WO2013032011A1 - 糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物 - Google Patents

糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物 Download PDF

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amino acid
polypeptide
glycosylated polypeptide
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洋文 落合
泰治 下田
一博 深江
政敏 前田
一之 石井
健太 吉田
克成 手塚
圭亮 田鶴
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株式会社糖鎖工学研究所
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Definitions

  • the present invention relates to a glycosylated polypeptide and a pharmaceutical composition containing the polypeptide.
  • Somatostatin is a cyclic peptide that exists in both the central nervous system and surrounding tissues. Somatostatin was first isolated from the mammalian hypothalamus and identified as an important inhibitor of growth hormone secretion from the anterior pituitary gland. This peptide is widely distributed in the hypothalamus, pancreas, gastrointestinal tract, and the like, and expresses an action through binding to a somatostatin receptor.
  • somatostatin suppresses growth hormone (GH) secretion in the pituitary gland, thyrotropin (TSH) secretion inhibition, gastrin in the gastrointestinal tract, selectin, cholecystokinin (CCK), VIP (Vasactive Intestinal Polypeptide), It is known to suppress secretion of various hormones such as glucagon and insulin in the pancreas. In addition, it is also known to have an action of suppressing gastrointestinal motility.
  • GH growth hormone
  • TSH thyrotropin
  • CCK cholecystokinin
  • VIP Vasactive Intestinal Polypeptide
  • Natural somatostatin (somatotropin release inhibitor (SRIF)) having the structural formula: Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys (SEQ ID NO: 1) was first isolated by Guillemin and collaborators. This somatostatin exerts its effects by interacting with a family of receptors.
  • the somatostatin receptor (SSTR) has 1 to 5 subtypes (SSTR1 to SSTR5).
  • SSTR2 is a GH-secreting human pituitary adenoma, central nervous system, anterior pituitary gland, retina, adrenal medulla, stomach It is known to be distributed in the duodenal mucosa, small intestine, colon tissues, and glucagon-secreting A cells of the pancreatic islets of Langerhans. Each of these receptors is also known to be expressed in various tumors. For example, SSTR1 and SSTR5 are expressed in functional pituitary adenomas, and SSTR1 in addition to SSTR2 in gastrointestinal tumors.
  • Non-Patent Document 1 SSTR3 is expressed, SSTR3 is expressed in pheochromocytoma, SSTR1 and SSTR5 are expressed in prostate cancer, and SSTR5 is expressed in colorectal cancer.
  • SSTR4 has been reported to function as a receptor having an antagonistic regulatory action and to be important in the treatment of glaucoma-related diseases (Non-patent Document 2).
  • somatostatin and its analogs are potentially useful therapeutic agents for somatostatin related diseases and various types of tumors.
  • somatostatin On the other hand, naturally occurring somatostatin has two undesirable properties of low bioavailability and short duration of action due to its short blood half-life of 2-3 minutes. Use and applications are limited. For this reason, various somatostatin analogs have been identified in order to find somatostatin analogs that are either superior in potency, biostability, duration of action, or selectivity considering the suppression of growth hormone, insulin or glucagon release. Development has been done.
  • Octreotide (Patent Document 1 and Patent Document 2) has been reported as the first approved somatostatin analog that can be clinically used, and this octreotide is associated with SSTR2, SSTR3, and SSTR5 of the somatostatin receptor. It is known to have an affinity for it.
  • Octreotide has a sequence of four amino acids (Phe-Trp-Lys-Thr), which is an important part for showing the biological activity of somatostatin, and has disulfide (SS) bonds at both ends of the sequence. It has been developed as a cyclic peptide consisting of 8 amino acids having Cys to form and further having D-Phe and Thr (ol) outside Cys at both ends.
  • This octreotide can have a sustained action by improving the blood half-life due to its amino acid sequence, and has a high selectivity against growth hormone (GH) compared to somatostatin and has a strong action. It is possible.
  • GH growth hormone
  • Somatostatin analogs containing such octreotide can be used to treat patients with hormone-secreting and hormone-dependent tumors.
  • symptoms associated with metastatic carcinoid tumors, neuroendocrine tumors (flushing, diarrhea, valvular disease and abdominal pain) and symptoms associated with vasoactive intestinal peptide (VIP) secretory adenomas (watery diarrhea) Is treated with octreotide.
  • VIP vasoactive intestinal peptide
  • octreotide inhibits both secretion and action of its active factor.
  • somatostatin analogs can reduce diarrhea by inhibiting VIP secretion and directly affecting intestinal secretion.
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • Octreotide is also used to treat acromegaly, but has been reported to be ineffective in about one third of patients with acromegaly.
  • octreotide is effective only in the initial stage of administration for carcinoid tumor patients, and tachyphylaxis (rapid growth tolerance, rapid growth tolerance) occurs when the administration period is prolonged.
  • octreotide has no effect on the suppression of adrenocorticotropic hormone (ACTH) production in patients with early Cushing's disease.
  • ACTH adrenocorticotropic hormone
  • somatostatin analogs that bind to multiple receptor subtypes with high affinity, such as natural somatostatin, is desired for tumors that express multiple somatostatin receptors.
  • the somatostatin analog having affinity for the somatostatin receptor may have an effect on patients who have no therapeutic effect or have resistance to conventional somatostatin analogs (non- Patent Document 4).
  • a somatostatin analog having a structure similar to that of naturally occurring somatostatin similarly having an affinity for the somatostatin receptor, and having an increased half-life in blood compared to somatostatin. It was.
  • An object of the present invention is to provide a glycosylated polypeptide having affinity for somatostatin receptor and having improved blood stability compared to somatostatin.
  • the present invention (A) SRIF14 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (B) polypeptide in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in SRIF14 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; C) an analog of SRIF14; (D) a polypeptide having 80% or more homology to SRIF14 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; (E) N in (A) to (D) (Where N is an integer of 1 or more and 20 or less) a polypeptide further comprising N amino acids on the N-terminal side; and (F) In (A) to (D), M (where M is 1 or more and 6) A polypeptide further comprising the following integer) amino acids on the C-terminal
  • the amino acid substituted with the glycosylated amino acid is an amino acid corresponding to position 19 in SRIF14.
  • the glycosylated polypeptide is such that at least one amino acid in the polypeptide of (E) is substituted with a glycosylated amino acid, The at least one amino acid substituted with the glycosylated amino acid is present in any one of the N amino acids on the N-terminal side of the polypeptide of (E).
  • the glycosylated polypeptide is such that at least one amino acid in the polypeptide of (F) is substituted with a glycosylated amino acid, The at least one amino acid substituted with the glycosylated amino acid is present in any one of the M amino acids on the C-terminal side of the polypeptide (F).
  • the glycosylated polypeptide is such that at least one amino acid in the polypeptide of (E) is substituted with a glycosylated amino acid, ,
  • the sequence of the N amino acids added to the N-terminal side is represented by XY-, where X is a sequence of L amino acids (where L is an integer from 1 to 6)
  • Y is (1) Lys, (2) Arg-Lys, (3) Glu-Arg-Lys, (4) Arg-Glu-Arg-Lys, (5) Pro-Arg-Glu- Arg-Lys, (6) Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (7) Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (8) Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu -Lys, (9) Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (10) Asn-Pro-Ala-Met
  • At least one amino acid substituted with the glycosylated amino acid is added to the N-terminal side of the polypeptide of (E). It is characterized in that it is present in any one of L amino acids representing X in XY- representing the amino acid sequence of In one embodiment of the glycosylated polypeptide of the present invention, the N amino acids added to the N-terminal side are linked to the N-terminal side via a linker.
  • SRIF28 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • B SRIF28 consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 1 Or a polypeptide in which several amino acids are deleted, substituted or added
  • C an analog of SRIF28
  • D a homology of 80% or more with SRIF28 comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2
  • E In (E) (A) to (D), a polypeptide further comprising J amino acids (where J is an integer of 1 or more and 6 or less) on the N-terminal side
  • F (A) In (D), a polypeptide further comprising K amino acids (where K is an integer of 1 to 6) on the C-terminal side
  • a polypeptide selected from the group consisting of at least one amino acid is substituted with a glycosylated amino acid and has an affinity for a somato
  • the amino acid substituted with the glycosylated amino acid corresponds to the amino acid corresponding to position 1 in SRIF28, the amino acid corresponding to position 5, and the 9th position. It is at least one amino acid selected from the group consisting of an amino acid, an amino acid corresponding to the 12th position, an amino acid corresponding to the 13th position, an amino acid corresponding to the 14th position, and an amino acid corresponding to the 19th position.
  • the glycosylated polypeptide is such that at least one amino acid in the polypeptide of (E) is substituted with a glycosylated amino acid, The at least one amino acid substituted with the glycosylated amino acid is present in any one of the J amino acids on the N-terminal side of the polypeptide of (E).
  • the glycosylated polypeptide is such that at least one amino acid in the polypeptide of (F) is substituted with a glycosylated amino acid, The at least one amino acid substituted with the glycosylated amino acid is present in any one of the K amino acids on the C-terminal side of the polypeptide (F).
  • the affinity for the somatostatin receptor is at least two or more of receptors selected from the group consisting of SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, and SSTR5. It has an affinity for the receptor.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has an affinity for at least one of SSTR1 and SSTR4. In one embodiment of the glycosylated polypeptide of the present invention, the glycosylated polypeptide has an affinity for both SSTR1 and SSTR4.
  • the glycosylated polypeptide has an affinity for all of SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, and SSTR5. . In one embodiment of the glycosylated polypeptide of the present invention, the glycosylated polypeptide has an increased blood stability compared to SRIF28. In one embodiment of the glycosylated polypeptide of the present invention, each glycosylated amino acid is glycosylated Asn or glycosylated Cys.
  • each of the glycosylated amino acids is characterized in that the sugar chain and the amino acid are bound via a linker.
  • each glycosylated amino acid is characterized in that the sugar chain is composed of 4 or more sugars.
  • the sugar chain in each of the glycosylated amino acids, is a double-stranded complex type sugar chain, a triple-stranded complex type sugar chain, or a four-chain complex type. It is a sugar chain.
  • each of the glycosylated amino acids is characterized in that the sugar chain is a double-stranded complex type sugar chain.
  • the double-stranded complex type sugar chain is a group consisting of a disialo sugar chain, a monosialo sugar chain, an asialo sugar chain, a diglucnac sugar chain, and a dimannose sugar chain. It is characterized by being a sugar chain selected from.
  • the sugar chain in each glycosylated amino acid, is represented by the following formula: [Wherein R 1 and R 2 are the same or different, And Ac represents an acetyl group. ] It is the sugar chain represented by these.
  • the sugar chain has at least one sialic acid at the non-reducing end, and the carboxy group of the sialic acid has 1 to 30 carbon atoms. It is modified with an alkylamino group, a benzyl group, an amino group, or an aminoethylamino group.
  • the glycosylated polypeptide has a plurality of glycosylated amino acids, and each of the glycosylated amino acids has any sugar chain. It is characterized by being identical.
  • the glycosylated polypeptide has Cys at position 17 and Cys at position 28 in SRIF28, and these Cys is characterized by being disulfide bonded to each other.
  • the C-terminus of the glycosylated polypeptide is amidated.
  • an azide group is introduced at the N-terminus of the glycosylated polypeptide.
  • the glycosylated polypeptide is labeled.
  • another aspect of the present invention includes (I) a glycosylated polypeptide as described above and / or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and (II) a pharmaceutically acceptable carrier. It is related with the pharmaceutical composition characterized by these. Moreover, in one embodiment of the pharmaceutical composition of the present invention, the sugar chain is substantially uniform in the glycosylated polypeptide. In one embodiment of the pharmaceutical composition of the present invention, the pharmaceutical composition is used for treatment or prevention of a disease related to somatostatin.
  • the somatostatin-related disease is acromegaly, giantism, Alzheimer's disease and other forms of dementia, cancer, hormone-producing tumor, endocrine tumor, carcinoid , VIPoma, insulinoma, glucagonoma, Cushing's disease, hormonal secretion disorder, diabetes and its complications, pain, arthritis, diarrhea, gastric ulcer, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, gastrointestinal obstruction, ileus, postoperative restenosis, It is characterized by being at least one disease selected from the group consisting of radiation injury, eye disease, dry eye, glaucoma, corneal inflammation, ulceris, cataract, and conjunctivitis.
  • the somatostatin-related disease is acromegaly, giantism, Alzheimer's disease and other forms of dementia, cancer, hormone-producing tumor, endocrine tumor, Carcinoid, VIP Oma, insulinoma, glucagonoma, Cushing's disease, hormonal secretion disorder, diabetes and its complications, pain, arthritis, diarrhea, gastric ulcer, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, gastrointestinal obstruction, ileus, postoperative restenosis And at least one disease selected from the group consisting of radiation injury, eye disease, dry eye, glaucoma, inflammation of the corneal stroma, ulceris, cataract, and conjunctivitis.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has affinity for somatostatin receptor and has improved blood stability compared to somatostatin.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has the above characteristics, and can be used for the treatment of somatostatin related diseases.
  • the sugar chain added to the sugar chain-added somatostatin of the present invention is easily decomposed in the living body, its accumulation does not cause phytotoxicity to the living body.
  • a part or all of the sugar chain added to the sugar chain-added somatostatin of the present invention is a sugar chain existing in a living body such as a mammal bird including humans or a modified body thereof, and even if administered in the body, it has a side effect. And is less likely to show antigenicity. There are few concerns about allergic reactions, antibody production, and inability to obtain medicinal effects.
  • FIG. 1A to FIG. 1D are diagrams showing each compound name and the amino acid sequence information of the glycosylated polypeptide having the compound name for the glycosylated polypeptide in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 1E shows the IC 50 for cAMP production inhibitory action (agonist activity) when SRIF14, SRIF28, and the glycosylated polypeptide of one embodiment of the present invention were treated in somatostatin receptor-expressing cells. It is a graph which shows a value.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when SRIF28 and S1C (disialo) -SRIF28 are intravenously or subcutaneously administered to rats.
  • S1C disialo
  • FIG. 2 shows changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously, and the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously.
  • FIG. 3 shows changes in plasma concentrations of SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, N5C (disialo) -SRIF28, and S1C (disialo) / N5C (disialo) -SRIF28 administered to rats intravenously and subcutaneously. It is a graph which shows. In FIG.
  • FIG. 4 shows intravenous and subcutaneous administration of SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo), R13C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo), N5C (disialo), A9C (disialo) -SRIF28 to rats. It is a graph which shows transition of the density
  • concentration in plasma at the time of doing.
  • FIG. 5 shows S1C (disialo) -SRIF28, N5C (disialo) -SRIF28, A9C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo) ⁇ N5C (disialo) -SRIF28, N5C (disialo) ⁇ A9C (disialo, SRIF28SSR 2 is a graph showing changes in plasma concentration when (disialo) ⁇ N5C (disialo) ⁇ A9C (disialo) -SRIF28 was administered intravenously and subcutaneously to rats.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in plasma concentrations when S1C (disialo) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, and S1-3C (disialo) -SRIF28 were administered intravenously and subcutaneously to rats. It is.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 7 shows changes in plasma concentrations of S1C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo (amide))-SRIF28, and S1C (disialo (aminoethylamide))-SRIF28 in rats after intravenous and subcutaneous administration. It is a graph to show.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 8 shows changes in plasma concentrations of S1C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo) -D-Trp22-SRIF28, and S1C (disialo (Bn))-SRIF28 administered intravenously and subcutaneously to rats. It is a graph which shows. In FIG. 8, the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously, and the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is. FIG.
  • FIG. 9 is a graph showing changes in plasma concentration when S1C (disialo) -SRIF28, R13C (disialo) -SRIF28, and K14C (disialo) -SRIF28 are intravenously and subcutaneously administered to rats.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 10 shows S1C (disialo) -SRIF28, E12C (disialo) -SRIF28, N19C (disialo) -SRIF28, 29C (disialo) -SRIF28, S1C (monosialo) -SRIF28, S1C (asialo) -SRIF28 intravenously It is a graph which shows transition of the density
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 10 shows S1C (disialo) -SRIF28, E12C (disialo) -SRIF28, N19C (disialo) -SRIF28, 29C (disialo) -SRIF28, S1C (monosi
  • FIG. 11 is a graph showing changes in plasma concentrations when S1C (disialo) -SRIF28, K14C (disialo) -SRIF28, and C (disialo) -SRIF14 are intravenously and subcutaneously administered to rats.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 12 is a graph showing changes in plasma concentrations of C (disialo) -SRIF14, C (disialo) -C12linker-SRIF14, and C (disialo) -PEGlinker-SRIF14 administered intravenously and subcutaneously to rats. It is.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 12 is a graph showing changes in plasma concentrations of C (disialo) -SRIF14, C (disialo) -C12linker-SRIF14, and C (disialo) -PEGlinker-SRIF14 administered intravenously and subcutaneously to rats. It is.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each
  • FIG. 13 shows that SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1C (asialo) -SRIF28, S1C (diGlcNAc) -SRIF28, S1C (diMan) -SRIF28, S1C (GlcNAc) -SRIF28 were administered intravenously and subcutaneously to rats. It is a graph which shows transition of the density
  • FIG. 13 shows that SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1C (asialo) -SRIF28, S1C (diGlcNAc) -SRIF28, S1C (diMan) -SRIF28, S1C (GlcNA
  • FIG. 14 shows intravenous and subcutaneous administration to S1C (disialo) -SRIF28, S1C (trisialo) -SRIF28, S1C (tetrasial) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, S1C (Asn (disialo))-SRIF28 rats.
  • It is a graph which shows transition of the density
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 14 shows intravenous and subcutaneous administration to S1C (disialo) -SRIF28, S1C (trisialo) -SRIF28, S1C (tetrasial) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, S1C (
  • FIG. 15 shows that SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, S1-3C (disialo) -SRIF28, S1-4C (disialo) -SRIF28 were administered intravenously and subcutaneously to rats. It is a graph which shows transition of the density
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 15 shows that SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, S1-3C (disialo) -SRIF28, S1-4C (disialo) -SRIF28 were administered intravenously and subcutaneously to rats. It is a graph which shows transition of the density
  • FIG. 16 shows SRIF14, C (disialo) -SRIF14, C (disialo) -K-SRIF14, C (disialo) -RK-SRIF14, 2C (disialo) -RK-SRIF14, 3C (disialo) -R -Is a graph showing changes in plasma concentration when K-SRIF14 was administered intravenously and subcutaneously to rats.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 17 is a graph showing changes in plasma concentrations when S1C (asialo) -SRIF28, S1-2C (asialo) -SRIF28, and S1-3C (asialo) -SRIF28 were intravenously and subcutaneously administered to rats. It is.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 18 shows S1C (disialo) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, S1-2C (asialo) -SRIF28, S1-2C (disialo (amide))-SRIF28, S1-2C (disialo (Bn)) -SRIF28, C (disialo (aminoethylamide))-S1C (disialo) -SRIF28 is a graph showing changes in plasma concentration when administered intravenously and subcutaneously to rats.
  • the left graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered intravenously
  • the right graph is a graph showing changes in plasma concentration of each polypeptide when administered subcutaneously. It is.
  • FIG. 19 is a graph showing the results of a plasma stability test using rat plasma for a glycosylated polypeptide according to one embodiment of the present invention.
  • somatostatin refers to SRIF14 consisting of a 14 amino acid sequence or SRIF28 consisting of a 28 amino acid sequence.
  • the N-terminal Ser in the amino acid sequence of SRIF28 is defined as position 1
  • the C-terminal Cys is defined as position 28.
  • SRIF14 completely coincides with the amino acid sequence at positions 15 to 28 in the amino acid sequence of SRIF28.
  • the 15th position of the amino acid sequence of SRIF28 is Ala
  • the N-terminal Ala in the amino acid sequence of SRIF14 corresponds to the 15th position of SRIF28 and becomes the 15th position.
  • SRIF14 and SRIF28 have a disulfide bond at Cys at position 17 and Cys at position 28.
  • SRIF14 has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 1).
  • Ala 15 ” 15 means Ala at position 15.
  • SRIF28 has the following amino acid sequence (SEQ ID NO: 2). Ser 1 -Ala 2 -Asn 3 -Ser 4 -Asn 5 -Pro 6 -Ala 7 -Met 8 -Ala 9 -Pro 10 -Arg 11 -Glu 12 -Arg 13 -Lys 14 -Ala 15 -Gly 16 -Cys 17 -Lys 18 -Asn 19 -Phe 20 -Phe 21 -Trp 22 -Lys 23 -Thr 24 -Phe 25 -Thr 26 -Ser 27 -Cys 28
  • amino acid is used in its broadest sense and includes not only natural amino acids but also non-natural amino acids such as amino acid variants and derivatives.
  • amino acids herein, for example, natural proteogenic L-amino acids; D-amino acids; chemically modified amino acids such as amino acid variants and derivatives; norleucine, It will be understood that natural non-proteogenic amino acids such as ⁇ -alanine, ornithine; and chemically synthesized compounds having properties known in the art that are characteristic of amino acids, and the like.
  • unnatural amino acids examples include ⁇ -methyl amino acids (such as ⁇ -methylalanine), D-amino acids, histidine-like amino acids (2-amino-histidine, ⁇ -hydroxy-histidine, homohistidine, ⁇ -fluoromethyl-histidine and ⁇ -Methyl-histidine, etc.), amino acids with extra methylene in the side chain (“homo" amino acids) and amino acids in which the carboxylic acid functional amino acids in the side chain are substituted with sulfonic acid groups (such as cysteic acid).
  • somatostatin analogs that have affinity for the somatostatin receptor are known to contain unnatural amino acids.
  • the amino acid contained in the compound of the present invention consists only of natural amino acids.
  • the number of substituted amino acids is not particularly limited as long as the affinity for the somatostatin receptor is maintained. 1 to 9, preferably 1 to 5, more preferably about 1 to 3, or within 20%, preferably within 10% of the total length.
  • the amino acid to be substituted or added can be a natural amino acid, a non-natural amino acid or an amino acid analog, preferably a natural amino acid.
  • somatostatin peptides in which one or several amino acids are deleted, substituted, or added include, for example, somatostatin peptide in which Trp at position 22 is replaced with D-form Trp (D-Trp), Asn at position 19 (J. Med. Chem, 2001, 44, 2238-2246), Phe at position 25 replaced with Tyr, Met at position 8 replaced with Leu (Endocrinology, 1982, 10: 1049-1051) and the like.
  • an analog of SRIF14 or SRIF28 refers to a polypeptide structurally similar to somatostatin and / or a polypeptide having a structure overlapping with somatostatin, for example, one or several amino acids of somatostatin amino acids. Substituted polypeptides, somatostatin variants, fragments of somatostatin with affinity for somatostatin receptors, extended somatostatin with affinity for somatostatin receptors.
  • one or several amino acids of an amino acid are conservatively substituted means that the hydrophilicity index and / or the hydrophobicity index of an amino acid substituted with the original amino acid in amino acid substitution is Similar substitutions that refer to substitutions that do not cause a clear decrease or loss of affinity for the somatostatin receptor before and after such substitutions.
  • somatostatin variant refers to a variant of somatostatin, which includes a naturally occurring variant of somatostatin, or a compound obtained by artificially modifying somatostatin.
  • alkylation e.g acetylation
  • acylation e.g acetylation
  • amidation carboxylation
  • ester formation e.g., glutathione
  • disulfide bond formation e.g., glutasylation
  • glycosylation lipidation
  • phosphorylation e.g., hydroxylation
  • labeling of one or more amino acid residues of somatostatin include binding of components.
  • a fragment of somatostatin having affinity for a somatostatin receptor means that one or more amino acids are deleted from the N-terminal and / or C-terminal of somatostatin, and the affinity for somatostatin receptor. It is a peptide that maintains sex.
  • extended somatostatin having affinity for somatostatin receptor means that one or more amino acids are added to the N-terminal and / or C-terminal of SRIF28 or SRIF14, and affinity for somatostatin receptor. It is a peptide that maintains sex.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence having 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and 80% or more homology with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the polypeptide having homology with SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 preferably has a homology of 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more as long as it has affinity for the somatostatin receptor. Can do.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention includes a polypeptide in which an amino acid is further added to the N-terminus and / or C-terminus of SRIF14 or SRIF28.
  • the amino acid further added to the N-terminus of SRIF14 is not particularly limited as long as the affinity for the somatostatin receptor is maintained. For example, 1 to 20 amino acids are added. Can do.
  • the amino acid further added to the N-terminus of SRIF14 can be represented by XY-.
  • Y is an amino acid that directly binds to the N-terminal amino acid in the SRIF14 polypeptide, and Y consists of any of the following amino acid sequences (1) to (15): (1) Lys, (2) Arg-Lys, (3) Glu-Arg-Lys, (4) Arg-Glu-Arg-Lys, (5) Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (6) Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (7) Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (8) Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (9) Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (10) Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (11) Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys, (12) Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met
  • the amino acid further added to the N-terminus of SRIF28 is not particularly limited as long as the affinity for the somatostatin receptor is maintained, but for example, any amino acid of 1 to 6 is added. Any one, two, three, four, five, or six amino acids can be added.
  • the amino acid further added to the N-terminus of SRIF28 is preferably a glycosylated amino acid, more preferably a glycosylated Asn or a glycosylated Cys.
  • all of the arbitrary amino acids of 1-6 can also be made into a glycosylated amino acid.
  • the amino acid further added to the C-terminus of SRIF14 or SRIF28 is not particularly limited as long as the affinity for the somatostatin receptor is maintained.
  • any amino acid of 1 to 6 any one, two, three, four, five, or six amino acids can be added.
  • the amino acid further added to the C-terminus of SRIF14 or SRIF28 is preferably a glycosylated amino acid, more preferably a glycosylated Asn or a glycosylated Cys.
  • all of the arbitrary amino acids of 1-6 can also be made into a glycosylated amino acid.
  • SRIF28 is N-terminal 1
  • An arbitrary amino acid or a glycosylated amino acid is further added to Ser at the position.
  • SRIF14 it refers to an N-terminal 15-position Ala to which any amino acid or glycosylated amino acid has been added.
  • any amino acid or sugar chain is added to Cys at position 28 of SRIF28 or SRIF14. This refers to the addition of an additional amino acid.
  • an amino acid can be further added to the N-terminus or C-terminus via a linker.
  • a linker include an alkyl chain and a polyethylene glycol chain having an amino group and a carboxy group at both ends so that an amino acid and a peptide can be bonded.
  • Such a linker is, for example, —NH— (CH 2 ) n —CO— (wherein n is an integer and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably 1 Represents an integer of ⁇ 15) or —NH— (CH 2 CH 2 O) m —CH 2 CH 2 —CO— (wherein m is an integer and is limited as long as the desired linker function is not inhibited) Although it is not a thing, Preferably it shows the integer of 1-7.) Etc. can be mentioned.
  • —NH— (CH 2 ) 11 —CO— (C12 linker), —NH— (CH 2 CH 2 O) 3 —CH 2 CH 2 —CO— (PEG linker), and the like can be given.
  • the amino acid added to the glycosylated polypeptide via the linker is not particularly limited, but is preferably a glycosylated amino acid.
  • examples of the sugar chain-added amino acid include sugar chain-added Asn and sugar chain-added Cys.
  • an azide group can also be introduced into the N-terminus of the glycosylated polypeptide.
  • the N-terminus of the glycosylated polypeptide is azylated, it is preferable because various molecules can be selectively introduced using an azido-alkyne [3 + 2] cycloaddition reaction or Staudinger reaction.
  • the method for azating a glycosylated polypeptide is not particularly limited, but for example, by condensing an azide-substituted fatty acid with a condensing agent to the N-terminus of a glycopeptide synthesized on a resin during solid phase synthesis. Obtainable.
  • the azide-substituted fatty acid include 4-azidobutanoic acid, 5-azido-pentanoic acid, and 6-azidohexanoic acid.
  • the glycosylated polypeptide can be added with a labeling compound at its N-terminus.
  • the labeling compound used in the present invention include, but are not limited to, biotin, fluorescent dyes, metal ion chelating agents, and the like.
  • the labeling compound can be directly bonded to the N-terminus of the glycopeptide, or can be bonded to the N-terminus of the glycopeptide via a linker.
  • biotin as a labeling compound to the N-terminus of a glycopeptide, it can be applied to research reagents, clinical diagnostics, or missile therapy using a strong bond with avidin. .
  • the labeling compound can be added to the glycosylated polypeptide of the present invention by methods well known to those skilled in the art.
  • the labeling compound can be condensed using a condensing agent at the N-terminus of the glycosylated polypeptide on the resin during solid phase synthesis.
  • the “glycosylated polypeptide” of the present invention is characterized in that at least one amino acid is substituted with a glycosylated amino acid.
  • the “glycosylated polypeptide” includes a polypeptide in which at least one amino acid of somatostatin is substituted with a glycosylated amino acid, and at least one amino acid in the above somatostatin analog is a glycosylated amino acid.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention even if one or several amino acids other than the glycosylated amino acid are deleted, substituted or added, respectively. It is.
  • Peptides in which the C-terminus of these peptides is amidated eg, Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH 2 (SEQ ID NO: 3)
  • SRIF14NH 2 having the amino acid sequence of Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe
  • a peptide in which at least one amino acid of SRIF28NH 2 having the amino acid sequence of -Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH 2 (SEQ ID NO: 4) is substituted with a glycosylated amino acid is also included in the present invention
  • the salts of these peptides are also included in Included in the chain
  • the salt may be either an acid addition salt or a base addition salt.
  • Acids commonly used to form acid addition salts include inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, hydroiodic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and p-toluenesulfonic acid, methanesulfonic acid, oxalic acid, p- Organic acids such as bromophenyl sulfonic acid, carboxylic acid, succinic acid, citric acid, benzoic acid and acetic acid.
  • Base addition salts include ammonium hydroxide or salts derived from inorganic bases such as alkali or alkaline earth metal hydroxides, carbonates, bicarbonates and the like. In particular, a pharmaceutically acceptable salt is preferable.
  • the “glycosylated amino acid” is an amino acid to which a sugar chain is bound, and the sugar chain and the amino acid may be bound via a linker.
  • the amino acid is bound to the reducing end of the sugar chain.
  • the type of amino acid to which the sugar chain is bound and either a natural amino acid or a non-natural amino acid can be used.
  • the glycosylated amino acid has the same or similar structure as that present as a glycopeptide (glycoprotein) in the living body
  • the glycosylated amino acid is a glycosylated Asn such as an N-linked sugar chain.
  • Glycosylated Ser such as O-linked sugar chain and glycosylated Thr are preferable, and glycosylated Asn is particularly preferable.
  • the amino acid of the sugar chain-added amino acid has two or more amino acids in the molecule such as aspartic acid and glutamic acid.
  • Amino acids with carboxy groups, lysine, arginine, histidine, tryptophan, etc. amino acids with two or more amino groups, serine, threonine, tyrosine, etc.
  • amino acids having an amide group in the molecule such as asparagine and glutamine.
  • aspartic acid, glutamic acid, lysine, arginine, serine, threonine, cysteine, asparagine, and glutamine are preferable.
  • the glycosylated amino acid is a sugar chain. It is considered that there is no significant difference in the half-life in blood of the glycosylated polypeptide of the present invention between the case of added Asn (not via a linker) and the case of glycosylated Cys (via a linker).
  • a sugar chain and an amino acid are bonded via a linker
  • those used in the art can be widely used.
  • a is an integer and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably represents an integer of 0 to 4
  • C 1-10 polymethylene —CH 2 —R—, wherein R is alkyl, substituted alkyl, alkenyl, substituted alkenyl, alkynyl, substituted alkynyl, aryl, substituted aryl, carbocyclic group, substituted carbocycle A group formed by elimination of one hydrogen atom from a group selected from the group consisting of a group, a heterocyclic group and a substituted heterocyclic group), — (CO) — (CH 2 ) a — (CO) — (formula A is an integer, and is not limited as long as the desired linker
  • the linker when the sugar chain and the amino acid on the somatostatin skeleton are bonded via a linker, the linker preferably includes an amino acid at the sugar chain side end.
  • the type of amino acid is not particularly limited, but a preferred example is Asn.
  • the production method of the glycosylated polypeptide of the present invention is not limited by the description (for example, “description of a glycosylated polypeptide in which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid”).
  • the glycosylated polypeptide produced by any of the methods A or B is included in the “glycosylated polypeptide in which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid”.
  • a glycosylated polypeptide in which a sugar chain to which no amino acid is bonded is bound to an amino acid on a peptide directly or via a linker; in a glycosylated polypeptide, a sugar or a sugar chain is further added to the added sugar chain
  • a glycosylated polypeptide obtained by extending a sugar chain that has already been added by adding 1 or several amino acids to the amino group and / or carboxy group of the glycosylated amino acid, and Glycosylated polypeptides linked to multiple somatostatin fragments; Glycosylated polypeptides in which an amino acid-linked sugar chain is linked to an amino acid on the peptide via a linker, etc. also have the same final structure. As long as it is included in the glycosylated polypeptide of the present invention.
  • the number of amino acids substituted with a glycosylated amino acid is present in the final glycosylated polypeptide, physiological activity such as blood stability and suppression of secretion of growth hormone, etc. What is necessary is just to adjust suitably according to the number of amino acids, the molecular weight of the glycosylated polypeptide before and after glycosylation, and the like.
  • 1 to 10 are preferably substituted, 1 to 5 are more preferably substituted, and 1 to 3 are more preferably substituted. From the viewpoint of simplicity, it is preferable to select one substitution if the desired activity can be obtained with one substitution.
  • two or more are preferably substituted, for example, 2 to 5 are preferably substituted, and 2 to 3 are more preferably substituted.
  • 2 to 5 are preferably substituted
  • 2 to 3 are more preferably substituted.
  • a glycosylated polypeptide in which one amino acid of somatostatin is substituted with a glycosylated amino acid when one or more amino acids other than the glycosylated amino acid are further substituted with a glycosylated amino acid, stability in blood Tends to increase and the affinity for the receptor tends to decrease.
  • the glycosylated polypeptide has increased blood stability, which can compensate or increase the decreased somatostatin activity.
  • the sugar chains can be added to consecutive amino acids in the amino acid sequence of the glycosylated polypeptide or added to the amino acids at intervals. You can also It is preferable to arrange sugar chains densely in that there is no sudden increase in plasma concentration. Further, from the viewpoint of bioavailability, it is preferable to add a plurality of sugar chains at intervals rather than densely adding consecutive sugar chains to the position where sugar chains are added.
  • the site where an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid can be appropriately adjusted, particularly from the viewpoint of affinity for a plurality of somatostatin receptors.
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid has affinity for a plurality of SSTR1 to SSTR5 receptors among the affinity of a glycosylated polypeptide for a somatostatin receptor.
  • the amino acid corresponding to position 19 in SRIF14 the amino acid further added to the N-terminal side of SRIF14, the first, second, third, sixth, tenth, and fourteenth positions from the N-terminal side
  • amino acids that are further added to the N-terminal side of SRIF14 include the third, sixth, tenth, and fourteenth amino acids from the N-terminal side.
  • amino acids that are added first and second from the C-terminal side among the amino acids further added to the C-terminus of SRIF28 Preferably, amino acids corresponding to positions 1, 5, 9, and 12 of SRIF28 can be mentioned.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has affinity for a plurality of somatostatin receptors
  • the amino acid further added to the N-terminal side of SRIF14 the amino acid added to the 10th and 14th positions from the N-terminal side
  • the amino acid further added to the N-terminal side of SRIF14 added to the 6th and 10th positions from the N-terminal side
  • An amino acid further added to the N-terminal side of SRIF14 an amino acid added to the second and 14th positions from the N-terminal side
  • 15th amino acid added; further to the N-terminal side of SRIF14 Amino acids added at the 14th, 15th and 16th positions from the N-terminal
  • the amino acid added to the 10th and 14th positions from the N-terminal side in the amino acid further added to the N-terminal side of SRIF14, the amino acid added to the 10th and 14th positions from the N-terminal side; in the amino acid further added to the N-terminal side of SRIF14, the 6th and 10th positions from the N-terminal side Amino acids added to the N-terminal side of SRIF14, amino acids added to the 14th and 15th positions from the N-terminal side; amino acids further added to the N-terminal side of SRIF14, 14 amino acids from the N-terminal side Amino acids added to the Nth, 15th, and 16th amino acids; substitution of amino acids added to the 6th, 10th, and 14th amino acids from the N-terminal side of SRIF14 Can do.
  • amino acids corresponding to position 5 amino acid corresponding to positions 5 and 9; amino acid corresponding to positions 1 and 13; amino acid corresponding to position 1 and amino acids further added to the N-terminal side of position 1 from the N-terminal side
  • Examples include substitution of amino acids corresponding to the 9th position, preferably substitution of amino acids corresponding to the 1st and 5th positions; substitution of amino acids corresponding to the 5th and 9th positions; Substitution of the corresponding amino acid and the first amino acid added in the amino acid further added to the N-terminal side of the 1st position; 1 amino acid from the N-terminal side in the amino acid corresponding to
  • the site at which an amino acid is substituted with a glycosylated amino acid is, for example, an amino acid corresponding to position 19 in SRIF14, or the N-terminus of SRIF14 from the viewpoint of blood stability of the glycosylated polypeptide.
  • the amino acids to be added the first, second, third, sixth, tenth and fourteenth amino acids added from the N-terminal side, and the additional amino acids added to the C-terminal side of SRIF14 are 1 from the C-terminal side.
  • the amino acid added to the 2nd and 2nd can be mentioned.
  • amino acids to be added are the first and second amino acids from the C-terminal side. More preferably, an amino acid corresponding to position 19 in SRIF14, an amino acid added first from the N-terminal side among amino acids further added to the N-terminal side of SRIF14, and an amino acid further added to the C-terminal side of SRIF14 Is the first amino acid added from the C-terminal side.
  • the glycosylated polypeptide corresponds to the 1st, 5th, 9th, 12th, 13th, 14th, and 19th positions in SRIF28.
  • amino acid corresponding to a specific amino acid refers to an amino acid at the same position corresponding to the amino acid sequence of SRIF14 or SRIF28 unless an amino acid is added or deleted in the sugar chain polypeptide.
  • amino acid addition or deletion when an amino acid addition or deletion is present in the amino acid sequence of the sugar chain polypeptide, it means an amino acid at a position that takes into account movement on the amino acid sequence due to the addition or deletion of the amino acid.
  • one amino acid (Trp) is added between the 2nd and 3rd amino acids.
  • the amino acid corresponding to the amino acid at position 3 is an amino acid that has moved one by one to the C-terminal side due to the insertion of Trp in the glycosylated polypeptide. (Asn).
  • the amino acid substituted with a glycosylated amino acid is one or more amino acids selected from amino acids other than the amino acids corresponding to positions 17, 21, 22, 23, and 28 in SRIF28
  • one or more amino acids selected from amino acids other than the amino acids corresponding to positions 17, 22, 23, and 28 in SRIF28 are more preferable.
  • any combination of the above can be adopted as the site where amino acids are substituted with glycosylated amino acids. It is not limited. For example, a combination in which one site is selected from the above preferred sites and the other site is selected from any site of SRIF14 or SRIF28; one site is selected from the above preferred sites and the other site is N of somatostatin Combinations selected from the terminal (position 1 in SRIF28 or position 15 in SRIF14) or any part of one or several amino acids further added to the C-terminal are also included in a preferred embodiment of the present invention. .
  • the site where deletion, substitution or addition of amino acids other than glycosylated amino acids occurs is, for example, from amino acids other than the amino acids corresponding to positions 17, 22, 23, and 28 in SRIF28.
  • One or more selected amino acids are preferred.
  • sugar chain refers to a compound in which one or more unit sugars (monosaccharides and / or derivatives thereof) are linked. When two or more unit sugars are connected, each unit sugar is bound by dehydration condensation by a glycosidic bond.
  • sugar chains include monosaccharides and polysaccharides (glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc), sialic acid contained in the living body.
  • sugar chains that are decomposed or derived from complex biomolecules such as degraded polysaccharides, glycoproteins, proteoglycans, glycosaminoglycans, glycolipids, etc. It is not limited to.
  • the sugar chain may be linear or branched.
  • sugar chain also includes sugar chain derivatives.
  • sugar chain derivatives include sugars having a carboxy group (for example, C-1 Oxidized aldonic acid converted to carboxylic acid (for example, D-gluconic acid oxidized D-glucose), uronic acid whose terminal C atom became carboxylic acid (D-glucose oxidized D-glucose) Glucuronic acid)), sugars having amino groups or derivatives of amino groups (eg acetylated amino groups) (eg N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-D-galactosamine etc.), amino groups and carboxy Sugars having both groups (eg, N-acetylneuraminic acid (sialic acid), N-acetylmuramic acid, etc.), deoxygenated sugars (eg, 2-deoxy-D-ribo Scan), sulfated sugar including a sulfuric acid group, including but sugar chains are such
  • a preferred sugar chain when added to somatostatin (when substituted with an amino acid of somatostatin in the form of a glycosylated amino acid), the blood stability of somatostatin is increased and the somatostatin receptor is added. It is a sugar chain that does not lose affinity.
  • a preferred sugar chain is a sugar that can maintain the affinity of somatostatin for multiple receptors when added to somatostatin (when substituted with an amino acid of somatostatin in the form of a glycosylated amino acid). More preferably, it is a sugar chain that can maintain affinity for all receptors of somatostatin.
  • the sugar chain in the glycosylated polypeptide of the present invention is not particularly limited, and may be a sugar chain that exists as a complex carbohydrate (glycopeptide (or glycoprotein), proteoglycan, glycolipid, etc.) in vivo, It may be a sugar chain that does not exist as a complex carbohydrate in vivo.
  • a sugar chain that exists as a complex carbohydrate in a living body is preferable from the viewpoint that the glycosylated polypeptide of the present invention is administered to a living body.
  • sugar chains include N-linked sugar chains and O-linked sugar chains that are sugar chains bound to peptides (or proteins) as glycopeptides (or glycoproteins) in vivo.
  • an N-linked sugar chain is used.
  • the N-linked sugar chain include a high mannose type, a complex type, and a hybrid type, and a complex type is particularly preferable.
  • Preferred complex type sugar chains used in the present invention include, for example, the following general formula [Wherein R 1 and R 2 are the same or different, Indicates. Ac represents an acetyl group. ] And the like.
  • the sugar chain in the glycosylated polypeptide of the present invention, even if the sugar chain exists as a complex carbohydrate in vivo, it binds to the somatostatin peptide by a method other than the O-linked type and the N-linked type. It may be.
  • those having a sugar chain bonded to Cys or Lys via a linker are also included in the glycosylated polypeptide of the present invention.
  • the sugar chain in the glycosylated polypeptide of the present invention is a sugar chain composed of 4 or more, for example, 5 or more, 7 or more, particularly 9 or more, 11 or more sugars. Is preferred.
  • the sugar chain in the glycosylated polypeptide of the present invention is a sugar chain composed of 5 to 11, 9 to 11, or 11 sugars.
  • the sugar chain in the glycosylated polypeptide of the present invention is a double-chain complex type sugar chain.
  • the complex-type sugar chain includes two or more types of monosaccharides, and has a basic structure shown below and a lactosamine structure represented by Gal ⁇ 1-4GlcNAc.
  • the double-stranded complex type sugar chain refers to one in which a single-chain sugar chain composed of 0 to 3 sugars is bonded to two mannoses at the end of the basic structure.
  • the complex sugar chain of the present invention includes the above-described double-chain complex sugar chain, a three-chain complex sugar chain (three-branch complex sugar chain), and a four-chain complex sugar chain. (4-branch complex type sugar chain) is also included.
  • examples of the three-chain complex sugar chain and the four-chain complex sugar chain also include sugar chains that have lost one or more sugars from the non-reducing end of these trisialo sugar chains or tetrasialo sugar chains.
  • the complex type sugar chain of the present invention includes those with fucose.
  • a fucose-containing complex type sugar chain represented by the following structural formula: Can be mentioned.
  • sugar chains in which one or more sugars have been lost from the non-reducing end of these fucose-containing complex sugar chains can also be mentioned.
  • “disialo sugar chain”, “monosialo sugar chain”, “asialo sugar chain”, “diglucnac sugar chain”, “dimannose sugar chain”, “double-stranded complex sugar chain”, “three” “Chain complex type sugar chain”, “Four chain complex type sugar chain” and “Fucose-containing complex type sugar chain” include those shown in the above chemical formula, and those having different binding modes from the examples shown in the chemical formula.
  • Such a sugar chain is also preferably used as the sugar chain of the present invention.
  • Examples of such sugar chains include those in which sialic acid and galactose are bonded by an ( ⁇ 2 ⁇ 3) bond in a dicialosaccharide chain or a monosialosugar chain.
  • a sugar chain in which the carboxy group of sialic acid is modified can also be used.
  • the modification of the carboxy group of sialic acid is preferably a group capable of eliminating the negative charge of the carboxy group or converting it to a positive charge, such as an alkylamino group having 1 to 30 carbon atoms, a benzyl group, an amino group And aminoethylamino group.
  • the negative charge of the carboxyl group of sialic acid is eliminated (benzyl group, amino group, etc.) or converted to a positive charge (aminoethylamino group, etc.), so that the glycosylated polypeptide Can be intended for control of blood clearance and body distribution.
  • the high mannose type sugar chain used in the present invention is a sugar chain in which two or more mannoses are further bonded to the basic structure of the complex type sugar chain described above. Since the high mannose type sugar chain is bulky, the stability in blood can be increased by binding the high mannose type sugar chain to the peptide.
  • a sugar chain containing 5 to 9 mannose is preferable like a mammalian high mannose sugar chain, but a sugar chain containing more mannose may be used like a high mannose sugar chain of yeast.
  • a high mannose type sugar chain preferably used in the present invention, for example, Highman North-5 (M-5) Highman North-9 (M-9) Etc.
  • preferable sugar chains include, for example, sugar chains existing as glycoproteins bound to proteins in the human body (for example, sugar chains described in “FEBS LETTERS Vol. 50, No. 3, Feb. 1975”). ) And a sugar chain having the same structure (a sugar chain having the same kind of constituent sugars and their coupling mode) or a sugar chain that has lost one or more sugars from the non-reducing end thereof. Examples include sugar chains.
  • the sugar chain structures of the glycosylated amino acids in the glycosylated polypeptide of the present invention can be substantially the same or have different sugar chain structures. Also good.
  • the sugar chain structure in the glycosylated polypeptide is substantially the same, for example, it is preferably 90% or more, or 99% or more, and the sugar chain structure is completely the same. Is most preferred.
  • the same sugar chain structure in a glycopeptide means that in a glycosylated polypeptide to which two or more sugar chains are added, the sugar chain is compared when the sugar chains are compared.
  • the sugar chain of the glycosylated polypeptide of the present invention is preferably uniform.
  • the sugar chain in the glycosylated polypeptide is uniform means that the sugar chain is compared between the glycosylated polypeptides, the sugar chain addition site in the peptide, and the type of each sugar constituting the sugar chain. That the order of linkage and the linkage mode between sugars are the same among glycopeptides, and that the structure of the sugar chain is at least 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more.
  • a composition containing a glycopeptide having a uniform sugar chain among glycopeptides has a constant quality, and is particularly preferable in the fields of pharmaceutical production and assay.
  • the uniform sugar chain ratio can be measured, for example, by a method using HPLC, capillary electrophoresis, NMR, mass spectrometry or the like.
  • glycosylated polypeptides include, for example, glycosylated polypeptides (SEQ ID NOs: 5-37, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 123 to 129, 133 to 135, 138 to 141, 148, 155, 160).
  • amino acid sequence of SRIF14 In Ala 15 -Gly 16 -Cys 17 -Lys 18 -Asn 19 -Phe 20 -Phe 21 -Trp 22 -Lys 23 -Thr 24 -Phe 25 -Thr 26 -Ser 27 -Cys 28 (SEQ ID NO: 1)
  • A60 Glycosylated polypeptide in which dicialoglycosylated Cys is further added to the N-terminal side of Ala at position 15 (Example 17) (SEQ ID NO: 35);
  • A61 Glycosylated polypeptide in which dicialoglycosylated Cys-Arg-Lys- is further added to the N-terminal side of Ala at position 15 (Example 18) (SEQ ID NO: 36);
  • the glycosylated polypeptide of the present invention can be produced by incorporating a glycosylation step into a peptide synthesis method known to those skilled in the art.
  • a method using an enzyme represented by transglutaminase can also be used.
  • a large amount of sugar chain to be added is required, and purification after the final step becomes complicated.
  • problems such as restrictions on the position of the chain and the sugar chain that can be added, it can be used for small-scale synthesis for assays and the like, but it is practical for large-scale production such as pharmaceutical production. It may not be a method.
  • Method B A method in which the prepared peptide is produced according to a known peptide synthesis method and then a sugar chain is added to Cys by chemical synthesis to produce a glycosylated polypeptide.
  • these A method and B method can be performed in combination of two or more.
  • a sugar chain elongation reaction by a transferase with the above method.
  • the method A is described in International Publication No. 2004/005330 pamphlet (US2005222382 (A1))
  • the method B is described in International Publication No. 2005/010053 pamphlet (US2007060543 (A1)).
  • International Publication No. 03/008431 pamphlet US2004181054 (A1)
  • 2004/058884 pamphlet (US2006228784 (A1)). )), International Publication No. 2004/058824 pamphlet (US2006009421 (A1)), International Publication No. 2004/070046 pamphlet (US200620039 (A1)), International Publication No. 2007/011055 pamphlet, and the like. are incorporated herein by reference in their entirety.
  • a glycosylated polypeptide can be produced, for example, by solid phase synthesis using a glycosylated Asn as outlined below.
  • a glycosylated Asn as outlined below.
  • the carboxy group of an amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is bonded to a resin (resin).
  • a resin resin
  • the amino group nitrogen of the amino acid is protected with a fat-soluble protecting group, self-condensation between the amino acids is prevented, and the resin and the amino acid react to form a bond.
  • the fat-soluble protecting group of the obtained reaction product is eliminated to form a free amino group.
  • a sugar chain-added Asn in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is used, and the carboxy group of the asparagine moiety is used. Can be obtained by reacting the hydroxyl group of the resin with the hydroxyl group of the resin.
  • a sugar chain can be added to any position by using sugar chain addition Asn in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group.
  • a sugar in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group instead of an amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group, at least twice If chain-added Asn is used, a peptide having sugar chains added at two or more arbitrary positions can be obtained.
  • the fat-soluble protecting group is removed to form a free amino group, and immediately after that, step (6) is performed to obtain a peptide having a glycosylated Asn at the N-terminus. it can.
  • the resin (resin) is usually a resin (resin) used in solid-phase synthesis, such as 2-chlorotrityl chloride resin functionalized with chlorine (Merck) or functionalized with an amino group.
  • Amino-PEGA resin manufactured by Merck
  • NovaSyn TGT alcohol resin having a hydroxyl group manufactured by Merck
  • Wang resin manufactured by Merck
  • HMPA-PEGA resin manufactured by Merck
  • a linker may be present between the amino-PEGA resin and the amino acid. Examples of such a linker include 4-hydroxymethylphenoxyacetic acid (HMPA), 4- (4-hydroxymethyl-3-methoxyphenoxy).
  • H-Cys (Trt) -Trity NovaPEG resin manufactured by Merck or the like in which the C-terminal amino acid is bonded to the resin in advance can also be used.
  • a Rink-Amide-PEGA resin Merck
  • the C-terminal amino acid of the peptide can be amidated.
  • the bond between the resin and the amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is obtained by esterifying the carboxy group of the amino acid to the resin.
  • the carboxy group of the amino acid is bonded to the resin by an amide bond.
  • 2-chlorotrityl chloride resin is preferable in that it can prevent racemization of Cys at the terminal when the peptide chain is extended in solid phase synthesis.
  • amino acids all amino acids can be used.
  • natural amino acids such as serine (Ser), asparagine (Asn), valine (Val), leucine (Leu), isoleucine (Ile), alanine (Ala), tyrosine (Tyr), glycine (Gly), lysine (Lys), arginine (Arg), histidine (His), aspartic acid (Asp), glutamic acid (Glu), glutamine (Gln), threonine (Thr), cysteine (Cys), Examples include methionine (Met), phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), and proline (Pro).
  • the D form of the natural amino acid can also be used.
  • the fat-soluble protective group examples include carbonate-based or amide groups such as 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) group, t-butyloxycarbonyl (Boc) group, benzyl group, allyl group, allyloxycarbonyl group, and acetyl group.
  • Protecting groups of the system can be mentioned.
  • a fat-soluble protecting group into an amino acid, for example, when introducing an Fmoc group, it can be introduced by adding 9-fluorenylmethyl-N-succinimidyl carbonate and sodium hydrogen carbonate to carry out the reaction. The reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 1 to 5 hours.
  • amino acids protected with a fat-soluble protecting group can also be used as amino acids protected with a fat-soluble protecting group.
  • amino acids protected with a fat-soluble protecting group and having a protecting group introduced in the side chain include, for example, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Asp (OtBu ) -OH, Fmoc-Cys (Acm) -OH, Fmoc-Cys (StBu) -OH, Fmoc-Cys (tBu) -OH, Fmoc-Cys (Trt) -OH, Fmoc-Glu (OtBu) -OH, Fmoc -Gln (Trt) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Lys (Boc) -OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Trp (Boc) -
  • esterification can be carried out by using a base such as diisopropylethylamine (DIPEA), triethylamine, pyridine, 2,4,6-collidine and the like.
  • DIPEA diisopropylethylamine
  • known esterification catalysts such as 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole (MSNT), dicyclohexylcarbodiimide (DCC), diisopropylcarbodiimide (DIC), etc.
  • MSNT 1-mesitylenesulfonyl-3-nitro-1,2,4-triazole
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • DIC diisopropylcarbodiimide
  • the dehydration condensing agent can be used.
  • the use ratio of the amino acid and the dehydration condensing agent is usually 1 to 10 parts by weight, preferably 2 to 5 parts by weight, with respect to 1 part by weight of the former.
  • the esterification reaction is preferably performed, for example, by placing a resin in a solid phase column, washing the resin with a solvent, and then adding an amino acid solution.
  • the cleaning solvent include dimethylformamide (DMF), 2-propanol, dichloromethane, and the like.
  • solvents that dissolve amino acids include dimethyl sulfoxide (DMSO), DMF, dichloromethane, and the like.
  • the esterification reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 minutes to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out, for example, by treatment with a base.
  • a base include piperidine and morpholine.
  • a solvent examples include DMSO, DMF, methanol and the like.
  • amidation reaction between the free amino group and the carboxy group of any amino acid whose amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group is preferably carried out in the presence of an activator and a solvent.
  • activator examples include dicyclohexylcarbodiimide (DCC), 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (WSC / HCl), diphenylphosphoryl azide (DPPA), carbonyldiimidazole (CDI).
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide
  • WSC / HCl 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride
  • DPPA diphenylphosphoryl azide
  • CDI carbonyldiimidazole
  • Diethyl cyanophosphonate (DEPC), benzotriazol-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium (DIPCI), benzotriazol-1-yloxy-trispyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP), 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), Hydroxysuccinimide (HOSu), dimethylaminopyridine (DMAP), 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAt), hydroxyphthalimide (HOP) t), pentafluorophenol (Pfp-OH), 2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU), 1- [bis (dimethyl Amino) methylene] -5-chloro-1H-benzotriazolium 3-oxide hexafluorophosphate (HCTU), O- (7-azabenzotriazol-1-yl)
  • the activator is used in an amount of 1 to 20 equivalents, preferably 1 to 10 equivalents, more preferably 1 to 5 equivalents with respect to any amino acid in which the amino group nitrogen is protected with a fat-soluble protecting group. Is preferred.
  • Examples of the solvent include DMSO, DMF, and dichloromethane.
  • the reaction is carried out at 0 to 50 ° C., preferably at room temperature, for about 10 to 30 hours, preferably about 15 minutes to 24 hours.
  • the elimination of the lipophilic protecting group can be carried out in the same manner as described above.
  • the acid include trifluoroacetic acid (TFA) and hydrogen fluoride (HF).
  • glycosylated polypeptide in which a desired position is substituted with glycosylated Asn can be obtained.
  • the glycosylated polypeptide thus purified forms a disulfide bond between deprotected Cys as described later.
  • the carboxy group of the sialic acid is protected by a protecting group.
  • the protecting group include benzyl group, allyl group, diphenylmethyl group and the like.
  • the introduction of the protecting group and the removal of the protecting group can be performed by known methods.
  • the protecting group may be removed before the disulfide bond forming step. It may be after the disulfide bond formation step.
  • the glycosylated polypeptide can also be produced by a method of first synthesizing a peptide chain and then adding the sugar chain to the synthesized peptide chain.
  • a peptide containing Cys at the position where a sugar chain is to be added is produced by a solid phase synthesis method, a liquid phase synthesis method, a method of synthesizing with a cell, a method of separating and extracting naturally occurring ones, and the like.
  • Cys that does not add a sugar chain such as Cys at a position where a disulfide bond is to be formed, is protected with, for example, an acetamidomethyl (Acm) group.
  • Cys that does not add a sugar chain and is not used for disulfide bond formation is introduced into a glycosylated polypeptide
  • Cys is protected by a protecting group during the sugar chain addition step and the disulfide bond formation step. Cys can be introduced so that it is protected and then deprotected. Examples of such a protecting group include tert-butyl (tBu) and 4-methoxybenzyl.
  • a protecting group include tert-butyl (tBu) and 4-methoxybenzyl.
  • the Cys to which the first sugar chain is to be introduced is unprotected and the Cys to which the second sugar chain is to be introduced is Fmoc-Cys (StBu) -OH. And so on, to obtain Cys having a protecting group. Thereafter, a sugar chain is introduced into unprotected Cys while retaining a protecting group such as StBu. Next, by deprotecting the StBu group and the like, different sugar chains can be introduced into the unprotected Cys. One or a plurality of Cys into which the first sugar chain is to be introduced and Cys into which the second sugar chain is to be introduced can be used.
  • the StBu group can be deprotected by reacting with a reducing agent such as tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP), dithiothreitol (DTT), or tributylphosphine.
  • TCEP tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride
  • DTT dithiothreitol
  • tributylphosphine tributylphosphine.
  • the above reaction is usually carried out at 0 to 80 ° C., preferably 5 to 60 ° C., more preferably 10 to 35 ° C.
  • the reaction time is preferably about 30 minutes to 5 hours. After completion of the reaction, it may be appropriately purified by a known method (for example, high performance liquid column chromatography (HPLC)).
  • HPLC high performance liquid column chromatography
  • a sugar chain that is more stable with respect to the reducing conditions in the Cys deprotection step and the acidic conditions in the purification step such as HPLC it is preferable to introduce a sugar chain that is more stable with respect to the reducing conditions in the Cys deprotection step and the acidic conditions in the purification step such as HPLC.
  • a sialic acid-containing sugar chain it is preferable to introduce a sugar chain that does not have sialic acid or a sugar chain having a small number of sialic acid residues first.
  • a linker is to be added to the amino acid sequence of a glycosylated polypeptide, for example, in the process of solid phase synthesis, a linker protected with a fat-soluble protecting group instead of an amino acid protected with a fat-soluble protecting group.
  • the sugar chain is reacted with the thiol group of unprotected Cys and bound to the peptide.
  • the above reaction is usually performed at 0 to 80 ° C., preferably 10 to 60 ° C., more preferably 15 to 35 ° C. in a phosphate buffer, Tris-HCl buffer, citrate buffer, or a mixed solution thereof. Good to do.
  • the reaction time is usually about 10 minutes to 24 hours, preferably about 30 minutes to 5 hours. After completion of the reaction, it may be appropriately purified by a known method (for example, HPLC).
  • the haloacetylated complex-type sugar chain derivative for example, represents a hydroxyl group bonded to the 1-position carbon of a complex-type asparagine-linked sugar chain by —NH— (CH 2 ) a — (CO) —CH 2 X (X is The halogen atom, a is an integer, and is not limited as long as the desired linker function is not inhibited, but preferably represents an integer of 0 to 4.
  • a haloacetylated complex type sugar chain derivative and a Cys-containing peptide are reacted in a phosphate buffer at room temperature.
  • a glycosylated polypeptide substituted with glycosylated Cys can be obtained by purification with HPLC.
  • the reaction can also be performed in a mixed solution of an organic solvent such as DMSO, DMF, methanol, and acetonitrile and the above buffer solution. At this time, the ratio of the organic solvent can be added to the buffer solution in the range of 0 to 99% (v / v).
  • a peptide containing unprotected Cys having low solubility in a buffer solution is preferable because it can improve solubility in a reaction solution by adding such an organic solvent.
  • the reaction can also be carried out in an organic solvent such as DMSO, DMF, methanol, acetonitrile, or a mixed solution thereof. In that case, it is preferable to carry out in the presence of a base.
  • the base include DIPEA, triethylamine, pyridine, 2,4,6-collidine and the like.
  • the reaction can also be performed in a mixed solution in which guanidine hydrochloride or urea is added to the buffer solution.
  • Guanidine hydrochloride and urea can be added to the buffer so that the final concentration is 1M to 8M. Addition of guanidine hydrochloride or urea is preferable because it can improve the solubility of a peptide having low solubility in a buffer solution. Furthermore, in order to prevent peptides containing unprotected Cys from forming dimers via disulfide bonds, tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride (TCEP) and dithiothreitol (DTT) are used. It can also be made to react by adding to a buffer solution. TCEP and DTT can be added to the buffer so that the final concentration is 10 ⁇ M to 10 mM.
  • TCEP (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride
  • DTT dithiothreitol
  • the Cys protecting group protected with Acm or the like is deprotected.
  • the protecting group is an Acm group
  • the reaction is performed using iodine, mercury (II) acetate, silver nitrate (I), silver (I) acetate, or the like in water, methanol, acetic acid, or a mixed solution thereof. Can be deprotected.
  • the above reaction is usually carried out at 0 to 80 ° C., preferably 5 to 60 ° C., more preferably 10 to 35 ° C.
  • the reaction time is preferably about 5 minutes to 24 hours.
  • glycosylated polypeptide After completion of the reaction, after treatment with DTT, hydrochloric acid or the like, it may be appropriately purified by a known method (for example, HPLC). In this manner, a glycosylated polypeptide in which a desired position is substituted with glycosylated Cys can be obtained. Moreover, the glycosylated polypeptide thus purified forms a disulfide bond between deprotected Cys as described later.
  • the glycosylated polypeptide prepared by the above methods A and B is a mixture of air and / or oxygen, iodine, DMSO, oxidized and reduced glutathione, potassium ferricyanate, Elman reagent (5,5 ′
  • a disulfide bond between Cys can be formed by a method well known to those skilled in the art using dithiobis (2-nitrobenzoic acid)), thallium trifluoroacetate (III), alkyltrichlorosilane sulfoxide, and the like.
  • Cys in a glycosylated polypeptide for which disulfide bond is not desirable is protected with a protecting group.
  • a protecting group which is stable under oxidizing conditions such as Acm, tBu, 4-methoxybenzyl, 4-methylbenzyl and the like can be used.
  • Method B disulfide bonds can be formed before introduction of sugar chains.
  • the deprotection step precedes the disulfide bond formation step.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has an affinity for somatostatin receptors.
  • affinity for somatostatin receptor means having affinity for at least one of SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, and SSTR5 which are somatostatin receptors.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention preferably has affinity for two or more somatostatin receptors, more preferably has affinity for three or more receptors, and more preferably four or more. And most preferably has affinity for all five receptors SSTR1 to SSTR5, similar to natural somatostatin (SRIF28 and SRIF14). In particular, it is preferable to have affinity for at least one of SSTR1 and SSTR4 and affinity for other SSTRs.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has somatostatin activity (agonist activity) and antagonist activity for the somatostatin receptor by having affinity for the somatostatin receptor.
  • the affinity for each somatostatin receptor can be measured using in vitro competitive binding experiments as shown in Examples 67-1 and 67-2.
  • Affinity measurement by competitive binding experiments is performed by competitively binding a labeled ligand and a test substance to a receptor, and determining the release of the labeled ligand by administration of the test substance. 50% inhibition concentration: IC 50 value and binding inhibition constant: Ki value) can be measured.
  • somatostatin activity can be evaluated by an in vitro cAMP production inhibition test using somatostatin receptor-expressing cells as shown in Examples 67-3 and 67-4.
  • cAMP production inhibition test somatostatin receptor-expressing cells are treated with a glycosylated polypeptide or a control compound SRIF14 or SRIF28, and after culturing for a certain period of time, the amount of cAMP accumulated in the cells is measured. It can be evaluated by comparing with. The amount of cAMP can be measured by a known method such as enzyme immunoassay (EIA).
  • EIA enzyme immunoassay
  • somatostatin activity (agonist activity) can be evaluated by an in vivo GH production inhibition test as shown in Example 86 and Example 87.
  • the GH production suppression test can be performed, for example, as follows. Glycosylated polypeptides are administered subcutaneously to non-fasted rats. Rats are administered a GH release promoter under general anesthesia, and blood is collected after about 5 minutes. Using the collected blood as a plasma sample, the GH concentration is measured by a known method such as enzyme immunoassay (EIA). As a control, somatostatin activity can be evaluated by obtaining a plasma sample from a rat administered with physiological saline containing no glycosylated polypeptide, by comparing the measured GH concentrations.
  • EIA enzyme immunoassay
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has a prolonged half-life in blood even if the addition of a sugar chain to the structure causes a certain amount of affinity decrease for each receptor. It can maintain somatostatin activity equivalent to that of naturally occurring somatostatin to which no sugar chain is added (hereinafter sometimes referred to as “non-glycosylated somatostatin”), and preferably has increased somatostatin activity. Can do.
  • the Ki value for each receptor of the glycosylated polypeptide of the present invention and the sugar chain is preferably in the range of 1000: 1 to 0.3: 1, more preferably in the range of 100: 1 to 0.3: 1. More preferably, it is within the range of 10: 1 to 0.3: 1.
  • the blood stability of the glycosylated polypeptide of the present invention is preferably equal to or higher than that of naturally occurring somatostatin (non-glycosylated somatostatin).
  • Blood stability can be measured using methods known to those skilled in the art. For example, the stability in plasma, blood half-life, AUC (area under the drug plasma concentration-time curve), etc. are used as indicators. Judgment can be made. In addition, a decrease in renal clearance and liver clearance also contributes to an increase in blood stability.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has an increased blood half-life compared to SRIF28 having no sugar chain.
  • the half-life is: Compared with SRIF28, it is increased 4 times or more, preferably 10 times or more, more preferably 20 times or more, and further preferably 30 times or more.
  • glycosylated polypeptide of the present invention is preferably 4 times or more, more preferably 10 times or more, still more preferably 20 times or more, as compared with SRIF28, for example, when measured by the experimental method shown in Example 85. Has blood stability.
  • composition a pharmaceutical composition containing the glycosylated polypeptide of the present invention as an active ingredient
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated polypeptide of the present invention as an active ingredient is effective for the treatment or prevention of diseases associated with somatostatin.
  • various actions are known for somatostatin, and there are various diseases associated with these actions.
  • diseases associated with somatostatin include, for example, acromegaly, giantism, Alzheimer's disease and other forms of dementia, cancer, hormone producing tumors, endocrine tumors (eg carcinoids, VIPomas, insulinomas, glucagonomas), cushing Disease, hormonal secretion, diabetes and its complications, pain, arthritis, diarrhea, gastric ulcer, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, gastrointestinal obstruction, ileus, postoperative restenosis, radiation damage, eye disease (eg dry eye , Glaucoma, inflammation of the corneal stroma, ulceris, cataract, conjunctivitis) and the like.
  • endocrine tumors eg carcinoids, VIPomas, insulinomas, glucagonomas
  • cushing Disease hormonal secretion
  • diabetes and its complications pain, arthritis, diarrhea, gastric ulcer, inflammatory bowel disease, irritable bowel syndrome, gastrointestinal obstruction, ileus, postoperative restenosis, radiation damage, eye disease (eg dry
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated polypeptide of the present invention as an active ingredient is the above-mentioned diseases, particularly acromegaly, dementia, cancer, hormone-producing tumor, endocrine tumor, Cushing disease, hormone secretion abnormality, diabetic complication, It is effective for the treatment or prevention of diarrhea, gastrointestinal obstruction, ileus, radiation disorders, eye diseases, as well as various tumors or intestinal related diseases, and gastrointestinal symptoms associated with excessive hormone production.
  • the above pharmaceutical composition is a normal pharmaceutical composition using diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants and the like that are usually used. It was formulated in the form of Examples of such a pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, inhalants, eye drops, injections, and the like.
  • diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, moisturizers, disintegrants, surfactants, lubricants and the like that are usually used. It was formulated in the form of Examples of such a pharmaceutical composition include tablets, pills, powders, solutions, suspensions, emulsions, granules, capsules, suppositories, inhalants, eye drops, injections, and the like.
  • the amount of the glycosylated polypeptide of the present invention contained in the pharmaceutical composition is not particularly limited and can be appropriately selected from a wide range. Usually, the glycosylated polypeptide of the present invention is contained in the pharmaceutical composition. It is preferable to contain 1 to 70% by weight of the peptide.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated polypeptide of the present invention as an active ingredient can further contain other active ingredients, or can be used in combination with a pharmaceutical composition containing other active ingredients.
  • the pharmaceutical composition containing the glycosylated polypeptide of the present invention as an active ingredient may contain the glycosylated polypeptide as a pharmaceutically acceptable salt, or may be one or more different sugars of the present invention.
  • a chain-added polypeptide can also be contained as an active ingredient.
  • the treatment using the glycosylated polypeptide of the present invention can include, for example, radiotherapy, and for measuring the distribution of cells and tissues expressing any of SSTR1 to SSTR5 throughout the body. It is also useful in scintigraphy.
  • the use of in vitro imaging with radioactive scanning or magnetic resonance can allow for semi-quantitative detection in the body.
  • Radiolabeled glycosylated polypeptides are useful for therapeutic treatment of malignant tumors expressing any of SSTR1 to SSTR5 in, for example, the human body, in tissues that do not normally contain substantial amounts of SSTR1 to SSTR5. Useful for.
  • the labeled glycosylated polypeptide can be administered as a composition containing an effective amount for scintigraphy or for tumor suppression. Examples of such labels include iodine (123 I, 125 I, 131 I), indium (111 an In), carbon (11 C), fluorine (18 F), technetium (99 mTc), yttrium (90 Y), etc. Different isotopes, or fluorescent labels.
  • Labeling can be performed by methods well known to those skilled in the art and are included in the glycosylated polypeptide, directly linked, or conjugated to an appropriate compound, which is linked to the glycosylated polypeptide. Can be combined. For example, tyrosine iodination can be labeled by a method using chloramine-T or the like.
  • the administration method of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and it is administered by a method according to various preparation forms, patient age, sex, disease state, and other conditions.
  • Examples of the administration method in the case of tablets, pills, solutions, suspensions, emulsions, granules and capsules include oral administration.
  • it can be administered intravenously, intramuscularly, intradermally, subcutaneously or intraperitoneally alone or mixed with a normal fluid such as glucose or amino acid.
  • a suppository it is administered intrarectally.
  • eye drops apply to eye tissues such as conjunctival sac.
  • For inhalants apply to bronchi or lungs.
  • the dosage of the above pharmaceutical composition may be appropriately selected according to usage, patient age, sex, disease severity, and other conditions.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention is 0 per 1 kg body weight.
  • the dosage may be 1 to 900 nmol, preferably 1 to 100 nmol, more preferably 1 to 10 nmol.
  • the number of administrations of the pharmaceutical composition may be appropriately selected according to usage, patient age, sex, disease severity, and other conditions. For example, 3 times / 1 day, 2 times / 1 day, 1 time / A less frequent number of administrations (for example, once / week, once / month, etc.) may be selected depending on the stability of the blood in one day.
  • the frequency of administration of the pharmaceutical composition is not more than once / day.
  • the sugar chain added to the glycosylated polypeptide of the present invention is easily degraded in the body's metabolic system.
  • the sugar chain has a structure that exists as a glycopeptide (or glycoprotein) in vivo. Therefore, the glycosylated polypeptide of the present invention and the pharmaceutical composition containing the peptide as an active ingredient do not show side effects or antigenicity even when administered in vivo, and have a medicinal effect by allergic reaction or antibody production. It has advantages such as less worry about being lost.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention can be stably and easily supplied in large quantities, and is very useful from the viewpoint of providing a high-quality pharmaceutical product with stable quality.
  • the present invention also provides a method for treating or preventing a disease associated with somatostatin, which comprises administering an effective amount of the glycosylated polypeptide of the present invention.
  • Embodiments of the present invention may be described with reference to schematic diagrams, but in the case of schematic diagrams, they may be exaggerated for clarity of explanation.
  • terms such as first, second, etc. are used to represent various elements, it is understood that these elements should not be limited by those terms. These terms are only used to distinguish one element from another, for example, the first element is referred to as the second element, and similarly, the second element is the first element. Can be made without departing from the scope of the present invention.
  • Trp at position 22 is substituted with D-Trp.
  • C (disialo) -RK-SRIF14 indicates that a glycosylated Cys-Arg-Lys- was added to the N-terminal side of SRIF14.
  • S1-2C (disialo) -SRIF28 indicates that the Ser at position 1 present at the N-terminal of the polypeptide of SRIF28 is replaced with two consecutive dicialoglycosylated Cys. .
  • “Disialo” means a dicialo sugar chain
  • “monosialo” means a monosialo glycan
  • “asialo” means an asialog glycan
  • “diGlcNAc” means a diglucnac glycan
  • “GlcNAc” means N-acetylglucosamine means
  • diMan means dimannose sugar chain
  • trisialo means trisialo sugar chain
  • tetrasialo means tetrasialo sugar chain.
  • aminoethylamide In the case of (disialo (aminoethylamide)), it means that the carboxy group of the sialic acid of the dicialo sugar chain is protected by an aminoethylamino group.
  • aminoethylamide those indicated as “Bn”, “amide”, and “hexadecylamide” are modified with the carboxy group of sialic acid on the sugar chain by benzyl group, amino group, hexadecylamino group, respectively.
  • Example 2 Synthesis of N5C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound (peptide 5) (SEQ ID NO: 41) represented by the following formula (5) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (6) (N5C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 6) was synthesized.
  • Example 3 Synthesis of A9C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (7) (peptide 7) (SEQ ID NO: 42) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (8) (A9C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 7) was synthesized.
  • Example 4 Synthesis of E12C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound (peptide 9) (SEQ ID NO: 43) represented by the following formula (9) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (10) (E12C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 8) was synthesized.
  • Example 5 Synthesis of R13C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (11) (peptide 11) (SEQ ID NO: 44) was used instead of peptide 1, A compound represented by formula (12) (R13C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 9) was synthesized.
  • Example 6 Synthesis of K14C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (13) (peptide 13) (SEQ ID NO: 45) was used instead of peptide 1, A compound represented by formula (14) (K14C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 10) was synthesized.
  • Example 7 Synthesis of A15C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (15) (peptide 15) (SEQ ID NO: 46) was used instead of peptide 1, A compound represented by formula (16) (A15C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 11) was synthesized.
  • Example 8 Synthesis of G16C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (17) (peptide 17) (SEQ ID NO: 47) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (18) (G16C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 12) was synthesized.
  • Example 9 Synthesis of K18C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (19) (peptide 19) (SEQ ID NO: 48) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (20) (K18C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 13) was synthesized.
  • Example 10 Synthesis of N19C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound (peptide 21) (SEQ ID NO: 49) represented by the following formula (21) was used instead of peptide 1, the following: A compound represented by formula (22) (N19C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 14) was synthesized.
  • Example 11 Synthesis of F21C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (23) (peptide 23) (SEQ ID NO: 50) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (24) (F21C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 15) was synthesized.
  • Example 12 Synthesis of T26C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (25) (peptide 25) (SEQ ID NO: 51) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (26) (T26C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 16) was synthesized.
  • Example 13 Synthesis of 29C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound (peptide 27) (SEQ ID NO: 52) represented by the following formula (27) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (28) (29C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 17) was synthesized.
  • Example 14 Synthesis of 30C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (29) (peptide 29) (SEQ ID NO: 53) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (30) (30C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 18) was synthesized.
  • Example 15 Synthesis of S1C (disialo) -D-Trp22-SRIF28 Same as Example 1 except that instead of peptide 1, a compound represented by the following formula (31) (peptide 31) (SEQ ID NO: 54) was used Thus, a compound represented by the following formula (32) (S1C (disialo) -D-Trp22-SRIF28) (SEQ ID NO: 19) was synthesized.
  • Example 16 Synthesis of A9C (disialo) -D-Trp22-SRIF28 Same as Example 1 except that the compound represented by the following formula (33) (peptide 33) (SEQ ID NO: 55) was used instead of peptide 1. Then, a compound (A9C (disialo) -D-Trp22-SRIF28) (SEQ ID NO: 20) represented by the following formula (34) was synthesized.
  • Example 17 Synthesis of C (disialo) -SRIF14 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (35) (peptide 35) (SEQ ID NO: 56) was used instead of peptide 1, A compound represented by formula (36) (C (disialo) -SRIF14) (SEQ ID NO: 35) was synthesized.
  • Example 18 Synthesis of C (disialo) -RK-SRIF14 Similar to Example 1 except that the compound represented by the following formula (37) (peptide 37) (SEQ ID NO: 57) was used instead of peptide 1. Thus, a compound (C (disialo) -RK-SRIF14) (SEQ ID NO: 36) represented by the following formula (38) was synthesized.
  • Example 19 Synthesis of C (disialo) -C12linker-SRIF14 19-1 Synthesis of Peptide 2-chlorotrityl chloride resin (100 ⁇ mol) was taken in a solid phase synthesis column, washed with DMF and dichloromethane, and then Fmoc-Cys (Acm). A solution of —OH (49.7 mg, 120 ⁇ mol) and DIPEA (104.5 ⁇ L, 600 ⁇ mol) in dichloromethane (3.0 mL) was added and shaken for 1 hour. After washing with dichloromethane and DMF, the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • a protected peptide 39 represented by the following formula (39), which is represented by the following formula (39), in a peptide solid phase synthesis method by Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer No. 58) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • Fmoc-12-aminododecanoic acid and Fmoc-Cys (Trt) -OH were sequentially condensed using HCTU as a condensing agent.
  • 19-2 Sugar chain modification reaction of thiol Peptide 40 (6.8 mg, 3.3 ⁇ mol) obtained by the method described in 19-1 above and compound a (19.1 mg, 8. 15 ⁇ mol) was dissolved in 0.2 M phosphate buffer (pH 7.4, 0.96 mL) containing 7 M guanidine hydrochloride and 330 ⁇ M TCEP, and reacted at room temperature for 2 hours.
  • the protected peptide was synthesized on the resin by the peptide solid phase synthesis method by the Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the resin was removed by filtration, and cooled diethyl ether was added to the filtrate to obtain a crude peptide as a precipitate.
  • Example 21 Synthesis of S1C (disialo) ⁇ N5C (disialo) -SRIF28
  • Example 20 was used except that a compound represented by the following formula (48) (peptide 48) (SEQ ID NO: 65) was used instead of peptide 44.
  • a compound represented by the following formula (49) (S1C (disialo) ⁇ N5C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 22) was synthesized.
  • Example 22 Synthesis of S1C (disialo) / R13C (disialo) -SRIF28
  • Example 20 was used except that a compound represented by the following formula (50) (peptide 50) (SEQ ID NO: 66) was used instead of peptide 44.
  • a compound represented by the following formula (51) (S1C (disialo) ⁇ R13C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 23) was synthesized.
  • Example 23 Synthesis of N5C (disialo) / A9C (disialo) -SRIF28
  • Example 20 Similarly, a compound represented by the following formula (53) (N5C (disialo) / A9C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 24) was synthesized.
  • a protected peptide was synthesized on a resin by a peptide solid phase synthesis method by Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the resin was removed by filtration, and cooled diethyl ether was added to the filtrate to obtain a crude peptide as a precipitate.
  • Example 25 Synthesis of S1C (disialo), N5C (disialo), A9C (disialo) -SRIF28 Example except that peptide 58 (SEQ ID NO: 71) represented by the following formula (58) was used instead of peptide 54 In the same manner as in 24, a compound represented by the following formula (59) (S1C (disialo) ⁇ N5C (disialo) ⁇ A9C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 26) was synthesized.
  • Example 26 Synthesis of S1C (monosialo) -SRIF28 Example 1 except that compound b represented by the following formula (b) (bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) was used instead of compound a.
  • compound b represented by the following formula (b) bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.
  • a compound represented by the following formula (60) S1C (monosialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 27) was synthesized.
  • the ratio of the sugar chain polypeptide having a sugar chain of the following formula b1 to the sugar chain-added polypeptide having a sugar chain of the following formula b2 was 45:55.
  • monosialo sugar chain derivatives having the same structure a glycosylated polypeptide having a substantially uniform sugar chain structure can be produced.
  • Example 27 Synthesis of S1C (asialo) -SRIF28 Example 1 except that compound c represented by the following formula (c) (bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) was used instead of compound a.
  • compound c represented by the following formula (c) bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.
  • Example 30 Synthesis of N5N (disialo) -SRIF28 30-1 Solid Phase Synthesis of Glycopeptide 2-chlorotrityl chloride resin (100 ⁇ mol) was taken in a column for solid phase synthesis, washed with DMF and dichloromethane, and then Fmoc-Cys (Trt ) -OH (72.5 mg, 120 ⁇ mol) and DIPEA (104.6 ⁇ L, 600 ⁇ mol) in dichloromethane (3.0 mL) were added and shaken for 1 hour. After washing with dichloromethane and DMF, the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the protected peptide 68 (sequence) represented by the following formula (68), in a peptide solid phase synthesis method by Fmoc method, using a Prelude (trademark) peptide synthesizer. No. 76) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was then removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • compound d represented by the following formula (d) (manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) (411.9 mg, 150.4 ⁇ mol), DMSO-DMF (1/1, v / v, 871 ⁇ L) solution, TBTU ( 64.2 mg, 200 ⁇ mol) and DIPEA (52.3 ⁇ L, 300 ⁇ mol) were sequentially added to the resin and condensed by shaking at room temperature for 3 hours. After washing with DMF, this condensation operation was repeated once.
  • formula (d) manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.
  • the resin was washed with DMF and dichloromethane, then shaken with 20% piperidine in DMF for 20 minutes to remove the Fmoc group, and the resin was washed with DMF to protect the compound represented by the following formula (69) (peptide) 69) (SEQ ID NO: 77) was synthesized on the resin.
  • Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Ala, and Fmoc-Ser (tBu) -OH were sequentially condensed on this resin using HOBt / DIC as a condensing agent. After condensation, the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • glycopeptide 70 SEQ ID NO: 78 (29.1 mg, 5.26 ⁇ mol) represented by the following formula (70).
  • a protected peptide 73 (sequence) represented by the following formula (73) in a peptide solid phase synthesis method by the Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer and bound to a resin No. 80) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was then removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • ESI-MS (m / z) calcd for C 236 H 356 N 48 O 100 S 3 : [M + 4H] 4+ 1391.5, [M + 5H] 5+ 1113.4, found 1391.3, 113.2.
  • the protected peptide was synthesized on the resin by the peptide solid phase synthesis method by the Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the resin was removed by filtration, and cooled diethyl ether was added to the filtrate to obtain a crude peptide as a precipitate.
  • ESI-MS (m / z) calcd for C 152 H 234 N 44 O 45 S 5 [M + 3H] 3+ 1187.0, [M + 4H] 4+ 890.5, found 1187.0, 890.5.
  • Example 33 Synthesis of S1C (disialo) ⁇ N19C (diMan) -SRIF28 Except for using compound f (bromoacetamidized oligosaccharide: Otsuka Chemical Co., Ltd.) represented by the following formula (f) instead of compound e
  • f bromoacetamidized oligosaccharide: Otsuka Chemical Co., Ltd.
  • a compound represented by the following formula (83) S1C (disialo) ⁇ N19C (diMan) -SRIF28) (SEQ ID NO: 34) was synthesized.
  • Example 34 Synthesis of C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound (peptide 84) (SEQ ID NO: 88) represented by the following formula (84) was used instead of peptide 1, the following. A compound represented by the formula (85) (C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 89) was synthesized.
  • Example 35 Synthesis of R11C (disialo) -SRIF28 The same procedure as in Example 1 was conducted except that the compound represented by the following formula (86) (peptide 86) (SEQ ID NO: 90) was used instead of peptide 1. A compound represented by the formula (87) (R11C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 91) was synthesized.
  • Example 36 Synthesis of F20C (disialo) -SRIF28 The same procedure as in Example 1 was conducted except that the compound represented by the following formula (88) (peptide 88) (SEQ ID NO: 92) was used instead of peptide 1. A compound represented by the formula (89) (F20C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 93) was synthesized.
  • Example 37 Synthesis of T24C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (90) (peptide 90) (SEQ ID NO: 94) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (91) (T24C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 95) was synthesized.
  • Example 38 Synthesis of F25C (disialo) -SRIF28 The same procedure as in Example 1 was conducted except that the compound represented by the following formula (92) (peptide 92) (SEQ ID NO: 96) was used instead of peptide 1. A compound represented by the formula (93) (F25C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 97) was synthesized.
  • Example 39 Synthesis of S27C (disialo) -SRIF28 In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (94) (peptide 94) (SEQ ID NO: 98) was used instead of peptide 1, A compound represented by the formula (95) (S27C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 99) was synthesized.
  • Example 40 Synthesis of C (disialo) -K-SRIF14 The same procedure as in Example 1 was conducted except that a compound represented by the following formula (96) (peptide 96) (SEQ ID NO: 100) was used instead of peptide 1. Then, a compound (C (disialo) -K-SRIF14) (SEQ ID NO: 101) represented by the following formula (97) was synthesized.
  • Example 41 Synthesis of S1C (disialo) -F25Y-SRIF28 The same procedure as in Example 1 was conducted, except that the compound represented by the following formula (98) (peptide 98) (SEQ ID NO: 102) was used instead of peptide 1. Then, a compound represented by the following formula (99) (S1C (disialo) -F25Y-SRIF28) (SEQ ID NO: 103) was synthesized.
  • Example 42 Synthesis of S1C (disialo) -SRIF28-amide In the same manner as in Example 1 except that the compound represented by the following formula (100) (peptide 100) (SEQ ID NO: 104) was used instead of peptide 1. Then, a compound represented by the following formula (101) (S1C (disialo) -SRIF28-amide) (SEQ ID NO: 105) was synthesized.
  • Example 43 Synthesis of C (disialo) -PEGlinker-SRIF14 43-1 Synthesis of peptide Protected peptide 39 (SEQ ID NO: 58) bound to the resin obtained by the method described in 19-1 above (50 ⁇ mol) ) was removed by treatment with 20% piperidine in DMF. After washing with DMF, Fmoc-NH- (PEG) 2 -COOH (manufactured by Merck) and Fmoc-Cys (Trt) -OH were sequentially condensed using HCTU as a condensing agent. The Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the resin was removed by filtration, and cooled diethyl ether was added to the filtrate to obtain a crude peptide as a precipitate.
  • the protected peptide 104 (sequence) in a state bound to the resin represented by the following formula (104) by the peptide solid phase synthesis method by Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer No. 108) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • biotin was condensed using HCTU as a condensing agent.
  • amino acid side chain protecting groups other than the Acm group
  • the resin was removed by filtration, and cooled diethyl ether was added to the filtrate to obtain a crude peptide as a precipitate.
  • Example 46 Synthesis of Azido-S1C (disalo) -SRIF28 46-1 Synthesis of peptide
  • Example 47 Synthesis of S1C (disialo) / E12C (disialo) -SRIF28 Except that peptide 44 was synthesized and used instead of peptide 44, the compound (peptide 111) (SEQ ID NO: 115) was used. In the same manner as in Example 20, a compound represented by the following formula (112) (S1C (disialo) ⁇ E12C (disialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 116) was synthesized.
  • Example 48 Synthesis of 2C (disialo) -RK-SRIF14 Example except that compound (peptide 113) (SEQ ID NO: 117) represented by the following formula (113) was synthesized and used instead of peptide 44 In the same manner as in Example 20, a compound (2C (disialo) -RK-SRIF14) (SEQ ID NO: 118) represented by the following formula (114) was synthesized.
  • Example 49 Synthesis of 3C (disialo) -RK-SRIF14
  • Example 3 except that compound (peptide 115) (SEQ ID NO: 119) represented by the following formula (115) was synthesized and used instead of peptide 54
  • Example 51 Synthesis of S1C (diMan) -SRIF28 A compound represented by the following formula (120) (S1C (diMan) -SRIF28) was obtained in the same manner as in Example 50 except that Compound f was used instead of Compound h. (SEQ ID NO: 124) was synthesized.
  • Example 52 Synthesis of N19C (diMan) -SRIF28 This was represented by the following formula (121) in the same manner as in Example 50 except that peptide 21 was used instead of peptide 1 and compound f was used instead of compound h. (N19C (diMan) -SRIF28) (SEQ ID NO: 125) was synthesized.
  • Example 53 Synthesis of S1C (GlcNAc) -SRIF28 A compound represented by the following formula (122) (S1C (GlcNAc) -SRIF28) was obtained in the same manner as in Example 50 except that compound e was used instead of compound h. (SEQ ID NO: 126) was synthesized.
  • Example 54 Synthesis of N19C (GlcNAc) -SRIF28 A compound represented by the following formula (123) was obtained in the same manner as in Example 50 except that peptide 21 was used instead of peptide 1 and compound e was used instead of compound h. (N19C (GlcNAc) -SRIF28) (SEQ ID NO: 127) was synthesized.
  • Example 55 Synthesis of S1C (trisialo) -SRIF28 Example 1 except that compound i represented by the following formula (i) (bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) was used instead of compound a.
  • compound (S1C (trisialo) -SRIF28) (SEQ ID NO: 128) represented by the following formula (124) was synthesized. (I)
  • Example 56 Synthesis of S1C (tetrasia) -SRIF28 Example 1 except that compound j represented by the following formula (j) (bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.) was used instead of compound a.
  • compound j represented by the following formula (j) bromoacetamidized oligosaccharide: manufactured by Otsuka Chemical Co., Ltd.
  • 57-2 Sugar chain modification reaction of thiol Compound m (14.2 mg, 5.40 ⁇ mol) obtained by the method described in 57-1 and peptide 1 (15.0 mg, 4.53 ⁇ mol) were mixed with 33 mM phosphate buffer. (PH 7.4, 1.3 mL) was dissolved and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • S1C (disialo (Bn))-SRIF28 A compound represented by the following formula (131) (S1C (disialo (S)) was prepared in the same manner as in Example 1 except that Compound g was used instead of Compound a. Bn))-SRIF28) (SEQ ID NO: 135) was synthesized.
  • 60-2 Sugar chain modification reaction of thiol Peptide 1 (10.4 mg, 3.14 ⁇ mol) was dissolved in 0.5 M phosphate buffer (pH 7.4, 62 ⁇ L) containing 30 ⁇ M TCEP. To this solution, a solution of compound q (79.4 mg, 28.5 ⁇ mol) obtained by the method described in 60-1 above in DMSO (3.7 mL) was added and reacted at room temperature for 20 minutes.
  • Example 62 Synthesis of S1-2C (disialo (Bn))-SRIF28 In the same manner as in Example 28 except that compound g was used instead of compound c, compound (S1- 2C (disialo (Bn))-SRIF28) (SEQ ID NO: 140) was synthesized.
  • the peptide 138 (SEQ ID NO: 142) represented by the following formula (138), which is protected and bound to the resin by the peptide solid phase synthesis method by the Fmoc method, using a Prelude (trademark) peptide synthesizer ) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was then removed by treatment with 20% piperidine in DMF. After washing with DMF, compound d (141.0 mg, 51.5 ⁇ mol), DMSO-DMF (1/1, v / v, 1.1 mL) solution, TBTU (21.2 mg, 66.0 ⁇ mol), and DIPEA (17 .2 ⁇ L, 98.7 ⁇ mol) were sequentially added to the resin and condensed by shaking at room temperature for 4 hours. After washing with DMF, this condensation operation was repeated once.
  • the resin is washed with DMF and dichloromethane, and then shaken with 20% piperidine in DMF for 20 minutes to remove the Fmoc group, and the resin is washed with DMF, whereby the resin is bound to the resin represented by the following formula (139).
  • glycopeptide 140 (SEQ ID NO: 144) (5.8 mg, 1.1 ⁇ mol) represented by the following formula (140).
  • ESI-MS (m / z) calcd for C 241 H 367 N 49 O 101 S 4 : [M + 4H] 4+ 1424.8, [M + 5H] 5+ 1140.0, found 1424.6, 1139.9.
  • Glycopeptide 142 (3.7 mg, 0.54 ⁇ mol) obtained by the method described in 64-3 above was added to 100 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) -DMSO (1/1, v / v, 1.4 mL) and reacted at room temperature for 31 hours.
  • Example 65 Synthesis of C (disialo (aminoethylamide)) ⁇ S1C (disialo) -SRIF28 65-1 Synthesis of peptide Take 2-chlorotrityl chloride resin (100 ⁇ mol) in a column for solid phase synthesis, and wash with DMF and dichloromethane. A solution of Fmoc-Cys (Acm) -OH (49.7 mg, 120 ⁇ mol) and DIPEA (104.5 ⁇ L, 600 ⁇ mol) in dichloromethane (3.0 mL) was added and shaken for 1 hour. After washing with dichloromethane and DMF, the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the protected peptide 145 represented by the following formula (145) in a state bound to the resin by the peptide solid phase synthesis method by the Fmoc method using a Prelude TM peptide synthesizer (SEQ ID NO: 149) ) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • a portion of the resin (50 ⁇ mol) was taken and the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • 65-3 Sugar chain modification of thiol Peptide 146 (20.6 mg, 5.89 ⁇ mol) obtained by the method described in 65-1 above and compound s (28.6 mg) obtained by the method described in 65-2 above 11.8 ⁇ mol) was dissolved in 33 mM phosphate buffer (pH 7.4, 1.8 mL) and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • a protected peptide 152 (sequence) in a state bound to a resin represented by the following formula (152) by a peptide solid-phase synthesis method by Fmoc method using a Prelude (trademark) peptide synthesizer No. 156) was synthesized.
  • the condensation reaction was performed in DMF using HCTU as the condensing agent.
  • the Fmoc protecting group was removed by treatment with 20% piperidine in DMF.
  • the resin was removed by filtration, and cooled diethyl ether was added to the filtrate to obtain a crude peptide as a precipitate.
  • Tables 1-1 to 1-7 show the MS spectrum data (ESI-MS) of the glycosylated SRIF peptides obtained by the methods described in Examples 1 to 66.
  • the molecular mass was obtained by performing deconvolution of multivalent protein mass spectrometry using MassLynx version 4.1 (manufactured by Waters).
  • Example 67-1 Calculation of Receptor Binding Affinity
  • Reagents used in competitive binding experiments and their official chemical names are as follows.
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheric acid
  • BSA bovine serum albumin
  • Competitive binding experiments were outsourced to Lyselka Biosciences for experiments and data analysis.
  • the receptor subtypes and receptor membrane preparations used are shown in Table 2.
  • SRIF14 was used as a positive control for each experimental round.
  • 50% inhibitory concentration (IC 50 value) was obtained based on the numerical data of the binding inhibition rate by non-linear least square method using MathIQ TM (ID Business Solutions, UK).
  • the binding inhibition constant (Ki value) was calculated by the method of Cheng, Y et al. (Biochem Pharmacol, 22, 3099-3108, 1973).
  • Table 3A the compounds according to the present invention bound strongly to all SSTRs.
  • the binding affinity of the positive control SRIF14 to SSTR1 was 0.362 nM in Ki value, whereas the compound having one or two sugar chains of the present invention has an excellent binding affinity of 0.704 to 147 nM. Showed sex.
  • the compounds having three sugar chains of the present invention (the compounds of Examples 24, 25, and 29) also showed 3.49 nM, 16.9 nM, and 57.3 nM, and had excellent binding affinity. It was.
  • Examples 1 to 6, 10, 13 to 19, 26, 27, 30, and 31 have one sugar chain having binding affinity for all receptors of SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, and SSTR5. It was found to be a modified form.
  • Examples 20 to 23 and 28 are modified sugar chains having affinity for all receptors of SSTR1 to SSTR5.
  • Examples 24, 25 and 29 are examples of SSTR1 to SSTR5. It was found to be a modified three sugar chain having affinity for all receptors.
  • Example 67-2 Calculation of receptor binding affinity-2
  • Each compound shown in Table 3B was subjected to a competitive binding experiment by the method described in Example 67-1, and the receptor binding affinity was calculated.
  • SRIF14 and SRIF28 were similarly evaluated as control compounds.
  • the results of the binding experiment are shown in Table 3B.
  • 1C and 1D show an example of the structure of a glycosylated peptide corresponding to the compound name in Table 3B.
  • control SRIF14 and SRIF28 bound to all receptors of SSTR1-SSTR5.
  • the Ki value for each receptor of SRIF14 is different and is 2.5 to 13.2 times higher.
  • the compounds 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 and 66 have Ki values for SSTR1 of 1.46 to 100 nM, and also 0.0536 to 6.51 nM for SSTR2.
  • SSTR3 was 0.160-7.44 nM
  • SSTR4 was 1.39-59.0 nM
  • SSTR5 was 0.310-95.0 nM, indicating high binding affinity for all receptors.
  • the compound of Example 12 had Ki values for SSTR2 and SSTR5 of 280-1600 times that of SRIF14, but 17.9, 7.44, and 24.1 nM for SSTR1, SSTR3, and SSTR4. , And was thought to retain binding affinity.
  • the compound of Example 38 had a Ki value for SSTR1, SSTR2, and SSTR3 of 310-5300 times that of SRIF14, which was significantly reduced in affinity, but was 110, 33.0 nM for SSTR4 and SSTR5. It was thought to retain binding affinity.
  • the compound of Example 49 had Ki values of SSTR2 and SSTR4 of 170 times and 46 times or more of SRIF14, but Ki values of 270 nM, 14.0 nM and 23.0 nM for SSTR1, SSTR3 and SSTR5, respectively. And was thought to retain binding affinity.
  • the somatostatin receptor is a G protein coupled receptor (GPCR). SSTR1 to SSTR5 all suppress adenylyl cyclase activity and reduce intracellular cAMP concentration via Gi / Go, a subfamily of G proteins. In this experimental system, each somatostatin receptor-expressing cell was used to calculate the IC 50 value of the cAMP production inhibitory action of the test substance, and the agonist activity was evaluated. In addition, SRIF14 and SRIF28 were similarly evaluated as control compounds. The reagents used in this experiment and their official chemical names are as follows.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • IBMX 3-isobutyl-1-methylxanthine
  • HBSS Hank's Buffered Salt Solution
  • the test substance is treated at a concentration of 0.00001 nM, 0.0001 nM, 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, or 1000 nM mixed with 10 ⁇ M forskolin and allowed to react at room temperature for 30 minutes. It was. After the reaction, the cells were lysed with 0.2N HCl, and the amount of cAMP accumulated in the cells was measured using a Cayman cyclic AMP EIA kit (Cayman, 582002). The evaluation for SSTR1 was outsourced to SELEP to conduct experiments.
  • HBSS containing 20 mM HEPES (pH 7.4) and 500 ⁇ M IBMX was used, and SSTR1 receptor-expressing cells were seeded at 10 4 cells / well.
  • the test substance was treated by mixing with 1 ⁇ M NKH477 at a concentration of 0.001 nM, 0.01 nM, 0.1 nM, 1 nM, 10 nM, or 100 nM and allowed to react at 37 ° C. for 20 minutes. After the reaction, the amount of cAMP accumulated in the cells was measured using a cAMP dynamic2 kit (cisbio, 62AM4PE) manufactured by Sysbio.
  • cAMP dynamic2 kit cisbio, 62AM4PE
  • Table 3D and FIG. 1E show the experimental results (IC 50 (nM)) of the agonist activity evaluation test when the compounds of Examples 1, 18, 27, 28, 57 and 58 were used as the sugar chain adduct.
  • the IC 50 of the control compounds SRIF14 and SRIF28 is 0.83-0.89 nM for SSTR1, 0.0076-0.073 nM, 0.029-0.21 nM for SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5, respectively. They were 0.015 to 0.074 nM and 0.066 to 0.12 nM.
  • the IC 50 of the agonist activity of SDR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, SSTR5 of the compound which is a glycosylated adduct is 1.0 to 2.4 nM, 0.041 to 0.10 nM, 0.12 to 0.30 nM, 0 0.039 to 0.085 nM and 0.043 to 0.081 nM, showing excellent agonist activity for all receptors of SSTR1 to SSTR5. From the results shown in Example 67-1 and Example 67-2, it is clear that these compounds have receptor binding ability, and these compounds exert agonist activity by binding to the receptor. Became clear.
  • Example 67-4 Agonist Activity Evaluation Using Receptor-Expressing Cells-2 Using each compound shown in Table 3E as the glycosylated product, an agonist activity evaluation test was conducted in the same manner as in Example 67-3. The experimental results are shown in Table 3E. In Table 3E, a column in which “-(hyphen)” is written indicates that the operation is not performed.
  • the IC 50 of the agonist activity with respect to SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR4, and SSTR5 of the compound that is a glycosylated is 1.2-22 nM, 0.019-1.4 nM, and 0.039-3. It was 8 nM, 0.033 to 1.6 nM, and 0.031 to 1.1 nM, and showed agonistic activity against the receptors of SSTR1 to SSTR5. From the results shown in Example 67-1 and Example 67-2, these compounds have receptor binding affinity, and these compounds exhibit agonist activity by binding to the receptor. It became clear.
  • Example 68 Pharmacokinetic study 1 using rats Compared with non-glycosylated SRIF28, the glycosylated polypeptide (glycosylated product) of the present invention has an area under the drug plasma concentration-time curve (AUC), blood half-life (t 1/2 ), In order to confirm that pharmacokinetic profiles such as mean residence time (MRT) and bioavailability were improved, pharmacokinetic analysis by intravenous administration and subcutaneous administration was performed using rats.
  • AUC drug plasma concentration-time curve
  • t 1/2 blood half-life
  • the aprotinin-containing EDTA-PBS solution was prepared by dissolving aprotinin (010-11834, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) with EDTA-PBS to a concentration of 0.142 mg / mL, and used as an anticoagulant for collected blood.
  • the administration liquid prepared in 68-1 was administered at a dose of 1 mL / kg under non-fasting conditions using a syringe and a 26G injection needle (both manufactured by Terumo) (40 nmol / kg as S1C (disialo) -SRIF28).
  • Blood was collected from the rat cervical vein before administration, 2 minutes, 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 2 hours, 4 hours, and 8 hours after administration.
  • the collected blood (0.2 mL) was immediately mixed with 0.2 mL of the aprotinin-containing EDTA-PBS solution prepared in 68-1 above, and left on ice for 30 minutes or more. After centrifugation (1,870 ⁇ g, 4 ° C., 10 minutes), 250 ⁇ L of the supernatant was collected and used as a plasma sample. As blank plasma, plasma obtained by similarly treating blood collected from an untreated rat cervical vein was used. Plasma samples were stored frozen until used for measurement. In addition, the chip
  • 68-3 Plasma Concentration Measurement S1C (disialo) -SRIF28 plasma concentration measurement in the plasma sample obtained in 68-2 above was performed using Phoenix Pharmaceuticals Inc. Somatostatin EIA kit (Phoenix Pharmaceuticals Inc, EK-060-03). It was performed using. The plasma sample was diluted 5 times, 20 times, 100 times, 400 times, 1600 times using the assay buffer attached to the EIA kit, and used as a measurement sample. A standard solution for preparing a calibration curve was prepared as follows.
  • the blank plasma obtained in 68-2 above is diluted in the same manner as the plasma sample using the assay buffer attached to the EIA kit, and used as an assay buffer for preparing a standard solution (for example, when the plasma sample is diluted 100 times).
  • S1C (disialo) -SRIF28 was diluted with a PBS solution to prepare a 100 ⁇ M solution, and a 2 ⁇ M solution was prepared from the 100 ⁇ M solution.
  • the obtained 2 ⁇ M S1C (disialo) -SRIF28 solution was serially diluted with an assay buffer for preparing a standard solution to prepare 20 nM, 10 nM, 2 nM, 0.4 nM, 0.08 nM, and 0.04 nM standard solutions.
  • the plasma concentration was calculated by multiplying the obtained result by the dilution rate and further by the dilution rate 2 with the aprotinin-containing EDTA-PBS solution as the anticoagulant treatment.
  • the same operation was performed using non-glycosylated SRIF28 instead of the glycosylated product.
  • FIG. 2 shows the time course of S1C (disialo) -SRIF28 concentration in the obtained plasma.
  • AUC was calculated by the trapezoidal method from the obtained S1C (disialo) -SRIF28 concentration transition using the moment analysis method. Further, the maximum plasma concentration (C max ) was determined by extrapolation from the predicted initial concentration (C 0 ) upon intravenous administration, and further from t 1/2 , MRT, and the actual measurement values upon subcutaneous administration. The resulting pharmacokinetic parameters are shown in Table 4. As can be seen from the results shown in FIG. 2 and Table 4, S1C (disialo) -SRIF28 has a significant increase in t1 / 2 and MRT compared to non-glycosylated SRIF28, and AUC and Cmax . An increase was observed.
  • sugar chain adducts have improved in vivo stability compared to non-sugar chain adducts.
  • the increase in AUC and Cmax is considered to be due to the improvement in stability in the living body.
  • Example 69 Pharmacokinetic Study 2 Using Rats A pharmacokinetic test was carried out in the same manner as in Example 68 except that S1C (disialo) -SRIF28, N5C (disialo) -SRIF28 and S1C (disialo) N5C (disialo) -SRIF28 were used as the glycosylated adduct. . As a control, non-glycosylated SRIF28 was used instead of the glycosylated product. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 70 Pharmacokinetic Study 3 Using Rats Example 68 Similarly, pharmacokinetic studies were performed. As a control, non-glycosylated SRIF28 was used instead of the glycosylated product.
  • FIG. 4 shows the compound concentration transition in the obtained plasma.
  • Example 71 Pharmacokinetic study 4 using rats S1C (disialo) -SRIF28, N5C (disialo) -SRIF28, A9C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo) N5C (disialo) -SRIF28, N5C (disialo) A9C (disIFo) And S1C (disialo), N5C (disialo), A9C (disialo) -SRIF28, and the pharmacokinetic study was performed in the same manner as in Example 68. The resulting plasma compound concentration transition is shown in FIG.
  • Example 72 Pharmacokinetic study 5 using rats 5 A pharmacokinetic study was performed in the same manner as in Example 68 except that S1C (disialo) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, and S1-3C (disialo) -SRIF28 were used as the glycosylated adduct. . The resulting plasma compound concentration transition is shown in FIG.
  • BA (%) (AUC (sc) / Dose (sc) ) / (AUC (iv) / Dose (iv) ) AUC (sc) : AUC at the time of subcutaneous administration (min ⁇ nM) Dose (sc) : Dose in subcutaneous administration (nmol / kg) AUC (iv) : AUC at the time of intravenous administration (min ⁇ nM) Dose (iv) : Dose in intravenous administration (nmol / kg)
  • the bioavailability of the sugar chain adduct of the present invention increased as the number of modified sugar chains increased. That is, the non-glycosylated adduct was 5%, but the glycosylated polypeptide with one sugar chain added was 37-60%, and the average was 50%. Two sugar chains were added at intervals. It was found that the increase was 77-85%, an average of 81%, and that of 3 sugar chains added at intervals was 91%. In addition, comparing the ones with closely spaced sugar chains, it was found that the number with one added increased to 37%, the number with two added 55%, and the number with three added increased to 69%. (Compounds of Examples 1, 20, and 24).
  • bioavailability is improved by the sugar chain modification according to the present invention.
  • One of the causes may be the stability of the compound in the blood or the transferability (from the administration site) into the blood.
  • AUC at the time of subcutaneous administration which is an index for inferring blood transferability at the time of subcutaneous administration, increases with an increase in the number of modified sugar chains (1: 2209 min ⁇ nM, 2 (with intervals): 3400 min ⁇ nM, 3 (with intervals): 4015 min ⁇ nM), and it was speculated that the improvement in blood migration contributed to the increase in bioavailability.
  • t 1/2 and MRT prolongation effect for example, t 1/2 for intravenous administration, 1: 19.0 min, 2 ( (With spacing): 27.2 min, 3 (with spacing): 39.8 min), and stability in blood was estimated to be improved.
  • AUC at the time of intravenous administration does not increase relative to the number of modified sugar chains (1: 4453 min ⁇ nM, 2 (with intervals): 4198 min ⁇ nM, 3 (with intervals) : 4402 min ⁇ nM), it is considered that only an increase in blood stability due to an increase in the number of modified sugar chains of the compound does not contribute to an increase in bioavailability.
  • the dense compound 20 has 7306 min ⁇ nM compared to 4029-4465 min ⁇ nM of the compound 21, compound 22 and compound 23 with a gap, and in the case of the triple sugar chain, the gap Compared to 4402 min ⁇ nM of Compound 25, the density of Compound 24 is 5660 min ⁇ nM.
  • the bioavailability was improved compared to the case where the distance between the sugar chain modification positions was closer.
  • the compound 21, compound 22, and compound 23 with a gap are 77 to 85% (average value 81%) compared to 55% of the dense compound 20, and the three sugar chains In this case, the compound 25 with a gap is 91% compared to 69% of the dense compound 24. From these facts, it is considered that, as the position for sugar chain modification related to the present invention, the modification with a plurality of intervals at intervals rather than the modification with a plurality of densely contributes to the improvement of bioavailability.
  • Example 73 Pharmacokinetic study using rats 7 The pharmacokinetics test was carried out in the same manner as in Example 68 except that S1C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo (amide))-SRIF28, and S1C (disialo (aminoethylamide))-SRIF28 were used as the glycosylated adduct. Carried out. The resulting plasma compound concentration transition is shown in FIG.
  • Example 74 Pharmacokinetic study 8 using rats The pharmacokinetic test was carried out in the same manner as in Example 68 except that S1C (disialo) -SRIF28, S1C (disialo (Bn))-SRIF28, and S1C (disialo) -D-Trp22-SRIF28 were used as the glycosyl adduct. Carried out. The resulting plasma compound concentration transition is shown in FIG.
  • Example 75 Pharmacokinetic study using rats 9 The pharmacokinetic test was carried out in the same manner as in Example 68 except that S1C (disialo) -SRIF28, R13C (disialo) -SRIF28, and K14C (disialo) -SRIF28 were used as the glycosylated adduct. The resulting plasma compound concentration transition is shown in FIG.
  • Example 76 Pharmacokinetic study 10 using rats 10 S1C (disialo) -SRIF28, E12C (disialo) -SRIF28, N19C (disialo) -SRIF28, 29C (disialo) -SRIF28, S1C (monosialo) -SRIF28, S1C (asialo) -SRIF28 were used as the glycosylation products.
  • a pharmacokinetic test was carried out in the same manner as in Example 68 except that. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 77 Pharmacokinetic Study 11 Using Rats 11 A pharmacokinetic test was carried out in the same manner as in Example 68 except that S1C (disialo) -SRIF28, K14C (disialo) -SRIF28, and C (disialo) -SRIF14 were used as the glycosylated adduct. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 78 Pharmacokinetic study 12 using rats 12 A pharmacokinetic test was carried out in the same manner as in Example 68 except that C (disialo) -SRIF14, C (disialo) -C12linker-SRIF14, and C (disialo) -PEGlinker-SRIF14 were used as the glycosyl adduct. The resulting plasma compound concentration transition is shown in FIG.
  • Example 79 Pharmacokinetic study using rats 13 Example 68 except that SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1C (asialo) -SRIF28, S1C (diGlcNAc) -SRIF28, S1C (diMan) -SRIF28, S1C (GlcNAc) -SRIF28 were used as the glycosylated adduct A pharmacokinetic study was performed in the same manner as described above. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 80 Pharmacokinetic Study 14 Using Rats Except that S1C (disialo) -SRIF28, S1C (tetrasialo) -SRIF28, S1C (trisialo) -SRIF28, S1C (Asn (disialo))-SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28 were used as glycosylation products.
  • a pharmacokinetic test was performed in the same manner as in Example 68. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 81 Pharmacokinetic study 15 using rats 15 Example 68 except that SRIF28, S1C (disialo) -SRIF28, S1-2C (disialo) -SRIF28, S1-3C (disialo) -SRIF28, S1-4C (disialo) -SRIF28 were used as the glycosylated adduct. In the same manner as described above, a pharmacokinetic study was performed. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 82 Pharmacokinetic study 16 using rats 16 SRIF14, C (disialo) -SRIF14, C (disialo) -K-SRIF14, C (disialo) -RK-SRIF14, 2C (disialo) -RK-SRIF14, 3C (disialo)- A pharmacokinetic test was performed in the same manner as in Example 68 except that RK-SRIF14 was used. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • Example 83 Pharmacokinetic study 17 using rats The pharmacokinetics test was carried out in the same manner as in Example 68 except that S1C (asialo) -SRIF28, S1-2C (asialo) -SRIF28, and S1-3C (asialo) -SRIF28 were used as the glycosyl adduct. The compound plasma concentration transition obtained is shown in FIG.
  • the pharmacokinetic parameters of each compound were calculated in the same manner as in Example 68 from the plasma compound concentration transition obtained in the pharmacokinetic tests 7 to 18 of Examples 73 to 84.
  • the resulting pharmacokinetic parameters are shown in Tables 5B-5F.
  • S1C (disialo) -D-Trp22-SRIF28 is 13 to 18 times longer by t 1/2 and AUC is 8 to 23 times compared to non-glycosylated SRIF28 in intravenous administration Increased.
  • C (disialo) -SRIF14, C (disialo) -K-SRIF14, and C (disialo) -R-K-SRIF14 are t 1/2 when administered intravenously as compared to SRIF14 which is a non-glycosylated adduct. Increased 33-38 times and AUC increased 44-55 times. Also, C (disialo) -C12linker-SRIF14 , C (disialo) -PEGlinker-SRIF14 , compared to SRIF14 non glycosylated body, t 1/2 is extended 22-33 times, AUC is 14-30 Doubled. That is, as in Example 68, it was considered that the modification in the sugar chain improved the stability in blood.
  • the size of the sugar chain to be modified is changed to GlcNAc (monosaccharide), diMan (pentasaccharide), diGlcNAc (7 saccharide), asialo (9 saccharide), monosialo (10 saccharide),
  • the t 1/2 , AUC, and bioavailability at the time of subcutaneous administration depend on the size of the sugar chain to be modified. Tee increased 2 to 17 times, 3 to 120 times, and 2 to 11 times, respectively.
  • sugar chain to be modified not only improves blood stability, but also changes the rate of increase.
  • dimannose sugar chains and asialo sugar chains are known to interact with specific proteins, so they can also be used to target specific proteins or organs or cells that have specific proteins. It is considered that it can be used.
  • sialic acid at the non-reducing end for example, S1C (disialo (amide))-SRIF28, S1C (disalo) added with a sugar chain whose charge has been changed by introducing aminoethylamide, amide, Bn or the like into a carboxy group (aminoethylamide)) - SRIF28, S1C (disialo (Bn)) - SRIF28 is compared to non-glycosylated member in intravenous administration, t 1/2 is extended 11-14 times, AUC is increased by 7 to 12 times And blood stability was improved.
  • SRIF14 was modified with a single disialo sugar chain C (disialo) -RK-SRIF14, two modified 2C (disialo) -RK-SRIF14, three Modified 3C (disialo) -RK-SRIF14 is 38,63,71 times longer by t1 / 2 compared to non-glycosides on intravenous administration, and AUC is 55,42, Increased 36 times.
  • SRIF28 was modified with S1C (disialo) -SRIF28 with one modified disialo sugar chain, 2 modified S1-2C (disialo) -SRIF28, 3 modified S1-3C (disialo) -SRIF28, 4 modified S1-4C (disialo) -SRIF28 has an increase in t 1/2 of 13, 21, 30, 48 times, respectively, and AUC of 11, 12, 12, Increased 15 times. In both cases of SRIF14 and SRIF28, it was revealed that blood stability was improved according to the number of disialo sugar chains to be modified.
  • S1-2C (disialo) -SRIF28, S1-2C (asialo) -SRIF28, C (disialo (aminoethylamide)) ⁇ S1C (disilo) -SRIF28, S1-2C (disialo) (Bn))-SRIF28, S1-2C (disialo (amide))-SRIF28 is increased by 6 to 21 times in t 1/2 compared to non-glycosylated adducts when administered intravenously, Increased 6-12 times. That is, the blood stability was improved by modifying the sugar chain to SRIF28.
  • Example 85 Plasma stability test using rat plasma 85-1
  • treatment solution reagent and rat plasma Glycoadduct and non-glycosylated SRIF28 were dissolved in PBS solution to prepare 2 ⁇ M solution, and treatment solution It was.
  • 10% TFA was prepared by dissolving trifluoroacetic acid (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 208-02746) with water so as to be 10 v / v%.
  • Rat plasma was prepared from Wistar rats (Crlj: Wistar, male, Nippon Charles River Co., Ltd., 7 weeks old) as heparin-added plasma (heparin: Japanese Pharmacopoeia Heparin Sodium Injection (Mochida Pharmaceutical)).
  • the sampling time was 0 hour, 1 hour, 2 hours, 4 hours, or 0 hour, 4 hours, 8 hours, and 24 hours.
  • plasma obtained by the same treatment was used except that a PBS solution was used as a treatment liquid. Plasma samples were stored frozen until used for measurement. In each experiment, non-glycosylated SRIF28 was used as a positive control.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention has increased plasma stability compared to SRIF28. That is, in the case where one sugar chain is added to the 1st, 5th, 9th and 12th positions (compounds of Examples 1, 2, 3 and 4), it is 4.5 to 6.7 times that of SRIF28. 15.9 times the sugar chain added at position 13 (compound of Example 5), 19.1 times the sugar chain added at position 14 (compound of Example 6), and the sugar chain at position 30 16.8 times (compound of Example 14). Moreover, in the case where one additional sugar chain-added amino acid was further added to the 19th position and the C-terminal side, the number was 20 times or more (compounds of Examples 10 and 13). It was shown that the position where the sugar chain is added increases the plasma stability from the 1st position toward the C-terminal side.
  • Example 86 GH Production Inhibition Test Using Rats
  • the glycosylated polypeptide of the present invention had affinity for each receptor of SSTR.
  • the affinity for each SSTR was attenuated, but even in such a case, the receptors in vivo were increased by extending the blood half-life and increasing bioavailability shown in Examples 68 to 85.
  • an in vivo test using rats was conducted to evaluate the administration effect of the glycosylated polypeptide of the present invention on growth hormone (GH) production. did.
  • the increase in the amount of GH produced in the blood is thought to affect the biological reaction by causing cell proliferation, differentiation and activation of biosynthetic systems in various organs through the paracrine action of GH. It is done. Somatostatin released from the hypothalamus suppresses GH secretion into the blood from the anterior pituitary gland.
  • This experimental system was carried out as a test system capable of evaluating the pharmacological action of the glycosylated form on SSTR and the residual in blood after administration of the glycosylated form, using blood GH production as an index.
  • 0608101 manufactured by Kyoritsu Pharmaceutical Co., Ltd.
  • a general anesthetic is 50 mg / kg. It was administered intraperitoneally using an injection needle.
  • GRF was administered as a GH release promoter at a dose of 1 mL / kg using a syringe and a needle at a dose of 1 mL / kg 1 hour after administration of the glycosylated, that is, after 50 minutes or more under anesthesia.
  • Five minutes after administration of GRF blood was collected from a rat neck vein using a syringe and a needle containing heparin.
  • Plasma samples were stored frozen until used for measurement.
  • Plasma GH Concentration GH concentration in the plasma sample obtained in the above 86-2 was measured using SPI-Bio Rat GrowthHorne EIA kit (SPI-Bio, A05104). The plasma sample was diluted 20 times, 100 times, and 500 times using the assay buffer attached to the EIA kit to obtain a measurement sample.
  • a standard solution for preparing a calibration curve was prepared by preparing a 40 ng / mL solution with distilled water according to the attached instructions, and then serially diluting with an assay buffer to obtain 20 ng / mL, 10 ng / mL, 5 ng / mL, 2 0.5 ng / mL, 1.25 ng / mL, 0.63 ng / mL, and 0.31 ng / mL were prepared.
  • the GH concentration was calculated by multiplying the obtained result by the dilution rate. Table 7 shows the GH concentration in the obtained plasma sample.
  • the glycosylated product of the present invention suppressed GH production in rats.
  • the glycosylated adducts of Example 1, Example 10, and Example 13 were measured by the method of Example 67-1 and the ratio between the Ki value for each receptor and the Ki value of SRIF14 having no sugar chain In the range of 100: 1 to 1.3: 1.
  • the sugar chain adduct of Example 1 is shown to have a blood half-life increased by 10 times or more when measured by the method of Examples 68 to 72. From this example, it was shown that the sugar chain adduct effectively exerts pharmacological action even in vivo.
  • the sugar chain adduct of the present invention had a GH production inhibitory action even when administered 1 hour before GRF administration. Moreover, it was shown that the effective dose with respect to rat GH production ability differs about 10 times in Example 1 and the glycosylated form of Example 10 and Example 13. This is similar to the fact that when measured by the method of Example 67-1, their receptor affinity is about a 10-fold difference in Ki value. Even when the affinity of the glycosylated adduct was somewhat attenuated, it was shown to have pharmacological activity.
  • Example 87 GH Production Inhibition Test 2 Using Rats In the same manner as in Examples 86-1 to 86-3, a rat GH production inhibition test was carried out on the following compound, which is a sugar chain adduct.
  • the glycosylated polypeptide of the present invention suppressed GH production in rats.
  • S1C (disialo) -SRIF28 suppressed GH production from 1 nmol / kg and showed 82-99% GH production suppression effect at 3-10 nmol / kg. This is presumably because, as shown in Examples 67-1 and 67-2 and Examples 68 to 85, it has affinity for SSTR1 to SSTR5 and the retention in blood is improved.
  • Example 88 Drug Efficacy Test in Gastrointestinal Obstruction Model As shown in Examples 86 and 87, it was proved that the glycosylated polypeptide of the present invention effectively acts as an agonist in the living body of rats.
  • an evaluation in a rat gastrointestinal obstruction model was performed. In gastrointestinal obstruction such as ileus, gastrointestinal symptoms such as abdominal fullness, vomiting, and abdominal pain occur due to tissue damage to the gastrointestinal tract and decreased absorption of water and electrolytes. It is known that the pathological condition is caused by obstruction of the contents of digestive tract contents or release of digestive juice or physiologically active substance into the digestive tract.
  • Somatostatin is effective in improving symptoms by suppressing the secretion of various digestive fluids via SSTR expressed in the digestive system or reducing the contents of the digestive tract by promoting absorption of water and electrolytes.
  • This experimental system was carried out as a test system for evaluating the intestinal fluid absorption promotion or secretion inhibitory effect using the change in the weight of the intestinal fluid in the jejunum after intestinal obstruction as an index.
  • blood parameters of amylase (pancreas), lactate dehydrogenase (LDH, liver), and creatine phosphokinase (CPK, skeletal muscle, myocardium, etc.), which are deviating enzymes were measured as indices at the time of tissue damage.
  • Example 88-1 Creation of Gastrointestinal Obstruction Model This test was commissioned to Mitsubishi Chemical Courtce Corporation.
  • a midline incision was made in the abdomen, and the jejunum at about 10 cm from the duodenal posterior muscle was ligated with a suture. Thereafter, the incision was quickly sutured and fasted until compound administration.
  • the jejunum was not ligated, and a midline incision was made in the abdomen and then the incision was sutured.
  • Example 88-2 Compound Preparation and Administration Japanese Pharmacopoeia Saline Solution Using S1C (disialo) -SRIF28, C (disialo) -RK-SRIF14, S1-2C (asialo) -SRIF28 as a glycosyl adduct It was dissolved in (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) to prepare a 40 ⁇ M solution, which was used as an administration solution. 18 hours after the gastrointestinal occlusive surgery, it was subcutaneously administered to the back of the neck using a syringe and a 25G injection needle (both manufactured by Terumo) at a dose of 1 mL / kg. As the Vehicle group, a physiological saline solution containing no glycosylated polypeptide was administered in the same manner. In addition, octreotide was administered as a control.
  • Example 88-3 Measurement of Intestinal Fluid Weight
  • a midline incision was made in the abdomen under inhalation anesthesia, and 1.5 mL of blood was collected from the abdominal vena cava. Then, the ligated jejunum on the duodenal ligament side was removed. The liquid and blood on the jejunum surface were removed with a paper towel, and nerves, blood vessels, and fats attached to the jejunum were excised, then cut to a length of 6 cm, and wet weight was measured. Then, it was dried at 36 degrees for 24 hours, and the dry weight was measured. Intestinal fluid weight (mg) was calculated as wet weight-dry weight. Table 9 shows the weight of the jejunum obtained.
  • S1C (disialo) -SRIF28, C (disialo) -RK-SRIF14, and S1-2C (asialo) -SRIF28 all showed an increase in intestinal fluid weight as compared to vehicle, and the glycosylated adduct of the present invention.
  • S1-2C (asialo) -SRIF28 had half the AUC upon subcutaneous administration in Examples 83 and 84 compared to S1C (disialo) -SRIF28.
  • Example 88-4 Measurement of blood parameters Using the blood collected in Example 88-3, the amylase concentration (IU / L), LDH concentration (IU / L), and CPK concentration (IU / L) were automatically analyzed 7170. (Hitachi). As the measurement method, BG5B method, UV-rate method and JSCC method were used, respectively. Table 10 shows the obtained results.
  • Octreotide is a compound having specific affinity for SSTR2, SSTR3, and SSTR5, while having binding affinity for the receptor. Since there is a report that all receptors of SSTR1 to SSTR5 are expressed in rat pancreas (J Histochem Cytochem. 2004 Mar; 52 (3): 391-400.), Glycosylated adduct is octreotide The possibility that the tissue damage was reduced by acting on a receptor different from that of. In addition, octreotide and C (disialo) -RK-SRIF14 had a low LDH activity compared to vehicle. In addition, none of the parameters deteriorated by administration of the glycosylated product.

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Abstract

　【課題】ソマトスタチン受容体に対する親和性を有し、かつ、ソマトスタチンと比べて、血中安定性が向上した糖鎖付加ポリペプチドを提供する。　【解決手段】ソマトスタチンまたはその類縁体において、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されていることを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドに関する。

Description

糖鎖付加ポリペプチドおよび当該ポリペプチドを含む医薬組成物
　本発明は、糖鎖付加ポリペプチド、当該ポリペプチドを含む医薬組成物に関する。
　ソマトスタチンは、中枢神経系および周辺組織の両方に存在する環式ペプチドである。ソマトスタチンは、最初に、哺乳類の視床下部から単離され、下垂体前葉から成長ホルモン分泌物の重要な阻害剤として同定された。このペプチドは、視床下部、膵臓、消化管等に広く分布しており、ソマトスタチンレセプターへの結合を介して作用を発現する。また、ソマトスタチンは、下垂体における成長ホルモン（ＧＨ）の分泌抑制、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）分泌抑制をはじめ、消化管でのガストリン、セレクチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ＶＩＰ（Ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、膵臓でのグルカゴン、インスリン等の種々のホルモン分泌を抑制することで知られている。加えて、消化管運動を抑制する作用を有することも知られている。
　構造式：Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｃｙｓ－Ｌｙｓ－Ａｓｎ－Ｐｈｅ－Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ－Ｓｅｒ－Ｃｙｓ（配列番号１）を有する天然のソマトスタチン（ソマトトロピン放出阻害因子（ＳＲＩＦ）としても知られる）が、最初に、Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎおよび共同研究者によって単離された。このソマトスタチンは受容体のファミリーと相互作用することによってその効果を発揮する。ソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）には、１から５までのサブタイプ（ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５）が存在し、なかでもＳＳＴＲ２はＧＨ分泌性ヒト下垂体アデノーマ、中枢神経系、下垂体前葉、網膜、副腎髄質、胃、十二指腸粘膜、小腸、結腸の各組織、および膵臓ランゲルハンス島のグルカゴン分泌性Ａ細胞に分布することが知られている。また、これらの各受容体は、各種の腫瘍においても発現することが知られており、例えば、機能性下垂体腺腫においてはＳＳＴＲ１とＳＳＴＲ５が発現しており、胃腸腫瘍においてはＳＳＴＲ２の他、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３が発現しており、褐色細胞腫ではＳＳＴＲ３が発現しており、前立腺癌においてはＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ５が発現しており、結腸直腸癌においては、ＳＳＴＲ５が発現していることが報告されている（非特許文献１）。また、ＳＳＴＲ４は、拮抗的に調節作用を持つレセプターとして機能すること、および、緑内障関連の疾患の治療において重要である可能性について報告されている（非特許文献２）。このように、ソマトスタチンおよびその類縁体は、ソマトスタチン関連疾患や様々な種類の腫瘍に対して潜在的に有用な治療薬である。
　一方で、天然に存在するソマトスタチンは、血中半減期が２～３分と短いため、生物学的利用能が小さく、作用の持続時間が短いという二つの望ましくない性質を示すので、治療剤としての使用や応用は限られる。この理由により、効力、生体安定性、作用の持続時間、または成長ホルモン、インスリンもしくはグルカゴンの放出の抑制を考慮した選択性のいずれかが優れたソマトスタチン類縁体を見い出すために様々なソマトスタチン類縁体の開発がなされてきた。
　臨床的に利用できる最初に承認されたソマトスタチン類縁体としては、オクトレオチド（Ｏｃｔｒｅｏｔｉｄｅ）（特許文献１および特許文献２）が報告されており、このオクトレオチドは、ソマトスタチン受容体のＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、およびＳＳＴＲ５に対して親和性を有することが知られている。
　オクトレオチドは、ソマトスタチンの生物学的活性を示すのに重要な部分である４つのアミノ酸（Ｐｈｅ－Ｔｒｐ－Ｌｙｓ－Ｔｈｒ）の配列を有し、その配列の両末端にジスルフィド（Ｓ－Ｓ）結合を形成するＣｙｓを有し、さらにその両末端のＣｙｓの外側にＤ－ＰｈｅとＴｈｒ（ｏｌ）を有する８つのアミノ酸よりなる環状ペプチドとして開発されている。このオクトレオチドは、そのアミノ酸配列により、血中半減期を向上させることで作用の持続性を得ることができ、また、ソマトスタチンに比べ、成長ホルモン（ＧＨ）に対する選択性が高く、強力な作用を持つことが可能である。
　このようなオクトレオチドを含むソマトスタチン類縁体は、ホルモン分泌性およびホルモン依存性腫瘍を有する患者の治療に使用することができる。現在のところ、神経内分泌系腫瘍である転移性カルチノイド腫瘍に関連する症状（潮紅、下痢、心弁膜疾患および腹痛）ならびに血管作用性腸管ペプチド（ＶＩＰ）分泌腺腫に関連する症状（水様性下痢）は、オクトレオチドによって治療される。
　例えば、カルチノイドおよびＶＩＰ産生腫瘍において、オクトレオチドはその活性因子の分泌および作用の両方を阻害する。したがって多量分泌性下痢を特徴とするＶＩＰ産生腫瘍では、ソマトスタチン類縁体は、ＶＩＰ分泌阻害により、また直接腸管分泌に影響を与えて、その下痢を低減させることができる。
　しかしながら、一方で多くの神経内分泌腫瘍は、オクトレオチドのようなソマトスタチン類縁体に対して耐性を有していることが報告されている（非特許文献３）。また、オクトレオチドは、先端巨大症の治療に使用されるが、先端巨大症患者の約３分の１には、効果がないことも報告されている。さらに、大半のカルチノイド腫瘍患者に対して、オクトレオチドは投与初期のみ効果を発揮し、投与期間が長引くとタキフィラキシー（速成耐性、速成寛容）が起こることが報告されている。さらに、初期のクッシング病患者の副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）産生抑制に対してオクトレオチドは効果を示さないことが報告されている。
　上記のような課題から、複数のソマトスタチン受容体を発現する腫瘍に対しては、天然のソマトスタチンのように高い親和性で複数の受容体サブタイプに結合するソマトスタチン類縁体の開発が望まれており、また、このようなソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチン類縁体は、これまでのソマトスタチン類縁体に治療効果がない患者や耐性を有する患者にも効果を有する可能性が示唆されている（非特許文献４）。
　このように、天然に存在するソマトスタチンに類似した構造で、同様にソマトスタチン受容体に対して親和性を有し、かつ、ソマトスタチンに比べて血中半減期が延長したソマトスタチンアナログの開発が望まれていた。
　一方、糖鎖が生体内において様々な役割を担っていることが明らかになってきており、血中における半減期を延長するために、オクトレオチドに糖鎖を付加する方法も提案されている（例えば、特許文献３）。
　しかしながら、その構造の複雑さや多様性によって研究が遅れており、糖鎖の種類や糖鎖を付加する位置が、必ずしも最適化されているとは言えず、これまでのソマトスタチン類似体の問題点を克服した糖鎖付加ポリペプチドについては報告されていない。
米国特許第４，３１０，５１８号 米国特許第４，２３５，８８６号 特開平０３－０１４５９９号
Ｃｕｒｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００４，Ｖｏｌ．４，ｐｐ．６０８－６１３ Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３，Ｖｏｌ．４６，ｐｐ．５５８７－５５９６ Ｍｏｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２０１０，Ｖｏｌ．２４（１），ｐｐ．２４０－２４９ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２８６，２００８，ｐｐ．６９－７４
　本発明の課題は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有し、かつ、ソマトスタチンと比べて、血中安定性が向上した糖鎖付加ポリペプチドを提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために研究を重ねた結果、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持し、かつ、血中安定性が向上した糖鎖付加ポリペプチドを見出した。
　即ち、本発明は、
（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４；（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；（Ｃ）ＳＲＩＦ１４の類縁体;（Ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４に対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｎ個（ここでＮは、１以上２０以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および、（Ｆ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｍ個（ここでＭは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする糖鎖付加ポリペプチドに関する。
　ここで、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸が、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｎ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｆ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｍ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、さらに、Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列が、Ｘ－Ｙ－で表され、ここで、ＸはＬ個（ここでＬは１以上６以下の整数）の任意のアミノ酸の配列を意味し、また、Ｙは、（１）Ｌｙｓ、（２）Ａｒｇ－Ｌｙｓ、（３）Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ、（４）Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（５）Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（６）Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（７）Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（８）Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（９）Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１０）Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１１）Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１２）Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１３）Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、（１４）Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、および（１５）上記配列（２）～（１４）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列からなる群から選択される配列であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列を表すＸ－Ｙ－におけるＸを意味するＬ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸は、リンカーを介して当該Ｎ末端側に連結していることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの別の実施態様においては、（Ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８；（Ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；（Ｃ）ＳＲＩＦ２８の類縁体;（Ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８に対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｊ個（ここでＪは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および（Ｆ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｋ個（ここでＫは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；
からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸が、ＳＲＩＦ２８における１位に相当するアミノ酸、５位に相当するアミノ酸、９位に相当するアミノ酸、１２位に相当するアミノ酸、１３位に相当するアミノ酸、１４位に相当するアミノ酸、および、１９位に相当するアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｊ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｆ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｋ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記ソマトスタチン受容体に対する親和性が、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５からなる群より選択される受容体の少なくとも２以上の受容体に対する親和性を有することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、少なくともＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４のいずれか１つに対して親和性を有することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４の両方に対して親和性を有することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５の全てに対して親和性を有することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリぺプチドは、ＳＲＩＦ２８と比較して、増大した血中安定性を有することを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓであることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が４個以上の糖からなることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖、３本鎖複合型糖鎖、または４本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記２本鎖複合型糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖、およびジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が、下記式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 を示し、Ａｃは、アセチル基を示す。］
で表される糖鎖であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖が、非還元末端に少なくとも１つのシアル酸を有しており、前記シアル酸のカルボキシ基が、炭素数１～３０のアルキルアミノ基、ベンジル基、アミノ基、またはアミノエチルアミノ基により修飾されていることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、複数の糖鎖付加アミノ酸を有しており、前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも同一であることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドは、ＳＲＩＦ２８における１７位のＣｙｓと２８位のＣｙｓに相当するＣｙｓを有しており、さらに、これらのＣｙｓは、相互にジスルフィド結合していることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドのＣ末端は、アミド化されていることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端に、アジド基が導入されていることを特徴とする。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドが、標識されていることを特徴とする。
　また、本発明の別の態様は、（Ｉ）上記に記載する糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、（ＩＩ）薬理学的に許容される担体を含むことを特徴とする医薬組成物に関する。
　また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖が、実質的に均一であることを特徴とする。
　また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする。
　また、本発明の医薬組成物の一実施態様においては、前記ソマトスタチンに関連する疾患が、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、カルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患、ドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、ならびに、結膜炎からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする。
　また、本発明の別の態様は、上記に記載の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防方法に関する。
　また、本発明の治療または予防方法の一実施態様においては、前記ソマトスタチンに関連する疾患が、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、カルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患、ドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、ならびに、結膜炎からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有しており、また、ソマトスタチンと比べて向上した血中安定性を有する。また、本発明の糖鎖付加ポリぺプチドは、上記特徴を有することにより、ソマトスタチン関連疾患の治療に用いることができる。
　また、本発明の糖鎖付加ソマトスタチンに付加される糖鎖は、生体内で容易に分解されるので、その蓄積により生体に薬害を与えることはない。
　また、本発明の糖鎖付加ソマトスタチンに付加される糖鎖の一部または全部は、ヒトを含む哺乳類鳥類等の生体内に存在する糖鎖やその改変体であり、体内に投与しても副作用や抗原性を示す可能性が低い。アレルギー反応や、抗体産生が生じたり、それによって薬効が得られなくなったりする等の心配が少ない。
　さらに、本発明で用いられる糖鎖には、比較的短いものが多いので、複雑な製造工程を経ずに、均一な構造のものを得ることができる。従って、大規模かつ安定に医薬品レベルの高品質なソマトスタチン活性を有する糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
図１Ａ～図１Ｄは、本発明の一実施の形態における糖鎖付加ポリペプチドについての各化合物名と、当該化合物名を有する糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列情報を示した図である。また、図１Ｅは、ＳＲＩＦ１４、ＳＲＩＦ２８、および本発明の一実施の形態における糖鎖付加ポリペプチドを、ソマトスタチン受容体発現細胞に処置した際の、ｃＡＭＰ産生抑制作用（アゴニスト活性）についてのＩＣ５０の値を示すグラフである。 図２は、ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与または皮下投与した際の、各ポリペプチドの血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図２中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図３は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図３中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図４は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図４中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図５は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図５中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図６は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図６中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図７は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図７中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図８は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図８中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図９は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図９中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１０は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１０中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１１は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１１中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１２は、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１２中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１３は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１３中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１４は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））－ＳＲＩＦ２８ラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１４中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１５は、ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１５中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１６は、ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１６中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１７は、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１７中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１８は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をラットへ静脈内投与および皮下投与した際の、血漿中の濃度の推移を示すグラフである。図１８中、左のグラフが静脈内投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフであり、右のグラフが皮下投与した際の各ポリペプチドの血漿中濃度の推移を示すグラフである。 図１９は、本発明の一実施の形態における糖鎖付加ポリペプチドについて、ラット血漿を用いた血漿中安定性試験の結果を示すグラフである。
　本明細書において「ソマトスタチン」とは、１４個のアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４、または、２８個のアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８を指す。
　なお、本明細書において、ＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列におけるＮ末端のＳｅｒを１位とし、Ｃ末端のＣｙｓを２８位とする。ここで、ＳＲＩＦ１４は、ＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列における１５位から２８位のアミノ酸配列と完全一致している。なお、ＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列の１５位はＡｌａであるが、ＳＲＩＦ１４のアミノ酸配列（配列番号１）におけるＮ末端のＡｌａを、ＳＲＩＦ２８の１５位に対応させて、１５位とする。なお、ＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８は、１７位のＣｙｓと２８位のＣｙｓにおいてジスルフィド結合を有する。
　ＳＲＩＦ１４は下記のアミノ酸配列（配列番号１）を有する。なお、下記アミノ酸配列において、「Ａｌａ１５」の１５は、１５位のＡｌａであることを意味する。
Ａｌａ１５‐Ｇｌｙ１６‐Ｃｙｓ１７‐Ｌｙｓ１８‐Ａｓｎ１９‐Ｐｈｅ２０‐Ｐｈｅ２１‐Ｔｒｐ２２‐Ｌｙｓ２３‐Ｔｈｒ２４‐Ｐｈｅ２５‐Ｔｈｒ２６‐Ｓｅｒ２７‐Ｃｙｓ２８
　ＳＲＩＦ２８は下記のアミノ酸配列（配列番号２）を有する。
Ｓｅｒ１‐Ａｌａ２‐Ａｓｎ３‐Ｓｅｒ４‐Ａｓｎ５‐Ｐｒｏ６‐Ａｌａ７‐Ｍｅｔ８‐Ａｌａ９‐Ｐｒｏ１０‐Ａｒｇ１１‐Ｇｌｕ１２‐Ａｒｇ１３‐Ｌｙｓ１４‐Ａｌａ１５‐Ｇｌｙ１６‐Ｃｙｓ１７‐Ｌｙｓ１８‐Ａｓｎ１９‐Ｐｈｅ２０‐Ｐｈｅ２１‐Ｔｒｐ２２‐Ｌｙｓ２３‐Ｔｈｒ２４‐Ｐｈｅ２５‐Ｔｈｒ２６‐Ｓｅｒ２７‐Ｃｙｓ２８
　本明細書中において、「アミノ酸」とは、その最も広い意味で用いられ、天然のアミノ酸のみならずアミノ酸変異体および誘導体といったような非天然アミノ酸を含む。当業者であれば、この広い定義を考慮して、本明細書におけるアミノ酸として、例えば、天然タンパク原性Ｌ－アミノ酸；Ｄ－アミノ酸；アミノ酸変異体および誘導体などの化学修飾されたアミノ酸；ノルロイシン、β－アラニン、オルニチンなどの天然非タンパク原性アミノ酸；およびアミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物などが挙げられることを理解するであろう。非天然アミノ酸の例として、α－メチルアミノ酸（α－メチルアラニンなど）、Ｄ－アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（２－アミノ－ヒスチジン、β－ヒドロキシ－ヒスチジン、ホモヒスチジン、α－フルオロメチル－ヒスチジンおよびα－メチル－ヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）および側鎖中のカルボン酸官能基アミノ酸がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）が挙げられる。ソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチン類縁体のいくつかは、非天然アミノ酸を含むことが知られる。好ましい態様において、本発明の化合物に含まれるアミノ酸は、天然アミノ酸のみからなる。
　本明細書中において、アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたという場合、置換等されるアミノ酸の個数は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を保持する限り特に限定されないが、１～９個、好ましくは１～５個、より好ましくは１～３個程度であるかあるいは全体の長さの２０％以内、好ましくは１０％以内である。置換または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸またはアミノ酸アナログであり得、好ましくは天然のアミノ酸である。アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたソマトスタチンペプチドの例としては、例えば、２２位のＴｒｐをＤ体のＴｒｐ（Ｄ－Ｔｒｐ）で置換したソマトスタチンペプチド、１９位のＡｓｎを欠失させたもの（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ，２００１，４４，２２３８－２２４６）、２５位のＰｈｅをＴｙｒに置換したもの、８位のＭｅｔをＬｅｕに置換したもの（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９８２，１０：１０４９－１０５１）等が挙げられる。
　本発明において、「ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８の類縁体」とは、ソマトスタチンと構造上類似したポリペプチドおよび／またはソマトスタチンと重複した構造を有するポリペプチド、例えば、ソマトスタチンのアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換されたポリペプチド、ソマトスタチン改変体、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチンのフラグメント、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する伸長ソマトスタチンが挙げられる。
　本明細書中において、「アミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が保存的に置換された」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数および／または疎水性指数が類似している置換であって、そのような置換の前後で、ソマトスタチン受容体に対する親和性の明らかな低下または消失を生じない置換をいう。
　本明細書中において、「ソマトスタチン改変体」とは、ソマトスタチンの改変体であって、ソマトスタチンの天然に存在する変異体、またはソマトスタチンを人工的に改変した化合物を含み、そのような改変としては、例えば、ソマトスタチンの１または複数のアミノ酸残基の、アルキル化、アシル化（例えばアセチル化）、アミド化、カルボキシル化、エステル形成、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、水酸化、標識成分の結合等が挙げられる。
　本明細書中において、「ソマトスタチン受容体に対する親和性を有するソマトスタチンのフラグメント」とは、ソマトスタチンのＮ末端および／またはＣ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失し、かつソマトスタチン受容体に対する親和性を維持したペプチドである。
　本明細書中において、「ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する伸長ソマトスタチン」とは、ＳＲＩＦ２８またはＳＲＩＦ１４のＮ末端および／またはＣ末端に１個またはそれ以上のアミノ酸が付加され、かつソマトスタチン受容体に対する親和性を維持したペプチドである。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；配列番号２で表わされるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチド；または、これらのポリペプチドのＮ末端またはＣ末端にさらにアミノ酸が付加されたポリペプチド；であって、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する糖鎖付加ポリペプチドを含む。
　配列番号１または配列番号２と相同性を有するポリペプチドは、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する限り、好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性を有することができる。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、上記のように、ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のＮ末端および／またはＣ末端に、さらにアミノ酸が付加されたポリペプチドも含む。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持する限り特に制限されないが、例えば、１以上２０個以下のアミノ酸を付加することができる。
　ここで、ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、Ｘ－Ｙ－で表すことができる。なお、ＹはＳＲＩＦ１４のポリペプチドにおけるＮ末端アミノ酸に直接結合するアミノ酸であり、Ｙは、以下（１）～（１５）のいずれかのアミノ酸配列からなる：
　（１）Ｌｙｓ、
　（２）Ａｒｇ－Ｌｙｓ、
　（３）Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ、
　（４）Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（５）Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（６）Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（７）Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（８）Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（９）Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（１０）Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（１１）Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（１２）Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（１３）Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
　（１４）Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、および、
　（１５）上記配列（２）～（１４）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列
　また、Ｘは１以上６以下の任意のアミノ酸であって、１個、２個、３個、４個、５個または、６個の任意のアミノ酸を示す。好ましくは、Ｘは、糖鎖付加アミノ酸であり、より好ましくは糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓである。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ＳＲＩＦ２８のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持する限り特に制限されないが、例えば、１以上６個以下の任意のアミノ酸を付加することができ、１個、２個、３個、４個、５個または、６個の任意のアミノ酸を付加することができる。ＳＲＩＦ２８のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸は、好ましくは糖鎖付加アミノ酸であり、より好ましくは糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓである。また、１以上６個以下の任意のアミノ酸は、その全てを糖鎖付加アミノ酸とすることもできる。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸は、ソマトスタチン受容体に対する親和性を維持する限り特に制限されないが、例えば、１以上６個以下の任意のアミノ酸を付加することができ、１個、２個、３個、４個、５個または、６個の任意のアミノ酸を付加することができる。ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸は、好ましくは糖鎖付加アミノ酸であり、より好ましくは糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓである。また、１以上６個以下の任意のアミノ酸は、その全てを糖鎖付加アミノ酸とすることもできる。
　本明細書中において、「ソマトスタチンのＮ末端側（ＳＲＩＦ２８の１位またはＳＲＩＦ１４の１５位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＳＲＩＦ２８においては、Ｎ末端である１位のＳｅｒに、さらに任意のアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸が付加したものいう。また、ＳＲＩＦ１４においては、Ｎ末端である１５位のＡｌａに、さらに任意のアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸が付加したものをいう。
　同様に、「Ｃ末端側（ＳＲＩＦ２８またはＳＲＩＦ１４の２８位）にさらに、１若しくは数個のアミノ酸が付加されたペプチド」という場合、ＳＲＩＦ２８またはＳＲＩＦ１４の２８位のＣｙｓに、さらに任意のアミノ酸または糖鎖付加アミノ酸が付加したもをのをいう。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、リンカーを介してアミノ酸をさらに付加することもできる。このようなリンカーとしては、例えば、アミノ酸とペプチド結合できるように、両末端にアミノ基およびカルボキシ基を有するアルキル鎖やポリエチレングリコール鎖等を挙げることができる。このようなリンカーとしては、例えば、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯ－（式中、ｎは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは１～１５の整数を示す。）や－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ－（式中、ｍは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは１～７の整数を示す。）等を挙げることができる。より具体的には、－ＮＨ－（ＣＨ２）１１－ＣＯ－（Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ）や－ＮＨ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３－ＣＨ２ＣＨ２－ＣＯ－（ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ）等を挙げることができる。また、リンカーを介して、糖鎖付加ポリペプチドに付加されるアミノ酸は、特に限定されないが、好ましくは糖鎖付加アミノ酸である。糖鎖付加アミノ酸としては、例えば、糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓを挙げることができる。
　また、本発明の一実施態様において、糖鎖付加ポリペプチドは、そのＮ末端に、アジド基を導入することもできる。糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端をアジ化すると、アジド‐アルキン［３＋２］環化付加反応やＳｔａｕｄｉｎｇｅｒ反応などを利用して、様々な分子を選択的に導入できることから好ましい。糖鎖付加ポリペプチドをアジ化する方法は、特に制限されないが、例えば、固相合成中において樹脂上に合成された糖ペプチドのＮ末端へ、縮合剤を用いてアジド置換脂肪酸を縮合させることにより得ることができる。アジド置換脂肪酸としては、４－アジドブタン酸、５－アジド－ペンタン酸（５－Ａｚｉｄｏ－ｐｅｎｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）、６－アジドヘキサン酸を挙げることができる。
　また、本発明の一実施態様において、糖鎖付加ポリペプチドは、そのＮ末端に、標識化合物を付加させることもできる。本発明に使用される標識化合物としては、以下に限定されないが、例えば、ビオチン、蛍光色素、金属イオンキレート剤等を挙げることができる。標識化合物は、糖ペプチドのＮ末端と直接結合させることもできるし、リンカーを介して糖ペプチドのＮ末端と結合とさせることもできる。例えば、標識化合物として、ビオチンを糖ペプチドのＮ末端に付加させることにより、アビジンとの強い結合を利用して、研究用試薬，臨床検査薬、またはミサイル療法への応用を可能とすることができる。
　なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドへの標識化合物の付加は、従来当業者に周知の方法により行うことができる。例えば、固相合成中における樹脂上の糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端に縮合剤を用いて標識化合物を縮合させることができる。
　本発明の「糖鎖付加ポリペプチド」は、少なくとも１個のアミノ酸が、糖鎖付加アミノ酸で置換されたことを特徴とする。
　本明細書中において、「糖鎖付加ポリペプチド」には、ソマトスタチンの少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたポリペプチド、上記ソマトスタチン類縁体において少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたポリペプチド等が含まれ、それぞれ、さらに糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されていても、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。これらのペプチドのＣ末端がアミド化されたペプチド（たとえば、Ａｌａ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ｌｙｓ‐Ａｓｎ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｔｒｐ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ｃｙｓ－ＮＨ２（配列番号３）のアミノ酸配列を有するＳＲＩＦ１４ＮＨ２や、Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ‐Ａｌａ‐Ｇｌｙ‐Ｃｙｓ‐Ｌｙｓ‐Ａｓｎ‐Ｐｈｅ‐Ｐｈｅ‐Ｔｒｐ‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｐｈｅ‐Ｔｈｒ‐Ｓｅｒ‐Ｃｙｓ－ＮＨ２（配列番号４）のアミノ酸配列を有するＳＲＩＦ２８ＮＨ２の、少なくとも１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されたペプチドも、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。さらに、これらのペプチドの塩も、糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。
　本明細書中において、塩は、酸付加塩または塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩を形成するために通常用いられる酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、リン酸等の無機酸およびｐ－トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、ｐ－ブロモフェニルスルホン酸、カルボン酸、コハク酸、クエン酸、安息香酸、酢酸等の有機酸である。塩基付加塩としては、水酸化アンモニウムまたはアルカリ若しくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、重炭酸塩等の無機塩基から誘導された塩が挙げられる。特に、薬学的に許容される塩が好ましい。
　本明細書中において、「糖鎖付加アミノ酸」とは、糖鎖が結合したアミノ酸であり、ここで糖鎖とアミノ酸とは、リンカーを介して結合していてもよい。糖鎖とアミノ酸との結合部位に特に制限はないが、糖鎖の還元末端にアミノ酸が結合していることが好ましい。
　糖鎖が結合するアミノ酸の種類に特に限定はなく、天然アミノ酸、非天然アミノ酸のいずれを用いることもできる。糖鎖付加アミノ酸が生体内に糖ペプチド（糖たんぱく質）として存在するものと同一または類似の構造を有するという観点からは、糖鎖付加アミノ酸は、Ｎ－結合型糖鎖のような糖鎖付加Ａｓｎ、Ｏ－結合型糖鎖のような糖鎖付加Ｓｅｒおよび糖鎖付加Ｔｈｒが好ましく、特に糖鎖付加Ａｓｎが好ましい。
　また、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとの結合容易性という観点からは、糖鎖付加アミノ酸のアミノ酸は、アスパラギン酸やグルタミン酸等の分子内に２つ以上のカルボキシ基を持つアミノ酸、リシン、アルギニン、ヒスチジン、トリプトファン等の分子内に２以上のアミノ基を持つアミノ酸、セリン、スレオニン、チロシン等の分子内に水酸基を持つアミノ酸、システイン等の分子内にチオール基を持つアミノ酸、アスパラギン、グルタミン等の分子内にアミド基を持つアミノ酸、が好ましい。特に、反応性の観点からは、アスパラギン酸、グルタミン酸、リシン、アルギニン、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、グルタミンが好ましい。
　なお、本発明の任意の糖鎖付加ポリペプチドについて、糖鎖構造、糖鎖以外の構造、糖鎖の付加部位および糖鎖の付加数が同一である場合に、糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎ（リンカーを介さない）の場合と糖鎖付加Ｃｙｓ（リンカーを介する）の場合で、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの血中半減期に大きな違いはないと考えられる。
　糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介して結合している場合、リンカーとしては、当該分野において用いられているものを広く使用することができるが、例えば、－ＮＨ－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－ＣＨ２－（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）、Ｃ１－１０ポリメチレン、－ＣＨ２－Ｒ－（ここで、Ｒは、アルキル、置換されたアルキル、アルケニル、置換されたアルケニル、アルキニル、置換されたアルキニル、アリール、置換されたアリール、炭素環基、置換された炭素環基、複素環基および置換された複素環基からなる群より選択される基から水素原子が１つ脱離して生ずる基である）、－（ＣＯ）－（ＣＨ２）ａ－（ＣＯ）－（式中、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）等を挙げることができる。
　糖鎖付加アミノ酸において糖鎖とソマトスタチン骨格上のアミノ酸がリンカーを介して結合している場合、リンカーが、糖鎖側の末端にアミノ酸を含むことも好ましい。アミノ酸の種類は特に限定されないが、好ましい例としてはＡｓｎを挙げることができる。
　なお、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、その記載（例えば、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチド」という記載）によって何ら製造方法が限定されるものではなく、後述のＡ法またはＢ法のいずれの方法で製造した糖鎖付加ポリペプチドであっても、「アミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチド」に含まれる。また、例えば、アミノ酸の結合していない糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸に直接またはリンカーを介して結合した糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加ポリペプチドにおいて、付加した糖鎖にさらに糖または糖鎖を付加することですでに付加された糖鎖を伸長させた糖鎖付加ポリペプチド；糖鎖付加アミノ酸のアミノ基および／またはカルボキシ基に１または数個のアミノ酸を結合させ、さらにこれを１または複数のソマトスタチンフラグメントと連結させた糖鎖付加ポリペプチド；アミノ酸の結合した糖鎖を、ペプチド上のアミノ酸にリンカーを介して結合した糖鎖付加ポリペプチド、なども最終的な構造が一致している限り、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸の数は、血中安定性や成長ホルモン等の分泌抑制等の生理活性、最終的な糖鎖付加ポリペプチドに存在するアミノ酸の個数や糖鎖付加前後の糖鎖付加ポリペプチドの分子量、等により適宜調節すればよい。例えば、１～１０個置換することが好ましく、１～５個置換することがより好ましく、１～３個置換することがさらに好ましい。簡便性の観点からは、１個の置換で所望の活性が得られるのであれば、１個の置換を選択することが好ましい。なお、本発明の一態様においては、２個以上置換することが好ましく、例えば、２～５個置換することが好ましく、２～３個置換することがより好ましい。一般に、ソマトスタチンの１個のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換された糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の１個以上をさらに糖鎖付加アミノ酸で置換した場合、血中安定性は増大し、受容体に対する親和性は減少する傾向がある。しかしながら、一方で糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性は増大するため、減少したソマトスタチン活性を補償または増大させることが可能である。
　また、糖鎖付加ポリペプチド中に複数の糖鎖を有する場合、糖鎖同士は糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列において、連続したアミノ酸に付加することもできるし、間隔をあけて、アミノ酸に付加することもできる。糖鎖を密に配置すると、急激な血漿中濃度の上昇がない点において好ましい。また、生物学的利用能の観点からは、糖鎖を付加する位置は、連続したアミノ酸に密に付加するよりも、間隔をとり複数の糖鎖を付加する方が好ましい。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいて、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、特に、複数のソマトスタチン受容体への親和性の観点より適宜調節することができる。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ポリペプチドのソマトスタチン受容体に対する親和性のうち、複数のＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の受容体に対して親和性を有するという観点からは、例えば、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側から１番目、２番目、３番目、６番目、１０番目、および、１４番目に付加されるアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。好ましくは、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側から３番目、６番目、１０番目、および、１４番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。
　また、同様に、複数のＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の受容体に対して親和性を有するという観点からは、ＳＲＩＦ２８における、１位、５位、９位、１２位、１３位、１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。好ましくはＳＲＩＦ２８の１位、５位、９位、および、１２位に相当するアミノ酸を挙げることができる。
　また、特に本発明の糖鎖付加ポリペプチドの２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する場合の例として、糖鎖付加ポリペプチドが複数のソマトスタチン受容体に対する親和性を有するという観点からは、例えばＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１０番目および１４番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目および１０番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より２番目および１４番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目および１５番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目、１５番目、および１６番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目、１０番目、および１４番目に付加されるアミノ酸の置換などを挙げることができる。好ましくは、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１０番目および１４番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目および１０番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目および１５番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１４番目、１５番目、および１６番目に付加されるアミノ酸；ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より６番目、１０番目、および１４番目に付加されるアミノ酸の置換などを挙げることができる。
　また、同様に、２以上のアミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する場合の例として、糖鎖付加ポリぺプチドが複数のソマトスタチン受容体に対する親和性を有するという観点からは、ＳＲＩＦ２８における、１位と５位に相当するアミノ酸；５位と９位に相当するアミノ酸；１位と１３位に相当するアミノ酸；１位に相当するアミノ酸と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸においてＮ末端側より１番目に付加されるアミノ酸；１位に相当するアミノ酸と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸においてＮ末端側より１番目および２番目に付加されるアミノ酸；１位、５位、および、９位に相当するアミノ酸の置換などを挙げることができ、好ましくは１位と５位に相当するアミノ酸の置換；５位と９位に相当するアミノ酸の置換；１位に相当するアミノ酸の置換と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸において１番目に付加されるアミノ酸；１位に相当するアミノ酸と１位のＮ末端側にさらに付加するアミノ酸においてＮ末端側より１番目および２番目に付加されるアミノ酸；１位、５位、および、９位に相当するアミノ酸の置換である。
　本発明の一態様において、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性という観点からは、例えば、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側から１番目、２番目、３番目、６番目、１０番目、１４番目に付加されるアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。好ましくは、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側より１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸を挙げることができる。より好ましくは、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＮ末端側より１番目に付加されるアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ１４のＣ末端側にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側より１番目に付加されるアミノ酸である。
　また、同様に、糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性という観点からは、例えば、ＳＲＩＦ２８における、１位、５位、９位、１２位、１３位、１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸であり、好ましくはＳＲＩＦ２８における１３位、１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目、および、２番目に付加されるアミノ酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸であり、特に好ましくはＳＲＩＦ２８における１４位、および、１９位に相当するアミノ酸、ならびに、ＳＲＩＦ２８のＣ末端にさらに付加されるアミノ酸においてＣ末端側から１番目に付加されるアミノ酸からなる群より選択される１以上のアミノ酸である。特にＳＲＩＦ２８のＮ末端から遠い部位のアミノ酸の置換も好ましい。
　ここで、「特定のアミノ酸に相当するアミノ酸」とは、糖鎖ポリペプチドにおいてアミノ酸の付加、欠失等がない限り、ＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列に対応する同一の位置のアミノ酸をいう。また、糖鎖ポリペプチドのアミノ酸配列内において、アミノ酸の付加、欠失が存在する場合には、アミノ酸の付加、欠失によるアミノ酸配列上の移動を考慮した位置にあるアミノ酸をいう。例えば、１位から４位までにＳｅｒ１‐Ａｌａ２‐Ａｓｎ３‐Ｓｅｒ４‐の配列を有する糖鎖付加ポリペプチドにおいて、２位と３位のアミノ酸の間に１つのアミノ酸（Ｔｒｐ）が付加された場合（Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ｔｒｐ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐）、３位のアミノ酸（Ａｓｎ）に相当するアミノ酸とは、糖鎖付加ポリペプチドにおいて、Ｔｒｐの挿入によりＣ末端側に１つ移動したアミノ酸（Ａｓｎ）をいう。
　本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸で置換するアミノ酸は、ＳＲＩＦ２８における１７位、２１位、２２位、２３位、および、２８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましく、特に、ＳＲＩＦ２８における１７位、２２位、２３位、および２８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸から選択される１以上のアミノ酸であることがより好ましい。
　本発明の一態様において、２以上のアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されている場合に、アミノ酸を糖鎖付加アミノ酸で置換する部位は、上記のいずれの組み合わせも採用することができるがこれに限定されない。例えば、１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がＳＲＩＦ１４またはＳＲＩＦ２８の任意の部位から選択される組み合わせ；１の部位が上記の好ましい部位から選択され、他の部位がソマトスタチンのＮ末端（ＳＲＩＦ２８における１位、または、ＳＲＩＦ１４における１５位）またはＣ末端にさらに付加された１若しくは数個のアミノ酸の任意の部位から選択される組み合わせ等もまた、本発明の好ましい一態様に含まれる。
　本発明の一態様において、糖鎖付加アミノ酸以外のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が生ずる部位は、例えば、ＳＲＩＦ２８における１７位、２２位、２３位、および２８位に相当するアミノ酸以外のアミノ酸から選択される１以上のアミノ酸であることが好ましい。
　本明細書中において、「糖鎖」とは、単位糖（単糖および／またはその誘導体）が１つ以上連なってできた化合物をいう。単位糖が２つ以上連なる場合、各々の単位糖同士の間は、グリコシド結合による脱水縮合によって結合する。このような糖鎖としては、例えば、生体中に含有される単糖類および多糖類（グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、シアル酸並びにそれらの複合体および誘導体）の他、分解された多糖、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、糖脂質などの複合生体分子から分解または誘導された糖鎖など広範囲なものが挙げられるがそれらに限定されない。糖鎖は直鎖型であっても分岐鎖型であってもよい。
　また、本明細書中において、「糖鎖」には糖鎖の誘導体も含まれ、糖鎖の誘導体としては、例えば、糖鎖を構成する糖が、カルボキシ基を有する糖（例えば、Ｃ－１位が酸化されてカルボン酸となったアルドン酸（例えば、Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルコン酸）、末端のＣ原子がカルボン酸となったウロン酸（Ｄ－グルコースが酸化されたＤ－グルクロン酸））、アミノ基またはアミノ基の誘導体（例えば、アセチル化されたアミノ基）を有する糖（例えば、Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミン、Ｎ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミンなど）、アミノ基およびカルボキシ基を両方とも有する糖（例えば、Ｎ－アセチルノイラミン酸（シアル酸）、Ｎ－アセチルムラミン酸など）、デオキシ化された糖（例えば、２－デオキシ－Ｄ－リボース）、硫酸基を含む硫酸化糖、リン酸基を含むリン酸化糖などである糖鎖が挙げられるがこれらに限定されない。
　本発明において、好ましい糖鎖は、ソマトスタチンに付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でソマトスタチンのアミノ酸と置換された場合）に、ソマトスタチンの血中安定性を増大させ、かつ、ソマトスタチン受容体に対する親和性を消失させない糖鎖である。本発明のある態様において、好ましい糖鎖は、ソマトスタチンに付加された場合（糖鎖付加アミノ酸の形でソマトスタチンのアミノ酸と置換された場合）に、ソマトスタチンの複数の受容体に対する親和性を維持できる糖鎖であり、さらに好ましくは、ソマトスタチンの全ての受容体に対する親和性を維持できる糖鎖である。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は特に限定されず、生体内で複合糖質（糖ペプチド（または糖タンパク質）、プロテオグリカン、糖脂質等）として存在する糖鎖であってもよいし、生体内では複合糖質として存在しない糖鎖であってもよい。
　生体内で複合糖質として存在する糖鎖は、本発明の糖鎖付加ポリペプチドが生体に投与されるという観点から好ましい。かかる糖鎖としては、生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）としてペプチド（またはタンパク質）に結合している糖鎖であるＮ－結合型糖鎖、Ｏ－結合型糖鎖等が挙げられる。好ましくは、Ｎ－結合型糖鎖が用いられる。Ｎ結合型糖鎖としては、例えば、高マンノース（ハイマンノース）型、複合（コンプレックス）型、混成（ハイブリッド）型を挙げることができ、特に好ましくは、複合型が良い。
　本発明で使用する好ましい複合型糖鎖としては、例えば、下記一般式
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
 ［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
 を示す。Ａｃはアセチル基を示す。］
で表される糖鎖等が挙げられる。
　尚、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおいては、糖鎖が生体内で複合糖質として存在する糖鎖であっても、Ｏ－結合型およびＮ－結合型以外の方法でソマトスタチンペプチドに結合していてもよい。例えば、上述のとおり、糖鎖がリンカーを介してＣｙｓやＬｙｓに結合しているものも、本発明の糖鎖付加ポリペプチドに含まれる。
　本発明の一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、４個以上、例えば５個以上、７個以上、特に９個以上、１１個以上の糖からなる糖鎖であることが好ましい。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、５～１１個、９～１１個または１１個の糖からなる糖鎖である。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドにおける糖鎖は、２本鎖の複合型糖鎖である。複合型糖鎖とは、２種類以上の単糖を含み、以下に示す基本構造と、Ｇａｌβ１－４ＧｌｃＮＡｃで示されるラクトサミン構造を有することを特徴とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
 　２本鎖複合型糖鎖とは、基本構造の末端の２つのマンノースに、それぞれ０～３糖からなる１本鎖の糖鎖が結合しているものをいう。２本鎖複合型糖鎖としては、例えば、以下に示すジシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 モノシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 アシアロ糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ジグルクナック糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ジマンノース糖鎖、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 等が好ましく、より好ましくはジシアロ糖鎖である。

　また、本発明の複合型糖鎖には、上記の２本鎖複合型糖鎖の他、３本鎖の複合型糖鎖（３分岐型複合型糖鎖）、４本鎖の複合型糖鎖（４分岐型複合型糖鎖）も含む。例えば、３本鎖、４本鎖の複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされる、トリシアロ糖鎖
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 下記構造式で表わされるテトラシアロ糖鎖
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
を挙げることができる。また、３本鎖複合型糖鎖および４本鎖複合型糖鎖としては、これらのトリシアロ糖鎖またはテトラシアロ糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
　さらに、本発明の複合型糖鎖には、フコースが付いたものも含む。フコースが付いた複合型糖鎖としては、以下の構造式で表わされるフコース含有複合型糖鎖
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
 を挙げることができる。また、これらのフコース含有複合型糖鎖の非還元末端から１又は複数の糖を失った糖鎖も挙げることができる。
　また、本明細書中において「ジシアロ糖鎖」、「モノシアロ糖鎖」、「アシアロ糖鎖」、「ジグルクナック糖鎖」、「ジマンノース糖鎖」、「２本鎖複合型糖鎖」、「３本鎖複合型糖鎖」、「４本鎖複合型糖鎖」、「フコース含有複合型糖鎖」には、上記化学式で示したもののほか、化学式で示した例と結合様式の異なるものも含まれ、かかる糖鎖も本発明の糖鎖として好ましく用いられる。かかる糖鎖としては、例えば、ジシアロ糖鎖またはモノシアロ糖鎖においてシアル酸とガラクトースが（α２→３）結合で結合しているもの等が挙げられる。
　また、糖鎖の非還元末端にシアル酸を有する糖鎖の場合には、シアル酸のカルボキシ基が修飾された糖鎖を用いることもできる。シアル酸のカルボキシ基の修飾としては、カルボキシ基の負電荷を消失させる、または、正電荷へ変換できる基であることが好ましく、例えば、炭素数１～３０のアルキルアミノ基、ベンジル基、アミノ基、アミノエチルアミノ基等を挙げることができる。これらの修飾基の導入により、シアル酸のカルボキシル基の負電荷を消失させる（ベンジル基、アミノ基等）、または、正電荷へ変換する（アミノエチルアミノ基等）ことで、糖鎖付加ポリペプチドの血中クリアランスや体内分布の制御を意図することができる。
　また、本発明で用いられる高マンノース型糖鎖は、上述した複合型糖鎖の基本構造に、さらにマンノースが２個以上結合している糖鎖である。高マンノース型糖鎖は嵩高いので、ペプチドに高マンノース型糖鎖を結合させることにより血中安定性がより高くなりうる。哺乳類の高マンノース型糖鎖のように、５～９個のマンノースを含む糖鎖が好ましいが、酵母の高マンノース型糖鎖のように、より多くのマンノースを含む糖鎖であってもよい。本発明に好ましく用いられる高マンノース型糖鎖としては、例えば、
ハイマンノース－５（Ｍ－５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
 ハイマンノース－９（Ｍ－９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
 等を挙げることができる。
　本発明において、好ましい糖鎖としては、例えば、ヒト体内において、タンパク質と結合した糖タンパク質として存在する糖鎖（例えば、「ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲＳ　Ｖｏｌ．５０，Ｎｏ．３，Ｆｅｂ．１９７５」に記載の糖鎖）と、同一の構造を有する糖鎖（構成糖の種類およびそれらの結合様式が同一の糖鎖）またはこれの非還元末端から１または複数の糖を失った糖鎖である、下記に記載の糖鎖を挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
　本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチド中の糖鎖付加アミノ酸における糖鎖の構造は、実質的に同一とすることもでき、または、異なる糖鎖構造を有していてもよい。糖鎖付加ポリペプチド中の糖鎖の構造を実質的に同一とする際は、例えば、９０％以上同一、あるいは９９％以上同一であることが好ましく、糖鎖の構造が完全に同一であることが最も好ましい。なお、本明細書中において、糖ペプチドにおける糖鎖の構造が同一であるとは、２本以上の糖鎖が付加した糖鎖付加ポリペプチドにおいて、当該糖鎖同士を比較した場合に糖鎖を構成する糖の種類、結合順序、および結合様式が糖ペプチド内において同一であることをいう。また、本発明の好ましい一態様において、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの糖鎖は、均一であることが好ましい。本明細書において、糖鎖付加ポリペプチドにおいて糖鎖が均一とは、糖鎖付加ポリペプチド間において糖鎖を比較した場合に、ペプチド中の糖鎖付加部位、糖鎖を構成する各糖の種類、結合順序、および糖間の結合様式が糖ペプチド間で同一であることをいい、少なくとも９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上の糖鎖の構造が均一であることを言う。特に、糖ペプチド間において糖鎖が均一である糖ペプチドを含む組成物等は、品質が一定であり、特に医薬品の製造や、アッセイなどの分野において好ましい。均一な糖鎖の割合は、例えば、ＨＰＬＣ、キャピラリー電気泳動、ＮＭＲ、質量分析等を用いた方法によって測定することが可能である。
　本発明において、好ましい糖鎖付加ポリペプチドは、例えば、後述の実施例１～６６において製造した糖鎖付加ポリペプチド（配列番号５～３７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２３～１２９、１３３～１３５、１３８～１４１、１４８、１５５、１６０）である。すなわち、以下のＳＲＩＦ２８のアミノ酸配列：
Ｓｅｒ１‐Ａｌａ２‐Ａｓｎ３‐Ｓｅｒ４‐Ａｓｎ５‐Ｐｒｏ６‐Ａｌａ７‐Ｍｅｔ８‐Ａｌａ９‐Ｐｒｏ１０‐Ａｒｇ１１‐Ｇｌｕ１２‐Ａｒｇ１３‐Ｌｙｓ１４‐Ａｌａ１５‐Ｇｌｙ１６‐Ｃｙｓ１７‐Ｌｙｓ１８‐Ａｓｎ１９‐Ｐｈｅ２０‐Ｐｈｅ２１‐Ｔｒｐ２２‐Ｌｙｓ２３‐Ｔｈｒ２４‐Ｐｈｅ２５‐Ｔｈｒ２６‐Ｓｅｒ２７‐Ｃｙｓ２８（配列番号２）において：
（ａ１）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１）（配列番号５）；
（ａ２）５位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２）（配列番号６）；
（ａ３）９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３）（配列番号７）；
（ａ４）１２位のＧｌｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４）（配列番号８）；
（ａ５）１３位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５）（配列番号９）；
（ａ６）１４位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６）（配列番号１０）；
（ａ７）１５位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例７）（配列番号１１）；
（ａ８）１６位のＧｌｙがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例８）（配列番号１２）；
（ａ９）１８位のＬｙｓがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例９）（配列番号１３）；
（ａ１０）１９位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１０）（配列番号１４）；
（ａ１１）２１位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１１）（配列番号１５）；
（ａ１２）２６位のＴｈｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１２）（配列番号１６）；
（ａ１３）２８位のＣｙｓのＣ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１３）（配列番号１７）；
（ａ１４）２８位のＣｙｓのＣ末端側にさらにＴｈｒ－ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１４）（配列番号１８）；
（ａ１５）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、２２位のＴｒｐがＤ体のＴｒｐに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１５）（配列番号１９）；
（ａ１６）９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、２２位のＴｒｐがＤ体のＴｒｐに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１６）（配列番号２０）；
（ａ１７）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２０）（配列番号２１）；
（ａ１８）１位のＳｅｒおよび５位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２１）（配列番号２２）；
（ａ１９）１位のＳｅｒおよび１３位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２２）（配列番号２３）；
（ａ２０）５位のＡｓｎおよび９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２３）（配列番号２４）；
（ａ２１）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが２つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２４）（配列番号２５）；
（ａ２２）１位のＳｅｒ、５位のＡｓｎ、および９位のＡｌａがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２５）（配列番号２６）；
（ａ２３）１位のＳｅｒがモノシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２６）（配列番号２７）；
（ａ２４）１位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２７）（配列番号２８）；
（ａ２５）１位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２８）（配列番号２９）；
（ａ２６）１位のＳｅｒがアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが２つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例２９）（配列番号３０）；
（ａ２７）５位のＡｓｎがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３０）（配列番号３１）；
（ａ２８）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３１）（配列番号３２）；
である。
（ａ２９）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、１９位のＡｓｎがＧｌｃＮＡｃ付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３２）（配列番号３３）；
（ａ３０）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、１９位のＡｓｎがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３３）（配列番号３４）；
（ａ３１）１位のＳｅｒのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３４）（配列番号８９）；
（ａ３２）１１位のＡｒｇがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３５）（配列番号９１）；
（ａ３３）２０位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３６）（配列番号９３）；
（ａ３４）２４位のＴｈｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３７）（配列番号９５）；
（ａ３５）２５位のＰｈｅがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３８）（配列番号９７）；
（ａ３６）２７位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例３９）（配列番号９９）；
（ａ３７）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、２５位のＰｈｅがＴｙｒによって置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４１）（配列番号１０３）；
（ａ３８）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｃ末端がアミド化された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４２）（配列番号１０５）；
（ａ３９）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、当該ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓがビオチン化されている糖鎖付加ポリペプチド（実施例４４）（配列番号１１０）；
（ａ４０）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、糖がジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが、ＰＥＧリンカーを介してビオチン化されている糖鎖付加ポリペプチド（実施例４５）（配列番号１１２）；
（ａ４１）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、当該ジシアロ糖鎖付加ＣｙｓのＮ末端にアジド基が導入されている糖鎖付加ポリペプチド（実施例４６）（配列番号１１４）；
（ａ４２）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、１２位のＧｌｕがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓによって置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４７）（配列番号１１６）；
（ａ４３）１位のＳｅｒがジグルクナック糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５０）（配列番号１２３）；
（ａ４４）１位のＳｅｒがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５１）（配列番号１２４）；
（ａ４５）１９位のＡｓｎがジマンノース糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５２）（配列番号１２５）；
（ａ４６）１位のＳｅｒがＮ－アセチルグルコサミン付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５３）（配列番号１２６）；
（ａ４７）１９位のＡｓｎがＮ－アセチルグルコサミン付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５４）（配列番号１２７）；
（ａ４８）１位のＳｅｒがトリシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５５）（配列番号１２８）；
（ａ４９）１位のＳｅｒがテトラシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５６）（配列番号１２９）；
（ａ５０）１位のＳｅｒが、アミノエチルアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５７）（配列番号１３３）；
（ａ５１）１位のＳｅｒが、アミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５８）（配列番号１３４）；
（ａ５２）１位のＳｅｒが、ベンジル基により保護されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例５９）（配列番号１３５）；
（ａ５３）１位のＳｅｒが、ヘキサデシルアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６０）（配列番号１３８）；
（ａ５４）１位のＳｅｒが、アミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６１）（配列番号１３９）；
（ａ５５）１位のＳｅｒが、ベンジル基により保護されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにベンジル基により保護されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６２）（配列番号１４０）；
（ａ５６）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎが付加されたＣｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６３）（配列番号１４１）；
（ａ５７）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換され、かつ、１９位のＡｓｎがジマンノース付加Ｃｙｓに置換された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６４）（配列番号１４８）；
（ａ５８）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらにアミノエチルアミノ基により修飾されたジシアロ糖鎖を有するジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６５）（配列番号１５５）；
（ａ５９）１位のＳｅｒがジシアロ糖鎖付加Ａｓｎに置換され、かつ、Ｎ末端側にさらに３つのジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例６６）（配列番号１６０）；
である。
　また、ＳＲＩＦ１４のアミノ酸配列：
Ａｌａ１５‐Ｇｌｙ１６‐Ｃｙｓ１７‐Ｌｙｓ１８‐Ａｓｎ１９‐Ｐｈｅ２０‐Ｐｈｅ２１‐Ｔｒｐ２２‐Ｌｙｓ２３‐Ｔｈｒ２４‐Ｐｈｅ２５‐Ｔｈｒ２６‐Ｓｅｒ２７‐Ｃｙｓ２８（配列番号１）において：
（ａ６０）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１７）（配列番号３５）；
（ａ６１）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１８）（配列番号３６）；
（ａ６２）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにＣ１２リンカーを介してジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例１９）（配列番号３７）；
（ａ６３）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ-Ｌｙｓ－が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４０）（配列番号１０１）；
（ａ６４）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにＰＥＧリンカーを介してジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４３）（配列番号１０７）；
（ａ６５）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４８）（配列番号１１８）；
（ａ６６）１５位のＡｌａのＮ末端側にさらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ－ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－が付加された糖鎖付加ポリペプチド（実施例４９）（配列番号１２０）；
である。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、当業者に公知のペプチド合成方法に、糖鎖付加工程を組み込むことで製造することができる。糖鎖付加に際しては、トランスグルタミナーゼに代表される、酵素を利用する方法も用いることができるが、この場合、付加する糖鎖が大量に必要になる、最終工程後の精製が煩雑になる、糖鎖の付加位置および付加可能な糖鎖が制限される、等の問題があるため、アッセイ用等の少量の合成には用いることが可能でも、医薬品製造等の大規模な製造には実用的な方法とは言えないことがある。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドの簡便な製造方法であって、かつ、糖鎖の構造が均一である糖鎖付加ポリペプチドの安定した製造方法の具体例として、以下、糖鎖付加アミノ酸として糖鎖付加Ａｓｎを使用し、固相合成、液相合成等の公知のペプチド合成方法を適用することにより糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ａ法）、およびソマトスタチンの任意のアミノ酸をＣｙｓで置換したペプチドを公知のペプチド合成方法に従って製造し、その後、Ｃｙｓに化学合成により糖鎖を付加し、糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ｂ法）を例示する。これらの製造方法を参考に、当業者であれば様々な糖鎖付加ポリペプチドを製造することが可能であり、得られる糖鎖付加ポリペプチドおよびその製造方法は、特に医薬品製造の分野において、非常に有用である。
　また、これらのＡ法およびＢ法は、２つ以上を組み合わせて行うことも可能である。アッセイなどに用いる少量の合成であれば、さらに、上記の方法に、転移酵素による糖鎖伸長反応を組み合わせることも可能である。なお、Ａ法は、国際公開第２００４／００５３３０号パンフレット（ＵＳ２００５２２２３８２（Ａ１））に、Ｂ法は、国際公開第２００５／０１００５３号パンフレット（ＵＳ２００７０６０５４３（Ａ１））に、それぞれ記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。また、Ａ法およびＢ法において用いられる糖鎖構造が均一な糖鎖の製造に関しては、国際公開第０３／００８４３１号パンフレット（ＵＳ２００４１８１０５４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８９８４号パンフレット（ＵＳ２００６２２８７８４（Ａ１））、国際公開第２００４／０５８８２４号パンフレット（ＵＳ２００６００９４２１（Ａ１））、国際公開第２００４／０７００４６号パンフレット（ＵＳ２００６２０５０３９（Ａ１））、国際公開第２００７／０１１０５５号パンフレット等に記載されており、その開示は全体として本明細書に参照により組み込まれる。
糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ａ法）
　糖鎖付加ポリペプチドは、例えば、以下に概略を示す糖鎖付加Ａｓｎを用いた固相合成によって製造することができる。
（１）脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸のカルボキシ基を樹脂（レジン）へ結合させる。この場合、アミノ酸のアミノ基窒素を脂溶性保護基で保護しているので、アミノ酸同士の自己縮合は防止され、レジンとアミノ酸とが反応して結合が起こる。
（２）得られた反応物の脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（３）この遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とを、アミド化反応させる。
（４）上記脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させる。
（５）上記（３）および（４）の工程を１回以上繰り返すことにより、任意の数の任意のアミノ酸が連結した、末端にレジンを結合し、他端に遊離アミノ基を有するペプチドが得られる。
（６）最後に、酸でレジンを切断することにより、所望のアミノ酸配列を有するペプチドを得ることができる。
　ここで、（１）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用い、当該アスパラギン部分のカルボキシ基とレジンの水酸基とを反応させれば、Ｃ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。
　また、（２）の後、または、（３）と（４）を１回以上の任意の回数繰り返した後、（３）において、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いれば、任意の箇所に糖鎖を付加することができる。
　また、（１）および（３）のいずれかの工程で、２回以上、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された糖鎖付加Ａｓｎを用いれば、任意の２ヶ所以上に糖鎖が付加されたペプチドを得ることができる。
　糖鎖付加アミノ酸を結合させた後、脂溶性保護基を脱離して遊離アミノ基を形成させ、その直後に工程（６）を行えば、Ｎ末端に糖鎖付加Ａｓｎを有するペプチドを得ることができる。
　樹脂（レジン）としては、通常、固相合成で使用する樹脂（レジン）であればよく、例えば、塩素で官能化された２－クロロトリチルクロリド樹脂（メルク社製）や、アミノ基で官能化されたＡｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）、水酸基を有するＮｏｖａＳｙｎ　ＴＧＴアルコール樹脂（メルク社製）、Ｗａｎｇレジン（メルク社製）、ＨＭＰＡ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）等を用いることができる。また、Ａｍｉｎｏ－ＰＥＧＡレジンとアミノ酸との間にリンカーを存在させてもよく、このようなリンカーとして、例えば、４－ヒドロキシメチルフェノキシ酢酸（ＨＭＰＡ）、４－(４－ヒドロキシメチル－３－メトキシフェノキシ) －ブチル酢酸（ＨＭＰＢ）等を挙げることができる。Ｃ末端のアミノ酸が樹脂にあらかじめ結合したＨ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－Ｔｒｉｔｙｌ　ＮｏｖａＰＥＧ樹脂（メルク社製）等も用いることができる。
　また、Ｃ末端をアミド化する場合には、例えば、アミノ基で官能化されたＲｉｎｋ－Ａｍｉｄｅ－ＰＥＧＡレジン（メルク社製）を用いることが好ましい。このレジンとペプチドを酸で切断することにより、ペプチドのＣ末端アミノ酸をアミド化することができる。
　樹脂と脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護されたアミノ酸との結合は、例えば、水酸基を有する樹脂や塩素で官能化された樹脂を使用するには、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂へエステル結合させる。また、アミノ基で官能化された樹脂を使用する場合には、アミノ酸のカルボキシ基を樹脂にアミド結合により結合させる。
　なお、２―クロロトリチルクロリド樹脂は、固相合成においてペプチド鎖を伸長する際、末端にあるＣｙｓのラセミ化を防止することができる点において、好ましい。
　アミノ酸としては全てのアミノ酸を用いることができ、例えば、天然アミノ酸である、セリン（Ｓｅｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、バリン（Ｖａｌ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、アラニン（Ａｌａ）、チロシン（Ｔｙｒ）、グリシン（Ｇｌｙ）、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、システイン（Ｃｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）を挙げることができる。
　また、上記天然アミノ酸のＤ体を使用することもできる。
　脂溶性保護基としては、例えば９－フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基、ｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、ベンジル基、アリル基、アリルオキシカルボニル基、アセチル基等の、カーボネート系またはアミド系の保護基等を挙げることができる。アミノ酸に脂溶性保護基を導入するには、例えばＦｍｏｃ基を導入する場合には９－フルオレニルメチル－Ｎ－スクシニミジルカーボネートと炭酸水素ナトリウムを加えて反応を行うことにより導入できる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１～５時間程度行うのが良い。
　脂溶性保護基で保護したアミノ酸としては、市販のものも使用することができる。例えば、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－ＡＩａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨを挙げることができる。
　また、脂溶性保護基で保護したアミノ酸であって、側鎖に保護基を導入したものとして、例えば、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを挙げることができる。
　また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、固相合成の過程において、上記の脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
　２－クロロトリチルクロリド樹脂を用いる場合、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６－コリジン等の塩基を用いることでエステル化を行うことができる。また、水酸基を有する樹脂を用いる場合、エステル化触媒として、例えば１－メシチレンスルホニル－３－ニトロ－１，２，４－トリアゾール（ＭＳＮＴ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）等の公知の脱水縮合剤を用いることができる。アミノ酸と脱水縮合剤との使用割合は、前者１重量部に対して、後者が、通常１～１０重量部、好ましくは２～５重量部である。
　エステル化反応は、例えば、固相カラムにレジンを入れ、このレジンを溶剤で洗浄し、その後アミノ酸の溶液を加えることにより行うのが好ましい。洗浄用溶剤としては、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、２－プロパノール、ジクロロメタン等を挙げることができる。アミノ酸を溶解する溶媒としては、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。エステル化反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０分～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。
　この時固相上の未反応の水酸基を、無水酢酸等を用いてアセチル化してキャッピングすることも好ましい。
　脂溶性保護基の脱離は、例えば塩基で処理することにより行うことができる。塩基としては、例えばピペリジン、モルホリン等を挙げることができる。その際、溶媒の存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール等を挙げることができる。
　遊離アミノ基と、脂溶性保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸のカルボキシ基とのアミド化反応は、活性化剤および溶媒の存在下行うのが好ましい。
　活性化剤としては、例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＷＳＣ／ＨＣｌ）、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）、カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、ジエチルシアノホスホネート（ＤＥＰＣ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウム（ＤＩＰＣＩ）、ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ－トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）、１－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、１－ヒドロキシ－７－アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、ヒドロキシフタルイミド（ＨＯＰｈｔ）、ペンタフルオロフェノール（Ｐｆｐ－ＯＨ）、２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－５－クロロ－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム　３－オキシド　ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ－（７－アザベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスホネート（ＨＡＴＵ）、Ｏ－ベンゾトリアゾール－１－イル－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、３，４－ジヒドロ－３－ヒドロジ－４－オキサ－１，２，３－ベンゾトリアジン（Ｄｈｂｔ）等を挙げることができる。
　活性化剤の使用量は、脂溶性の保護基でアミノ基窒素が保護された任意のアミノ酸に対して、１～２０当量、好ましくは１～１０当量、さらに好ましくは、１～５当量とするのが好ましい。
　溶媒としては、例えばＤＭＳＯ、ＤＭＦ、ジクロロメタン等を挙げることができる。反応は０～５０℃、好ましくは室温で、約１０～３０時間程度、好ましくは１５分～２４時間程度行うのが良い。脂溶性保護基の脱離は、上記と同様に行うことができる。
　樹脂（レジン）からペプチド鎖を切断するには酸で処理するのが好ましい。酸としては、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、弗化水素（ＨＦ）等を挙げることができる。
　このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ａｓｎで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。また、このように精製された糖鎖付加ポリペプチドは、後述するように、脱保護されたＣｙｓ同士でのジスルフィド結合を形成させる。
　なお、本発明の一実施態様において、固相合成に用いる糖鎖付加Ａｓｎにおける糖鎖上の非還元末端にシアル酸を含む場合には、酸処理によりシアル酸が切断されるのを防ぐために、当該シアル酸のカルボキシ基を、保護基により保護していることが好ましい。保護基としては、例えば、ベンジル基、アリル基、ジフェニルメチル基等を挙げることができる。保護基の導入および保護基の脱離の方法は、公知の方法により行うことができる。また、保護基の脱離は、固相合成により製造された糖鎖付加ポリペプチドを樹脂から切断した後に行うことが好ましい。樹脂より切断後、糖鎖付加ポリペプチドにおいてジスルフィド結合を形成させることにより糖鎖付加ポリペプチドを環化させる場合には、保護基の脱離は、ジスルフィド結合の形成工程の前であってもよく、ジスルフィド結合の形成工程の後であってもよい。
糖鎖付加ポリペプチドを製造する方法（Ｂ法）
　糖鎖付加ポリペプチドは、まずペプチド鎖を合成し、後で合成したペプチド鎖へ糖鎖を付加する方法によっても製造することができる。具体的には、糖鎖を付加したい位置にＣｙｓを含むペプチドを、固相合成法、液相合成法、細胞により合成する方法、天然に存在するものを分離抽出する方法等により製造する。ここで、ジスルフィド結合を形成する予定の位置にあるＣｙｓ等、糖鎖を付加しないＣｙｓに対しては、例えばアセトアミドメチル（Ａｃｍ）基で保護しておく。また、糖鎖を付加せず、かつ、ジスルフィド結合の形成にも使用しないＣｙｓを糖鎖付加ポリペプチドに導入する場合には、糖鎖付加工程およびジスルフィド結合形成工程の間、Ｃｙｓを保護基により保護しておき、その後脱保護するようにしてＣｙｓを導入することができる。このような保護基としては、例えば、ｔｅｒｔ－ブチル（ｔＢｕ）や４－メトキシベンジルを挙げることができる。
　また、糖鎖付加ポリペプチド中のＣｙｓに、異なる糖鎖を付加する場合には、最初に糖鎖を導入するＣｙｓを無保護とし、次に異なる糖鎖を導入するＣｙｓを、ＳｔＢｕ等により保護しておくことで、異なる糖鎖を導入することができる。具体的には、固相合成等によりペプチドを合成する際、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓを無保護とし、かつ、第二の糖鎖を導入したいＣｙｓをＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（ＳｔＢｕ）－ＯＨ等を用いて、保護基を有するＣｙｓとする。その後、ＳｔＢｕ等の保護基を保持したまま、無保護のＣｙｓへ糖鎖を導入する。次に、ＳｔＢｕ基等を脱保護することで、無保護となったＣｙｓへ異なる糖鎖を導入することができる。なお、第一の糖鎖を導入したいＣｙｓおよび第二の糖鎖を導入したいＣｙｓは、１つ又は複数個とすることができる。
　なお、ＳｔＢｕ基の脱保護は、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、トリブチルホスフィン等の還元剤を用いて反応させることにより脱保護することができる。上記反応は、通常０～８０℃、好ましくは、５～６０℃、更に好ましくは１０～３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常３０分～５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、高速液体カラムクロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））で精製するのが良い。
　異なる糖鎖を導入する際には、Ｃｙｓの脱保護工程における還元条件やＨＰＬＣ等の精製工程における酸性条件に対して、より安定な糖鎖から導入することが好ましい。特に、シアル酸含有糖鎖を導入する際には、シアル酸を有さない糖鎖又はシアル酸残基数が少ない糖鎖から、先に導入することが好ましい。
　また、糖鎖付加ポリペプチドのアミノ酸配列中に、リンカーを付加させたい場合には、例えば固相合成の過程において、脂溶性保護基で保護したアミノ酸の代わりに、脂溶性保護基で保護したリンカーを使用することで、合成したポリペプチドの好ましい位置に、リンカーを挿入することができる。
　次に、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体を上記で得た無保護のＣｙｓを含むペプチドと反応させることにより、糖鎖を無保護のＣｙｓのチオール基と反応させ、ペプチドに結合させる。上記反応は、リン酸緩衝液、トリス‐塩酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはこれらの混合溶液中において、通常０～８０℃、好ましくは、１０～６０℃、更に好ましくは１５～３５℃で行うのが良い。反応時間は、通常１０分～２４時間、好ましくは、通常３０分～５時間程度である。反応終了後は、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
　ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体は、例えば、複合型アスパラギン結合型糖鎖の１位の炭素に結合している水酸基を、－ＮＨ－（ＣＨ２）ａ－（ＣＯ）－ＣＨ２Ｘ（Ｘはハロゲン原子、ａは整数であり、目的とするリンカー機能を阻害しない限り限定されるものではないが、好ましくは０～４の整数を示す。）で置換した化合物である。
　具体的には、ハロアセチル化複合型糖鎖誘導体とＣｙｓ含有ペプチドとをリン酸緩衝液中、室温で反応させる。反応終了後、ＨＰＬＣで精製することにより糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。
　また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒と、上記の緩衝液との混合溶液中で反応を行うこともできる。このとき、有機溶媒の比率は、０～９９％（ｖ／ｖ）の範囲で、上記緩衝液に添加することができる。緩衝液への溶解性が低い無保護のＣｙｓを含むペプチドは、このような有機溶媒を添加することにより反応溶液への溶解性を向上させることができ、好ましい。
また、ＤＭＳＯ、ＤＭＦ、メタノール、アセトニトリルといった有機溶媒や、それらの混合溶液中で反応を行うこともできる。その際、塩基の存在下で行うのが好ましい。塩基としては、例えばＤＩＰＥＡ、トリエチルアミン、ピリジン、２，４，６－コリジン等を挙げることができる。
　また、グアニジン塩酸塩や尿素を緩衝溶液に加えた混合溶液中においても反応を行うことができる。なお、グアニジン塩酸塩や尿素は、最終濃度が１Ｍ～８Ｍとなるように上記緩衝液に加えることができる。グアニジン塩酸塩や尿素の添加によっても、緩衝液への溶解性の低いペプチドの溶解性を向上させることができ、好ましい。
　さらに、無保護のＣｙｓを含むペプチドが、ジスルフィド結合を介した２量体を形成することを防止するために、トリス(２-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）やジチオトレイトール（ＤＴＴ）を緩衝液に添加して反応させることもできる。ＴＣＥＰやＤＴＴは、最終濃度が１０μＭ～１０ｍＭとなるように緩衝液に加えることができる。
　また、糖鎖を目的のＣｙｓへ結合させた後、Ａｃｍ等で保護されたＣｙｓの保護基を脱保護する。保護基がＡｃｍ基である場合は、水、メタノール、酢酸、またはこれらの混合溶液中において、ヨウ素、酢酸水銀（ＩＩ）、硝酸銀（Ｉ）、または、酢酸銀（Ｉ）等を用いて反応させることにより脱保護することができる。
　上記反応は、通常０～８０℃、好ましくは、５～６０℃、更に好ましくは１０～３５℃で行うのが良い。反応時間は、好ましくは、通常５分～２４時間程度である。反応終了後は、ＤＴＴや塩酸等により処理した後、適宜、公知の方法（例えば、ＨＰＬＣ）で精製するのが良い。
　このようにして、所望の位置を糖鎖付加Ｃｙｓで置換した糖鎖付加ポリペプチドを得ることができる。また、このように精製された糖鎖付加ポリペプチドは、後述するように、脱保護されたＣｙｓ同士でのジスルフィド結合を形成させる。
　また、上記Ａ法およびＢ法により作製された糖鎖付加ポリペプチドは、空気および／または酸素、ヨウ素、ＤＭＳＯ、酸化および還元されたグルタチオンの混合物、フェリシアン酸カリウム、エルマン試薬（５，５’－ジチオビス（２－ニトロ安息香酸））、トリフルオロ酢酸タリウム（III）、ならびに、アルキルトリクロロシランスルホキシドなどを用いた当業者に周知の方法で、Ｃｙｓ同士のジスルフィド結合を形成することができる。
　なお、Ｃｙｓ－Ｃｙｓ間でのジスルフィド結合を形成させる際に、ジスルフィド結合することが望ましくない糖鎖付加ポリペプチド中のＣｙｓに対しては、保護基により保護しておく。このような保護基としては、Ａｃｍ、ｔＢｕ、４－メトキシベンジル、４－メチルベンジル等、酸化条件で安定な保護基を用いることができる。
　また、Ｂ法において、ジスルフィド結合の形成は、糖鎖の導入の前に行うことも可能である。ただし、ジスルフィド結合させたいＣｙｓに保護基が導入されている場合には、脱保護の工程がジスルフィド結合形成の工程よりも先となる。
（活性）
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ソマトスタチン受容体に対する親和性を有している。本明細書において、「ソマトスタチン受容体に対する親和性を有する」とは、ソマトスタチン受容体であるＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、およびＳＳＴＲ５のうちの少なくとも１つに親和性を有することを意味する。
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、好ましくは２つ以上のソマトスタチン受容体に対する親和性を有し、より好ましくは３つ以上の受容体に対して親和性を有し、さらに好ましくは４つ以上の受容体に対して親和性を有し、最も好ましくは天然のソマトスタチン（ＳＲＩＦ２８およびＳＲＩＦ１４）と同様に、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の５つ全ての受容体に親和性を有する。特に、少なくともＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４のいずれか一方の親和性と、その他のＳＳＴＲとの親和性を有していることが好ましい。
　このように、本発明の糖鎖付加ポリペプチドが、ソマトスタチン受容体に対して親和性を有することで、ソマトスタチン受容体に対するソマトスタチン活性（アゴニスト活性）およびアンタゴニスト活性を有する。
　例えば、各ソマトスタチン受容体に対する親和性は、実施例６７－１および６７－２に示すような、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける競合的結合実験などを用いて測定することができる。
　競合的結合実験による親和性の測定は、受容体に対して、標識リガンドと試験物質を競合的に結合させ、試験物質投与による標識リガンドの遊離を求めることより、試験物質の親和性（例えば、５０％阻害濃度：ＩＣ５０値や、結合阻害定数：Ｋｉ値）を測定することができる。
　例えば、ソマトスタチン活性（アゴニスト活性）は、実施例６７－３および６７－４に示すような、ソマトスタチン受容体発現細胞を用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏにおけるｃＡＭＰ産生抑制試験により評価することができる。
　ｃＡＭＰ産生抑制試験は、ソマトスタチン受容体発現細胞に対して、糖鎖付加ポリペプチドまたは対照化合物となるＳＲＩＦ１４もしくはＳＲＩＦ２８を処置し、一定時間培養後に、細胞内に蓄積したｃＡＭＰ量を測定し、対照化合物と比較することで評価することができる。ｃＡＭＰ量の測定は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等、公知の手法により測定することができる。
　例えば、ソマトスタチン活性（アゴニスト活性）は、実施例８６および実施例８７に示すようなｉｎ　ｖｉｖｏにおけるＧＨ産生抑制試験により評価することができる。
　ＧＨ産生抑制試験は、例えば、下記のように実施することができる。非絶食下のラットへ糖鎖付加ポリペプチドを皮下投与する。ラットは全身麻酔下でＧＨ遊離促進剤を投与し、その後５分程度で採血を行う。採血した血液を血漿サンプルとし、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）等、公知の手法によりＧＨ濃度を測定する。また、対照として糖鎖付加ポリペプチドを含まない生理食塩液を投与したラットより血漿サンプルを得ることで、測定されるＧＨ濃度の比較により、ソマトスタチン活性を評価することができる。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、たとえ、その構造への糖鎖の付加により各受容体に対するある程度の親和性の減衰を招いたとしても、血中半減期が延長されるため、結果として、糖鎖が付加されていない天然に存在するソマトスタチン（以下、「非糖鎖付加ソマトスタチン」と呼ぶことがある。）と同等のソマトスタチン活性を維持することができ、好ましくは増大したソマトスタチン活性を有することができる。この血中半減期の延長を考慮すると、例えば、実施例６７－１および６７－２に記載の手法により測定した場合、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの各受容体に対するＫｉ値と、糖鎖を有さないＳＲＩＦ１４のＫｉ値との比は、１０００：１～０．３：１の範囲内であることが好ましく、１００：１～０．３：１の範囲内であることがより好ましく、１０：１～０．３：１の範囲内であることがさらに好ましい。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドの血中安定性は、好ましくは天然に存在するソマトスタチン（非糖鎖付加ソマトスタチン）と同等またはそれ以上である。血中安定性は当業者に公知の手法を用いて測定することができ、例えば、血漿中における安定性や、血中半減期、ＡＵＣ（薬物血漿中濃度－時間曲線下面積）等を指標に判断することができる。また、腎クリアランスや肝クリアランスの減少も血中安定性の増大に寄与する。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、糖鎖を有さないＳＲＩＦ２８と比較して、血中半減期が増大しており、例えば実施例６８に示す実験手法により測定した場合、その半減期は、ＳＲＩＦ２８と比較して、４倍以上、好ましくは１０倍以上、より好ましくは２０倍以上、さらに好ましくは３０倍以上増大している。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、例えば実施例８５に示す実験手法により測定した場合、ＳＲＩＦ２８と比較して、好ましくは４倍以上、より好ましくは１０倍以上、さらに好ましくは２０倍以上の血中安定性を有する。
（医薬組成物）
　次に、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物について説明する。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防に有効である。上述の通り、ソマトスタチンには種々の作用が知られており、これらの作用に関連する疾患も様々である。例えば、ソマトスタチンに関連する疾患には、例えば、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍（例えばカルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ）、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患（例えばドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、結膜炎）等が含まれる。本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、上記疾患、特に先端巨大症、認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病合併症、下痢、消化管閉塞、イレウス、放射線障害、眼疾患、ならびに、各種腫瘍あるいは腸関連疾患、ホルモン産生過剰に伴う消化器症状の治療または予防に有効である。
　上記医薬組成物は、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、滑沢剤等の希釈剤あるいは賦形剤を用いて、通常の医薬組成物の形態に製剤したものである。
　このような医薬組成物としては、例えば、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、注射剤等が挙げられる。
　医薬組成物中に含有される本発明の糖鎖付加ポリペプチドの量は、特に限定されず広い範囲内から適宜選択することができるが、通常、医薬組成物中に本発明の糖鎖付加ポリペプチドを１～７０重量％含有させるのが好ましい。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、さらに他の有効成分を含有することもできるし、他の有効成分を含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物は、糖鎖付加ポリペプチドを薬学的に許容可能な塩として含むこともできるし、さらに異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有することもできる。また、異なる１以上の本発明の糖鎖付加ポリペプチドを有効成分として含有する医薬組成物と組み合わせて用いることもできる。また、医薬組成物に含有させることのできるその他の成分としては、当業者に周知の薬学的に許容される担体等を挙げることができる。
　また、本発明の糖鎖付加ポリペプチドを使用する治療としては、たとえば放射線治療を含み得ることができ、また、身体全体にわたってＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５のいずれかを発現する細胞および組織の分布を測定するためのシンチグラフィーにおいても有用である。放射性スキャニングまたは磁気共鳴による体外画像化の使用は、体内での半定量的検出を可能にすることができる。
　放射性標識された糖鎖付加ポリペプチドは、例えばヒトの体内で、健常状態では実質的な量のＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５を含まない組織において、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５のいずれかを発現する悪性腫瘍の治療的処置のために有用である。また、標識した糖鎖付加ポリペプチドを、シンチグラフィーのために、または、腫瘍を抑制するために有効な量を含有する組成物として投与することができる。このような標識の例は、ヨウ素（１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、炭素（１１Ｃ）、フッ素（１８Ｆ）、テクネチウム（９９ｍＴｃ）、イットリウム（９０Ｙ）などの異なる同位体、または蛍光標識である。標識は、当業者に周知の方法により実施することができ、糖鎖付加ポリペプチドへ含まれるか、直接的に結合されるか、または適当な化合物へ結合され、それが糖鎖付加ポリペプチドに結合されることが可能である。例えば、チロシンのヨード化には、クロラミン―Ｔを用いた方法等により標識することができる。
　本発明に係る医薬組成物の投与方法としては特に制限はなく、各種製剤形態、患者の年齢、性別、疾患の状態、その他の条件に応じた方法で投与される。錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤およびカプセル剤の場合の投与方法としては、例えば、経口投与が挙げられる。また、注射剤の場合には、単独で、またはブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して、静脈内、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内に投与することができる。坐剤の場合には、直腸内に投与される。点眼剤の場合は、結膜嚢などの眼組織に適用する。吸入剤の場合には、気管支または肺に適用する。
　上記医薬組成物の投与量は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、体重１ｋｇに対して本発明の糖鎖付加ポリペプチドが０．１～９００ｎｍｏｌ、好ましくは１～１００ｎｍｏｌ、より好ましくは１～１０ｎｍｏｌとなる投与量とすることができる。
　上記医薬組成物の投与回数は、用法、患者の年齢、性別、疾患の程度、その他の条件に応じて適宜選択すればよく、例えば、３回／１日、２回／１日、１回／１日、さらにはその血中安定性に応じて、より頻度の少ない投与回数（例えば、１回／週、１回／月など）も選択しうる。好ましくは、上記医薬組成物の投与回数は、１回以下／１日である。
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドに付加された糖鎖は、体内の代謝系で容易に分解される。また、本発明の一態様において、該糖鎖は生体内で糖ペプチド（または糖タンパク質）として結合して存在する構造を有する。従って、本発明の糖鎖付加ポリペプチドおよび該ペプチドを有効成分として含む医薬組成物は、生体内に投与しても副作用や抗原性を示すことがなく、アレルギー反応や、抗体産生により薬効が得られなくなる心配が少ないなどの利点を有する。
　さらに、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは安定して簡便に大量に供給することが可能であり、品質の安定した、高品質の医薬品の提供という観点からも、非常に有用である。
　本発明はまた、本発明の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防方法も提供する。
　なお、本明細書において用いられる用語は、特定の実施態様を説明するために用いられるのであり、発明を限定する意図ではない。
　また、本明細書において用いられる「含む」との用語は、文脈上明らかに異なる理解をすべき場合を除き、記述された事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを意図するものであり、それ以外の事項（部材、ステップ、要素、数字など）が存在することを排除しない。
　異なる定義が無い限り、ここに用いられるすべての用語（技術用語および科学用語を含む。）は、本発明が属する技術の当業者によって広く理解されるのと同じ意味を有する。ここに用いられる用語は、異なる定義が明示されていない限り、本明細書および関連技術分野における意味と整合的な意味を有するものとして解釈されるべきであり、理想化され、または、過度に形式的な意味において解釈されるべきではない。
　本発明の実施態様は模式図を参照しつつ説明される場合があるが、模式図である場合、説明を明確にするために、誇張されて表現されている場合がある。
　第一の、第二のなどの用語が種々の要素を表現するために用いられるが、これらの要素はそれらの用語によって限定されるべきではないことが理解される。これらの用語は一つの要素を他の要素と区別するためのみに用いられているのであり、例えば、第一の要素を第二の要素と記し、同様に、第二の要素は第一の要素と記すことは、本発明の範囲を逸脱することなく可能である。
　以下において、本発明を、実施例を参照してより詳細に説明する。しかしながら、本発明はいろいろな態様により具現化することができ、ここに記載される実施例に限定されるものとして解釈されてはならない。
　なお、本明細書中における糖鎖付加ポリペプチドの表記方法について下記に説明する。
　例えば、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のポリペプチドの１位のＳｅｒ（Ｓ１）と５位のＡｓｎとが、両方ともジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ））によって、置換されていることを示す。
　また、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のポリペプチドの１位のＳｅｒ（Ｓ１）が、ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ））によって、置換されており、さらに、２２位のＴｒｐが、Ｄ－Ｔｒｐに置換されていることを示す。
　また、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４と示した場合には、ＳＲＩＦ１４のＮ末端側に、糖鎖付加Ｃｙｓ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ－が付加したことを示す。
　また、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８や、３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のＣ末端である２８位のＣｙｓに、さらにジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓが１つ付加したもの（２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）、または、ＳＲＩＦ２８のＣ末端である２８位のＣｙｓに、さらに－Ｗ－ジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓ（Ｗは、２８位のＣｙｓに結合する任意のアミノ酸を示す）が付加したもの（３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）を示す。
　また、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と示した場合には、ＳＲＩＦ２８のポリペプチドのＮ末端に存在する１位のＳｅｒが、連続する２つのジシアロ糖鎖付加Ｃｙｓに置換されていることを示す。
　なお、「ｄｉｓｉａｌｏ」はジシアロ糖鎖を意味し、「ｍｏｎｏｓｉａｌｏ」はモノシアロ糖鎖を意味し、「ａｓｉａｌｏ」はアシアロ糖鎖を意味し、「ｄｉＧｌｃＮＡｃ」はジグルクナック糖鎖を意味し、「ＧｌｃＮＡｃ」はＮ－アセチルグルコサミンを意味し、「ｄｉＭａｎ」はジマンノース糖鎖を意味し、「ｔｒｉｓｉａｌｏ」はトリシアロ糖鎖を意味し、「ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ」はテトラシアロ糖鎖を意味する。また、（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））と示した場合には、ジシアロ糖鎖のシアル酸のカルボキシ基が、アミノエチルアミノ基により保護されていることを意味する。「ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ」の代わりに、「Ｂｎ」、「ａｍｉｄｅ」、「ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ」と示されているものは、それぞれ糖鎖上のシアル酸のカルボキシ基が、ベンジル基、アミノ基、ヘキサデシルアミノ基により修飾されていることを意味する。
　実施例１　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　１－１　チオールの糖鎖修飾反応
　下記式（１）で表わされるペプチド１（配列番号３８）（ＡＰＣ社製）（６０．６ｍｇ、１８．３μｍｏｌ）と下記式（ａ）で表わされる化合物ａ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）（８５．８ｍｇ、３６．６μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５．５ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
 　反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％酢酸（ＡｃＯＨ）水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（２）で表わされる糖ペプチド２（配列番号３９）（６０．５ｍｇ、１０．９μｍｏｌ、収率５９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２９Ｈ３５８Ｎ５０Ｏ１０２Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８５８．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３９４．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１１５．４、found　１８５８．１、１３９３．８、１１１５．２。
　１－２　Ａｃｍ基の脱保護
　上記１－１に記載の方法で得られた糖ペプチド２（５１．２ｍｇ、９．１９μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１８．８ｍｇ、１１３μｍｏｌ）の水溶液（３．７ｍＬ）を添加し、室温で４０分間反応させた。２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、３．７ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（４３．６ｍｇ、２８２μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．９２ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（３）で表わされる糖ペプチド３（配列番号４０）（２９．２ｍｇ、５．３８μｍｏｌ、収率５８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２３Ｈ３４８Ｎ４８Ｏ１００Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８１０．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３５８．４、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１０８６．９、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９０６．０、found　１８１０．７、１３５８．３、１０８６．６、９０５．７。
　１－３　ジスルフィド結合の形成
　上記１－２に記載の方法で得られた糖ペプチド３（２９．２ｍｇ、５．３８μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１０．８ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエントＡ：Ｂ＝７７：２３→６４：３６　１７分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号５）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（１７．２ｍｇ、３．１７μｍｏｌ、収率５９％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２３Ｈ３４６Ｎ４８Ｏ１００Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８１０．２、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３５７．９、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１０８６．５、found　１８１０．０、１３５７．５、１０８６．４。
　実施例２　Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（５）で表わされる化合物（ペプチド５）（配列番号４１）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（６）で表わされる化合物（Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
　実施例３　Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（７）で表わされる化合物（ペプチド７）（配列番号４２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８）で表わされる化合物（Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000036
　実施例４　Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（９）で表わされる化合物（ペプチド９）（配列番号４３）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０）で表わされる化合物（Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000038
　実施例５　Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（１１）で表わされる化合物（ペプチド１１）（配列番号４４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１２）で表わされる化合物（Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000039
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000040
　実施例６　Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（１３）で表わされる化合物（ペプチド１３）（配列番号４５）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１４）で表わされる化合物（Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１０）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000041
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
　実施例７　Ａ１５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（１５）で表わされる化合物（ペプチド１５）（配列番号４６）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１６）で表わされる化合物（Ａ１５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000044
　実施例８　Ｇ１６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（１７）で表わされる化合物（ペプチド１７）（配列番号４７）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１８）で表わされる化合物（Ｇ１６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000045
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000046
　実施例９　Ｋ１８Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（１９）で表わされる化合物（ペプチド１９）（配列番号４８）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２０）で表わされる化合物（Ｋ１８Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000047
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000048
　実施例１０　Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（２１）で表わされる化合物（ペプチド２１）（配列番号４９）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２２）で表わされる化合物（Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000049
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000050
　実施例１１　Ｆ２１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（２３）で表わされる化合物（ペプチド２３）（配列番号５０）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２４）で表わされる化合物（Ｆ２１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000051
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000052
　実施例１２　Ｔ２６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（２５）で表わされる化合物（ペプチド２５）（配列番号５１）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２６）で表わされる化合物（Ｔ２６Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000053
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000054
　実施例１３　２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（２７）で表わされる化合物（ペプチド２７）（配列番号５２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（２８）で表わされる化合物（２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000056
　実施例１４　３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（２９）で表わされる化合物（ペプチド２９）（配列番号５３）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３０）で表わされる化合物（３０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000057
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000058
　実施例１５　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（３１）で表わされる化合物（ペプチド３１）（配列番号５４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000059
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000060
　実施例１６　Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（３３）で表わされる化合物（ペプチド３３）（配列番号５５）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３４）で表わされる化合物（Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２０）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000061
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000062
　実施例１７　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（３５）で表わされる化合物（ペプチド３５）（配列番号５６）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３６）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４）（配列番号３５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000063
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000064
　実施例１８　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（３７）で表わされる化合物（ペプチド３７）（配列番号５７）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（３８）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４）（配列番号３６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000065
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000066
　実施例１９　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４の合成
　１９－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（３９）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド３９（配列番号５８）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000067
 　Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ－１２－アミノドデカン酸およびＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを順に縮合した。縮合後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、３時間室温で振盪した。これにより、アミノ酸側鎖の保護基（Ａｃｍ基以外）を脱離させるとともに、ペプチドと樹脂とを切り離した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18　UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント　Ａ：Ｂ＝６０：４０→３６．２：６３．８　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４０）で表わされる化合物（ペプチド４０）（配列番号５９）（１１．２ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000068
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ９７Ｈ１４４Ｎ２２Ｏ２３Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１０４２．３、［Ｍ＋３Ｈ］３＋　６９５．２、found　１０４２．０、６９５．０。
　１９－２　チオールの糖鎖修飾反応
　上記１９－１に記載の方法で得られたペプチド４０（６．８ｍｇ、３．３μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（１９．１ｍｇ、８．１５μｍｏｌ）を７Ｍグアニジン塩酸塩と３３０μＭ　ＴＣＥＰを含む０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９６ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。ＨＰＬＣで原料消失を確認した後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→５０：５０　２５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４１）で表わされる化合物（糖ペプチド４１）（配列番号６０）（７．１ｍｇ、１．６μｍｏｌ、収率５０％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000069
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１８３Ｈ２８３Ｎ２９Ｏ８５Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１４４９．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１０８７．４、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　８７０．１、found　１４４９．３、１０８７．２、８７０．０。
　１９－３　Ａｃｍ基の脱保護
　上記１９－２に記載の方法で得られた糖ペプチド４１（１０．３ｍｇ、２．３７μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（９．７ｍｇ、５８μｍｏｌ）の水溶液（０．９５ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９５ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（２２．３ｍｇ、１４５μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．９５ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→５０：５０　２５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式４２で表わされる糖ペプチド４２（配列番号６１）（５．８ｍｇ、１．４μｍｏｌ、収率５９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000070
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１７７Ｈ２７３Ｎ２７Ｏ８３Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１４０２．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１０５１．８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　８４１．７、found　１４０１．９、１０５１．７、８４１．５。
　１９－４　ジスルフィド結合の形成
　上記１９－３に記載の方法で得られた糖ペプチド４２（５．８ｍｇ、１．４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、３．５ｍＬ）に溶解し、室温で３０時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント　Ａ：Ｂ＝７０：３０→５０：５０　２５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式４３で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４）（配列番号３７）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000071
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→５０：５０　２５分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４（３．６ｍｇ、０．８６μｍｏｌ、収率６１％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１７７Ｈ２７１Ｎ２７Ｏ８３Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１４０１．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１０５１．３、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　８４１．３、found　１４０１．２、１０５１．２、８４１．１。
　実施例２０　Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　２０－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドを樹脂上に合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
　Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、３時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒 Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７２：２８→６８．５：３１．５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４４）で表わされるペプチド４４（配列番号６２）（３０．７ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000072
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１４６Ｈ２２４Ｎ４４Ｏ４１Ｓ５：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１３８．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８５４．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　６８３．４、found　１１３８．２、８５３．９、６８３．１。
　２０－２　チオールの糖鎖修飾反応
　上記２０－１に記載の方法で得られたペプチド４４（４５．８ｍｇ、１３．４μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（１２５．８ｍｇ、５３．７μｍｏｌ、ペプチド４４に対して４．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、４．０ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８３：１７→７２：２８　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式４５で表わされる糖ペプチド４５（配列番号６３）（４４．５ｍｇ、５．６１μｍｏｌ、収率４２％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000073
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３１８Ｈ５０２Ｎ５８Ｏ１６５Ｓ５：［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１５８８．６、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１３２４．０、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１１３５．０、［Ｍ＋８Ｈ］８＋　９９３．３、［Ｍ＋９Ｈ］９＋　８８３．０、found　１５８８．６、１３２４．０、１１３５．０、９９３．２、８８３．０。
　２０－３　Ａｃｍ基の脱保護
　上記２０－２に記載の方法で得られた糖ペプチド４５（４４．５ｍｇ、５．６１μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１４．８ｍｇ、８８．７μｍｏｌ）の水溶液（２．２ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．２ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（３３．２ｍｇ、２１５μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（５６１μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８３：１７→７２：２８　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４６）で表わされる糖ペプチド４６（配列番号６４）（３４．４ｍｇ、４．４１μｍｏｌ、収率７９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000074
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３１２Ｈ４９２Ｎ５６Ｏ１６３Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１９５０．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１５６０．２、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１３００．３、found　１９４９．８、１５６０．１、１３００．２。
　２０－４　ジスルフィド結合の形成
　上記２０－３に記載の方法で得られた糖ペプチド４６（３４．４ｍｇ、４．４１μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、８．８ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７７：２３→６５：３５　１６分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（４７）で表わされる化合物（Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２１）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000075
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８３：１７→７２：２８　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（２０．１ｍｇ、２．５８μｍｏｌ、収率５８％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３１２Ｈ４９０Ｎ５６Ｏ１６３Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１９４９．５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１５５９．８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１３００．０、found　１９４９．４、１５５９．７、１２９９．９。
　実施例２１　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド４４の代わりに下記式（４８）で表わされる化合物（ペプチド４８）（配列番号６５）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（４９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000076
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000077
　実施例２２　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド４４の代わりに下記式（５０）で表わされる化合物（ペプチド５０）（配列番号６６）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（５１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000078
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000079
　実施例２３　Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド４４の代わりに下記式（５２）で表わされる化合物（ペプチド５２）（配列番号６７）を用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（５３）で表わされる化合物（Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000080
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000081
　実施例２４　Ｓ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　２４－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドを樹脂上に合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
　Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ５０ｘ２５０ｍｍ、流速：４３．７ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６５：３５　１４分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５４）で表わされるペプチド５４（配列番号６８）（４１．７ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000082
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１４９Ｈ２２９Ｎ４５Ｏ４２Ｓ６：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１７２．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８７９．８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　７０４．０、found　１１７２．５、８７９．４、７０３．９。
　２４－２　チオールの糖鎖修飾反応
　上記２４－１に記載の方法で得られたペプチド５４（１０．７ｍｇ、３．０４μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（３６．６ｍｇ、１５．６μｍｏｌ、ペプチド５４に対して５．２等量）を１０μＭ　ＴＣＥＰを含む３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９１ｍＬ）に溶解し、室温で１００分間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→７０：３０　５分、次いで　Ａ：Ｂ＝７０：３０→６５：３５　１２分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５５）で表わされる糖ペプチド５５（配列番号６９）（１１．７ｍｇ、１．１４μｍｏｌ、収率３８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000083
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ４０７Ｈ６４６Ｎ６６Ｏ２２８Ｓ６：［Ｍ＋５Ｈ］５＋　２０６１．８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１７１８．４、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１４７３．０、［Ｍ＋８Ｈ］８＋　１２８９．０、［Ｍ＋９Ｈ］９＋　１１４５．９、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋　１０３１．４、found　２０６１．８、１７１８．２、１４７２．９、１２８９．０、１１４５．８、１０３１．３。
　２４－３　Ａｃｍ基の脱保護
　上記２４－２に記載の方法で得られた糖ペプチド５５（１１．７ｍｇ、１．１４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（４．７ｍｇ、２８μｍｏｌ）の水溶液（０．４６ｍＬ）を添加し、室温で２時間反応させた。２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．４６ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（１１．３ｍｇ、７３μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．１１ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→７０：３０　５分、次いで７０：３０→５５：４５　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（５６）で表わされる糖ペプチド５６（配列番号７０）（７．４ｍｇ、０．７３μｍｏｌ、収率６４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000084
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ４０１Ｈ６３６Ｎ６４Ｏ２２６Ｓ６：［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１６９４．７、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１４５２．７、［Ｍ＋８Ｈ］８＋　１２７１．３、［Ｍ＋９Ｈ］９＋　１１３０．１、［Ｍ＋１０Ｈ］１０＋　１０１７．２、found　１６９４．６、１４５２．５、１２７１．４、１１３０．０、１０１７．２。
　２４－４　ジスルフィド結合の形成
　上記２４－３に記載の方法で得られた糖ペプチド５６（７．４ｍｇ、０．７３μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．８ｍＬ）に溶解し、室温で２５時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→７０：３０　５分、次いで７０：３０→６９．３：３０．７　５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製することで、下記式（５７）で表わされる化合物（Ｓ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２５）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000085
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→４０：６０　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（４．７ｍｇ、０．４６μｍｏｌ、収率６３％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ４０１Ｈ６３４Ｎ６４Ｏ２２６Ｓ６：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　３３８７．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　２５４１．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　２０３３．０、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１６９４．３、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１４５２．４、found　３３８７．６、２５４０．９、２０３２．７、１６９４．２、１４５２．３。
　実施例２５　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド５４の代わりに下記式（５８）で表わされるペプチド５８（配列番号７１）を用いたこと以外は、実施例２４と同様にして、下記式（５９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000086
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000087
　実施例２６　Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに下記式（ｂ）で表わされる化合物ｂ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（６０）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000088
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000089
 　最終生成物において、下記式ｂ１の糖鎖を有する糖鎖ポリぺプチドと、下記式ｂ２の糖鎖を有する糖鎖付加ポリペプチドの比は、４５：５５であった。なお、構造が同一のモノシアロ糖鎖誘導体を使用することにより、実質的に均一の糖鎖構造を有する糖鎖付加ポリペプチドが製造可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000090
　実施例２７　Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに下記式（ｃ）で表わされる化合物ｃ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（６１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000091
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000092
　実施例２８　Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　２８－１　チオールの糖鎖修飾反応
　上記２０－１に記載の方法で得られたペプチド４４（２１．２ｍｇ、６．２１μｍｏｌ）と化合物ｃ（４４．５ｍｇ、２５．３μｍｏｌ、ペプチド４４に対して４．１等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．９ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７７：２３→６２：３８　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６２）で表わされる糖ペプチド６２（配列番号７２）（２４．０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ、収率５７％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000093
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２７４Ｈ４３４Ｎ５４Ｏ１３３Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１６９４．３、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１３５５．６、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１１２９．８、found　１６９４．３、１３５５．６、１１３０．０。
　２８－２　Ａｃｍ基の脱保護
　上記２８－１に記載の方法で得られた糖ペプチド６２（２４．０ｍｇ、３．５４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（６．０ｍｇ、３６μｍｏｌ）の水溶液（１．４ｍＬ）を添加し、室温で３時間反応させた。５００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．５７ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（１４．０ｍｇ、９０．８μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．３５ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６３）で表わされる糖ペプチド６３（配列番号７３）（２０．１ｍｇ、３．０３μｍｏｌ、収率８６％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000094
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２６８Ｈ４２４Ｎ５２Ｏ１３１Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１６５８．７、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１３２７．２、found　１６５８．８、１３２７．０。
　２８－３　ジスルフィド結合の形成
　上記２８－２に記載の方法で得られた糖ペプチド６３（２０．１ｍｇ、３．０３μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、６．１ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７７：２３→６５：３５　１６分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６４）で表わされる化合物（Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号２９）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000095
　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９２：８→８０：２０　１６分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（１１．０ｍｇ、１．６６μｍｏｌ、収率５５％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２６８Ｈ４２２Ｎ５２Ｏ１３１Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１６５８．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１３２６．８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１１０５．８、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　９４８．０、［Ｍ＋８Ｈ］８＋　８２９．６、found　１６５８．１、１３２６．７、１１０５．６、９４７．８、８２９．４。
　実施例２９　Ｓ１－３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　２９－１　チオールの糖鎖修飾反応
　上記２４－１に記載の方法で得られたペプチド５４（２１．３ｍｇ、６．０６μｍｏｌ）と化合物ｃ（５３．４ｍｇ、３０．３μｍｏｌ、ペプチド５４に対して５．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に溶解し、室温で１時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→７０：３０　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６５）で表わされる糖ペプチド６５（配列番号７４）（３９．３ｍｇ、４．５９μｍｏｌ、収率７６％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000096
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３４１Ｈ５４４Ｎ６０Ｏ１８０Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　２１４０．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１７１２．３、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１４２７．１、found　２１４０．２、１７１２．４、１４２７．２。
　２９－２　Ａｃｍ基の脱保護
　上記２９－１に記載の方法で得られた糖ペプチド６５（３９．３ｍｇ、４．５９μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１８．７ｍｇ、１１２μｍｏｌ）の水溶液（１．８ｍＬ）を添加し、室温で９０分間反応させた。２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（４３．４ｍｇ、２８．１μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．４６ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６８：３２　１８分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６６）で表わされる糖ペプチド６６（配列番号７５）（２７．６ｍｇ、３．２８μｍｏｌ、収率７１％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000097
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３３５Ｈ５３４Ｎ５８Ｏ１７８Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　２１０４．６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１６８３．９、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１４０３．４、found　２１０４．６、１６８４．０、１４０３．３。
　２９－３　ジスルフィド結合の形成
　上記２９－２に記載の方法で得られた糖ペプチド６６（２７．６ｍｇ、３．２８μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、８．２ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７２：２８→７０．５：２９．５　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（６７）で表わされる化合物（Ｓ１－３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号３０）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000098
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９６：４→８２：１８　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１－３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（１４．５ｍｇ、１．７２μｍｏｌ、収率５２％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３３５Ｈ５３２Ｎ５８Ｏ１７８Ｓ６：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　２１０４．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１６８３．５、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１４０３．１、found　２１０３．７、１６８３．３、１４０３．０。
　実施例３０　Ｎ５Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　３０－１　糖ペプチドの固相合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．６μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（６８）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド６８（配列番号７６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000099
 　次に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、下記式（ｄ）で表わされる化合物ｄ（大塚化学株式会社製）（４１１．９ｍｇ、１５０．４μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ－ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、８７１μＬ）溶液、ＴＢＴＵ（６４．２ｍｇ、２００μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（５２．３μＬ、３００μｍｏｌ）を順次樹脂に添加し、室温で３時間振盪させて縮合させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000100
 　ＤＭＦで洗浄後、この縮合操作を１回繰り返した。樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２０分間振盪しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄することで、保護された下記式（６９）で表わされる化合物（ペプチド６９）（配列番号７７）を樹脂上で合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000101
 　この樹脂に、ＨＯＢｔ／ＤＩＣを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨを順に縮合した。縮合後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。この粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　Ａ：Ｂ＝７０：３０］を用いて精製し、下記式（７０）で表わされる糖ペプチド７０（配列番号７８）（２９．１ｍｇ、５．２６μｍｏｌ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000102
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３５Ｈ３５７Ｎ４７Ｏ１００Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８４６．６、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３８５．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１０８．４、found　１８４６．５、１３８５．１、１１０８．３。
　３０－２　ジスルフィド結合の形成
　上記３０－１に記載の方法で得られた糖ペプチド７０（１２．２ｍｇ、２．２０μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、５．５ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→６６：３５　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７１）で表わされる糖ペプチド７１（配列番号７９）（８．３ｍｇ、１．５μｍｏｌ、収率６８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000103
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３５Ｈ３５５Ｎ４７Ｏ１００Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８４６．５、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３８４．７、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１０８．０、found　１８４６．５、１３８４．７、１１０８．１。
　３０－３　ベンジル基の脱保護
　上記３０－２に記載の方法で得られた糖ペプチド７１（７．５ｍｇ、１．４μｍｏｌ）を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（２０．６ｍＬ）に溶解させ、０℃で８０分間反応させた。２００ｍＭ酢酸水溶液（５．１ｍＬ）を加え、混合溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６６．３：３３．７　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７２）で表わされる化合物（Ｎ５Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号３１）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000104
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８０：２０→６０：４０　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｎ５Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（１．４ｍｇ、収率１９％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２１Ｈ３４３Ｎ４７Ｏ１００Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１７８５．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３３９．６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１０７１．９、found　１７８５．７、１３３９．５、１０７１．８。
　実施例３１　Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　３１－１　糖ペプチドの固相合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．６μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（７３）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド７３（配列番号８０）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000105
 　次に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、化合物ｄ（４２０．２ｍｇ、１５３．３μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ－ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、８７１μＬ）溶液、ＴＢＴＵ（６４．２ｍｇ、２００μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（５２．３μＬ、３００μｍｏｌ）を順次樹脂に添加し、室温で２時間振盪させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後、この縮合操作を１回繰り返した。樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２０分間振盪しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄することで、保護された下記式（７４）で表わされるペプチド７４（配列番号８１）を樹脂上で合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000106
 　ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。この粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　Ａ：Ｂ＝７１：２９］を用いて精製し、下記式（７５）で表わされる糖ペプチド７５（配列番号８２）（６５．７ｍｇ、１１．８μｍｏｌ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000107
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３６Ｈ３５８Ｎ４８Ｏ１００Ｓ３：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３９２．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１１３．８、found　１３９１．９、１１１３．８。
　３１－２　ジスルフィド結合の形成
　上記３１－１に記載の方法で得られた糖ペプチド７５（２０．３ｍｇ、３．６５μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、９．０ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７２：２８→６７：３３　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７６）で表わされる糖ペプチド７６（配列番号８３）（１７．０ｍｇ、３．０６μｍｏｌ、収率８４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000108
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３６Ｈ３５６Ｎ４８Ｏ１００Ｓ３：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３９１．５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１１３．４、found　１３９１．３、１１１３．２。
　３１－３　ベンジル基の脱保護
　上記３１－２に記載の方法で得られた糖ペプチド７６（７．０ｍｇ、１．３μｍｏｌ）を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（１９．１ｍＬ）に溶解させ、０℃で１時間反応させた。２００ｍＭ酢酸水溶液（９．６ｍＬ）を加え、混合溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８５：１５→７７．５：２２．５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７７）で表わされる化合物（Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号３２）（２．７ｍｇ、０．５０μｍｏｌ、収率４０％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000109
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２２Ｈ３４４Ｎ４８Ｏ１００Ｓ３：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１７９４．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３４６．４、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１０７７．３、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　８９７．９、found　１７９４．７、１３４６．２、１０７７．２、８９７．７。
　実施例３２　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　３２－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて保護されたペプチドを樹脂上に合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
　Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７２：２８→６４：３６　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７８）で表わされるペプチド７８（配列番号８４）（２８．９ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000110
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１４６Ｈ２２６Ｎ４２Ｏ３９Ｓ６：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１２９．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８４７．５、found　１１２９．５、８４７．４。
　３２－２　チオールの糖鎖修飾とＳｔＢｕ基の脱保護
　上記３２－１に記載の方法で得られたペプチド７８（１０．０ｍｇ、２．９５μｍｏｌ）と下記式（ｅ）で表わされる化合物ｅ（ブロモアセトアミド化した単糖：大塚化学株式会社製[0]）（２．０ｍｇ、５．９０μｍｏｌ、ペプチド７８に対して２．０等量）を２０μＭ　ＴＣＥＰを含む３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．８９ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000111
 反応後、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３．０ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（４５．５ｍｇ、２９５μｍｏｌ）を添加し、室温で３時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（７９）で表わされる糖ペプチド７９（配列番号８５）（６．８ｍｇ、１．９μｍｏｌ、収率６４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000112
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１５２Ｈ２３４Ｎ４４Ｏ４５Ｓ５［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１８７．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８９０．５、found　１１８７．０、８９０．５。
　３２－３　チオールの糖鎖修飾反応
　上記３２－２に記載の方法で得られたペプチド７９（６．８ｍｇ、１．９μｍｏｌ）と上記式（ａ）で表わされる化合物ａ（２２．４ｍｇ、９．５６μｍｏｌ、ペプチド７９に対して５．０等量）を７．６ｍＭ　ＤＴＴを含む０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．０ｍＬ）に溶解し、室温で２時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８５：１５→６５：３５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８０）で表わされる糖ペプチド８０（配列番号８６）（３．４ｍｇ、０．５８μｍｏｌ、収率３１％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000113
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３８Ｈ３７３Ｎ５１Ｏ１０７Ｓ５：［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１６５．２、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９７１．２、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　８３２．６、［Ｍ＋８Ｈ］８＋　７２８．６、found　１１６５．２、９７１．１、８３２．６、７２８．６。
　３２－４　Ａｃｍ基の脱保護
　上記３２－３に記載の方法で得られた糖ペプチド８０（３．８ｍｇ、０．６５μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（２．７ｍｇ、１６μｍｏｌ）の水溶液（２６２μＬ）を添加し、室温で１時間反応させた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、４２６μＬ）に溶解したＤＴＴ（１０．０ｍｇ、６４．８μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（６６μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→６０：４０　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８１）で表わされる糖ペプチド８１（配列番号８７）（２．５ｍｇ、０．４４μｍｏｌ、収率６７％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000114
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３２Ｈ３６３Ｎ４９Ｏ１０５Ｓ５：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８９４．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４２０．７、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１３６．８、found　１８９３．８、１４２０．６、１１３６．７。
　３２－４　ジスルフィド結合の形成
　上記３２－３に記載の方法で得られた糖ペプチド８１（２．５ｍｇ、０．４４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．１ｍＬ）に溶解し、室温で終夜反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７０：３０　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（８２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号３３）（１．５ｍｇ、０．２６μｍｏｌ、収率５９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000115
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３２Ｈ３６１Ｎ４９Ｏ１０５Ｓ５：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８９３．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４２０．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１３６．４、found　１８９３．５、１４２０．１、１１３６．３。
　実施例３３　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ｅの代わりに下記式（ｆ）で表わされる化合物ｆ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例３２と同様にして、下記式（８３）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号３４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000116
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000117
　実施例３４　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（８４）で表わされる化合物（ペプチド８４）（配列番号８８）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８５）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号８９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000118
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000119
　実施例３５　Ｒ１１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（８６）で表わされる化合物（ペプチド８６）（配列番号９０）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８７）で表わされる化合物（Ｒ１１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号９１）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000120
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000121
　実施例３６　Ｆ２０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（８８）で表わされる化合物（ペプチド８８）（配列番号９２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（８９）で表わされる化合物（Ｆ２０Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号９３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000122
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000123
　実施例３７　Ｔ２４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（９０）で表わされる化合物（ペプチド９０）（配列番号９４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９１）で表わされる化合物（Ｔ２４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号９５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000124
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000125
　実施例３８　Ｆ２５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（９２）で表わされる化合物（ペプチド９２）（配列番号９６）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９３）で表わされる化合物（Ｆ２５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号９７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000126
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000127
　実施例３９　Ｓ２７Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（９４）で表わされる化合物（ペプチド９４）（配列番号９８）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９５）で表わされる化合物（Ｓ２７Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号９９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000128
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000129
　実施例４０　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｋ－ＳＲＩＦ１４の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（９６）で表わされる化合物（ペプチド９６）（配列番号１００）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９７）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｋ－ＳＲＩＦ１４）（配列番号１０１）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000130
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000131
　実施例４１　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｆ２５Ｙ－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに下記式（９８）で表わされる化合物（ペプチド９８）（配列番号１０２）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（９９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｆ２５Ｙ－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１０３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000132
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000133
　実施例４２　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８－アミドの合成
　ペプチド１の代わりに下記式（１００）で表わされる化合物（ペプチド１００）（配列番号１０４）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８－アミド）（配列番号１０５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000134
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000135
　実施例４３　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４の合成
　４３－１　ペプチドの合成
　　上記１９－１に記載の方法で得られた、樹脂に結合している保護されたペプチド３９（配列番号５８）（５０μｍｏｌ）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－（ＰＥＧ）２－ＣＯＯＨ（メルク社製）およびＦｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨを順に縮合した。Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、３時間室温で振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドの一部をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18　UG‐120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル、グラジエント　Ａ：Ｂ＝７４：２６→６９：３１　１分、次いで６９：３１→６２：３８　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１０２）で表わされる化合物（ペプチド１０２）（配列番号１０６）（４３．１ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000136
 　ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ９４Ｈ１３８Ｎ２２Ｏ２６Ｓ３：［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１０４５．２、［Ｍ＋３Ｈ］３＋　６９７．１、found　１０４５．０、６９７．０。
　４３－２　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４の合成
　ペプチド１の代わりに上記４３－１に記載の方法で得られたペプチド１０２を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０３）で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４）（配列番号１０７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000137
　実施例４４　Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　４４－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）を含むジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（１０４）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド１０４（配列番号１０８）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000138
 　Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、ビオチンを縮合させた。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。これにより、アミノ酸側鎖の保護基（Ａｃｍ基以外）を脱離させるとともに、ペプチドと樹脂とを切り離した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６１：３９　１８分　直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１０５）で表わされるペプチド１０５（配列番号１０９）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000139
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１５３Ｈ２３３Ｎ４５Ｏ４２Ｓ５：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１７９．４、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８８４．８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　７０８．０、found　１１７９．２、８８４．４、７０７．９。
　４４－２　Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに上記４４－１に記載の方法で得られたペプチド１１４を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０６）で表わされる化合物（Ｂｉｏｔｉｎ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１０）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000140
　実施例４５　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　４５－１　ペプチドの合成
　　上記４４－１で得られた、樹脂に結合している保護されたペプチド１０４（配列番号１０８）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、Ｆｍｏｃ－ＮＨ－（ＰＥＧ）２－ＣＯＯＨ（メルク社製）およびビオチンを順に縮合した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６１：３９　２２分　直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１０７）で表わされるペプチド１０７（配列番号１１１）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000141
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１６２Ｈ２５０Ｎ４６Ｏ４６Ｓ５：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１２４７．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　９３５．６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　７４８．７、found　１２４６．９、９３５．４、７４８．６。
　４５－２　Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに上記４５－１に記載の方法で得られたペプチド１０７を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１０８）で表わされる化合物（Ｂｉｏｔｉｎ－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１２）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000142
　実施例４６　Ａｚｉｄｏ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　４６－１　ペプチドの合成
　　上記４４－１で得られた、樹脂に結合している保護されたペプチド１０４（配列番号１０８）のＦｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、ＨＣＴＵを縮合剤として用いて、５－Ａｚｉｄｏ－ｐｅｎｔａｎｏｉｃ　ａｃｉｄを縮合した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７０：３０→６０：４０　２０分　直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１０９）で表わされるペプチド１０９（配列番号１１３）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000143
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１４８Ｈ２２６Ｎ４６Ｏ４１Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１４５．６、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８５９．５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　６８７．８、found　１１４５．５、８５９．２、６８７．５。
　４６－２　Ａｚｉｄｏ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりに上記４６－１に記載の方法で得られたペプチド１０９を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１１０）で表わされる化合物（Ａｚｉｄｏ－Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000144
　実施例４７　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド４４の代わりに下記式（１１１）で表わされる化合物（ペプチド１１１）（配列番号１１５）を合成して用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（１１２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１１６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000145
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000146
 実施例４８　２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４の合成
　ペプチド４４の代わりに下記式（１１３）で表わされる化合物（ペプチド１１３）（配列番号１１７）を合成して用いたこと以外は、実施例２０と同様にして、下記式（１１４）で表わされる化合物（２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４）（配列番号１１８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000147
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000148
　実施例４９　３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４の合成
　ペプチド５４の代わりに下記式（１１５）で表わされる化合物（ペプチド１１５）（配列番号１１９）を合成して用いたこと以外は、実施例２４と同様にして、下記式（１１６）で表わされる化合物（３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４）（配列番号１２０）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000149
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000150
　実施例５０　Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　５０－１　チオールの糖鎖修飾反応
　ペプチド１（配列番号３８）（ＡＰＣ社製）（２５．０ｍｇ、７．５６μｍｏｌ）と下記式（ｈ）で表わされる化合物ｈ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）（１５．６ｍｇ、１５．１μｍｏｌ、ペプチド１に対して２．０等量）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．３ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000151
 （ｈ）
　反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６２：３８　１３分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１１７）で表わされる糖ペプチド１１７（配列番号１２１）（２５．６ｍｇ、６．０１μｍｏｌ、収率７９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000152
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１９５Ｈ３０４Ｎ４８Ｏ７６Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１５５６．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１１６７．３、found　１５５５．７、１１６７．０。
　５０－２　Ａｃｍ基の脱保護
　上記５０－１に記載の方法で得られた糖ペプチド１１７（２８．３ｍｇ、６．０７μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１２．５ｍｇ、７４．５μｍｏｌ）の水溶液（２．４ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．４ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（２８．８ｍｇ、１８７μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（０．６ｍＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６０：４０　１３分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１１８）で表わされる糖ペプチド１１８（配列番号１２２）（１９．８ｍｇ、４．３８μｍｏｌ、収率７２％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000153
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１８９Ｈ２９４Ｎ４６Ｏ７４Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１５０８．６、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１１３１．７、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　９０５．６、found　１５０８．３、１１３１．５、９０５．４。
　５０－３　ジスルフィド結合の形成
　上記５０－２に記載の方法で得られた糖ペプチド１１８（１９．８ｍｇ、４．３８μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）‐ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、８．８ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６０：４０　１３分　直線濃度勾配溶出］を用いて粗精製し、下記式（１１９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２３）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000154
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７８：２２　１２分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８（１１．９ｍｇ、２．６３μｍｏｌ、収率６０％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１８９Ｈ２９２Ｎ４６Ｏ７４Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１５０８．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１１３１．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　９０５．２、found　１５０７．７、１１３１．０、９０５．０。
　実施例５１　Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ｈの代わりに化合物ｆを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２０）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000155
　実施例５２　Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりにペプチド２１を用い、化合物ｈの代わりに化合物ｆを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２１）で表わされる化合物（Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000156
　実施例５３　Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ｈの代わりに化合物ｅを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２２）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２６）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000157
　実施例５４　Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　ペプチド１の代わりにペプチド２１を用い、化合物ｈの代わりに化合物ｅを用いたこと以外は、実施例５０と同様にして、下記式（１２３）で表わされる化合物（Ｎ１９Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２７）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000158
　実施例５５　Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに下記式（ｉ）で表わされる化合物ｉ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１２４）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２８）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000159
 （ｉ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000160
　実施例５６　Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに下記式（ｊ）で表わされる化合物ｊ（ブロモアセトアミド化したオリゴ糖：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１２５）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１２９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000161
 （ｊ）

Figure JPOXMLDOC01-appb-C000162
　実施例５７　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　５７－１　ブロモアセトアミド化されたジシアロ糖鎖誘導体の合成
　下記式（ｋ）で表わされる化合物ｋ（大塚化学株式会社製）（２０４．１ｍｇ、９２．１μｍｏｌ）に水（２ｍＬ）、ｔｅｒｔ－Ｂｕｔｙｌ　Ｎ－（２－Ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ｃａｒｂａｍａｔｅ（０．２９ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌させた。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥物にＤＭＦ（５ｍＬ）、ＨＡＴＵ（３４９ｍｇ、９２１μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１６１μＬ、９２１μｍｏｌ）を加え３７℃で１８時間反応させた。溶液にトルエン（５０ｍＬ）を加え析出した沈殿物をろ過で回収した。沈殿物をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ゲルろ過精製［カラム：Sephadex G-25、φ２０ｘ２００ｍｍ、流速：３０ｍＬ／ｈ］を用いて精製し、目的分画を回収し凍結乾燥することで、下記式（ｌ）で表される化合物ｌ（１５２．４ｍｇ、６０．８μｍｏｌ、収率６６％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000163
 （ｋ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000164
 （ｌ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ９８Ｈ１６６Ｎ１０Ｏ６４：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２５３０．０、found　２５２９．４。
　化合物ｌ（１００ｍｇ、３９．８μｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（３１．４ｍｇ、３９８μｍｏｌ）を水（１ｍＬ）に溶解し室温で７日間反応させた。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥物に対し、水（１ｍＬ）、ＤＣＣ（４１．０ｍｇ、１９９μｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したブロモ酢酸（２７．７ｍｇ、１９９μｍｏｌ）を順次加えた。氷冷下で１時間反応後、溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒　水：アセトニトリル＝８４：１６］を用いて精製し下記式（ｍ）で表される化合物ｍ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖誘導体：１００ｍｇ、３８．２μｍｏｌ、収率９６％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000165
 （ｍ）
MALDI-MS：（m／z）（m／z）calcd for　Ｃ１００Ｈ１６８ＢｒＮ１１Ｏ６４：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２６４８．９、found　２６４８．５。
　５７－２　チオールの糖鎖修飾反応
　上記５７－１に記載の方法で得られた化合物ｍ（１４．２ｍｇ、５．４０μｍｏｌ）とペプチド１（１５．０ｍｇ、４．５３μｍｏｌ）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．３ｍＬ）に溶解し、室温で３０分間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％酢酸（ＡｃＯＨ）水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８６：１４→８２：１８　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２６）で表わされる糖ペプチド１２６（配列番号１３０）（１３．４ｍｇ、２．２９μｍｏｌ、収率５１％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２４３Ｈ３８６Ｎ５４Ｏ１０４Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４６５．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１７２．２、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９７７．０、found　１４６４．９、１１７２．１、９７７．１。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000166
　　５７－３　Ｂｏｃ基の脱保護
　　上記５７－２に記載の方法で得られた糖ペプチド１２６（１３．４ｍｇ、２．２９μｍｏｌ）を９５％ＴＦＡ水溶液（４５８μＬ）に溶解させ、室温で５分間振盪した。５０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液（ｐＨ６．８、３３ｍＬ）を添加した後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６５：３５　１０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２７）で表わされる糖ペプチド１２７（配列番号１３１）（１２．７ｍｇ、９８μｍｏｌ、収率９８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000167
 　ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３３Ｈ３７０Ｎ５４Ｏ１００Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４１５．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１３２．２、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９４３．７、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　８０９．０、found　１４１４．９、１１３２．１、９４３．６、８０８．９。
　　５７－４　Ａｃｍ基の脱保護
　　上記５７－３に記載の方法で得られた糖ペプチド１２７（１２．７ｍｇ、２．２５μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（９．２ｍｇ、５５μｍｏｌ）の水溶液（０．９ｍＬ）を添加し、室温で３０分間反応させた。その後、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（２１．２ｍｇ、１３７μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（２２５μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６０：４０　１３分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２８）で表わされる糖ペプチド１２８（配列番号１３２）（５．２ｍｇ、０．９４μｍｏｌ、収率４２％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000168
 　ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２７Ｈ３６０Ｎ５２Ｏ９８Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３７９．５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１０３．８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９２０．０、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　７８８．７、found　１３７９．４、１１０３．７、９１９．９、７８８．６。
　５７－５　ジスルフィド結合の形成
　上記５７－４に記載の方法で得られた糖ペプチド１２８（５．２ｍｇ、０．９４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．９ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７０：３０→６５：３５　１３分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１２９）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３３）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000169
 この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９２：８→８５：１５　１４分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８（３．８ｍｇ、０．６９μｍｏｌ、収率７３％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２２７Ｈ３５８Ｎ５２Ｏ９８Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１８３８．３、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１３７９．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１０３．４、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９１９．６、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　７８８．４、found　１８３８．０、１３７８．５、１１０３．２、９１９．５、７８８．２。
　実施例５８　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　５８－１　ブロモアセトアミド化されたジシアロ糖鎖誘導体の合成
　　化合物ｋ（大塚化学株式会社製）（１５２ｍｇ、６８．６μｍｏｌ）にＤＭＦ（１．９ｍＬ）、臭化リチウム（３５７ｍｇ、４．１２ｍｍｏｌ）、塩化フェナシル（２７３ｍｇ、１．３７ｍｍｏｌ）を順次加え、３７℃で反応させた。１０時間後、水（１９ｍＬ）を加え析出物をろ過で取り除いた。ろ液に２５％アンモニウム水（５ｍＬ）を加え室温で１８時間反応させた後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、８０ｍＬ）を加え中和した。溶液をＨＰＬＣ［カラム：YMC Hydrosphere C18（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒　０．１％ＴＦＡ水：アセトニトリル＝９８：２→９２：８　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し凍結乾燥することで下記式（ｎ）で表される化合物ｎ（６０．９ｍｇ、２７．４μｍｏｌ、収率４０％）を得た。
MALDI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ８４Ｈ１４０Ｎ８Ｏ６０：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２２４３．８、found　２２４３．６。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000170
 （ｎ）
得られた中間体ｎ（３７．３ｍｇ、１６．８μｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（１３．３ｍｇ、１６８μｍｏｌ）を水（０．３７ｍＬ）に溶解し室温で７日間反応させた。凍結乾燥後、得られた[0]凍結乾燥物に対し、水（０．３７ｍＬ）、ＤＣＣ（１７．３ｍｇ、８４μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．３７ｍＬ）に溶解したブロモ酢酸（１１．７ｍｇ、８４μｍｏｌ）を順次加えた。氷冷下で１時間反応後の溶液をＨＰＬＣ［カラム：YMC Hydrosphere C18（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒　０．１％ＴＦＡ水：アセトニトリル＝９８：２→９２：８、３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（ｏ）で表される化合物ｏ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖誘導体：２９．０ｍｇ、１２．４μｍｏｌ、収率７４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000171
 （ｏ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ８６Ｈ１４２ＢｒＮ９Ｏ６０：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２３６２．７、found　２３６２．５。
　５８－２　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに上記５８－１に記載の方法で得られた化合物ｏを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１３０）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３４）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000172
　実施例５９　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　５９－１　ブロモアセトアミド化されたベンジル保護基を持つジシアロ糖鎖の合成
　化合物ａ（２８．９ｍｇ、１２．３μｍｏｌ）にＤＭＦ（０．５８ｍＬ）、臭化リチウム（２１．５ｍｇ、２４８μｍｏｌ）、臭化ベンジル（１４．６μＬ、１２２μｍｏｌ）を順次加え、３０℃で２０時間反応させた。臭化ベンジル（１４．６μＬ、１２２μｍｏｌ）をさらに添加して２０時間反応させた。反応液にトルエン（３０ｍＬ）を加え、遠心分離（１０，０００×ｇ、１０分間）の後、沈殿物を水（１００μＬ）に溶解してＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒　水：アセトニトリル＝９５：５→７０：３０　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（ｇ）で表される化合物ｇ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖：７．６ｍｇ、３．０μｍｏｌ、収率２４％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000173
 （g）
MALDI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１００Ｈ１５２ＢｒＮ７Ｏ６２：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２５４４．８、found　２５４４．４。
　５９－２　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに化合物ｇを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１３１）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３５）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000174
　　実施例６０　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　　６０－１　ブロモアセトアミド化されたジシアロ糖鎖誘導体の合成
   　化合物ｋ（大塚化学株式会社製）（１４０ｍｇ、６３．０μｍｏｌ）に水（１．５ｍＬ）、メタノール（１．５ｍＬ）、ヘキサデシルアミン（３００ｍｇ、１２６μｍｏｌ）を加え、室温で１時間撹拌させた。凍結乾燥後、得られた凍結乾燥物にＤＭＦ（５ｍＬ）、ＨＡＴＵ（２３９ｍｇ、６３０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１１０μＬ、６３０μｍｏｌ）を加え３７℃で反応させた。１８時間後、溶液にジエチルエーテル（１００ｍＬ）を加え析出した沈殿物をろ過で回収した。この沈殿物をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解し、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒　水：アセトニトリル＝４０：６０→１０：９０、３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製することで下記式（ｐ）で表される化合物ｐ（７１．１ｍｇ、２６．６μｍｏｌ、収率４２％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000175
 （ｐ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１１６Ｈ２０４Ｎ８Ｏ６０：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２６９２．３、found　２６９１．９。
　得られた化合物ｐ（７１．７ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）と炭酸水素アンモニウム（２１．８ｍｇ、２６６μｍｏｌ）を水（０．７ｍＬ）、メタノール（０．７ｍＬ）に溶解し室温で反応させた。７日後、凍結乾燥して得られた凍結乾燥物に対し、水（０．７ｍＬ）、メタノール（０．７ｍＬ）、ＤＣＣ（２７．４ｍｇ、１３３μｍｏｌ）、ＤＭＦ（０．７ｍＬ）に溶解したブロモ酢酸（１８．５ｍｇ、１３３μｍｏｌ）を順次加えた。氷冷下で１時間反応後、溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：８．０ｍＬ／分、展開溶媒　水：アセトニトリル＝４０：６０→１０：９０、３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し下記式（ｑ）で表される化合物ｑ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖：２４．９ｍｇ、８．９μｍｏｌ、収率３３％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000176
 （ｑ）
MALDI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１１８Ｈ２０６ＢｒＮ９Ｏ６０：［Ｍ＋Ｎａ］＋　２８１１．２、found　２８１１．０。
　６０－２　チオールの糖鎖修飾反応
　ペプチド１（１０．４ｍｇ、３．１４μｍｏｌ）を３０μＭ　ＴＣＥＰを含む０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、６２μＬ）に溶解させた。この溶液に、上記６０－１に記載の方法で得られた化合物ｑ（７９．４ｍｇ、２８．５μｍｏｌ）のＤＭＳＯ（３．７ｍＬ）溶液を添加し、室温で２０分間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　　グラジエント　Ａ：Ｂ＝５０：５０→２２：７８　１４分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３２）で表わされる糖ペプチド１３２（配列番号１３６）（６．４ｍｇ、１．１μｍｏｌ、収率３５％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２６１Ｈ４２４Ｎ５２Ｏ１００Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　２００７．２、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１５０５．７、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１２０４．７、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１００４．１、found　２００７．４、１５０５．５、１２０４．８、１００４．０。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000177
　　６０－３　Ａｃｍ基の脱保護
　　上記６０－２に記載の方法で得られた糖ペプチド１３２（６．４ｍｇ、１．１μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（３．８ｍｇ、２３μｍｏｌ）の水溶液（０．８ｍＬ）を添加し、室温で４０分間反応させた。その後、２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３７７μＬ）に溶解したＤＴＴ（８．８ｍｇ、５７μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（１０６μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝４８：５２→３８：６２　３分、次いで３８：６２→３０：７０　８分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３３）で表わされる糖ペプチド１３３（配列番号１３７）（３．２ｍｇ、０．５４μｍｏｌ、収率４９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000178
 　ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２５５Ｈ４１４Ｎ５０Ｏ９８Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１９５９．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４７０．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１７６．３、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９８０．４、found　１９５９．６、１４６９．９、１１７６．１、９８０．５。
　　６０－３　ジスルフィド結合の形成
　　上記６０－２に記載の方法で得られた糖ペプチド１３３（３．２ｍｇ、０．５４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）‐ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．１ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝４８：５２→３８：６２　３分、次いで３８：６２→３０：７０　８分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１３４）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ｈｅｘａｄｅｃｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３８）（２．８ｍｇ、０．４８μｍｏｌ、収率８９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000179
 　ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２５５Ｈ４１２Ｎ５０Ｏ９８Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１９５９．２、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４６９．６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１７５．９、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９８０．１、found　１９５８．９、１４６９．４、１１７５．７、９７９．９。
実施例６１　Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ｃの代わりに化合物ｏを用いたこと以外は、実施例２８と同様にして、下記式（１３５）で表わされる化合物（Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１３９）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000180
　実施例６２　Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ｃの代わりに化合物ｇを用いたこと以外は、実施例２８と同様にして、下記式（１３６）で表わされる化合物（Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４０）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000181
　実施例６３　Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））－ＳＲＩＦ２８の合成
　化合物ａの代わりに下記式（ｒ）で表わされる化合物ｒ（ブロモアセチル化した糖鎖付加Ａｓｎ：大塚化学株式会社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、下記式（１３７）で表わされる化合物（Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４１）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000182
 （ｒ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000183
　実施例６４　Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　６４－１　糖ペプチドの固相合成
　　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（７２．５ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．６μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基をＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて樹脂に結合した状態にある保護された下記式（１３８）で表わされるペプチド１３８（配列番号１４２）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000184
　次に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、化合物ｄ（１４１．０ｍｇ、５１．５μｍｏｌ）、ＤＭＳＯ－ＤＭＦ（１／１、ｖ／ｖ、１．１ｍＬ）溶液、ＴＢＴＵ（２１．２ｍｇ、６６．０μｍｏｌ）、およびＤＩＰＥＡ（１７．２μＬ、９８．７μｍｏｌ）を順次樹脂に添加し、室温で４時間振盪させて縮合させた。ＤＭＦで洗浄後、この縮合操作を１回繰り返した。樹脂をＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで２０分間振盪しＦｍｏｃ基を脱保護しＤＭＦで樹脂を洗浄することで、下記式（１３９）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド１３９（配列番号１４３）を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000185
 　ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。この粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　Ａ：Ｂ＝７０：３０］を用いて精製し、下記式（１４０）で表わされる糖ペプチド１４０（配列番号１４４）（５．８ｍｇ、１．１μｍｏｌ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000186
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２４１Ｈ３６７Ｎ４９Ｏ１０１Ｓ４：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４２４．８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１４０．０、found　１４２４．６、１１３９．９。
　６４－２　チオールの糖鎖修飾反応
　上記６４－１に記載の方法で得られた糖ペプチド１４０（１０．８ｍｇ、１．９０μｍｏｌ）と化合物ｆ（５．３ｍｇ、５．１μｍｏｌ）を１４１μＭ　ＴＣＥＰを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．８ｍＬ）に溶解し、室温で２４時間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４１）で表わされる糖ペプチド１４１（配列番号１４５）（４．９ｍｇ、０．７４μｍｏｌ、収率３９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000187
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２７７Ｈ４２６Ｎ５２Ｏ１２７Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　２２１６．０、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１６６２．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１３３０．０、found　２２１５．６、１６６１．９、１３３０．１。
　６４－３　Ａｃｍ基の脱保護
　上記６４－２に記載の方法で得られた糖ペプチド１４１（４．９ｍｇ、０．７４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（１．５ｍｇ、９．０μｍｏｌ）の水溶液（１４８μＬ）を添加し、室温で１．５時間反応させた。２００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１４５μＬ）に溶解したＤＴＴ（３．５ｍｇ、２３μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（３７μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７４：２６→６４：３６　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４２）で表わされる糖ペプチド１４２（配列番号１４６）（３．７ｍｇ、０．５７μｍｏｌ、収率７７％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000188
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２７１Ｈ４１６Ｎ５０Ｏ１２５Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　２１６８．６、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１６２６．７、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１３０１．５、found　２１６８．６、１６２６．４、１３０１．３。
　６４－４　ジスルフィド結合の形成
　上記６４－３に記載の方法で得られた糖ペプチド１４２（３．７ｍｇ、０．５４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）‐ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．４ｍＬ）に溶解し、室温で３１時間反応させた。反応溶液を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４３）で表わされる糖ペプチド１４３（配列番号１４７）（２．９ｍｇ、０．４５μｍｏｌ、収率７８％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000189
 　ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２７１Ｈ４１４Ｎ５０Ｏ１２５Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　２１６７．９、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１６２６．２、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１３０１．１、found　２１６７．９、１６２６．０、１３０１．２。
　６４－５　ベンジル基の脱保護
　上記６４－４に記載の方法で得られた糖ペプチド１４３（２．９ｍｇ、０．４５μｍｏｌ）を５０ｍＭ水酸化ナトリウム水溶液（１３．６ｍＬ）に溶解させ、０℃で１時間反応させた。２００ｍＭ酢酸水溶液（３．４ｍＬ）を加え、混合溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６０：４０　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式１４４で表わされる化合物（Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１４８）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000190
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ４．６ｘ２５０ｍｍ、流速：０．７ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９５：５→８５：１５　２分、次いで８５：１５→６５：３５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｓ１Ｎ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ１９Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８（１．６ｍｇ、０．２５μｍｏｌ、収率５７％）を得た。
ESI-MS：calcd for　Ｃ２５７Ｈ４０２Ｎ５０Ｏ１２５Ｓ４：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　２１０７．８、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１５８１．１、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１２６５．１、found　２１０７．９、１５８０．９、１２６５．１。
　実施例６５　Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　６５－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて樹脂に結合した状態にある保護された下記式（１４５）で表わされるペプチド１４５（配列番号１４９）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000191
 　樹脂の一部（５０μｍｏｌ）を取り、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７３：２７→６３：３７　３０分　直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１４６）で表わされるペプチド１４６（配列番号１５０）（３０．４ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000192
 ESI-MS：（m／z）（m／z）calcd for　Ｃ１５０Ｈ２３２Ｎ４４Ｏ４１Ｓ６：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１１６７．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　８７６．０、found　１１６７．５、８７５．９。
　６５－２　糖鎖誘導体におけるＢｏｃ基の脱保護
　化合物ｍ（５０．０ｍｇ、１９．０μｍｏｌ）を９５％ＴＦＡ水（２．５ｍＬ）に溶解させ、室温で振盪した。１０分後、ジエチルエーテル（１５ｍＬ）を加え、析出した沈殿を遠心分離（１０，０００×ｇ１０分間）した。沈殿物を水に溶解して凍結乾燥することで、下記式（ｓ）で表される化合物ｓ（ブロモアセトアミド化したジシアロ糖鎖：４６．０ｍｇ、１８．９μｍｏｌ、収率９９％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000193
 （ｓ）
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ９０Ｈ１５２ＢｒＮ１１Ｏ６０：［Ｍ＋２Ｈ］２＋　１２１５．１、［Ｍ＋３Ｈ］３＋　８１０．４、found　１２１４．９、８１０．３。
　６５－３　チオールの糖鎖修飾
　上記６５－１に記載の方法で得られたペプチド１４６（２０．６ｍｇ、５．８９μｍｏｌ）と上記６５－２に記載の方法で得られた化合物ｓ（２８．６ｍｇ、１１．８μｍｏｌ）を３３ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、１．８ｍＬ）に溶解し、室温で３０分反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７４：２６→６４：３６　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４７）で表わされる糖ペプチド１４７（配列番号１５１）（１７．１ｍｇ、２．９３μｍｏｌ、収率５０％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000194
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２４０Ｈ３８３Ｎ５５Ｏ１０１Ｓ６：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１９５０．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４６２．８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１７０．５、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９７５．６、found　１９４９．９、１４６２．６、１１７０．３、９７５．４。
　６５－４　ＳｔＢｕ基の脱保護
　上記６５－３に記載の方法で得られた糖ペプチド１４７（１７．１ｍｇ、２．９３μｍｏｌ）に、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３．４ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（５２．９ｍｇ、３４３μｍｏｌ）を添加し、室温で３時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９５：５→７５：２５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４８）で表わされる糖ペプチド１４８（配列番号１５２）（８．６ｍｇ、１．５μｍｏｌ、収率５１％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000195
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ２３６Ｈ３７５Ｎ５５Ｏ１０１Ｓ５：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１９２０．７、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１４４０．８、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１１５２．８、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　９６０．９、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　８２３．７、found　１９２０．５、１４４０．６、１１５２．７、９６０．６、８２３．６。
　６５－５　チオールの糖鎖修飾反応
　上記６５－４に記載の方法で得られたペプチド１４８（６．２ｍｇ、１．１μｍｏｌ）と化合物ａ（３．８ｍｇ、１．６μｍｏｌ）を１．６ｍＭ　ＤＴＴを含む０．３６Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、３３９ｍＬ）に溶解し、室温で２．５時間反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１４９）で表わされる糖ペプチド１４９（配列番号１５３）（６．４ｍｇ、０．８０μｍｏｌ、収率７３％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000196
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３２２Ｈ５１４Ｎ６２Ｏ１６３Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　２００６．５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１６０５．４、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１３３８．０、found　２００６．６、１６０５．３、１３３８．０。
　６５－６　Ａｃｍ基の脱保護
　上記６５－５に記載の方法で得られた糖ペプチド１４９（８．２ｍｇ、１．０μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（２．１ｍｇ、１３μｍｏｌ）の水溶液（２２５μＬ）を添加し、室温で１時間反応させた。１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２０４μＬ）に溶解したＤＴＴ（４．８ｍｇ、３１μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（５１μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５０）で表わされる糖ペプチド１５０（配列番号１５４）（５．５ｍｇ、０．７０μｍｏｌ、収率７０％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000197
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ３１６Ｈ５０４Ｎ６０Ｏ１６１Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１９７１．０、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１５７７．０、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１３１４．３、found　１９７０．６、１５７６．８、１３１４．２。
　６５－７　ジスルフィド結合の形成
　上記６５－６に記載の方法で得られた糖ペプチド１５０（５．４ｍｇ、０．６９μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、１．７ｍＬ）に溶解し、室温で終夜反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５　３０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式１５１で表わされる化合物（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）（配列番号１５５）を含む画分を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000198
 　この画分を、ＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝９０：１０→７５：２５　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いてさらに精製し、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（３．１ｍｇ、０．４０μｍｏｌ、収率５８％）を得た。
ESI-MS：calcd for　Ｃ３１６Ｈ５０２Ｎ６０Ｏ１６１Ｓ５：［Ｍ＋４Ｈ］４＋　１９７０．５、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　１５７６．６、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　１３１４．０、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１１２６．４、［Ｍ＋８Ｈ］８＋　９８５．８、［Ｍ＋９Ｈ］９＋　８７６．３、found　１９７０．３、１５７６．４、１３１３．９、１１２６．４、９８５．５、８７６．１。
　実施例６６　Ｓ１－４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の合成
　６６－１　ペプチドの合成
　固相合成用カラムに２－クロロトリチルクロリド樹脂（１００μｍｏｌ）を取り、ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ（４９．７ｍｇ、１２０μｍｏｌ）とＤＩＰＥＡ（１０４．５μＬ、６００μｍｏｌ）のジクロロメタン（３．０ｍＬ）溶液を加え、１時間振盪した。ジクロロメタンおよびＤＭＦで洗浄後、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦで洗浄後、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成機を用いて、Ｆｍｏｃ法によるペプチド固相合成法にて、下記式（１５２）で表わされる、樹脂に結合した状態にある保護されたペプチド１５２（配列番号１５６）を合成した。縮合反応は、縮合剤としてＨＣＴＵを使用してＤＭＦ中で行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000199
 　Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。ＤＭＦおよびジクロロメタンで洗浄後、ＴＦＡ：水：トリイソプロピルシラン：エタンジチオール（＝９０：２．５：５：２．５）を加え、室温で３時間振盪した。樹脂をろ過して除き、ろ液に冷却したジエチルエーテルを加え、粗ペプチドを沈殿として得た。粗ペプチドをＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120（５μｍ）、φ５０ｘ２５０ｍｍ、流速：４３．７ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＴＦＡ水　Ｂ：０．０９％ＴＦＡ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→６５：３５　２０分　直線濃度勾配溶出］で精製し、下記式（１５３）で表わされるペプチド１５３（配列番号１５７）（１２７．２ｍｇ）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000200
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ１５２Ｈ２３４Ｎ４６Ｏ４３Ｓ７：［Ｍ＋３Ｈ］３＋　１２０７．１、［Ｍ＋４Ｈ］４＋　９０５．６、［Ｍ＋５Ｈ］５＋　７２４．６、found　１２０６．９、９０５．１、７２４．５。
　６６－２　チオールの糖鎖修飾反応
　上記６６－１に記載の方法で得られたペプチド１５３（３０．４ｍｇ、８．４０μｍｏｌ）と化合物ａ（１２８ｍｇ、５４．７μｍｏｌ）を３３ ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、２．５ｍＬ）に溶解し、室温で終夜反応させた。反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８２：１８→７１：２９　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５４）で表わされる糖ペプチド１５４（配列番号１５８）（３０．９ｍｇ、２．４４μｍｏｌ、収率２９％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ４９６Ｈ７９０Ｎ７４Ｏ２９１Ｓ７：［Ｍ＋６Ｈ］６＋　２１１２．７、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１８１１．１、found　２１１２．８、１８１１．０。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000201
　６６－３　Ａｃｍ基の脱保護
　上記６６－２に記載の方法で得られた糖ペプチド１５４（３０．９ｍｇ、２．４４μｍｏｌ）に酢酸銀（Ｉ）（５．０ｍｇ、３０μｍｏｌ）の水溶液（０．９８ｍＬ）を添加し、室温で２０分間反応させた。その後、２００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ７．４、０．９８ｍＬ）に溶解したＤＴＴ（１１．８ｍｇ、７６．５μｍｏｌ）および１００ｍＭアスコルビン酸水溶液（２４４μＬ）を添加し、速やかにフィルターでろ過した。ろ液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：０．１％ＡｃＯＨ水　Ｂ：０．０９％ＡｃＯＨ／１０％水／９０％アセトニトリル　グラジエント　Ａ：Ｂ＝８２：１８→７０：３０　２０分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５５）で表わされる糖ペプチド１５５（配列番号１５９）（２０．６ｍｇ、１．６４μｍｏｌ、収率６７％）を得た。
ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ４９０Ｈ７８０Ｎ７２Ｏ２８９Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋　２５０６．６、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　２０８９．０、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１７９０．７、found　２５０６．５、２０８８．８、１７９０．４。
　６６－４　ジスルフィド結合の形成
　上記６６－３に記載の方法で得られた糖ペプチド１５５（２０．６ｍｇ、１．６４μｍｏｌ）を１００ｍＭトリス‐塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）―ＤＭＳＯ（１／１、ｖ／ｖ、２．１ｍＬ）に溶解し、室温で２日間反応させた。その後、反応溶液をＨＰＬＣ［カラム：SHISEIDO Proteonavi（５μｍ）、φ２０ｘ２５０ｍｍ、流速：７．０ｍＬ／分、展開溶媒　Ａ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液　Ｂ：１０ｍＭ酢酸アンモニウム‐アセトニトリル（１／９、ｖ／ｖ）　グラジエント　Ａ：Ｂ＝７５：２５→７２：２８　１５分　直線濃度勾配溶出］を用いて精製し、下記式（１５６）で表わされるＳ１－４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８（配列番号１６０）（１１．６ｍｇ、０．９３μｍｏｌ、収率５７％）を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000203
 ESI-MS：（m／z）calcd for　Ｃ４９０Ｈ７７８Ｎ７２Ｏ２８９Ｓ７：［Ｍ＋５Ｈ］５＋　２５０６．２、［Ｍ＋６Ｈ］６＋　２０８８．７、［Ｍ＋７Ｈ］７＋　１７９０．５、found　２５０６．１、２０８８．６、１７９０．４。
　表１－１から表１－７に、実施例１～６６に記載の方法で得られた糖鎖付加ＳＲＩＦペプチドのＭＳスペクトルデータ（ＥＳＩ－ＭＳ）を示す。分子質量は、ＭａｓｓＬｙｎｘバージョン４．１（Ｗａｔｅｒｓ社製）を用いて、多価タンパク質質量分析のデコンボリューションを行うことによって得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000204
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000205
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000206
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000207
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000208
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000209
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000210
　実施例６７－１　受容体結合親和性の算出
　下記の方法で競合的結合実験を行い、受容体結合親和性を算出した。
　競合的結合実験に用いた試薬とその正式化学名は以下の通り。ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）。
　競合的結合実験はリセルカバイオサイエンス社に委託し、実験およびデータ解析を行った。用いた受容体サブタイプおよび受容体膜標品を表２に示す。各結合実験に共通して、標識リガンドとして［１２５Ｉ］Ｔｙｒ１１－Ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ１４（Ｔｙｒ１１－ＳＲＩＦ１４）を、非標識リガンドとしてＳｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ－１４（ＳＲＩＦ１４）を、バッファとして５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＣａＣｌ２、０．１％　ＢＳＡを含んだ２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４を使用した。試験物質は、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または、１０００ｎＭの濃度で使用し、膜標品と混ぜ合わせて反応液とした。また、反応液に添加した標識リガンドおよび非標識リガンドの濃度を表２に示す。反応液のインキュベーション条件は、ＳＳＴＲ２では２５℃で４時間、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５では２５℃で２時間とした。実験回ごとに、陽性対照としてＳＲＩＦ１４を用いた。データ解析は、ＭａｔｈＩＱＴＭ（ＩＤ　Ｂｕｓｉｎｅｓｓ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社、ＵＫ）を使用して非線形性最小二乗法で、結合阻害率の数値データを基に５０％阻害濃度（ＩＣ５０値）を求めた。結合阻害定数（Ｋｉ値）はＣｈｅｎｇ，Ｙらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２２，３０９９－３１０８，１９７３）により算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000211
　結合実験を実施した化合物および結合実験の結果を表３Ａに示す。また、対照化合物としてオクトレオチド、ＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８を同様に評価した。なお、オクトレオチドについては最高濃度を１００ｎＭとしたため、ＳＳＴＲ１、およびＳＳＴＲ４においてＩＣ５０値を算出できず、>１００ｎＭと表記した。
　なお、図１Ａおよび図１Ｂは、表３Ａ中の化合物名に対応する糖鎖付加ペプチド（糖鎖付加体）の構造の一例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000212
　対照としたオクトレオチドはＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ５の各受容体に、またＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８は全てのＳＳＴＲに結合した。表３Ａに示すように、本発明に係る化合物は、全てのＳＳＴＲに強力に結合した。陽性対照のＳＲＩＦ１４のＳＳＴＲ１に対する結合親和性がＫｉ値で０．３６２ｎＭであったのに対し、本発明の糖鎖を１本または２本有する化合物は０．７０４～１４７ｎＭであり、優れた結合親和性を示した。また、本発明の糖鎖を３本有する化合物（実施例２４、２５、２９の化合物）も、３．４９ｎＭ、１６．９ｎＭ、および、５７．３ｎＭを示し、優れた結合親和性を有していた。なお、その血中半減期の延長による生物学的利用能（バイオアベイラビリティ：ＢＡ）も大幅に増大するため、結合親和性のＫｉ値が多少高い場合であっても、生体内において受容体に対し有効に作用することができる。同様に、ＳＲＩＦ１４のＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ４に対する結合親和性がＫｉ値でそれぞれ０．００７５５ｎＭ、０．０４５０ｎＭ、０．２７３ｎＭであったのに対し、本発明の化合物はそれぞれ０．０１１９～３．３３ｎＭ、０．０５３１～３．７７ｎＭ、０．５６４～４０．５ｎＭであり、いずれも優れた結合親和性を示した。また、ＳＲＩＦ１４のＳＳＴＲ５に対する結合親和性が０．３２６ｎＭであったのに対し、本発明の化合物は８．３３ｎＭまでの高い結合親和性を示した。
　実施例１～６、１０、１３～１９、２６、２７、３０、および、３１の化合物は、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５のすべての受容体に対し結合親和性を有する糖鎖１本修飾体であることがわかった。また、同様に、実施例２０～２３、および２８は、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の全ての受容体に対する親和性を有する糖鎖２本修飾体であり、実施例２４、２５、および２９はＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の全ての受容体に対する親和性を有する糖鎖３本修飾体であることがわかった。
実施例６７－２　受容体結合親和性の算出－２
　表３Ｂに示す各化合物について、実施例６７－１に記載の方法で競合的結合実験を行い、受容体結合親和性を算出した。また、対照化合物としてＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８を同様に評価した。結合実験の結果を表３Ｂに示す。
　なお、図１Ｃおよび図１Ｄは、表３Ｂ中の化合物名に対応する糖鎖付加ペプチドの構造の一例を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000213
 　表３Ｂに示すように、対照となるＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８はＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の全ての受容体に結合した。ここで、実施例６７－１と試験実施回等は異なるため、ＳＲＩＦ１４の各受容体に対するＫｉ値は異なり、２．５から１３．２倍の高い数値となっている。実施例１、７、８、９、２６、２７、３２、３３、３４、３５、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５および６６の化合物は、ＳＳＴＲ１に対するＫｉ値は１．４６～１００ｎＭ、同じくＳＳＴＲ２で０．０５３６～６．５１ｎＭ、ＳＳＴＲ３で０．１６０～７．４４ｎＭ、ＳＳＴＲ４で１．３９～５９．０ｎＭ、ＳＳＴＲ５で０．３１０～９５．０ｎＭであり、全ての受容体に対して高い結合親和性を示した。実施例１２の化合物は、ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ５に対するＫｉ値がＳＲＩＦ１４の２８０～１６００倍であったが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ４に対しては１７．９、７．４４、２４．１ｎＭのＫｉ値であり、結合親和性を保持していると考えられた。実施例３８の化合物は、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３に対するＫｉ値がＳＲＩＦ１４の３１０～５３００倍と著しく親和性が低下していたが、ＳＳＴＲ４およびＳＳＴＲ５対しては１１０、３３．０ｎＭのＫｉ値であり、結合親和性を保持していると考えられた。実施例４９の化合物は、ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ４に対するＫｉ値がＳＲＩＦ１４の１７０倍および４６倍以上であったが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ５に対してはそれぞれ、２７０ｎＭ、１４．０ｎＭ、２３．０ｎＭのＫｉ値であり、結合親和性を保持していると考えられた。
実施例６７－３　受容体発現細胞を用いたアゴニスト活性評価－１
　ソマトスタチン受容体はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５はいずれもＧタンパク質のサブファミリーであるＧｉ／Ｇｏを介してアデニリルシクラーゼ活性を抑制し、細胞内ｃＡＭＰ濃度を低下させる。本実験系では、各ソマトスタチン受容体発現細胞を用い、試験物質のｃＡＭＰ産生抑制作用のＩＣ５０値を算出し、アゴニスト活性を評価した。また、対照化合物としてＳＲＩＦ１４、ＳＲＩＦ２８を同様に評価した。
　本実験に用いた試薬とその正式化学名は以下の通り。ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ＩＢＭＸ（３-ｉｓｏｂｕｔｙｌ－１－ｍｅｔｈｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｔ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）。
　ＳＳＴＲ２～ＳＳＴＲ５に対する評価は、以下の条件で実験を行った。バッファとして、０．３％　ＢＳＡ、０．５ｍＭ　ＩＢＭＸを含んだＤＭＥＭを用い、表３Ｃに示す受容体発現細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。試験物質は０．００００１ｎＭ、０．０００１ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、または１０００ｎＭの濃度で、１０μＭ　ｆｏｒｓｋｏｌｉｎと混ぜ合わせて処置し、室温で３０分反応させた。反応後、０．２Ｎ　ＨＣｌで細胞を溶解し、細胞内に蓄積したｃＡＭＰ量をケイマン社ｃｙｃｌｉｃ　ＡＭＰ　ＥＩＡ　ｋｉｔ（Cayman、582002）を用いて測定した。
　ＳＳＴＲ１に対する評価はセレップ社に委託し、実験を行った。バッファとして、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、５００μＭ　ＩＢＭＸを含んだＨＢＳＳを用い、ＳＳＴＲ１受容体発現細胞を１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種した。試験物質は０．００１ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの濃度で、１μＭ　ＮＫＨ４７７と混ぜ合わせて処置し、３７℃で２０分反応をさせた。反応後、細胞内に蓄積したｃＡＭＰ量をシスバイオ社ｃＡＭＰ ｄｙｎａｍｉｃ２　ｋｉｔ（cisbio、62AM4PE）を用いて測定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000214
　糖鎖付加体として、実施例１、１８、２７、２８、５７および５８の化合物を用いた際の、アゴニスト活性評価試験の実験結果（ＩＣ５０（ｎＭ））を表３Ｄおよび図１Ｅに示す。対照化合物のＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８のＩＣ５０はＳＳＴＲ１に対し０．８３～０．８９ｎＭ、また、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５に対してそれぞれ０．００７６～０．０７３ｎＭ、０．０２９～０．２１ｎＭ、０．０１５～０．０７４ｎＭ、０．０６６～０．１２ｎＭであった。糖鎖付加体である化合物の、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５に対するアゴニスト活性のＩＣ５０は１．０～２．４ｎＭ、０．０４１～０．１０ｎＭ、０．１２～０．３０ｎＭ、０．０３９～０．０８５ｎＭ、０．０４３～０．０８１ｎＭであり、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の全ての受容体に対して優れたアゴニスト活性を示した。実施例６７－１および実施例６７－２に示した結果から、これらの化合物は受容体結合能をもっていることが明らかであり、これらの化合物は受容体に結合することによってアゴニスト活性を発揮することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000215
実施例６７－４　受容体発現細胞を用いたアゴニスト活性評価－２
　糖鎖付加体として、表３Ｅに記載の各化合物を用いて、実施例６７－３と同様にしてアゴニスト活性評価試験を実施した。実験結果を表３Ｅに示す。なお、表３Ｅ中、「－（ハイフン）」が記載されている欄は、未実施であることを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000216
　表３Ｅにおいて、糖鎖付加体である化合物の、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、ＳＳＴＲ５に対するアゴニスト活性のＩＣ５０はそれぞれ１．２～２２ｎＭ、０．０１９～１．４ｎＭ、０．０３９～３．８ｎＭ、０．０３３～１．６ｎＭ、０．０３１～１．１ｎＭであり、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５の受容体に対してアゴニスト活性を示した。実施例６７－１及び実施例６７－２に示した結果から、これらの化合物は受容体結合親和性を有しており、これらの化合物は受容体に結合することによってアゴニスト活性を発揮することが明らかとなった。
　実施例６８　ラットを用いた薬物動態試験１
　本発明の糖鎖付加ポリペプチド（糖鎖付加体）が、非糖鎖付加のＳＲＩＦ２８と比較して薬物血漿中濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣ）、血中半減期（ｔ１／２）、平均滞留時間（ＭＲＴ）、およびバイオアベイラビリティなど薬物動態プロファイルが改善されていることを確認するために、ラットを用いて静脈内投与および皮下投与による薬物動態解析を行った。
　６８－１　投与液および試薬の調製
　糖鎖付加体（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８）を日本薬局方生理食塩液（大塚製薬工場社製）に溶解して４０μＭ溶液を調製し、投与液とした。ＰＢＳ溶液は、Phosphate buffered saline（シグマ社製　P4417）１錠を超純水２００ｍＬに溶解し、調製した。ＥＤＴＡ－ＰＢＳは、ＥＤＴＡ－２Ｎａ（和光純薬工業社製）を２ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳで溶解し、調製した。アプロチニン含有ＥＤＴＡ－ＰＢＳ液は、アプロチニン（和光純薬工業社製　010-11834）を０．１４２ｍｇ／ｍＬとなるようにＥＤＴＡ－ＰＢＳで溶解して調製し、採取血液に対する抗凝固剤として用いた。
　６８－２　血漿サンプルの調製
　雄性のＳＤ系ラット（Crl:CD(SD)、日本チャールスリバー株式会社、６週齢、ｎ＝３、体重１６１．３～２３９．３ｇ）の尾静脈もしくは背部皮下に、上記６８－１で調製した投与液を、非絶食下１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および２６Ｇ注射針（いずれもテルモ社製）を用いて投与した（Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８として４０ｎｍｏｌ／ｋｇ）。投与前、投与後２分、５分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間後に、ラット頚部静脈より採血を行った。採取した血液０．２ｍＬを、上記６８－１で調製したアプロチニン含有ＥＤＴＡ－ＰＢＳ液０．２ｍＬと速やかに混和し、氷上で３０分以上放置した。遠心分離（１，８７０ｘｇ、４℃、１０分）後、上清を２５０μＬ採取し、血漿サンプルとした。ブランク血漿として、無処置のラット頚部静脈より採取した血液を同様に処理して得た血漿を用いた。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。なお、チップおよびチューブはビーエム機器社の低吸着性のものを使用した。
　６８－３　血漿中濃度測定
　上記６８－２で得られた血漿サンプルにおけるＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の血漿中濃度測定を、フェニックスファーマシューティカルズ社ソマトスタチンＥＩＡキット（Phoenix Pharmaceuticals Inc、EK-060-03）を用いて行った。血漿サンプルを、ＥＩＡキット付属アッセイバッファを用いて５倍、２０倍、１００倍、４００倍、１６００倍に希釈し、測定サンプルとした。検量線を作成するための標準液は、以下のように調製した。まず、上記６８－２で得られたブランク血漿を、ＥＩＡキット付属アッセイバッファを用いて血漿サンプルと同様に希釈し、標準液調製用のアッセイバッファとした（例えば、血漿サンプルを１００倍希釈する場合は、ＥＩＡキット付属アッセイバッファに１／１００量のブランク血漿を添加して標準液調製用アッセイバッファとした）。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８をＰＢＳ溶液で希釈して１００μＭ溶液を調製し、１００μＭ溶液から２μＭ溶液を調製した。得られた２μＭ　Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８溶液を、標準液調製用アッセイバッファを用いて段階希釈し、２０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０４ｎＭの標準液を調製した。得られた結果に、希釈率を掛け、さらに抗凝固剤処理としてのアプロチニン含有ＥＤＴＡ－ＰＢＳ液での希釈率２を掛けることにより、血漿中濃度を算出した。対照として、糖鎖付加体の代わりに非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いて同様の操作を行った。得られた血漿中のＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８濃度推移を図２に示す。
　６８－４　薬物速度論的パラメータの算出
　得られたＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８濃度推移からモーメント解析手法を用い、ＡＵＣを台形法により算出した。また、外挿法により静脈内投与時の予測初期濃度（Ｃ０）、さらにｔ１／２、ＭＲＴ、および皮下投与時の実測値より最高血漿中濃度（Ｃｍａｘ）を求めた。得られた薬物速度論的パラメータを表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000217
 　図２および表４に示した結果から判明するように、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８は、非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８と比較してｔ１／２およびＭＲＴが著しく延長し、また、ＡＵＣおよびＣｍａｘの増加が認められた。これらのことは、糖鎖付加体とすることにより血液中の分解活性に対し抵抗性が増したためと考えられる。糖鎖付加体は、非糖鎖付加体に比べ生体中での安定性が向上することが明らかである。また、ＡＵＣおよびＣｍａｘが増加したことの要因は、本発明に係るバイオアベイラビリティの向上のほかに、これら生体中での安定性向上も一因と考えられる。
　実施例６９　ラットを用いた薬物動態試験２
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。対照として、糖鎖付加体の代わりに非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いた。得られた血漿中の化合物濃度推移を図３に示す。
　実施例７０　ラットを用いた薬物動態試験３
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。対照として、糖鎖付加体の代わりに非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いた。得られた血漿中の化合物濃度推移を図４に示す。
　実施例７１　ラットを用いた薬物動態試験４
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図５に示す。
　実施例７２　ラットを用いた薬物動態試験５
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、およびＳ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図６に示す。
　実施例６９～７２の薬物動態試験において得られた血漿中の化合物濃度推移から、実施例６８と同様に各化合物の薬物速度論的パラメータを算出した。また、得られたパラメータを用いて、バイオアベイラビリティを以下の数式により算出した。結果を表５Ａに示す。
ＢＡ（％）＝（ＡＵＣ（ｓｃ）／Ｄｏｓe（ｓｃ））　／　（ＡＵＣ（ｉｖ）／Ｄｏｓe（ｉｖ））
　　ＡＵＣ（ｓｃ）：皮下投与時のＡＵＣ（ｍｉｎ・ｎＭ）
　　Ｄｏｓe（ｓｃ）：皮下投与における投与量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）
　　ＡＵＣ（ｉｖ）：静脈内投与時のＡＵＣ（ｍｉｎ・ｎＭ）
　　Ｄｏｓe（ｉｖ）：静脈内投与における投与量（ｎｍｏｌ／ｋｇ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000218
　表５Ａに示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加体は、修飾糖鎖の本数が増えるにつれてそのバイオアベイラビリティが増加した。すなわち、非糖鎖付加体で５％であったものが、糖鎖を１本付加した糖鎖付加ポリペプチドでは３７～６０％、平均で５０％に、２本の糖鎖を間隔ありで付加したものでは７７～８５％、平均で８１％に、３本の糖鎖を間隔ありで付加したものでは９１％に増加していることが判明した。また、糖鎖を付加した間隔が密なものを比較すると、１本付加したものでは３７％、２本付加したものでは５５％、３本付加したものでは６９％に増加していることが判明した（実施例１、２０、および２４の化合物）。これらの結果により、本発明に係る糖鎖修飾によってバイオアベイラビリティが向上することが証明された。
　皮下投与時のバイオアベイラビリティが増加する要因には、様々な薬物動態学的な変動因子が存在する。そのうちの一因として、化合物の血中安定性、あるいは血中への（投与部位からの）移行性が考えられる。表５Ａに示したように、皮下投与時の血中移行性を推察するための指標となる、皮下投与時のＡＵＣは、修飾糖鎖本数の増加に伴い増大する（１本：２２０９ｍｉｎ・ｎＭ、２本（間隔あり）：３４００ｍｉｎ・ｎＭ、３本（間隔あり）：４０１５ｍｉｎ・ｎＭ）ことが認められ、血中移行性の向上がバイオアベイラビリティの増加に寄与していることが推察された。
　また、修飾糖鎖の本数が増えるにつれ、静脈内および皮下投与時のｔ１／２およびＭＲＴの延長作用（たとえば、静脈内投与時のｔ１／２、１本：１９．０ｍｉｎ、２本（間隔あり）：２７．２ｍｉｎ、３本（間隔あり）：３９．８ｍｉｎ）が認められ、血液中での安定性が向上していることが推察された。一方で、静脈内投与時のＡＵＣは、修飾糖鎖本数に比した増大とはなっておらず（１本：４４５３ｍｉｎ・ｎＭ、２本（間隔あり）：４１９８ｍｉｎ・ｎＭ、３本（間隔あり）：４４０２ｍｉｎ・ｎＭ）、化合物の修飾糖鎖本数増加による血中安定性増加のみがバイオアベイラビリティの増加に貢献しているものではないと考えられる。
　皮下投与時のＣｍａｘは、非糖鎖付加体に比べ修飾糖鎖本数が２本までは増加した（０本：４．４７ｎＭ、１本：３０．５ｎＭ、２本（間隔あり）：３５．６ｎＭ）が、３本（間隔あり）（２４．８ｎＭ）では逆に減少する結果となった。投与部位（本実施例では皮下投与）からの血中移行を考えた場合、ＡＵＣが増加する要因として、速やかな血液中への移行、あるいは緩やかでも持続的な血液中への移行の二つの様式が推測される。前者は、投与部位での分解を避けるメリットがあるが、安定性に問題がなければ、後者の様式がより血中移行性が高いと推察される。バイオアベイラビリティの高い糖鎖を３本修飾したものにおいてＣｍａｘが減少していたことは、急激ではなく緩やかな、かつ持続的な血中移行性を示した結果であると考えられる。これらのことから、本発明に関わる修飾糖鎖本数の増加は、急激な血漿中濃度の上昇がなく、持続的な血中移行性（一般的には吸収遅延効果とも言ってよい）を示すと考えられる。
　表５Ａに示した結果から判明するように、修飾位置として、間隔をとった場合と密にした場合では、ｔ１／２およびＭＲＴに著明な差はなかった（たとえば、静脈内投与時のｔ１／２、２本（密）：２８．８ｍｉｎ、２本（間隔あり）：２７．２ｍｉｎ、３本（密）：３８．５ｍｉｎ、３本（間隔あり）：３９．８ｍｉｎ）。
　また、ＡＵＣに関しては、静脈内投与時には糖鎖修飾が密である方が、ＡＵＣが増大した。すなわち、２本糖鎖の場合、間隔をとった化合物２１、化合物２２、化合物２３の４０２９～４４６５ｍｉｎ・ｎＭに比べ、密にした化合物２０は７３０６ｍｉｎ・ｎＭであり、３本糖鎖の場合、間隔をとった化合物２５の４４０２ｍｉｎ・ｎＭに比べ、密にした化合物２４は５６６０ｍｉｎ・ｎＭである。
　一方で、バイオアベイラビリティは、糖鎖修飾位置に間隔をとった方が密である方に比べ、向上した。すなわち、２本糖鎖の場合、密にした化合物２０の５５％に比べ、間隔をとった化合物２１、化合物２２、化合物２３は７７～８５％（平均値８１％）であり、３本糖鎖の場合、密にした化合物２４の６９％に比べ、間隔をとった化合物２５は９１％である。これらのことから、本発明に関わる糖鎖修飾する位置としては、密に複数修飾するよりも、間隔をとり複数本修飾する方が、バイオアベイラビリティの向上に寄与するものと考えられる。
　実施例７３　ラットを用いた薬物動態試験７
　糖鎖付加体として、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図７に示す。
　実施例７４　ラットを用いた薬物動態試験８
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図８に示す。
　実施例７５　ラットを用いた薬物動態試験９
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図９に示す。
　実施例７６　ラットを用いた薬物動態試験１０
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１０に示す。
　実施例７７　ラットを用いた薬物動態試験１１
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１１に示す。
　実施例７８　ラットを用いた薬物動態試験１２
　糖鎖付加体としてＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１２に示す。
　実施例７９　ラットを用いた薬物動態試験１３
　糖鎖付加体としてＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉＭａｎ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ＧｌｃＮＡｃ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１３に示す。
　実施例８０　ラットを用いた薬物動態試験１４ 
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｔｒｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（Ａｓｎ（ｄｉｓｉａｌｏ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１４に示す。
　実施例８１　ラットを用いた薬物動態試験１５ 
　糖鎖付加体としてＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１５に示す。
　実施例８２　ラットを用いた薬物動態試験１６ 
　糖鎖付加体としてＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１６に示す。
　実施例８３　ラットを用いた薬物動態試験１７ 
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１７に示す。
　実施例８４　ラットを用いた薬物動態試験１８ 
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ）・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８を用いたこと以外は実施例６８と同様にして、薬物動態試験を実施した。得られた血漿中の化合物濃度推移を図１８に示す。
　実施例７３～８４の薬物動態試験７～１８において得られた血漿中の化合物濃度推移から、実施例６８と同様にして、各化合物の薬物速度論的パラメータを算出した。得られた薬物速度論的パラメータを表５Ｂ～表５Ｆに示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000219
 　表５Ｂに示した結果から判明するように、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８は、静脈内投与において非糖鎖付加体のＳＲＩＦ２８に比較して、ｔ１／２が１３～１８倍延長し、ＡＵＣは８～２３倍増加した。また、非糖鎖付加体のＳＲＩＦ１４に比較して、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４は、静脈内投与においてｔ１／２が３３～３８倍延長し、ＡＵＣは４４～５５倍増加した。また、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｃ１２ｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＰＥＧｌｉｎｋｅｒ－ＳＲＩＦ１４は、非糖鎖付加体のＳＲＩＦ１４に比較して、ｔ１／２が２２～３３倍延長し、ＡＵＣは１４～３０倍増加した。すなわち、実施例６８の場合と同様に、糖鎖修飾を行うことで血液中での安定性が向上した結果と考えられた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000220
　表５Ｃに示した結果から判明するように、修飾する糖鎖の大きさをＧｌｃＮＡｃ（単糖）、ｄｉＭａｎ（５糖）、ｄｉＧｌｃＮＡｃ（７糖）、ａｓｉａｌｏ（９糖）、ｍｏｎｏｓｉａｌｏ（１０糖）、ｄｉｓｉａｌｏ（１１糖）、ｔｒｉｓｉａｌｏ（１４糖）、ｔｅｔｒａｓｉａｌｏ（１７糖）へと変更していった場合、修飾する糖鎖の大きさ依存的に皮下投与時のｔ１／２、ＡＵＣ、バイオアベイラビィティがそれぞれ２～１７倍、３～１２０倍、２～１１倍増加した。このことから、修飾する糖鎖の大きさを変更することによって、血中安定性を向上させるだけでなく、その増加率に変化を持たせられることが明らかとなった。また、これらの糖鎖のうちジマンノース糖鎖やアシアロ糖鎖などは、特定のタンパク質と相互作用することが知られているため、特定のタンパク質あるいは特定のタンパク質を有する臓器や細胞へのターゲッティングにも利用可能と考えられる。また、非還元末端のシアル酸の修飾として、たとえばカルボキシ基へのａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ、ａｍｉｄｅ、Ｂｎなどの導入により電荷を変更させた糖鎖を付加した、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において非糖鎖付加体と比較して、ｔ１／２が１１～１４倍延長し、ＡＵＣは７～１２倍増加し、血中安定性が向上した。これらのことは、シアル酸のカルボキシ基が血中滞留性に大きな影響を与え、カルボキシ基の負電荷の消失（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ）、ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））、あるいは正電荷への変換（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））により、血中クリアランスや体内分布を制御できる可能性（利用法）を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000221
　表５Ｄに示した結果から判明するように、ＳＲＩＦ１４にｄｉｓｉａｌｏ糖鎖を１本修飾したＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、２本修飾した２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、３本修飾した３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４は静脈内投与において非糖鎖付加体に比較して、ｔ１／２がそれぞれ３８、６３、７１倍延長し、またＡＵＣはそれぞれ５５、４２、３６倍増加した。同様に、ＳＲＩＦ２８にｄｉｓｉａｌｏ糖鎖を１本修飾したＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、２本修飾したＳ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、３本修飾したＳ１－３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、４本修飾したＳ１－４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において非糖鎖付加体に比較して、ｔ１／２がそれぞれ１３、２１、３０、４８倍延長し、またＡＵＣはそれぞれ１１、１２、１２、１５倍増加した。ＳＲＩＦ１４およびＳＲＩＦ２８どちらの場合においても、修飾するｄｉｓｉａｌｏ糖鎖の本数に従い、血中安定性が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000222
　表５Ｅに示した結果から判明するように、ＳＲＩＦ２８にａｓｉａｌｏ糖鎖を１本修飾したＳ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、２本修飾したＳ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、３本修飾したＳ１－３Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において非糖鎖付加体に比較して、ｔ１／２がそれぞれ１０、６、５倍延長し、またＡＵＣはそれぞれ１０、６、６倍増加した。修飾する糖鎖がａｓｉａｌｏ糖鎖の場合においても、血中安定性が向上することが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000223
表５Ｆに示した結果から判明するように、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８は静脈内投与において、非糖鎖付加体に比較して、ｔ１／２がそれぞれ６～２１倍延長し、ＡＵＣはそれぞれ６～１２倍増加した。すなわち、ＳＲＩＦ２８に糖鎖を修飾することによって、血中安定性が向上した。また、シアル酸糖鎖本数の増加に従い、静脈内投与および皮下投与ともｔ１／２、ＡＵＣ，Ｃmax，ＢＡが増加した。一方で、シアル酸のカルボキシ基の負電荷を消失した場合（２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））、２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ）））、あるいは正電荷を隣接に追加した場合（Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））・Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ））には皮下投与時のｔ１／２が延長したにも関わらず、ＡＵＣやＣmaxは増加しなかった．シアル酸のカルボキシ基が血中滞留性あるいは血中移行に大きな影響を与えることから、糖鎖末端の電荷への変換により、血中クリアランスや体内分布を制御できる可能性（利用法）を示している。
　実施例８５　ラット血漿を用いた血漿中安定性試験
　８５－１　処置液、試薬およびラット血漿の調製
　糖鎖付加体および非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８をＰＢＳ溶液に溶解して２μＭ溶液を調製し、処置液とした。１０％ＴＦＡは、トリフルオロ酢酸（和光純薬工業社製　208-02746）を１０ｖ／ｖ％となるように水で溶解し、調製した。ラット血漿は、Ｗｉｓｔａｒ系ラット（Crlj:Wistar、雄性、日本チャールスリバー株式会社、７週齢）からヘパリン加血漿（ヘパリン：日本薬局方ヘパリンナトリウム注射液（持田製薬））として調製した。
　８５－２　血漿添加サンプルの調製
　ラット血漿０．２７ｍＬ（ｎ＝３）に対し、上記８５－１で調製した糖鎖付加体処置液０．０３ｍＬを速やかに混和して血漿添加サンプルとし、３７℃恒温槽で保温した。混和後、０分と、１～２４時間までに経時的に血漿添加サンプル０．０４ｍＬを採取し、１０％ＴＦＡ０．０１ｍＬと速やかに混和した。遠心分離（２０，０００ｘｇ、４℃、１０分）後、上清を０．０４ｍＬ採取し、血漿中安定性測定サンプルとした。サンプリング時間は０時間、１時間、２時間、４時間、あるいは０時間、４時間、８時間、２４時間とした。ブランク血漿として、処置液としてＰＢＳ溶液を用いたこと以外は同様に処理して得た血漿を用いた。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。実験回ごとに、陽性対照として非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８を用いた。
　８５－３　サンプル中濃度測定および血漿中安定性インデックスの算出
　実施例６８－３の血漿中濃度測定と同様の方法で、上記８５－２で得られた血漿中安定性測定サンプル中に残存する糖鎖付加体の濃度を測定した。混和後０分の糖鎖付加体濃度を１００％とし、時間経過後の残存率を百分率（％）で表し、以下の指数式（１）の消失速度定数から算出式（２）を用いて、半減期を算出した。その後、実験回ごとの非糖鎖付加ＳＲＩＦ２８の半減期を１として、糖鎖付加体の血漿中安定性インデックス（ＰＳ　ｉｎｄｅｘ）を算出した。結果を表６および図１９に示す。また、血漿中安定性インデックスが２０以上のものについては、>２０として表記した。なお、図１９では、血漿中安定性インデックスが２０を超えるものであっても、２０を上限として表記している。
　　　残存率（％）＝１００・ｅ（ｋ・ｔ）　・・・（１）
　　　　　ｅ：自然対数の底
　　　　　ｋ：消失速度定数
　　　　　ｔ：時間（hour）
　　　半減期（hour）＝０．６９３／ｋ　・・・（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000224
　図１９に示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ＳＲＩＦ２８に比べ、血漿中安定性が増加した。すなわち、１位、５位、９位、１２位に１本糖鎖を付加したもの（実施例１、２、３、４の化合物）では、ＳＲＩＦ２８の４．５倍～６．７倍であり、１３位に糖鎖を付加したもので１５．９倍（実施例５の化合物）、１４位に糖鎖を付加したもので１９．１倍（実施例６の化合物）、３０位に糖鎖を付加したもので１６．８倍（実施例１４の化合物）であった。また、１９位、Ｃ末端側にさらに糖鎖付加アミノ酸を１つ付加したものでは２０倍以上（実施例１０、１３の化合物）であった。糖鎖を付加する位置は、１位からＣ末側へ向かうにつれて、血漿中安定性が増すことが示された。
　実施例８６　ラットを用いたＧＨ産生抑制試験
　本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、実施例６７で示すように、ＳＳＴＲの各受容体に対する親和性を有していた。一方、各ＳＳＴＲに対する親和性が減衰したものも見られたが、このような場合においても実施例６８～８５で示した血中半減期の延長やバイオアベイラビリティの増大などにより、生体内で受容体に対し薬理学的に有効に作用を示すことを証明するために、ラットを用いたインビボ試験として、成長ホルモン（ＧＨ）産生に対する本発明の糖鎖付加ポリペプチドの投与効果を評価する試験を実施した。血液中へのＧＨ産生量の増加は、ＧＨのパラクライン的作用を介し、各種臓器に対し細胞の増殖や分化系、生合成系の活性化あるいは抑制を引き起こし、生体反応に影響を及ぼすと考えられる。視床下部から放出されるソマトスタチンは下垂体前葉からの血中へのＧＨ分泌を抑制する。本実験系は、血中ＧＨ産生量を指標に、糖鎖付加体のＳＳＴＲに対する薬理作用、および、糖鎖付加体の投与後の血中残存を評価できる試験系として実施した。
　８６－１　投与液および試薬の調製
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ１９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８および２９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用い、日本薬局方生理食塩液（大塚製薬工場社製）に溶解して１～１００μＭ溶液を調製し、投与液とした。また、ＧＨ遊離促進剤として、ＧＲＦ（ＧＨ放出ホルモン、Growth hormone releasing factor）を使用した。ＧＲＦは、ＧＲＦ注射液（注射用ＧＲＦ住友５０、Lot. 2006C、大日本住友製薬社製）を注射用水（Lot. 09H18C、扶桑薬品工業社製）１ｍＬで溶解後、２μｇ／ｍＬとなるように生理食塩液で２５倍希釈し、調製した。採血の際に、抗凝固剤として用いるヘパリンは、日本薬局方ヘパリンナトリウム注射液（Lot. B084、持田製薬社製）を原液のまま、使用した。
　８６－２　血漿サンプルの調製
　雄性のＳＤ系ラット（Crl:CD(SD)、日本チャールスリバー株式会社、６週齢、ｎ＝３、体重１４５．２～１６３．９ｇ）の背部皮下に、上記８６－１で調製した投与液を、非絶食下１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および２６Ｇ注射針（いずれもテルモ社製）を用いて投与した。対照群として、糖鎖付加ポリペプチドを含まない生理食塩液を、同様に投与した（ベヒクル群）。その後、すなわち糖鎖付加体投与後５～６分の間に、全身麻酔剤としてペントバルビツール酸ナトリウム（ソムノペンチル、Lot.0608101、共立製薬社製）を５０ｍｇ／ｋｇとなるように、注射筒および注射針を用い腹腔内に投与した。糖鎖付加体投与後１時間に、すなわち麻酔下で５０分以上経過した状態で、ＧＨ遊離促進剤としてＧＲＦを尾静脈に１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および注射針を用いて投与した。ＧＲＦ投与後５分に、ラット頚部静脈よりヘパリンを入れた注射筒および注射針を用い、採血を行った。採取した血液０．４ｍＬを氷上で２０分以上放置した後、遠心分離（１，８７０ｘｇ、４℃、１０分）し、上清を１００μＬ採取し、血漿サンプルとした。ブランク血漿として、無処置のラット頚部静脈より採取した血液を同様に処理して得た血漿を用いた。血漿サンプルは測定に用いるまで冷凍保存した。
　８６－３　血漿中ＧＨ濃度の測定
　上記８６－２で得られた血漿サンプルにおけるＧＨ濃度測定を、ＳＰＩ－Ｂｉｏ社ラットＧｒｏｗｔｈＨｏｒｍｏｎｅＥＩＡキット（SPI-Bio、A05104）を用いて行った。血漿サンプルを、ＥＩＡキット付属アッセイバッファを用いて２０倍、１００倍、５００倍に希釈し、測定サンプルとした。検量線を作成するための標準液は、添付の説明書に従い蒸留水で４０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製した後、アッセイバッファを用いて段階希釈し、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、２．５ｎｇ／ｍＬ、１．２５ｎｇ／ｍＬ、０．６３ｎｇ／ｍＬ、０．３１ｎｇ／ｍＬを調製した。得られた結果に、希釈率を掛けることにより、ＧＨ濃度を算出した。得られた血漿サンプル中ＧＨ濃度を表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000225
　表７に示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加体は、ラットにおけるＧＨ産生を抑制した。実施例１、実施例１０、実施例１３の糖鎖付加体は、実施例６７－１の手法により測定した場合、各受容体に対するＫｉ値と糖鎖を有さないＳＲＩＦ１４のＫｉ値との比が１００：１～１．３：１の範囲内と示されている。また、実施例１の糖鎖付加体は、実施例６８～７２の手法により測定した場合、血中半減期が１０倍以上増大していることが示されている。本実施例からは、糖鎖付加体が生体内でも薬理学的な作用を有効に発揮することが示された。
　また、本発明の糖鎖付加体は、ＧＲＦ投与の１時間前に投与した場合であっても、ＧＨ産生抑制作用を有していた。
　また、実施例１と、実施例１０および実施例１３の糖鎖付加体では、ラットＧＨ産生能に対する有効な投与量が１０倍程度異なることが示された。このことは、実施例６７－１の手法により測定した場合、それらの受容体親和性がＫｉ値で１０倍程度の差であることと類似する。糖鎖付加体の親和性が多少減衰した場合においても、薬理学的な活性を有することが示された。
　実施例８７　ラットを用いたＧＨ産生抑制試験２
実施例８６－１～８６－３と同様にして、次に示す糖鎖付加体である化合物のラットＧＨ産生抑制試験を実施した。糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ２２－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用いた。得られた血漿サンプル中ＧＨ濃度を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000226
　表８に示した結果から判明するように、本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、ラットにおけるＧＨ産生を抑制した。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８は本試験系において、１ｎｍｏｌ／ｋｇからＧＨ産生を抑制し、３～１０ｎｍｏｌ／ｋｇで８２～９９％のＧＨ産生抑制効果を示した。これは実施例６７－１及び６７－２および実施例６８～８５で示したように、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５に対して親和性を持ち、血中滞留性が向上したためであると考えられる。
実施例６７－１及び６７－２において、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と同等の親和性を示すＮ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｅ１２Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｄ－Ｔｒｐ－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（Ｂｎ））－ＳＲＩＦ２８およびＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４は、１０ｎｍｏｌ／ｋｇで９５～９９％のＧＨ産生抑制効果を示し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と同等の効果を示した。
　実施例６８～８５の手法に示す結果から、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８は、皮下投与時のＡＵＣがＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の３分の１から２分の１であり、またＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８は７分の１であった。一方、実施例６７－１及び６７－２に示す手法によって、これらはいずれもＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８よりも高い親和性を示した。そのため本実験系において、Ｓ１Ｃ（ｍｏｎｏｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ（ａｍｉｄｅ））－ＳＲＩＦ２８は１０ｎｍｏｌ／ｋｇで７０～９９％のＧＨ産生を抑制し、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と同等の効果を示したと考えられる。
　実施例６７－１及び６７－２に示す手法によって、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８は、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８よりも低い親和性を示した。一方、実施例６８～８５の手法に示す結果から、皮下投与時のＡＵＣが、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の１．８倍から２．８倍と向上した化合物である。本実験系において、Ｒ１３Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｋ１４Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ｎ５Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）・Ａ９Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８は、１０もしくは１００ｎｍｏｌ／ｋｇ投与によってＧＨ産生抑制活性を示した。これらの結果は、受容体親和性が低下した場合においても血中安定性が増大することで、ソマトスタチンの活性を補償または増大させることができたことを示す。
　実施例８８　消化管閉塞モデルでの薬効試験
本発明の糖鎖付加ポリペプチドは、実施例８６および実施例８７で示すように、ラット生体内においてもアゴニストとして有効に作用することを証明した。次に、疾患モデルにおいても有効性を示すことを証明するために、ラット消化管閉塞モデルでの評価を実施した。イレウス等の消化管閉塞では、消化管の組織障害、また水や電解質などの吸収能低下により、腹部膨満感・嘔吐・腹痛などといった消化器症状を示す。その病態は、消化管内容物の通過障害や、消化液や生理活性物質の消化管内への放出によって引き起こされることが知られている。ソマトスタチンは、消化器系に発現するＳＳＴＲを介して各種消化液の分泌抑制、あるいは水・電解質の吸収促進により消化管内容物を減少させるといった作用を示し、症状改善に有効とされる。本実験系は、腸管閉塞後の空腸における腸液重量の変化を指標として、腸液の吸収促進あるいは分泌抑制作用を評価する試験系として実施した。また、組織障害時の指標として逸脱酵素であるアミラーゼ（膵臓）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ、肝臓）およびクレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ、骨格筋、心筋等）の血液パラメータを測定した。
　実施例８８－１　消化管閉塞モデルの作成
　本試験は三菱化学メディエンス社に委託し、実施した。雄性のＳＤ系ラット（Crl:CD（SD）日本チャールスリバー株式会社、８週齢、ｎ＝５以上、体重２５１．１～２７８．１ｇ）を１２時間以上絶食させた。２％イソフルラン及び笑気：酸素＝７：３吸入にて麻酔導入し、手術中はこれを維持した。腹部を正中切開し、十二指腸提筋から約１０ｃｍのところの空腸を縫合糸にて結紮した。その後、切開部を速やかに縫合し、化合物投与まで絶食とした。偽処置群は、空腸の結紮を行わず、腹部を正中切開した後に切開部を縫合する処置を行った。
　実施例８８－２　化合物の調製および投与
　糖鎖付加体としてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８を用い、日本薬局方生理食塩液（大塚製薬工場社製）に溶解して４０μＭ溶液を調製し、投与液とした。消化管閉塞手術から１８時間後、１ｍＬ／ｋｇの用量で注射筒および２５Ｇ注射針（いずれもテルモ社製）を用いて頸背部に皮下投与した。Ｖｅｈｉｃｌｅ群として、糖鎖付加ポリペプチドを含まない生理食塩液を、同様に投与した。また、対照としてオクトレオチドを投与した。
　実施例８８－３　腸液重量の測定
　化合物投与１時間後に、吸入麻酔下にて腹部を正中切開し、腹部大静脈から血液を１．５ｍＬ採取した。そして、十二指腸提筋側の結紮空腸を摘出した。空腸表面の液体および血液をペーパータオルで除去し、空腸に付いた神経・血管・脂肪を切除した後に、長さ６ｃｍとなるように切り取り、湿重量を測定した。その後、３６度で２４時間乾燥させ、乾重量を測定した。腸液重量（ｍｇ）は、湿重量‐乾重量で算出した。得られた空腸の腸液重量を表９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000227
　表９から明らかなように、ｖｅｈｉｃｌｅは、偽処置と比較して腸液重量が有意に増加し、結紮による消化管閉塞に伴い腸液の分泌亢進が生じていることが認められた。ソマトスタチンやオクトレオチドは、このような消化管閉塞モデルにおいて、腸液の腸管内への分泌抑制と腸組織側への腸液吸収促進作用を有することが示されており（Scand J Gastroenterol. 1995 May;30(5):464-9.）、本実験系においてもオクトレオチドはその作用が確認された。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８ではいずれもｖｅｈｉｃｌｅと比較して、腸液重量の増加が認められ、本発明における糖鎖付加体においても、腸液の分泌抑制、水・電解質の吸収促進といった有効性を示すことが明らかとなった。また、Ｓ１－２Ｃ（ａｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８はＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８と比較して、実施例８３および８４において皮下投与時のＡＵＣが２分の１となっていたが、実施例６７－１においてＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８よりもＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５に対する親和性が１．７～２．９倍ほど高いことが明らかとなっている。このことは、血漿中濃度が低い場合であっても受容体親和性の向上により本モデルにおける薬効が類似していることの理由と考えられる。また同様に、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４はＳ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８の皮下投与時のＡＵＣを比較すると少し低いが、受容体親和性が０．７～２．４倍ほど高いため、薬効が類似していることの理由と考えられる。
　実施例８８－４　血液パラメータの測定
　実施例８８－３で採取した血液を用いて、アミラーゼ濃度（ＩＵ／Ｌ）、ＬＤＨ濃度（ＩＵ／Ｌ）およびＣＰＫ濃度（ＩＵ／Ｌ）を自動分析装置７１７０（日立製作所）を用いて測定した。測定方法はそれぞれ、ＢＧ５Ｂ法、ＵＶ－ｒａｔｅ法およびＪＳＣＣ法を用いた。得られた結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000228
　表１０から明らかなように、ｖｅｈｉｃｌｅは偽処置と比較してアミラーゼ活性、ＬＤＨ活性が増加しており、消化管閉塞に伴い消化器系の組織障害が生じていることが推察された。Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８およびＣ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較し、アミラーゼ活性は低値であった。一方、オクトレオチドでは、アミラーゼ活性はｖｅｈｉｃｌｅと同等であった。実施例６７－１及び６７－２から明らかなように、Ｓ１Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４、およびＳ１－２Ｃ（ｓｉａｌｏ）－ＳＲＩＦ２８はＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５までの全ての受容体に結合親和性を有するのに対し、オクトレオチドはＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ５に対し特異的に親和性を有する化合物である。ラット膵臓においては、ＳＳＴＲ１～ＳＳＴＲ５のすべての受容体が発現しているとの報告があることから（J Histochem Cytochem. 2004 Mar;52(3):391-400.）、糖鎖付加体はオクトレオチドとは異なった受容体に作用することによって、組織障害を軽減した可能性が考えられた。また、オクトレオチド、Ｃ（ｄｉｓｉａｌｏ）－Ｒ－Ｋ－ＳＲＩＦ１４では、ｖｅｈｉｃｌｅと比較し、ＬＤＨ活性は低値であった。そのほか、各パラメータに対し、糖鎖付加体の投与によって悪化するものはなかった。

Claims (35)

  1. 　（Ａ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４；
    　（Ｂ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
    　（Ｃ）ＳＲＩＦ１４の類縁体;
    　（Ｄ）配列番号１で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ１４に対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；
    　（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｎ個（ここでＮは、１以上２０以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および
    　（Ｆ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｍ個（ここでＭは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；
    からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、
    少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、
    ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  2. 　請求項１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸が、ＳＲＩＦ１４における１９位に相当するアミノ酸であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリぺプチド。
  3. 　請求項１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
    　ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｎ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  4. 　請求項１における糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｆ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
    　ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つアミノ酸が、前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｍ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  5. 　請求項１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
    　さらに、Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列が、Ｘ－Ｙ－で表され、
    　ここで、ＸはＬ個（ここでＬは１以上６以下の整数）の任意のアミノ酸の配列を意味し、また、Ｙは、
    　（１）Ｌｙｓ、
    　（２）Ａｒｇ－Ｌｙｓ、
    　（３）Ｇｌｕ－Ａｒｇ－Ｌｙｓ、
    　（４）Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（５）Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（６）Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（７）Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（８）Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（９）Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（１０）Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（１１）Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（１２）Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（１３）Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、
    　（１４）Ｓｅｒ‐Ａｌａ‐Ａｓｎ‐Ｓｅｒ‐Ａｓｎ‐Ｐｒｏ‐Ａｌａ‐Ｍｅｔ‐Ａｌａ‐Ｐｒｏ‐Ａｒｇ‐Ｇｌｕ‐Ａｒｇ‐Ｌｙｓ、および
    　（１５）上記配列（２）～（１４）において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加された配列
    からなる群から選択される配列である
    ことを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  6. 　請求項５に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸の配列を表すＸ－Ｙ－におけるＸを意味するＬ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  7. 　請求項３に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　Ｎ末端側に付加される前記Ｎ個のアミノ酸は、リンカーを介して当該Ｎ末端側に連結していることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  8. 　（Ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８；
    　（Ｂ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたポリペプチド；
    　（Ｃ）ＳＲＩＦ２８の類縁体;
    　（Ｄ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるＳＲＩＦ２８に対して、８０％以上の相同性を有するポリペプチド；
    　（Ｅ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｊ個（ここでＪは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＮ末端側にさらに含むポリペプチド；および
    　（Ｆ）（Ａ）～（Ｄ）において、Ｋ個（ここでＫは、１以上６以下の整数）のアミノ酸をＣ末端側にさらに含むポリペプチド；
    からなる群から選ばれるポリペプチドにおいて、
    少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、かつ、
    ソマトスタチン受容体に対する親和性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  9. 　請求項８に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加アミノ酸で置換されるアミノ酸が、ＳＲＩＦ２８における１位に相当するアミノ酸、５位に相当するアミノ酸、９位に相当するアミノ酸、１２位に相当するアミノ酸、１３位に相当するアミノ酸、１４位に相当するアミノ酸、および、１９位に相当するアミノ酸からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリぺプチド。
  10. 　請求項８に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｅ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
    　ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｅ）のポリペプチドのＮ末端側の前記Ｊ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  11. 　請求項８に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、前記（Ｆ）のポリペプチドにおいて、少なくとも１つのアミノ酸が糖鎖付加アミノ酸で置換されており、
    　ここで、前記糖鎖付加アミノ酸で置換された少なくとも１つのアミノ酸が、前記（Ｆ）のポリペプチドのＣ末端側の前記Ｋ個のアミノ酸のいずれかに存在することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  12. 　請求項１～１１のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記ソマトスタチン受容体に対する親和性が、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５からなる群より選択される受容体の少なくとも２以上の受容体に対する親和性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  13. 　請求項１２に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドが、少なくともＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４のいずれか１つに対して親和性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  14. 　請求項１２に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４の両方に対して親和性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  15. 　請求項１２に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドが、ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、および、ＳＳＴＲ５の全てに対して親和性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  16. 　請求項１～１５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリぺプチドは、ＳＲＩＦ２８と比較して、増大した血中安定性を有することを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  17. 　請求項１～１６のいずれか1項に記載の糖鎖付加ポリぺプチドであって、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸が、糖鎖付加Ａｓｎまたは糖鎖付加Ｃｙｓであることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  18. 　請求項１～１７のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖とアミノ酸とがリンカーを介することなく結合していることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  19. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が４個以上の糖からなることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  20. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖、３本鎖複合型糖鎖、または４本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  21. 　請求項１～１９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が２本鎖複合型糖鎖であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  22. 　請求項２０または２１に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記２本鎖複合型糖鎖が、ジシアロ糖鎖、モノシアロ糖鎖、アシアロ糖鎖、ジグルクナック糖鎖およびジマンノース糖鎖からなる群から選択される糖鎖であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  23. 　請求項１～１８のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸において、糖鎖が、下記式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１およびＲ２は、同一または異なって、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     を示し、Ａｃは、アセチル基を示す。］
    で表される糖鎖であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  24. 　請求項１～２０のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖が、非還元末端に少なくとも１つのシアル酸を有しており、前記シアル酸のカルボキシ基が、炭素数１～３０のアルキルアミノ基、ベンジル基、アミノ基、またはアミノエチルアミノ基により修飾されていることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  25. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、複数の糖鎖付加アミノ酸を有しており、
    　前記各糖鎖付加アミノ酸における糖鎖が、いずれも同一であることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  26. 　請求項１～２５のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドは、ＳＲＩＦ２８における１７位のＣｙｓと２８位のＣｙｓに相当するＣｙｓを有しており、
    　さらに、これらのＣｙｓは、相互にジスルフィド結合していることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  27. 　請求項１～２６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドのＣ末端は、アミド化されていることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  28. 　請求項１～２６のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドのＮ末端にアジド基が導入されていることを特徴とする、
    糖鎖付加ポリペプチド。
  29. 　請求項１～２８のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドであって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドが、標識されていることを特徴とする、糖鎖付加ポリペプチド。
  30. 　（Ｉ）請求項１～２９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドおよび／または薬学的に許容されるその塩、および、
    　（ＩＩ）薬理学的に許容される担体
    を含むことを特徴とする、
    医薬組成物。
  31. 　請求項３０に記載の医薬組成物であって、
    　前記糖鎖付加ポリペプチドにおいて、糖鎖が、実質的に均一であることを特徴とする、
    医薬組成物。
  32. 　請求項３０または３１に記載の医薬組成物であって、
    　ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防のために用いられることを特徴とする、医薬組成物。
  33. 　請求項３０に記載の医薬組成物であって、
    　前記ソマトスタチンに関連する疾患が、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、カルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、クッシング病、ホルモン分泌異常、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、放射線障害、眼疾患、ドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、ならびに、結膜炎からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする、
    医薬組成物。
  34. 　請求項１～２９のいずれか１項に記載の糖鎖付加ポリペプチドの有効量を投与することを特徴とする、ソマトスタチンに関連する疾患の治療または予防方法。
  35. 　請求項３４に記載の治療または予防方法であって、
    　前記ソマトスタチンに関連する疾患が、先端巨大症、巨人症、アルツハイマー病および他の形態の認知症、癌、ホルモン産生腫瘍、内分泌腫瘍、カルチノイド、ＶＩＰオーマ、インスリノーマ、グルカゴノーマ、クッシング病、ホルモン分泌異常、糖尿病およびその合併症、疼痛、関節炎、下痢、胃潰瘍、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、消化管閉塞、イレウス、術後再狭窄、眼疾患、放射線障害、ドライアイ、緑内障、角膜実質の炎症、虹彩炎、白内障、ならびに、結膜炎からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であることを特徴とする、
    治療または予防方法。
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