24小时后，用HPLC确认反应结束后，将反应溶液直接用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的31残基的糖链肽3.8mg。
将得到的糖链肽(1.3mg)放入离心管，使其溶解于pH7.0的缓冲溶液(用35mM TCEP溶液、6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)。在室温下在该反应溶液中加入活化的兰尼镍，40小时后，用HPLC确认反应结束后，用膜滤器过滤反应溶液，将含有糖链肽的滤液部分用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的GLP-1的28位的Phe被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(28Asn GLP-1-去唾液酸)0.8mg。
实施例41 30位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(50μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.125mmol)、TBTU(0.125mmol)及N-乙基吗啉(0.125mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.25mmol)、MSNT(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.175mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.25mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.25mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.25mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)的7残基肽(序列92)。
使198mg(100μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D01161
化学株式会社制)和DEPBT 30.0mg(100μmol)溶解于NMP/DMSO(2.4/0.6ml)，将其加入到固相合成用柱中。加入DIPEA 26μl(150μmol)，在室温下搅拌24小时。用DMF和DCM洗涤时，在固相上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(寡糖链)的8残基的糖链肽(序列93)。其后，通过HOBt 34mg(0.25mmol)、DIPCI 38μl(0.25mmol)、DMF(1ml)使氨基被Fmoc保护的氨基酸缩合，形成Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(寡糖链)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基的糖链肽(序列94)。
将得到的形成有糖链肽的树脂以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的30位的Ala被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(30Asn GLP-1-去唾液酸)6.4mg。
实施例42 36位Asn-附加去唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(50μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.125mmol)、TBTU(0.125mmol)及N-乙基吗啉(0.125mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.25mmol)、MSNT(0.25mmol)及N-甲基咪唑(0.175mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.25mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.25mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。
使198mg(100μmol)去唾液酸糖链天冬酰胺(b)(大
Figure G2008800253949D01181
化学株式会社制)和DEPBT 30.0mg(100μmol)溶解于NMP/DMSO(2.4/0.6ml)，将其加入到固相合成用柱中。加入DIPEA 26μl(150μmol)，在室温下搅拌24小时。用DMF和DCM洗涤时，在固相上得到Gly-Asn(寡糖链)的2残基的糖链肽。
其后，通过HOBt 34mg(0.25mmol)、DIPCI 38μl(0.25mmol)、DMF(1ml)使氨基被Fmoc保护的氨基酸缩合，形成Gly-Asn(寡糖链)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基的糖链肽(序列95)。
将得到的形成有糖链肽的树脂以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的36位的Arg被去唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(36Asn GLP-1-去唾液酸)8.0mg。
实施例43 18位Asn-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
使由实施例36合成的18Asn GLP-1-去唾液酸(0.6mg)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，200μl)后，加入牛血清白蛋白(BSA，1mg)。向其中加入CMP-唾液酸(5mg)、碱性磷酸酶(1μl)并进行均匀化，最后，加入α2，6-唾液酸转移酶(JT社制、10mU)，在30℃下使其反应24小时。(HPLC反应监控条件：柱：SHISEIDOCAPCELPAK C18 UG120、Φ4.6×250mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、展开溶剂B：0.09％TFA 乙腈/水＝90/10、梯度A/B＝60/40→30/60 40分钟 流速0.7ml/分钟)图1表示HPLC图的1例。图中，在前的峰为原料18Asn GLP-1-去唾液酸，在后的峰为18AsnGLP-1-二唾液酸。在HPLC同条件下纯化，得到GLP-1的18位的Ser被二唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(18Asn GLP-1-二唾液酸)0.3mg。
实施例44 22位Asn-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
使由实施例37合成的22Asn GLP-1-去唾液酸(1.3mg)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，200μl)后，加入牛血清白蛋白(BSA，1mg)。向其中加入CMP-唾液酸(5mg)、碱性磷酸酶(1μl)并进行均匀化，最后，加入α2，6-唾液酸转移酶(JT社制、10mU)，在30℃下使其反应24小时。(HPLC反应监控条件：柱：SHISEIDOCAPCELPAKC18 UG120、Φ4.6×250mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、展开溶剂B：0.09％TFA 乙腈/水＝90/10、梯度 A/B＝60/40→30/60 40分钟 流速0.7ml/分钟)图2表示HPLC图的1例。图中，在前的峰为原料22Asn GLP-1-去唾液酸，在后的峰为22AsnGLP-1-二唾液酸。在HPLC同条件下纯化，得到GLP-1的22位的Gly被二唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(22Asn GLP-1-二唾液酸)1.3mg。
实施例45 30位Asn-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
使由实施例41合成的30Asn GLP-1-去唾液酸(0.9mg)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，200μl)后，加入牛血清白蛋白(BSA，1mg)。向其中加入CMP-唾液酸(5mg)、碱性磷酸酶(1μl)并进行均匀化，最后，加入α2，6-唾液酸转移酶(JT社制、10mU)，在30℃下使其反应24小时。(HPLC反应监控条件：柱：SHISEIDOCAPCELPAKC18 UG120、Φ4.6×250mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、展开溶剂B：0.09％TFA 乙腈/水＝90/10、梯度A/B＝60/40→30/60 40分钟 流速0.7ml/分钟)图3表示HPLC图的1例。图中，在前的峰为原料30Asn GLP-1-去唾液酸，在后的峰为30AsnGLP-1-二唾液酸。在HPLC同条件下纯化，得到GLP-1的30位的Ala被二唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(30Asn GLP-1-二唾液酸)0.6mg。
实施例46 30位Asn-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Ala(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala，用Boc保护的氨基酸使用Boc-His(Trt)，在固相树脂上得到Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的18残基的肽(序列96)。
使用DCM及DMF洗涤后，以树脂充分浸没的程度添加三氟乙醇和醋酸的混合溶液(1∶1)，在室温下搅拌18小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣浓缩，得到保护肽Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)-NHBoc(序列97)。
将相当于35μmol 18残基的保护肽移到茄形烧瓶，使其溶解于DMF(3.7ml)后，在氩气氛围下冷却至-15～-20℃。在其中加入苄基硫醇125μl(1.06mmol)后，加入另外准备好的PyBOP 94.7mg(182μmol)的DMF溶液(1.0ml)，接着，加入DIPEA 29.8μl(175μmol)。在-15～-20℃下搅拌2小时后，加入到冷却好的二乙醚(150ml)，使肽成分沉淀，然后，用膜滤器除去溶液部分。在得到的残渣中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌。2小时后，再次将该溶液加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，用膜滤器除去溶液部分，由此得到含有目标肽硫酯体的残渣。将该得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到C末端为苄基硫酯的18残基的肽Phs-Ala-Gln-Gly-Glu-Leu-Tyr-Ser-Ser-Val-Asp-Ser-Thr-Phe-Thr-Gly-Glu-Ala-His(序列98)。
ESI-MS：计算C88H125N21O31S:[M+2H]2+1002.9，测得1003.3。
另一方面，在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌4小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt 67.6mg(0.50mmol)、DIPCI 77.0μl(63.1mg，0.50mmol)溶解于DMF(2ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)的7残基的肽(序列99)。将该7残基的肽34.6μmol分转移到另外准备好的固相合成用柱，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟，用DMF洗涤后，在另外准备好的离心管中使132.7mg(48.4μmol)糖链链天冬酰胺(f)(大
Figure G2008800253949D01221
化学株式会社制)和DEPBT 31.2mg(104.3μmol)溶解于DMF/DMSO(1∶4混合溶液、0.6ml)，将其加入到固相合成用柱中，加入DIPEA 18.1μl(103.8μmol)，在室温下搅拌18小时。
[化10]
Figure G2008800253949D01231
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的糖链肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸和HOBt 33.8mg(0.25mmol)、DIPCI 38.5μl(31.5mg，0.25mmol)溶解于DMF(1ml)，使其活化15分钟后，加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌1小时后，使用20％哌啶/DMF溶液(1ml)将Fmoc基脱保护20分钟。重复该操作，使氨基酸依次缩合。用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)，用Boc基保护的氨基酸使用Boc-Cys(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Asn(寡糖链)-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Cys(Trt)的13残基的糖链肽(序列100)。在该肽中加入三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)并在室温下搅拌3.5小时。其后，加入到另外准备好的二乙醚(150ml)并使其沉淀后，进行离心分离操作，将含有糖链肽的沉淀物和溶液部分分开。其后，除去溶液部分后，使得到的沉淀物溶解于pH6.8的50mM二硫苏糖醇溶液缓冲液(用50mM二硫苏糖醇溶液、6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)，使其反应一晚上。用HPLC确认目的物后，直接用HPLC[柱：SHISEIDOUG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到13残基的糖链肽18.2mg。
ESI-MS：计算C169H260N26O78S:[M+3H]3+1312.2，测得1313.0。
将这样制备成的18残基的C末端为苄基硫酯肽(9.3mg)和13残基的糖链肽(18.2mg)两种放入相同的离心管，使其溶解于pH6.8的缓冲溶液(0.15ml)(用6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)后，在室温下加入硫代苯酚(15.4μl)，在37℃下进行反应。24小时后，将反应溶液直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到31残基的糖链肽9.2mg。
ESI-MS：计算C250H377N47O109S:[M+4H]4+1454.4，测得1455.0。
将得到的糖链肽(9.2mg)放入离心管，使其溶解于pH7.0的缓冲溶液(用35mM TCEP溶液、6M盐酸胍溶液、0.2mM磷酸溶液制备)。在室温下在该反应溶液中加入活化的兰尼镍，72小时后，用HPLC确认反应结束后，用膜滤器过滤反应溶液，将含有目标糖链肽的滤液部分用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到31残基的糖链肽1.3mg。
ESI-MS：计算C250H377N47O109:[M+4H]4+1446.4，测得1447.2。
将这样得到的31残基的糖链肽1.3mg放入微量离心管，用蒸馏水(25μl)使其溶解后，在室温下加入100mM氢氧化钠水溶液(25μl)。30分钟后，用HPLC确认目的物的生成后，冷却至0℃，加入50mM醋酸水溶液(50μl)进行中和操作，其后，用HPLC[柱：Vydac柱(C185μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 7.0ml/分钟、；B液25→45％(15分钟)→60％(10分钟)→95％(10分钟)、线性梯度]纯化，得到目标的GLP-1的30位的Ala被二唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(30Asn GLP-1-二唾液酸)0.3mg。
ESI-MS：计算C236H365N47O109:[M+4H]4+1401.4，测得1402.1。
实施例47 36位Asn-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合成法
使由实施例42合成的36Asn GLP-1-去唾液酸(0.8mg)溶解于50mM二甲胂酸缓冲液(pH＝5.0，200μl)后，加入牛血清白蛋白(BSA，1mg)。向其中加入CMP-唾液酸(5mg)、碱性磷酸酶(1μl)并进行均匀化，最后，加入α2，6-唾液酸转移酶(JT社制、10mU)，在30℃下使其反应24小时。(HPLC反应监控条件：柱：SHISEIDOCAPCELPAK C18 UG120、Φ4.6×250mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、展开溶剂B：0.09％TFA 乙腈/水＝90/10、梯度A/B＝60/40→30/6040分钟流速0.7ml/分钟)图4表示HPLC图的1例。图中，在前的峰为原料36Asn GLP-1-去唾液酸，在后的峰为36AsnGLP-1-二唾液酸。在HPLC同条件下纯化，得到GLP-1的36位的Arg被二唾液酸糖链Asn取代的附加糖链的GLP-1肽(36Asn GLP-1-二唾液酸)0.6mg。
实施例48 26位-34位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合 成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Arg(Pbf)、Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Arg(Pbf)-Gly-Cys(Trt)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Cys(Trt)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基的肽(序列101)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的26位及34位的Lys被Cys取代的肽。
使10.5mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D01261
化学株式会社制)和上述合成的肽链2.1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、210μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的26位及34位的Lys被Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(26-34Cys GLP-1-二唾液酸)0.1mg。
实施例49 18位-36位Cys-附加二唾液酸糖链的GLP-1肽的合 成法
在固相合成用柱中加入A分钟o-PEGA树脂(默克公司制)(100μmol)，用二氯甲烷(DCM)、DMF充分洗涤后，用DMF充分溶胀。使4-羟甲基-3-甲氧基苯氧基丁酸(HMPB)(0.25mmol)、TBTU(0.25mmol)及N-乙基吗啉(0.25mmol)溶解于DMF(2ml)并加入柱中，在室温下搅拌4小时。用DMF及DCM充分洗涤树脂，得到HMPB-PEGA树脂，将其用作固相合成的固相。
使Fmoc-Gly(0.50mmol)、MSNT(0.50mmol)及N-甲基咪唑(0.375mmol)溶解于DCM(2ml)，将其加入到固相合成用柱中，在25℃下搅拌3小时。
搅拌后，使用DCM、DMF洗涤树脂。使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。用DMF洗涤后，其后的肽链的延长使用以下所示的方法，使氨基酸依次缩合。
将用Fmoc基保护了氨基的氨基酸溶解于N-甲基吡咯烷酮(NMP)(1ml)，加入0.45M HCTU·HOBT/NMP(0.4mmol)，然后，加入到固相合成用柱中，接着，将0.9M DIPEA/NMP(0.8mmol)加入到固相合成用柱中。在室温下搅拌20分钟后，使用DCM及DMF洗涤树脂，使用20％哌啶/DMF溶液(2ml)将Fmoc基脱保护15分钟。重复该操作，使用用Fmoc基保护的氨基酸(0.5mmol)，使氨基酸依次缩合。
用Fmoc基保护的氨基酸使用Fmoc-Gly、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Val、Fmoc-Leu、Fmoc-Trp(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ile、Fmoc-Phe、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Lys(Boc)、Fmoc-Ala、Fmoc-Ala、Fmoc-Gln(Trt)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Leu、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Cys(Trt)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Val、Fmoc-Asp(OtBu)、Fmoc-Ser(tBu)、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Phe、Fmoc-Thr(tBu)、Fmoc-Gly、Fmoc-Glu(OtBu)、Fmoc-Ala、Fmoc-His(Trt)，在固相树脂上得到Gly-Cys(Trt)-Gly-Lys(Boc)-Val-Leu-Trp(Boc)-Ala-Ile-Phe-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ala-Ala-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Ala-His(Trt)的31残基肽(序列102)。
取一部分得到的形成有肽的树脂放到固相合成用柱中，以树脂充分浸没的程度添加三氟醋酸∶水∶TIPS(＝95∶2.5∶2.5)，在室温下搅拌3小时。过滤除去树脂，在减压下将反应溶液浓缩。将得到的残渣用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C185μm)、Φ20×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 8.0ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的18位的Ser及36位的Arg被Cys取代的肽。
使10.5mg溴乙酰基化了的二唾液酸糖链(a)(大
Figure G2008800253949D01281
化学株式会社制)和上述合成的肽链2.1mg溶解于100mM磷酸缓冲液pH7.5、210μl，在37℃下使其反应4小时。用HPLC确认原料消失后，直接用HPLC[柱：SHISEIDO UG-120(C18，5μm)、Φ4.6×250mm、梯度：A液：0.1％TFA水、B液：0.09％TFA/10％水/90％AN 0.7ml/分钟、；B液35→60％20分钟线性梯度]纯化，得到GLP-1的18位的Ser及36位的Arg被附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽(18-36CysGLP-1-二唾液酸)0.8mg。
以下的表7为由实施例8～49得到的附加糖链的GLP-1肽的质谱数据。表中，[M+H]+表示用MALDI-TOF mass测定的结果，[M+3H]3+及[M+4H]4+表示用EMI-MS测定的结果。
表7
  实施例8   6Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C240H372N48O110S   [M+H]+   5719.5   测得   5721.9
  实施例9   8Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C237H367N47O109S   [M+H]+   5648.4   测得   5649.3
  实施例10   9Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C235H365N47O107S   [M+H]+   5590.4   测得   5590.7
  实施例11   10Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C238H369N47O109S   [M+H]+   5662.5   测得   5665.4
  实施例12   11Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C236H365N47O108S   [M+H]+   5618.4   测得   5618.5
  实施例13   12Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C231H363N47O109S   [M+H]+   5572.4   测得   5571.2
  实施例14   14Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C237H367N47O108S   [M+H]+   5632.5   测得   5632.6
  实施例15   16Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C235H363N47O109S   [M+H]+   5620.4   测得   5623.5
  实施例16   20Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C234H361N47O109S   [M+H]+   5606.4   测得   5606.0
  实施例17   24Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C237H367N47O109S   [M+H]+   5648.4   测得   5648.2
  实施例18   25Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C237H367N47O109S   [M+H]+   5648.4   测得   5650.5
  实施例19   27Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C235H365N47O107S   [M+H]+   5590.4   测得   5592.4
  实施例20   28Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C231H353N47O109S   [M+H]+   5572.4   测得   5575.2
  实施例21   30Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C237H367N47O109S   [M+H]+   5648.4   测得   5651.7
  实施例22   32Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C234H361N47O109S   [M+H]+   5606.4   测得   5606.2
  实施例23   34Cys GLP-1-二唾液酸   计算   C234H360N46O109S   [M+H]+   5591.4   测得   5591.1
  实施例24   22Cys GLP-1-去唾液酸   计算   C216H335N45O93S   [M+H]+   5080.3   测得   5081.9
  实施例25   26Cys GLP-1-去唾液酸   计算   C212H326N44O93S   [M+H]+   5009.2   测得   5010.1
  实施例26   30Cys GLP-1-去唾液酸   计算   C215H333N45O93S   [M+H]+   5066.3   测得   5068.0
  实施例27   34Cys GLP-1-去唾液酸   计算   C212H326N44O93S   [M+H]+   5009.2   测得   5010.1
  实施例28   36Cys GLP-1-去唾液酸   计算   C212H326N42O93S   [M+H]+   4981.2   测得   4983.1
  实施例29   22Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺   计算   C204H315N45O83S   [M+H]+   4756.2   测得   4758.2
  实施例30   30Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺   计算   C203H313N45O83S   [M+H]+   4742.1   测得   4742.0
  实施例31   34Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺   计算   C200H306N44O83S   [M+H]+   4685.1   测得   4686.8
  实施例32   22Cys GLP-1-二甘露糖   计算   C188H289N43O73S   [M+H]+   4350.0   测得   4351.0
  实施例33   30Cys GLP-1-二甘露糖   计算   C187H287N43O73S   [M+H]+   4336.0   测得   4338.0
  实施例34   34Cys GLP-1-二甘露糖   计算   C184H280N42O73S   [M+H]+   4278.9   测得   4280.3
  实施例35   12Asn GLP-1-去唾液酸   计算   C208H327N45O93   [M+3H]+   1648.7   测得   1649.5
  实施例36   18Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C214H331N45O92   [M+H]+   5004.3   测得   5003.4
  实施例37   22Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C215H333N45O93   [M+H]+   5034.3   测得   5035.9
  实施例38   26Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C211H324N44O93   [M+3H]+   1656.0   测得   1655.8
  实施例39   27Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C212H329N45O91   [M+3H]+   1655.7   测得   1655.5
  实施例40   28Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C208H327N45O93   [M+3H]+   1648.7   测得   1649.6
  实施例41   30Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C214H331N45O93   [M+H]+   5020.3   测得   5020.8
  实施例42   36Asn GLP-1-去唾液酸   计算  C211H324N42O93   [M+H]+   4935.2   测得   4936.7
  实施例43   18Asn GLP-1-二唾液酸   计算  C236H365N47O108   [M+H]+   5586.5   测得   5588.6
  实施例44   22Asn GLP-1-二唾液酸   计算  C237H367N47O109   [M+H]+   5616.5   测得   5618.4
  实施例45   30Asn GLP-1-二唾液酸   计算  C236H365N47O109   [M+H]+   5602.5   测得   5606.2
  实施例46   30Asn GLP-1-二唾液酸   计算  C236H365N47O109   [M+4H]+   1401.4   测得   1402.1
  实施例47   36Asn GLP-1-二唾液酸   计算  C233H358N44O109   [M+H]+   5517.4   测得   5521.7
  实施例48   26，34Cys GLP-1-二唾液酸   计算  C317H492N52O171S2   [M+H]+   7828.1   测得   7828.8
  实施例49   18，36Cys GLP-1-二唾液酸   计算  C320H449N51O170S2   [M+H]+   7841.1   测得   7845.3
试验例1(血浆中的稳定性)
将由实施例7或比较例1制造的肽0.1mg放入微量离心管，以总量至0.114ml的方式依次加入PBS(0.08ml、总量的70％)及血浆(0.034ml、总量的30％)，在37℃下使其反应。
将在反应容器中加入血浆的时间设定为0分钟，通过在10、30、60、180、360、720及1440分钟从反应溶液取出0.01ml来进行取样调查。
使取样的反应溶液与预先准备在微量离心管中的10％三氟醋酸溶液0.02ml混合后，进行离心分离，取该混合溶液的上清液0.025ml并注射到HPLC中，分析反应溶液的组成(反应监控条件：柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18，UG120、250×4.6mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、B：0.1％TFA 乙腈/水＝90∶10、梯度A∶B＝95∶5→5∶9515分钟流速0.7ml/分钟)。将结果示于图5(实施例7)及图6(比较例1)。
在图5中，在13.3分钟附近观察到附加糖链的GLP-1肽的峰。如图5所示，至血浆添加后24小时(1440分钟)后，实施例7的附加糖链的GLP-1肽的大部分残存。
另一方面，在图6中，16～16.5分钟之间的峰表示未被分解的GLP-1，17.5～18分钟之间的峰表示7位及8位的His-Ala脱离的GLP-1片段(9-36)。如图6所示，未附加糖链的比较例1的GLP-1至血浆添加后180分钟，其大部分被分解。
试验例2(db/db小鼠中的血糖值降低作用1)
将由实施例1～5或比较例1制造的肽以在8周龄的雄性II型糖尿病模型小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl＊)中总量至8ml/kg体重(样品浓度9nmol/kg体重)的方式对3只模型小鼠分别腹腔内给予与给药样品相同的肽。即，对BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl小鼠(8周龄、雄)以10ml/kg的给药量向腹腔内给予该肽的PBS溶液(9nmol/10ml)。给药后，在0、30、60、90、120、180分钟后，通过眼底采血法采血0.03ml，将得到的血液以总量至0.3ml的方式用PBS稀释，将该溶液进行离心分离操作，分离为血浆成分和血细胞成分。其后，仅将血浆成分转移到另外准备好的微量离心管，进行冷藏保存。使用利用吸光光度计的Glicose CII-Test Wako测定血浆中的葡萄糖浓度。进行统计学处理，得到结果。将结果示于图7。
如图7所示，未附加糖链的比较例1的GLP-1几乎不使血糖值降低。相对于此，实施例1～5的附加糖链的GLP-1肽都使血糖值显著降低，且120分钟后仍持续其效果。
试验例3(db/db小鼠中的血糖值降低作用2)
将由实施例5或比较例1制造的肽以在8周龄的雄性II型糖尿病模型小鼠(BKS.Cg-+Leprdb/Leprdb/Jcl＊)中总量至8ml/kg体重(样品浓度(体重)：0.9nmol/kg、9nmol/kg、90nmol/kg、900nmol/kg)的方式对3只模型小鼠分别腹腔内给予与给药样品相同的肽。即，对BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl小鼠(8周龄、雄性)以10ml/kg的给药量向腹腔内给予该肽的PBS溶液(分别为0.9nmol/10ml、9nmol/10ml、90nmol/10ml、900nmol/10ml)。在给予样品的0、30、60、90及120分钟后，通过眼底采血法采血0.03ml，将得到的血液以总量至0.3ml的方式用PBS稀释，将该溶液进行离心分离操作，分离为血浆成分和血细胞成分。其后，仅将血浆成分转移到另外准备好的微量离心管，进行冷藏保存。使用利用吸光光度计的Glicose CII-Test Wako测定血浆中的葡萄糖浓度。进行统计学处理，得到结果。将结果示于图8。
由图8的结果得知，与GLP-1的给药量为900nmol/kg的情况相比，附加糖链的GLP-1肽以GLP-1的1/100的给药量也显示优异的血糖值降低作用。
试验例4(对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的耐受性试验1)
向0.5ml的微量离心管中加入由实施例1～5、13～23、25、27、31、34、36、48或49制造的附加糖链的GLP-1肽或由比较例1制造的GLP-117.7nmol和DPP-IV(源自猪肾的二肽基肽酶IV，SIGMA社制)2.2mU，分别用100mM磷酸钠缓冲液以总量至100μl的方式制备，在37℃下使其反应。使反应液10μl与预先准备在其它微量离心管中的10％三氟醋酸溶液15μl混合，注射20μl到HPLC中，监控原料的消失(HPLC条件：柱：SHISEIDO CAPCELPAK C18 UG120、Φ4.6×250mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、展开溶剂B：0.09％TFA乙腈/水＝90/10、梯度A/B＝65/30→30/6020分钟流速0.7ml/分钟)。
以未附加糖链的比较例1的GLP-1的半衰期(t1/2)为基准(＝1)，对各实施例的附加糖链的GLP-1肽的作为对DPP-IV的耐受性的指标的半衰期(t1/2)进行评价，将其值示于表8。
表8
  实施例   化合物   相对耐受性
  实施例13   12Cys GLP-1-二唾液酸   34.4
  实施例14   14Cys GLP-1-二唾液酸   6.3
  实施例15   16Cys GLP-1-二唾液酸   1.2
  实施例1   18Cys GLP-1-二唾液酸   1.6
  实施例16   20Cys GLP-1-二唾液酸   2.6
  实施例2   22Cys GLP-1-二唾液酸   3.1
  实施例17   24Cys GLP-1-二唾液酸   3.0
  实施例18   25Cys GLP-1-二唾液酸   3.1
  实施例3   26Cys GLP-1-二唾液酸   4.6
  实施例19   27Cys GLP-1-二唾液酸   2.3
  实施例20   28Cys GLP-1-二唾液酸   9.0
  实施例21   30Cys GLP-1-二唾液酸   2.4
  实施例22   32Cys GLP-1-二唾液酸   3.7
  实施例23   34Cys GLP-1-二唾液酸   3.0
  实施例4   36Cys GLP-1-二唾液酸   1.6
  实施例5   38Cys GLP-1-二唾液酸   1.7
  实施例25   26Cys GLP-1-去唾液酸   4.6
  实施例27   34Cys GLP-1-去唾液酸   2.0
  实施例31   34Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺   2.0
  实施例34   34Cys GLP-1-二甘露糖   1.6
  实施例36   18Asn GLP-1-去唾液酸   1.3
  实施例48   26，34Cys GLP-1-二唾液酸   23.6
  实施例49   18，36Cys GLP-1-二唾液酸   128.6
各实施例的附加糖链的GLP-1肽显示为比较例1的GLP-1的DPP-IV耐受性的1.2倍～128倍的DPP-IV耐受性。18，36位(Cys-二唾液酸)附加糖链的GLP-1肽显示最大的耐受性，接下来以12位(Cys-二唾液酸)、26，34位(Cys-二唾液酸)、28位(Cys-二唾液酸)、14位(Cys-二唾液酸)、26位(Cys-二唾液酸)、26位(Cys-去唾液酸)、32位(Cys-二唾液酸)、25位(Cys-二唾液酸)、22位(Cys-二唾液酸)、24位(Cys-二唾液酸)、34位(Cys-二唾液酸)、20位(Cys-二唾液酸)、30位(Cys-二唾液酸)、27位(Cys-二唾液酸)、34位(Cys-去唾液酸)、34位(Cys-二N-乙酰葡萄糖胺)、38位(Cys-二唾液酸)、36位(Cys-二唾液酸)、34位(Cys-二甘露糖)、18位(Cys-二唾液酸)、18位(Asn-去唾液酸)、16位(Cys-二唾液酸)的顺序从大至小显示DPP-IV耐受性。
比较实施例3、23及48或实施例1、4及49的附加糖链的GLP-1肽的DPP-IV耐受性，通过在附加糖链的GLP-1肽中附加2条以上糖链，与附加1条糖链的情况相比，对DPP-IV耐受性增大，显示产生协同效果。
关于糖链结构，按二唾液酸糖链＞去唾液酸糖链＞二N-乙酰葡萄糖胺糖链＞二甘露糖糖链的顺序，附加的附加糖链的GLP-1肽显示从大至小的DPP-IV耐受性。
试验例5(对二肽基肽酶IV(DPP-IV)的耐受性试验2)
在0.5ml的微量离心管中加入由实施例10～13中任一个制造的附加糖链的GLP-1肽17.7nmol和DPP-IV(源自猪肾的二肽基肽酶IV，SIGMA社制)22mU，用100mM磷酸钠缓冲液以总量至100μl的方式制备，在37℃下使其反应。使反应液10μl与预先准备在其它微量离心管中的10％三氟醋酸溶液15μl混合，注射20μl到HPLC中，监控原料的消失(HPLC条件：柱：SHISEIDO CAPCELPAK C18UG120、Φ4.6×250mm、展开溶剂A：0.1％TFA水溶液、展开溶剂B：0.09％TFA乙腈/水＝90/10、梯度A/B＝65/30→30/6020分钟流速0.7ml/分钟)。
以实施例13的附加糖链的GLP-1的半衰期(t1/2)为基准(＝1)，对实施例10～12的附加糖链的GLP-1肽的作为对DPP-IV的耐受性的指标的半衰期(t1/2)进行评价，将其值示于表9。
表9
  实施例   化合物   相对耐受性
  实施例10   9Cys GLP-1-二唾液酸   17.2
  实施例11   10Cys GLP-1-二唾液酸   9.0
  实施例12   11Cys GLP-1-二唾液酸   1.1
  实施例13   12Cys GLP-1-二唾液酸   1.0
在试验例4中，实施例13的附加糖链的GLP-1肽与未附加糖链的比较例1的GLP-1相比，显示约34倍的DPP-IV耐受性。与该实施例13的附加糖链的GLP-1肽(12位(Cys-二唾液酸))相比，实施例10～12的附加糖链的GLP-1肽显示1.1倍～17.2倍的DPP-IV的耐受性。9位(Cys-二唾液酸)显示最大的耐受性，增大的DPP-IV耐受性接下来按10位(Cys-二唾液酸)、11位(Cys-二唾液酸)、12位(Cys-二唾液酸)和靠近GLP-1的N末端的部位的顺序显示。需要说明的是，在已知对DPP-IV的反应部位存在于GLP-1的N末端的部位越附加糖链，越显示高的DPP-IV的耐受性。
试验例6(cAMP合成能力试验)
1.小鼠GLP-1受体表达载体的构建
分别合成结合于小鼠GLP-1受体cDNA的5’末端和3’末端的小鼠GLP-1受体正义引物(5’-GTTGCTAGCGCCACCATGGCCAGCACCCCAAGCCT-3’)(序列152)及小鼠GLP-1受体反义引物(5’-CCTGAATTCTCAGCTGTAGGAACTCTGGCAG-3’)(序列153)，以cDNA(Clone ID：40046534、Open Biosystems社)为模板，使用ExTaq聚合酶(TakaRa公司)进行PCR。即，使用由模板cDNA(10ng/μL)1μL、2.5mM dNTPs 4μL、引物混合液(各50μM)1μL、×10Ex Taq聚合酶Buffer 5μL、Ex Taq聚合酶0.25μL及灭菌水38.75μL构成的总计50μL的反应液，在94℃下反应1分钟、94℃下反应45秒、55℃下反应1分钟、72℃下反应2分钟(35循环)，在72℃下反应10分钟。对于PCR反应产物，在1％琼脂糖凝胶电泳后，使用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System(Promega社)纯化cDNA片段，进一步进行限制酶(EcoRI及NheI)处理，得到小鼠GLP-1受体cDNA。
为了有效地得到小鼠GLP-1受体高表达细胞，使用plRES-gfp载体作为表达载体。本载体通过将含有plRESpuro2(Clontech社)的由限制酶处理(Sal I、BamHI)得到的IRES基因的DNA片段插入载体pEGFP-N1(Clontech社)来制作。
通过将小鼠GLP-1受体cDNA片段插入plRES-gfp，得到小鼠GLP-1受体表达载体mGLP-1R/plRES-gfp。得到的载体使用AB13100-Avant(Applied Biosystems社)进行DNA碱基序列的确认。
2.小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞的制作
得到的mGLP-1R/plRES-gfp使用FuGENE(注册商标)(Roche社)，按照使用说明书对CHO-K1细胞(ATCC目录编号CCL-61)进行基因导入。进行了基因导入的CHO-K1细胞在含10％FCS(Hyclone社)、青霉素-链霉素(SIGMA社)RPMI 1640培养基(和光纯药社)中培养，进一步添加G418(和光纯药工业株式会社)1.0mg/ml进行药剂选择。获得药剂耐受性的细胞使用细胞分选仪(EPICS ALTRA、Beckman Coulter社)以GFP表达量为指标进行分选。对分选后的细胞进行有限稀释，得到GFP高表达细胞即高表达小鼠GLP-1受体的细胞。将得到的细胞作为小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞用于下述实验中。
3.附加糖链的GLP-1肽的激动剂作用(cAMP合成能力)分析
使用由上述2制成的小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞，以cAMP合成能力为指标，评价附加糖链的GLP-1肽的激动剂作用。
使小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞以至5×105个/ml的浓度的方式悬浮在含10％FCS的RPMI 1640培养基中。将细胞悬浮液以每次100μL接种在平底96孔板(Falcon社)上，在37℃、5％CO2下培养16小时。舍弃培养上清液，以每100μL/孔添加用含2.5mM葡萄糖的Krebs Ringer碳酸氢钠缓冲夜溶解的附加糖链的GLP-1肽，在37℃下培养30分钟，快速地舍弃培养上清液。在小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞内合成的cAMP量使用cAMP ELISA试剂盒(GEHealthcare Science社或Cayman社)测定，将其设定为附加糖链的GLP-1肽对小鼠GLP-1受体的激动剂作用的指标。
GLP-1通过与GLP-1受体结合，使细胞内cAMP浓度上升，促进胰岛素分泌。因此，以cAMP合成能力为指标，评价附加糖链的GLP-1肽的活性。用附加糖链的GLP-1肽刺激小鼠GLP-1受体表达CHO-K1细胞，测定在细胞内合成的cAMP量。表10表示将未附加糖链的比较例1的GLP-1的EC50值设定为1时的实施例1～5、8～23、25、27的附加糖链的GLP-1肽的相对活性。
表10
  实施例   化合物   相对耐受性
  实施例8   6Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例9   8Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例10   9Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例11   10Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例12   11Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例13   12Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例14   14Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例15   16Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例1   18Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例16   20Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例2   22Cys GLP-1-二唾液酸   1.0
  实施例17   24Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例18   25Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例3   26Cys GLP-1-二唾液酸   0.2
  实施例19   27Cys GLP-1-二唾液酸   0.2
  实施例20   28Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例21   30Cys GLP-1-二唾液酸   0.6
  实施例22   32Cys GLP-1-二唾液酸   ＜0.1
  实施例23   34Cys GLP-1-二唾液酸   0.7
  实施例4   36Cys GLP-1-二唾液酸   1.9
  实施例5   38Cys GLP-1-二唾液酸   1.9
  实施例25   26Cys GLP-1-去唾液酸   0.8
  实施例27   34Cys GLP-1-去唾液酸   2.2
作为显示与未附加糖链的比较例1的GLP-1同等以上的活性的实施例的附加糖链的GLP-1肽，发现了22Cys GLP-1-二唾液酸、26CysGLP-1-去唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-去唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸、38Cys GLP-1-二唾液酸。可以认为，22、26、30、34、36、38位(＝在37位的氨基酸上附加附加糖链的氨基酸)的氨基酸为适于附加糖链的位置。
试验例7口服葡萄糖耐量试验(OGTT：Oral Glucose Tolerance Test)
对绝食了一晚上的C57BL/6JJcl小鼠(10周龄、雄性)以10ml/kg的给药量向腹腔内给予由实施例1～5、9、10、13、16、21、23～27、29～34、38、45、48或49制造的附加糖链的GLP-1肽或由比较例1制造的GLP-1的PBS溶液。30分钟后，以1mg/g的给药量经口给予葡萄糖溶液。在给予葡萄糖前、给予葡萄糖30分钟后、60分钟后、120分钟后进行眼窝采血，使用罗氏卓越血糖仪(Accu-Chek Aviva)(roche-diagnostics公司)测定血糖值。
试验例7-1(各种附加糖链的GLP-1肽的OGTT)
对绝食了一晚上的上述小鼠经口给予葡萄糖溶液后，经时地进行采血，测定血糖值。通过给予葡萄糖，小鼠血糖值上升，给药后30分钟达到最大，其后，缓慢地减少。在给予葡萄糖30分钟前，分别以9nmol/kg的给药量向腹腔内给予由各实施例制造的附加糖链的GLP-1肽(8Cys GLP-1-二唾液酸、9Cys GLP-1-二唾液酸、12CysGLP-1-二唾液酸、18Cys GLP-1-二唾液酸、20Cys GLP-1-二唾液酸、22Cys GLP-1-二唾液酸、26Cys GLP-1-二唾液酸、26Cys GLP-1-去唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-去唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸、38Cys GLP-1-二唾液酸)或由比较例1制造的GLP-1，比较血糖值上升抑制作用。将结果示于图9～11。
未附加糖链的比较例1的GLP-1的血中稳定性低，给药后，快速地被分解，因此，血糖值上升抑制作用小。
相对于此，作为附加糖链的GLP-1肽的18Cys GLP-1-二唾液酸、20Cys GLP-1-二唾液酸、22Cys GLP-1-二唾液酸、26Cys GLP-1-二唾液酸、26Cys GLP-1-去唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-去唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸、38CysGLP-1-二唾液酸显示强的血糖值上升抑制作用。
试验例7-2(附加糖链的GLP-1肽的OGTT中的糖链结构的影响)
分别以9nmol/kg的给药量向腹腔内给予附加有11糖(二唾液酸糖链)、9糖(去唾液酸糖链)、7糖(二N-乙酰葡萄糖胺糖链)或5糖(二甘露糖糖链)的附加糖链的GLP-1肽(22Cys GLP-1-二唾液酸、22Cys GLP-1-去唾液酸、22Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺、22CysGLP-1-二甘露糖、30Cys GLP-1-二唾液酸、30Cys GLP-1-去唾液酸、30Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺、30Cys GLP-1-二甘露糖、34CysGLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-去唾液酸、34Cys GLP-1-二N-乙酰葡萄糖胺、34Cys GLP-1-二甘露糖)或由比较例1制造的GLP-1，用小鼠OGTT研究糖链结构-活性的关系。将结果示于图12～14。
在22位、30位、34位任一个附加部位都显示最强的血糖值上升抑制作用的是附加有最大的11糖(二唾液酸糖链)的附加糖链的GLP-1肽。血糖值上升抑制活性依次为11糖≥9糖≥7糖≥5糖。
试验例7-3(附加糖链的GLP-1肽的OGTT中的给药量的影响)
以高活性附加糖链的GLP-1肽的附加顺序为目的，对26CysGLP-1-二唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸实施将给药量分别设定为1/10(0.9nmol/kg)或1/100(0.09nmol/kg)的小鼠OGTT。将结果示于图15～18。关于GLP-1，图15～18中表示由试验例7-2得到的给药量为9nmol/kg的OGTT的结果。
26Cys GLP-1-二唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸任一个附加糖链的GLP-1肽都显示依赖给药量的血糖值上升抑制活性。给药量为0.9nmol/kg时抑制血糖值上升作用最强的是30Cys GLP-1-二唾液酸及36Cys GLP-1-二唾液酸，几乎完全抑制血糖值上升。
另外，给药量0.09nmol/kg的36Cys GLP-1-二唾液酸的血糖值上升抑制活性与给药量9nmol/kg的GLP-1活性相等，因此可以认为，36Cys GLP-1-二唾液酸的活性与GLP-1相比，增大约100倍。同样地，给药量0.09nmol/kg的30Cys GLP-1-二唾液酸的血糖值上升抑制活性比同给药量的36Cys GLP-1-二唾液酸的活性弱，因此可以认为，30CysGLP-1-二唾液酸的活性为GLP-1的10倍～100倍以下。给药量为0.9nmol/kg时，26Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸的药效为同给药量的30Cys GLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸的血糖值上升抑制活性的1/2左右，因此可以认为，26Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸的活性为GLP-1的5倍～50倍左右。在上述OGTT中显示高活性的附加糖链部位为30位及36位。
试验例7-4(Asn附加糖链的GLP-1肽的OGTT)
对GLP-1的22位或30位的氨基酸被附加糖链的Asn(天然联糖链)或附加糖链的Cys取代的附加糖链的GLP-1肽，用小鼠OGTT比较给药量0.9nmol/kg时的活性。将结果示于图19。关于GLP-1，图19中表示由试验例7-2得到的给药量为9nmol/kg的OGTT的结果。
在22位上附加有9糖(去唾液酸糖链)的情况与在30位上附加有11糖(二唾液酸糖链)的情况，在附加糖链的Asn和附加糖链的Cys之间附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用没有差异，在附加有任一种附加糖链的氨基酸的情况下，附加糖链的GLP-1肽也显示活性。
试验例7-5(附加糖链的GLP-1肽的OGTT中的附加糖链数的影 响)
对附加有2条糖链的实施例48及49的附加糖链的GLP-1肽的血糖值上升抑制作用，使用小鼠OGTT进行评价。将给药量为9nmol/kg时26、34Cys GLP-1-二唾液酸及18、36Cys GLP-1-二唾液酸的OGTT的结果示于图20。关于GLP-1，图20中表示由试验例7-2得到的给药量为9nmol/kg的OGTT的结果。
给药量为9nmoL/kg时18、36Cys GLP-1-二唾液酸的作用与图5、14中的36Cys GLP-1-二唾液酸大致相等。给药量为9nmoL/kg时26、34Cys GLP-1-二唾液酸的血糖值上升抑制活性与同给药量的GLP-1相比得到一定改善。
接着，对18、36Cys GLP-1-二唾液酸，将给药量设定为1/10(0.9nmol/kg)进行OGTT。同样地，对给药量9nmol/kg的GLP-1进行OGTT，与18、36Cys GLP-1-二唾液酸进行比较。将结果示于图21。
给药量为0.9nmol/kg时18、36Cys GLP-1-二唾液酸的血糖值降低作用与给药量为9nmol/kg的GLP-1大致相等。可以认为，18、36CysGLP-1-二唾液酸的血糖值上升抑制活性与GLP-1相比，增大10倍左右。
试验例8(糖尿病模型小鼠中的附加糖链的GLP-1肽的血糖值降 低作用)
对BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl小鼠(10周龄、雄性)以10ml/kg的给药量向腹腔内给予由实施例2、3、4、21或23制造的附加糖链的GLP-1肽或由比较例1制造的GLP-1的PBS溶液(9nmol/10ml)。在给予化合物前、30分钟后、60分钟后、120分钟、180分钟、300分钟后进行眼窝采血，使用罗氏卓越血糖仪(Accu-Chek Aviva)(roche-diagnostics公司)测定血糖值。
作为糖尿病模型小鼠的db/db(BKS.Cg-+Leprdb/+Leprdb/Jcl)小鼠为在作为摄食抑制/能量代谢亢进激素的瘦素的受体中产生变异的小鼠，出现肥胖、高血糖等症状。
在小鼠OGTT(试验例7)中显示血糖值上升抑制活性的附加糖链的GLP-1肽中，对db/db小鼠以9nmol/kg的给药量向腹腔内给予22Cys GLP-1-二唾液酸、26Cys GLP-1-二唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸，经时地测定血糖值，由此，将血糖值降低作用与未附加糖链的比较例1的GLP-1进行比较。将结果示于图22。
GLP-1的血中稳定性低，给药后，快速地被分解。因此，血糖值降低作用小，与给予PBS的小鼠的血糖值相比，几乎没有变化。
相对于此，附加糖链的GLP-1肽(26Cys GLP-1-二唾液酸、30CysGLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸)显示强的血糖值降低作用，在小鼠OGTT中显示血糖值上升抑制活性的肽即使是db/db小鼠也显示血糖值降低作用。(120分钟时的血糖值降低作用：26Cys GLP-1-二唾液酸、30Cys GLP-1-二唾液酸、34CysGLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸≥22Cys GLP-1-二唾液酸)
给予26Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸时的血糖值其后缓慢地上升，血糖值降低作用经时地减弱一些。给予30CysGLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸时的血糖值维持低至300分钟的水平(300分钟时的血糖值降低作用：30Cys GLP-1-二唾液酸、36Cys GLP-1-二唾液酸≥22Cys GLP-1-二唾液酸、26Cys GLP-1-二唾液酸、34Cys GLP-1-二唾液酸)。
序列表简述
序列1是通式(1)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列2是GLP-1(7-37)。
序列3是GLP-1(7-36)NH2。
序列4是(a1)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列5是(a2)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列6是(a3)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列7是(a4)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列8是(a5)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列9是(a6)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列10是(a7)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列11是(a8)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列12是(a9)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列13是(a10)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列14是(a11)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列15是(a12)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列16是(a13)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列17是(a14)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列18是(a15)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列19是(a16)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列20是(a17)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列21是(a18)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列22是(a19)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列23是(a20)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列24是(a21)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列25是(a22)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列26是(a23)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列27是(a24)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列28是(a25)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列29是(a26)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列30是实施例1中合成的具有保护基的31残基肽。
序列31是比较例1中合成的具有保护基的31残基肽。
序列32是实施例6中合成的具有保护基的31残基肽。
序列33是实施例6中合成的具有保护基的31残基肽。
序列34是实施例7中合成的具有保护基的18残基肽。
序列35是实施例7中合成的具有保护基的19残基的附加糖链的肽。
序列36是实施例7中合成的具有保护基的31残基的附加糖链的肽。
序列37是实施例8中合成的具有保护基的31残基肽。
序列38是实施例9中合成的具有保护基的31残基肽。
序列39是实施例10中合成的具有保护基的31残基肽。
序列40是实施例11中合成的具有保护基的31残基肽。
序列41是实施例12中合成的具有保护基的31残基肽。
序列42是实施例13中合成的具有保护基的31残基肽。
序列43是实施例14中合成的具有保护基的31残基肽。
序列44是实施例15中合成的具有保护基的31残基肽。
序列45是实施例16中合成的具有保护基的31残基肽。
序列46是实施例17中合成的具有保护基的31残基肽。
序列47是实施例18中合成的具有保护基的31残基肽。
序列48是实施例19中合成的具有保护基的31残基肽。
序列49是实施例20中合成的具有保护基的31残基肽。
序列50是实施例21中合成的具有保护基的31残基肽。
序列51是实施例22中合成的具有保护基的31残基肽。
序列52是实施例23中合成的具有保护基的31残基肽。
序列53是实施例24中合成的具有保护基的31残基肽。
序列54是实施例25中合成的具有保护基的31残基肽。
序列55是实施例26中合成的具有保护基的31残基肽。
序列56是实施例27中合成的具有保护基的31残基肽。
序列57是实施例28中合成的具有保护基的31残基肽。
序列58是实施例29中合成的具有保护基的31残基肽。
序列59是实施例30中合成的具有保护基的31残基肽。
序列60是实施例31中合成的具有保护基的31残基肽。
序列61是实施例32中合成的具有保护基的31残基肽。
序列62是实施例33中合成的具有保护基的31残基肽。
序列63是实施例34中合成的具有保护基的31残基肽。
序列64是实施例35中合成的具有保护基的12残基肽。
序列65是实施例35中合成的具有保护基的13残基的附加糖链的肽。
序列66是实施例35中合成的具有保护基的18残基的附加糖链的肽。
序列67是实施例35中合成的具有保护基的18残基的附加糖链的肽。
序列68是实施例35中合成的具有脱离基的18残基的附加糖链的肽。
序列69是实施例35中合成的具有保护基的13残基肽。
序列70是实施例35中合成的13残基肽。
序列71是实施例36中合成的具有保护基的19残基肽。
序列72是实施例36中合成的具有保护基的20残基的附加糖链的肽。
序列73是实施例36中合成的具有保护基的31残基的附加糖链的肽。
序列74是实施例37中合成的具有保护基的15残基肽。
序列75是实施例37中合成的具有保护基的16残基的附加糖链的肽。
序列76是实施例37中合成的具有保护基的31残基的附加糖链的肽。
序列77是实施例38中合成的具有保护基的18残基肽。
序列78是实施例38中合成的具有保护基的18残基肽。
序列79是实施例38中合成的具有脱离基的18残基肽。
序列80是实施例38中合成的具有保护基的11残基肽。
序列81是实施例38中合成的具有保护基的13残基的附加糖链的肽。
序列82是实施例39中合成的具有保护基的18残基肽。
序列83是实施例39中合成的具有保护基的18残基肽。
序列84是实施例39中合成的具有脱离基的18残基肽。
序列85是实施例39中合成的具有保护基的10残基肽。
序列86是实施例39中合成的具有保护基的13残基的附加糖链的肽。
序列87是实施例40中合成的具有保护基的18残基肽。
序列88是实施例40中合成的具有保护基的18残基肽。
序列89是实施例40中合成的具有脱离基的18残基肽。
序列90是实施例40中合成的具有保护基的9残基肽。
序列91是实施例40中合成的具有保护基的13残基的附加糖链的肽。
序列92是实施例41中合成的具有保护基的7残基肽。
序列93是实施例41中合成的具有保护基的8残基的附加糖链的肽。
序列94是实施例41中合成的具有保护基的31残基的附加糖链的肽。
序列95是实施例42中合成的具有保护基的31残基的附加糖链的肽。
序列96是实施例46中合成的具有保护基的18残基肽。
序列97是实施例46中合成的具有保护基的18残基肽。
序列98是实施例46中合成的具有脱离基的18残基肽。
序列99是实施例46中合成的具有保护基的7残基肽。
序列100是实施例46中合成的具有保护基的13残基的附加糖链的肽。
序列101是实施例48中合成的具有保护基的31残基肽。
序列102是实施例49中合成的具有保护基的31残基肽。
序列103是(b1)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列104是(b2)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列105是(b3)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列106是(b4)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列107是(b5)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列108是(b6)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列109是(b7)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列110是(b8)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列111是(b9)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列112是(b10)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列113是(b11)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列114是(b12)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列115是(b13)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列116是(b14)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列117是(b15)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列118是(b16)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列119是(b17)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列120是(b18)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列121是(b19)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列122是(b20)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列123是(b21)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列124是(b22)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列125是(b23)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列126是(b24)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列127是(b25)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列128是(b26)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列129是(b27)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列130是(b28)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列131是(b29)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列132是(b30)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列133是(b31)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列134是(b32)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列135是(b33)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列136是(b34)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列137是(b35)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列138是(b36)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列139是(b37)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列140是(b38)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列141是(b39)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列142是(b40)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列143是(b41)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列144是(b42)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列145是(b43)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列146是(b44)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列147是(b45)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列148是(b46)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列149是(b47)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列150是(b48)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列151是(b49)所示的附加糖链的GLP-1肽。
序列152是实验例6中合成的45残基的小鼠GLP-1受体正义引物。
序列153是实验例6中合成的41残基的小鼠GLP-1受体反义引物。
工业实用性
本发明提供与GLP-1相比，血中半衰期长，且优选血糖值抑制活性增大的附加糖链的GLP-1肽。本发明在医药品领域尤其有用。
序列表
<110>Otsuka Chemical Co.，Ltd.和Yokohama City University
 
<120>附加糖链的GLP-1肽
 
<130>W001192
 
<150>JP 2007-160951
<151>2007-06-19
 
<160>153
 
<170>PatentIn version 3.1
 
<210>1
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>附加糖链的(glycosylated)GLP-1肽
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>Xaa18：Ser、附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>Xaa19：Tyr、附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>Xaa22：Gly、附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>Xaa26：Lys、附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>Xaa36：Arg、附加糖链的Cys或附加糖链的Asn。
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>Xaa37：Gly、-NH2、Gly-附加糖链的Cys或Gly-附加糖链的Asn。
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>当Xaa18是Ser，Xaa19是Tyr，Xaa22是Gly，Xaa26是Lys及Xaa36是Arg时，Xaa37
是Gly-附加糖链的Cys或Gly-附加糖链的Asn。
 
<400>1
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Xaa Xaa Leu Glu Xaa
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Xaa Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Xaa Xaa
            20                  25                  30
 
<210>2
<211>31
<212>PRT
<213>人
 
<220>
<223>GLP-1(7-37)OH
 
<400>2
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>3
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>GLP-1(7-36)NH2
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>3
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>4
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a1)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<400>4
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>5
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a2)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<400>5
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>6
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a3)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
 
<400>6
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>7
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a4)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>
 
<400>7
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
            20                  25                  30
 
<210>8
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a5)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(32)..(32)
<223>
 
<400>8
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
            20                  25                  30
 
<210>9
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a6)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(13)..(13)
<223>
 
<400>9
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Cys Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>10
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a7)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<400>10
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>11
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a8)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<400>11
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>12
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a9)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
 
<400>12
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>13
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a10)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>
 
<400>13
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly
            20                  25                  30
 
<210>14
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a11)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(32)..(32)
<223>
 
<400>14
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Asn
            20                  25                  30
<210>15
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a12)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(13)..(13)
<223>
 
<400>15
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>16
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a13)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>16
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>17
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a14)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>17
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>18
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a15)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>
 
<400>18
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>19
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a16)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>19
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys
            20                  25                  30
 
<210>20
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a17)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(13)..(13)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>20
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Cys Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>21
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a18)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>21
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>22
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a19)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>22
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25              30
 
<210>23
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>(a20)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>23
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>24
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a21)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>24
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn
            20                  25                  30
 
<210>25
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a22)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(13)..(13)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>25
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>26
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a23)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(32)..(32)
<223>
 
<400>26
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
            20                  25                  30
 
<210>27
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a24)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
<400>27
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>28
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a25)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(32)..(32)
<223>
 
<400>28
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly Asn
            20                  25                  30
 
<210>29
<211>30
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(a26)的氨基酸序列
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>
 
<220>
<221>MOD_RES
<222>(30)..(30)
<223>酰胺化
 
<400>29
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Asn
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg
            20                  25                  30
 
<210>30
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例1)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
<400>30
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>31
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(比较例1)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
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<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>31
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>32
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例6)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>32
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>33
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(Exapmle 6)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt和Boc的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>33
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>34
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例7)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>34
 
Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly
1                5                  10                  15
Arg Gly
 
<210>35
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例7)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(1)..(1)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>35
 
Asn Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
1                5                  10                  15
Gly Arg Gly
 
<210>36
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(13)..(13)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>36
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>37
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例8)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(22)..(22)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(29)..(29)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>37
 
Cys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu
1                5                  10                  15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>38
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例9)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>38
 
His Cys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>39
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例10)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
<400>39
 
His Ala Cys Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>40
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>40
 
His Ala Glu Cys Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>41
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例12)
 
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>41
 
His Ala Glu Gly Cys Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
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<210>42
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>42
 
His Ala Glu Gly Thr Cys Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>43
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例14)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
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<400>43
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Cys Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>44
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
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<400>44
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>45
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例16)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
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<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>45
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Cys Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>46
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例17)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>46
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Cys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>47
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例18)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>47
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>48
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例19)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
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<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
<220>
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<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
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<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>48
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Cys Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
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<211>31
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<213>人工序列
 
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<400>49
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
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Gln Ala Ala Lys Glu Cys Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
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<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>50
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>51
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例22)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(26)..(26)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>51
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Cys Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>52
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例23)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>52
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>53
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例24)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>53
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>54
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例25)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>54
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>55
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例26)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<22l>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
 
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>55
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>56
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例27)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>56
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>57
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例28)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
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<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<400>57
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
            20                  25                   30
 
<210>58
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例29)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>58
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>59
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例30)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>59
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>60
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例31)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>60
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>61
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例32)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>61
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>62
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例33)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>62
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>63
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例34)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>63
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
<210>64
<211>12
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>64
Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
1                5                  10
 
<210>65
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(1)..(1)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>65
 
Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala
1                5                   10
 
<210>66
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(6)..(6)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>66
 
His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                   10                 15
Gln Ala
 
<210>67
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt和Boc的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(6)..(6)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>67
 
His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
<210>68
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有脱离基的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(6)..(6)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有脱离基PhS的Ala
 
<400>68
 
His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala
 
<210>69
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>69
Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                  10
 
<210>70
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>氨基酸序列(实施例35)
 
<400>70
Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                  10
 
<210>71
<211>19
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例36)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>71
Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys
1                5                  10                  15
Gly Arg Gly
 
<210>72
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例36)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(1)..(1)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(19)..(19)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>72
Asn Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val
1                5                  10                  15
Lys Gly Arg Gly
 
<210>73
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例36)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>73
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>74
<211>15
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例37)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(14)..(14)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>74
 
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1               5                 10                 15
 
<210>75
<211>16
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例37)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(1)..(1)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>75
 
Asn Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                   10                 15
 
<210>76
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例37)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(16)..(16)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>76
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>77
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例38)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>77
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala
 
<210>78
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例38)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt和Boc的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>78
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
 
<210>79
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有脱离基的氨基酸序列(实施例38)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有脱离基PhS的Ala
 
<400>79
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
 
<210>80
<211>11
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例38)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>80
Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                  10
 
<210>81
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例38)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Cys
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(2)..(2)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>81
 
Cys Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                  10
 
<210>82
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例39)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>82
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
 
<210>83
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例39)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt和Boc的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>83
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala
 
<210>84
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有脱离基的氨基酸序列(实施例39)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有脱离基PhS的Ala
 
<400>84
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala
 
<210>85
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例39)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基Pbf的Arg
<400>85
Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1               5                10
 
<210>86
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例39)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(3)..(3)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>86
Cys Lys Asn Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                  10
 
<210>87
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例40)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>87
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala
 
<210>88
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例40)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt和Boc的His
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>88
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
 
<210>89
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有脱离基的氨基酸序列(实施例40)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有脱离基PhS的Ala
 
<400>89
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
 
<210>90
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例40)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>90
Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5
 
<210>91
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例40)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(4)..(4)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>91
Cys Lys Glu Asn Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                  10
 
<210>92
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例41)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>92
Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1               5
 
<210>93
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例41)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(1)..(1)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>93
Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5
 
<210>94
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例41)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(24)..(24)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>94
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>95
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例42)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>95
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly
            20                  25                  30
 
<210>96
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例46)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>96
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala
 
<210>97
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例46)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt和Boc的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<400>97
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala
 
<210>98
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有脱离基的氨基酸序列(实施例46)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>具有脱离基PhS的Ala
<400>98
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                   15
Gln Ala
 
<210>99
<211>7
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例46)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(4)..(4)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(6)..(6)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>99
Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5
 
<210>100
<211>13
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例46)
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(6)..(6)
<223>附加二苄基二唾液酸寡糖链的Asn
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(10)..(10)
<223>具有保护基Boc的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>100
Cys Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
1                5                   10
 
<210>101
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例48)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基tBu的Ser
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Pbf的Arg
 
<400>101
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>102
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>具有保护基的氨基酸序列(实施例49)
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(1)..(1)
<223>具有保护基Trt的His
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(3)..(3)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(5)..(5)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(7)..(7)
<223>具有保护基tBu的Thr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(8)..(8)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(9)..(9)
<223>具有保护基OtBu的Asp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(11)..(11)
<223>具有保护基tBu的Ser
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(12)..(12)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(13)..(13)
<223>具有保护基tBu的Tyr
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(15)..(15)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(17)..(17)
<223>具有保护基Trt的Gln
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(20)..(20)
<223>具有保护基Trt的Lys
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(21)..(21)
<223>具有保护基OtBu的Glu
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(25)..(25)
<223>具有保护基Boc的Trp
 
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(28)..(28)
<223>具有保护基Boc的Lys
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>具有保护基Trt的Cys
 
<400>102
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
            20                  25                  30
 
<210>103
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b1)的氨基酸序列(实施例1)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>103
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>104
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b2)的氨基酸序列(实施例2)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>104
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>105
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b3)的氨基酸序列(实施例3)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>105
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>106
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b4)的氨基酸序列(实施例4)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>106
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
            20                  25                  30
 
<210>107
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b5)的氨基酸序列(实施例5)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(32)..(32)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>107
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Cys
            20                  25                   30
 
<210>108
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b6)的氨基酸序列(实施例6)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(32)..(32)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>108
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly Asn
            20                  25                   30
 
<210>109
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b7)的氨基酸序列(实施例7)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(13)..(13)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>109
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Asn Leu Glu Gly
1                5                  10                 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>110
<211>32
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b8)的氨基酸序列(实施例8)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(1)..(1)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>110
 
Cys His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Yal Ser Ser Tyr Leu Glu
1                5                   10                 15
Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>111
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b9)的氨基酸序列(实施例9)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(2)..(2)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>111
 
His Cys Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>112
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b1O)的氨基酸序列(实施例10)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(3)..(3)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>112
 
His Ala Cys Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                   30
 
<210>113
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b11)的氨基酸序列(实施例11)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(4)..(4)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>113
 
His Ala Glu Cys Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>114
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b12)的氨基酸序列(实施例12)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(5)..(5)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>114
 
His Ala Glu Gly Cys Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>115
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b13)的氨基酸序列(实施例13)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(6)..(6)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>115
 
His Ala Glu Gly Thr Cys Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>116
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b14)的氨基酸序列(实施例14)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(8)..(8)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>116
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Cys Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>117
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b15)的氨基酸序列(实施例15)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(10)..(10)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>117
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Cys Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>118
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b16)的氨基酸序列(实施例16)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(14)..(14)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>118
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Cys Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>119
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b17)的氨基酸序列(实施例17)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(18)..(18)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>119
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Cys Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>120
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b18)的氨基酸序列(实施例18)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(19)..(19)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>120
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1               5                   10                  15
Gln Ala Cys Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>121
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b19)的氨基酸序列(实施例19)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(21)..(21)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>121
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Cys Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>122
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b20)的氨基酸序列(实施例20)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(22)..(22)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>122
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Cys Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>123
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b21)的氨基酸序列(实施例21)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>123
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>124
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b22)的氨基酸序列(实施例22)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(26)..(26)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>124
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Cys Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>125
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b23)的氨基酸序列(实施例23)
 
<220>125
<221>CARBOHYD
<222>(28)..(28)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>125
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>126
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b24)的氨基酸序列(实施例24)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>126
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                   30
 
<210>127
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b25)的氨基酸序列(实施例25)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>127
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                   15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                   30
 
<210>128
 
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b26)的氨基酸序列(实施例26)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>128
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>129
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b27)的氨基酸序列(实施例27)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(28)..(28)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>129
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>130
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b28)的氨基酸序列(实施例28)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>130
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
            20                  25                  30
 
<210>131
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b29)的氨基酸序列(实施例29)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>附加二N-乙酰葡萄糖胺寡糖链的Cys
 
<400>131
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>132
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b30)的氨基酸序列(实施例30)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加二N-乙酰葡萄糖胺寡糖链的Cys
 
<400>132
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>133
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b31)的氨基酸序列(实施例31)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(28)..(28)
<223>附加二N-乙酰葡萄糖胺寡糖链的Cys
 
<400>133
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>134
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b32)的氨基酸序列(实施例32)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>附加二甘露糖寡糖链的Cys
 
<400>134
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Cys
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>135
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b33)的氨基酸序列(实施例33)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加二甘露糖寡糖链的Cys
 
<400>135
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Cys Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>136
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b34)的氨基酸序列(实施例34)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(28)..(28)
<223>附加二甘露糖寡糖链的Cys
 
<400>136
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                 15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>137
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b35)的氨基酸序列(实施例35)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(6)..(6)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>137
 
His Ala Glu Gly Thr Asn Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>138
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b36)的氨基酸序列(实施例36)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>138
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>139
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b37)的氨基酸序列(实施例37)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>139
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>140
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b38)的氨基酸序列(实施例38)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>140
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Asn Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>141
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b39)的氨基酸序列(实施例39)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(21)..(21)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>141
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Asn Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>142
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b40)的氨基酸序列(实施例40)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(22)..(22)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>142
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Asn Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>143
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b41)的氨基酸序列(实施例41)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>143
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>144
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b42)的氨基酸序列(实施例42)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>附加去唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>144
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly
            20                  25                   30
 
<210>145
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b43)的氨基酸序列(实施例43)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>145
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Asn Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                   15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                   30
 
<210>146
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b44)的氨基酸序列(实施例44)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(16)..(16)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>146
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Asn
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>147
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b45)的氨基酸序列(实施例45)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>147
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>148
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b46)的氨基酸序列(实施例46)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(24)..(24)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>148
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Asn Trp Leu Val Lys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>149
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b47)的氨基酸序列(实施例47)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Asn
 
<400>149
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Asn Gly
            20                  25                  30
 
<210>150
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b48)的氨基酸序列(实施例48)
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(20)..(20)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(28)..(28)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>150
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly
1                5                   10                 15
Gln Ala Ala Cys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Cys Gly Arg Gly
            20                  25                  30
 
<210>151
<211>31
<212>PRT
<213>人工序列
 
<220>
<223>(b49)的氨基酸序列(实施例49)
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(12)..(12)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<220>
<221>CARBOHYD
<222>(30)..(30)
<223>附加二唾液酸寡糖链的Cys
 
<400>151
 
His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Cys Tyr Leu Glu Gly
1                5                  10                  15
Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Cys Gly
            20                  25                  30
<210>152
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>小鼠GLP-1受体的正义引物
 
<400>152
 
GTTGCTAGCG CCACCATGGC CAGCACCCCA AGCCT  45
 
<210>153
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>小鼠GLP-1受体的反义引物
 
<400>153
 
CCTGAATTCT CAGCTGTAGG AACTCTGGCA G      41

Claims (61)

1.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代：
(a)GLP-1；
(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或
(c)GLP-1的类似物。
2.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代：
(a)GLP-1；或
(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽。
3.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少1个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代：
(a)GLP-1；或
(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸，且具有GLP-1活性的肽。
4.权利要求1～3中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn或附加糖链的Cys。
5.权利要求1～3中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn。
6.权利要求1～3中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Cys。
7.权利要求1～5中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
8.权利要求1～7中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为由4个以上的糖构成的糖链。
9.权利要求1～8中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为由5～11个糖构成的糖链。
10.权利要求1～9中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
11.权利要求1～9中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为下式表示的糖链：
[化1]
Figure F2008800253949C00021
式中，R1及R2相同或不同，表示化2所示的基团：
[化2]
Figure F2008800253949C00022
，
Ac表示乙酰基。
12.权利要求1～11中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链基本上均一。
13.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1的C末端(37位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附加的氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
14.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1的C末端(37位)上进一步附加有1个氨基酸的肽中，该被附加的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
15.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1的N末端(7位)上进一步附加有1或数个氨基酸的肽中，该被附加的氨基酸的至少一个被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
16.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1的N末端(7位)上进一步附加有1个氨基酸的肽中，该被附加的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
17.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)GLP-1的选自18、20、22、26、30、34及36位中的1个以上部位的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
18.权利要求13～17中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn或附加糖链的Cys。
19.权利要求13～18中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
20.权利要求13～19中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为由4个以上的糖构成的糖链。
21.权利要求13～20中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
22.权利要求13～20中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链为下式表示的糖链：
[化3]
Figure F2008800253949C00041
式中，R1及R2相同或不同，表示化4所示的基团：
[化4]
Figure F2008800253949C00051
，
Ac表示乙酰基。
23.权利要求13～22中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链99％以上均一。
24.权利要求13～17中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中，
所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn，
在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合，
所述糖链为由4个以上的糖构成的糖链，
所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链，
所述糖链基本上均一。
25.权利要求1～24中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其具有比GLP-1增大的血中稳定性。
26.权利要求1～24中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其具有与GLP-1相比为10倍以上的在OGTT(口服葡萄糖耐量实验)中的血糖值抑制活性。
27.权利要求1～24中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其具有与GLP-1相比为30倍以上的DPP-IV耐受性。
28.医药组合物，其特征在于，含有权利要求1～27中任一项的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分。
29.权利要求28的医药组合物，其中所述糖链90％以上均一。
30.权利要求28的医药组合物，其用于治疗或预防GLP-1相关疾病。
31.权利要求28的医药组合物，其中所述GLP-1相关疾病为糖尿病。
32.GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于，给予有效量的权利要求1～27中任一项的附加糖链的GLP-1肽。
33.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代：
(a)GLP-1；
(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽；或
(c)GLP-1的类似物。
34.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代：
(a)GLP-1；或
(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸的肽。
35.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，下列肽中的至少2个氨基酸被附加糖链的氨基酸取代：
(a)GLP-1；或
(b)GLP-1中缺失、取代或附加1或数个氨基酸，且具有GLP-1活性的肽。
36.权利要求33～35中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn和/或附加糖链的Cys。
37.权利要求33～35中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸均为附加糖链的Asn。
38.权利要求33～35中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸均为附加糖链的Cys。
39.权利要求33～37中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
40.权利要求33～39中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均为由4个以上的糖构成的糖链。
41.权利要求33～40中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均为由5～11个糖构成的糖链。
42.权利要求33～41中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均独立地为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
43.权利要求33～41中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均独立地为下式表示的糖链：
[化5]
Figure F2008800253949C00071
式中，R1及R2相同或不同，表示化6所示的基团：
[化6]
Figure F2008800253949C00072
，
Ac表示乙酰基。
44.权利要求33～43中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链基本上均一。
45.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1中，2个以上的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代，且至少一个取代部位为18、20、22、26、30、34及36位的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
46.具有GLP-1活性的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，为：
(a)在GLP-1中，2以上的氨基酸被附加糖链的氨基酸取代，且全部取代部位均选自18、20、22、26、30、34及36位的附加糖链的GLP-1肽；或
(b)在由(a)定义的附加糖链的GLP-1肽中，缺失、取代或附加1或数个附加糖链的氨基酸以外的氨基酸的附加糖链的GLP-1肽。
47.权利要求45或46的附加糖链的GLP-1肽，其中所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn和/或附加糖链的Cys。
48.权利要求45～47中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其特征在于，在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合。
49.权利要求45～48的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均为由4个以上的糖构成的糖链。
50.权利要求45～49中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均独立地为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链。
51.权利要求45～49中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中所述糖链均独立地为下式表示的糖链：
[化7]
Figure F2008800253949C00091
式中，R1及R2相同或不同，表示化8所示的基团：
[化8]
Figure F2008800253949C00092
，
Ac表示乙酰基。
52.权利要求45～51中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其中，其中所述糖链99％以上均一。
53.权利要求45或46的附加糖链的GLP-1肽，其中，
所述附加糖链的氨基酸为附加糖链的Asn，
在所述附加糖链的氨基酸中，糖链和氨基酸不通过接头结合，
所述糖链为由4个以上的糖构成的糖链，
所述糖链为选自二唾液酸糖链、单唾液酸糖链、去唾液酸糖链、二N-乙酰葡萄糖胺糖链及二甘露糖糖链的糖链，
所述糖链基本上均一。
54.权利要求33～53中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其具有比GLP-1增大的血中稳定性。
55.权利要求33～53中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其具有与GLP-1相比为10倍以上的在OGTT(口服葡萄糖耐量实验)中的血糖值抑制活性。
56.权利要求33～53中任一项的附加糖链的GLP-1肽，其具有与GLP-1相比为30倍以上的DPP-IV耐受性。
57.医药组合物，其特征在于，含有权利要求33～56中任一项的附加糖链的GLP-1肽作为有效成分。
58.权利要求57的医药组合物，其中所述糖链90％以上均一。
59.权利要求57的医药组合物，其用于治疗或预防GLP-1相关疾病。
60.权利要求57的医药组合物，其中所述GLP-1相关疾病为糖尿病。
61.GLP-1相关疾病的治疗或预防方法，其特征在于，给予有效量的权利要求33～57中任一项的附加糖链的GLP-1肽。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102666580A (zh) * 2009-10-30 2012-09-12 大塚化学株式会社 抗原性glp-1类似物的糖链加成物
WO2013037267A1 (zh) * 2011-09-14 2013-03-21 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽变构体及其缀合物
CN104918962A (zh) * 2012-11-22 2015-09-16 株式会社糖锁工学研究所 糖链加成连接基团、含有糖链加成连接基团部分与生理活性物质部分的化合物或其盐、及其制造方法
CN109134642A (zh) * 2011-10-01 2019-01-04 株式会社糖锁工学研究所 加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2172479T3 (en) * 2007-06-19 2016-12-19 Glytech Inc GLP-1 peptide having the sugar chain attached thereto
RU2543157C2 (ru) * 2008-06-17 2015-02-27 Глитек,Инк. Гликозилированный пептид glp-1
US9234023B2 (en) * 2010-06-24 2016-01-12 Biousian Biosystems, Inc. Glucagon-like peptide-1 glycopeptides
EP2657244B8 (en) * 2010-12-22 2016-08-31 Ajinomoto Co., Inc. Glycoside compounds as glp-1 secretion promoting agents
CN102718858B (zh) * 2011-03-29 2014-07-02 天津药物研究院 胰高血糖素样肽-1类似物单体、二聚体及其制备方法与应用
EP2752424B1 (en) * 2011-09-04 2019-09-11 Glytech, Inc. Glycosylated somatostatin and drug composition containing it
KR102227919B1 (ko) * 2012-11-30 2021-03-15 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 링커, 당쇄 부가 링커와 생리 활성 물질을 포함하는 화합물 또는 그 염, 및 그것들의 제조 방법
CN104334574B (zh) * 2013-03-29 2020-01-14 株式会社糖锁工学研究所 附加唾液酸化糖链的多肽
CA2972748A1 (en) 2014-12-30 2016-07-07 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative having improved stability
AU2016287209B2 (en) 2015-06-30 2023-03-02 Hanmi Pharm. Co., Ltd. Glucagon derivative and a composition comprising a long acting conjugate of the same
CN116063453A (zh) 2015-12-31 2023-05-05 韩美药品株式会社 胰高血糖素/glp-1/gip受体三重激动剂
TN2018000452A1 (en) 2016-06-29 2020-06-15 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Glucagon derivative, conjugate thereof, composition comprising same and therapeutic use thereof
CA3147770A1 (en) * 2019-08-13 2021-02-18 Jae Ha Ryu Exenatide analog and use thereof
WO2021145552A1 (ko) * 2020-01-13 2021-07-22 한미약품 주식회사 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체의 폐질환의 치료 용도
CN115463208B (zh) * 2021-10-09 2023-05-30 上海海赜生物科技有限公司 一种口服降糖组合物

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004005330A1 (ja) * 2002-07-05 2004-01-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドの製造法及び該糖ペプチド
WO2005010053A1 (ja) * 2003-07-28 2005-02-03 Otsuka Chemical Co., Ltd. アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法
WO2006010143A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7772188B2 (en) * 2003-01-28 2010-08-10 Ironwood Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of gastrointestinal disorders
SI1605897T1 (sl) 2003-03-19 2012-11-30 Lilly Co Eli Polietilen glikol povezane GLP spojine
NZ543292A (en) * 2003-06-12 2008-04-30 Lilly Co Eli GLP-1 analog fusion proteins
JP2005095331A (ja) 2003-09-24 2005-04-14 Ihara Suisan Kk 魚皮真皮コラーゲンを含有する発泡体シートおよびその用途
DK2172479T3 (en) * 2007-06-19 2016-12-19 Glytech Inc GLP-1 peptide having the sugar chain attached thereto

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004005330A1 (ja) * 2002-07-05 2004-01-15 Otsuka Chemical Co., Ltd. 糖鎖アスパラギンを有する糖ペプチドの製造法及び該糖ペプチド
WO2005010053A1 (ja) * 2003-07-28 2005-02-03 Otsuka Chemical Co., Ltd. アミノ化複合型糖鎖誘導体及びその製造方法
WO2006010143A2 (en) * 2004-07-13 2006-01-26 Neose Technologies, Inc. Branched peg remodeling and glycosylation of glucagon-like peptide-1 [glp-1]
WO2007063907A1 (ja) * 2005-11-30 2007-06-07 Shionogi & Co., Ltd. ペプチド糖鎖付加体およびそれを有効成分とする医薬

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEURER J. A. ET AL: "Properties of native and in vitro glycosylated forms of the glucagon-like peptide-1 receptor antagonist exendin(9-39)", 《METABOLISM》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102666580A (zh) * 2009-10-30 2012-09-12 大塚化学株式会社 抗原性glp-1类似物的糖链加成物
WO2013037267A1 (zh) * 2011-09-14 2013-03-21 深圳翰宇药业股份有限公司 利拉鲁肽变构体及其缀合物
CN109134642A (zh) * 2011-10-01 2019-01-04 株式会社糖锁工学研究所 加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物
CN104918962A (zh) * 2012-11-22 2015-09-16 株式会社糖锁工学研究所 糖链加成连接基团、含有糖链加成连接基团部分与生理活性物质部分的化合物或其盐、及其制造方法
CN104918962B (zh) * 2012-11-22 2017-12-19 株式会社糖锁工学研究所 糖链加成连接基团、含有糖链加成连接基团部分与生理活性物质部分的化合物或其盐、及其制造方法

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