TW201315478A - 附加糖鏈之聚胜肽及含有該聚胜肽之醫藥組合物 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種附加糖鏈之聚胜肽，其對體抑素受體具有親和性，且與體抑素相比血中穩定性提高。本發明之附加糖鏈之聚胜肽之特徵在於：其係於體抑素或其類似物中，至少2個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換。

Description

附加糖鏈之聚胜肽及含有該聚胜肽之醫藥組合物
本發明係關於一種附加糖鏈之聚胜肽、及含有該聚胜肽之醫藥組合物。
體抑素係存在於中樞神經系統及周邊組織兩者中之環式胜肽。體抑素最初係自哺乳類之下丘腦單離，鑑定為來自腦下垂體前葉之生長激素分泌物之重要抑制劑。該胜肽廣泛地分佈於下丘腦、胰腺、消化道等中，經由與體抑素受體之結合而表現作用。又，體抑素係因抑制腦下垂體中之生長激素(GH，growth hormone)之分泌、抑制甲狀腺促素(TSH，thyroid stimulating hormone)分泌，以及抑制消化道中之胃泌素、選擇素、膽囊收縮素(CCK，cholecystokinin)、VIP(Vasoactive Intestinal Polypeptide，激脈腸聚胜肽)、胰腺中之升糖素、胰島素等各種激素之分泌而為人知曉。另外，亦已知體抑素具有抑制消化道蠕動之作用。
具有結構式：Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(序列編號1)的天然之體抑素(亦作為體促素釋放抑因(SRIF，somatotropin release-inhibiting factor)而為人知曉)最初係由Guillemin及合作研究者單離。該體抑素係藉由與受體家族相互作用而發揮其效果。已知體抑素受體(SSTR，somatostatin receptor)存在1至5之亞型(SSTR1~SSTR5)，其中SSTR2分佈於GH分泌性人腦下垂體腺瘤、中樞神經系統、腦下垂體前葉、視網膜、腎上 腺髓質、胃、十二指腸黏膜、小腸、結腸之各組織、及胰腺蘭氏小島之升糖素分泌性A細胞中。又，已知該等各受體亦於各種腫瘤中進行表現，例如據報告：於功能性腦下垂體腺瘤中，SSTR1與SSTR5進行表現；於胃腸道腫瘤中，除了SSTR2以外，SSTR1、SSTR3亦進行表現；於嗜鉻細胞瘤(Pheochromocytoma)中，SSTR3進行表現；於前列腺癌中，SSTR1及SSTR5進行表現；於結腸直腸癌中，SSTR5進行表現(非專利文獻1)。又，SSTR4據報告可作為拮抗性地具有調節作用之受體而發揮功能、以及有可能於青光眼相關之疾病之治療中較為重要(非專利文獻2)。如此，體抑素及其類似物對於體抑素相關疾病或各種腫瘤為潛在性的有用之治療藥。
另一方面，天然存在之體抑素由於血中半衰期為較短之2~3分鐘，故而表現出生物可用度較小，作用之持續時間較短該兩個不理想之性質，因此作為治療劑之使用或應用受限。出於該理由，為找出效力、活體穩定性、作用之持續時間、或考慮生長激素、胰島素或升糖素之釋放之抑制的選擇性中任一者均優異之體抑素類似物，業界不斷開發出各種體抑素類似物。
作為可於臨床上利用的最先得到承認之體抑素類似物，報告有奧曲肽(Octreotide)(專利文獻1及專利文獻2)，已知該奧曲肽對體抑素受體之SSTR2、SSTR3、及SSTR5具有親和性。
奧曲肽係開發為包含8個胺基酸之環狀胜肽，即其具有 作為對於表現體抑素之生物活性重要之部分的4個胺基酸(Phe-Trp-Lys-Thr)之序列，於該序列之兩末端具有形成雙硫(S-S)鍵之Cys，進而於其兩末端之Cys之外側具有D-Phe與Thr(ol)。該奧曲肽可藉由利用其胺基酸序列使血中半衰期提高，而獲得作用之持續性，又，與體抑素相比，對生長激素(GH)之選擇性較高，可具有強效之作用。
包含此種奧曲肽之體抑素類似物可用於患有激素分泌性及激素依賴性腫瘤之患者之治療。目前已藉由奧曲肽治療與作為神經內分泌系統腫瘤的轉移性類癌腫瘤相關之症狀(潮紅、腹瀉、心臟瓣膜疾病及腹痛)以及與激脈腸聚胜肽(VIP)分泌腺瘤相關之症狀(水瀉)。
例如，於類癌及VIP產生性腫瘤中，奧曲肽抑制其活性因子之分泌及作用之兩者。因此，於以大量分泌性腹瀉為特徵之VIP產生性腫瘤中，體抑素類似物可藉由抑制VIP分泌，並直接影響腸道分泌，而使其腹瀉減輕。
然而，另一方面，有報告指出大部分神經內分泌腫瘤對如奧曲肽之體抑素類似物具有耐性(非專利文獻3)。又，亦有報告指出將奧曲肽用於肢端肥大症之治療，但對於約三分之一的肢端肥大症患者並無效果。進而，有報告指出對於大半之類癌腫瘤患者，奧曲肽僅於投予初期發揮效果，若投予時間延長，則會引起急速減敏(tachyphylaxis)(速增耐性、急速免疫)。進而，有報告指出對於抑制初期之庫欣氏病(Cushing's disease)患者產生促腎上腺皮質激素(ACTH，adrenocorticotrophic hormone)，奧曲肽並未顯示 出效果。
由於如上所述之課題，期待對於表現複數種體抑素受體之腫瘤，開發出可如天然之體抑素般以較高之親和性與複數種受體亞型結合的體抑素類似物，又，有提示指出此種對體抑素受體具有親和性之體抑素類似物有可能對此前之體抑素類似物無治療效果之患者或具有耐性之患者亦具有效果(非專利文獻4)。
如此，期望開發出為與天然存在之體抑素類似之結構，同樣地對體抑素受體具有親和性’且與體抑素相比血中半衰期延長的體抑素類似物。
另一方面，已明確糖鏈於活體內擔負各種作用，為使血中之半衰期延長，亦提出有對奧曲肽附加糖鏈之方法(例如，專利文獻3)。
然而，由於其結構之複雜性及多樣性而研究進展緩慢，糖鏈之種類或附加糖鏈之位置無法謂之已達到最適合，尚未報告有克服了此前之體抑素類似物之問題的附加糖鏈之聚胜肽。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]美國專利第4,310,518號
[專利文獻2]美國專利第4,235,886號
[專利文獻3]日本專利特開平03-014599號
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Currrent Opinion in Pharmacology, 2004, Vol. 4, pp. 608-613
[非專利文獻2]J. Med. Chem. 2003, Vol. 46, pp. 5587-5596
[非專利文獻3]Mol Endocrinol, 2010, Vol. 24 (1), pp. 240-249
[非專利文獻4]Molecular and Cellular Endocrinology, Vol. 286, 2008, pp. 69-74
本發明之課題在於提供一種附加糖鏈之聚胜肽，其對體抑素受體具有親和性，且與體抑素相比血中穩定性提高。
本發明者等人為解決上述課題而反覆進行研究，結果發現了可維持對體抑素受體之親和性，且血中穩定性提高的附加糖鏈之聚胜肽。
即，本發明係關於一種附加糖鏈之聚胜肽，其特徵在於，其係於選自由以下之(A)~(F)所組成之群中之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換：(A)包含以序列編號1表示之胺基酸序列的SRIF14；(B)於包含以序列編號1表示之胺基酸序列之SRIF14中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加的聚胜肽；(C)SRIF14之類似物；(D)相對於包含以序列編號1表示之胺基酸序列之SRIF14，具有80%以上之同源性的聚胜肽；(E)於(A)~(D)中，於N末端側進而含有N個(此處，N為1以上20以下之整數)胺基酸的聚 胜肽；及(F)於(A)~(D)中，於C末端側進而含有M個(此處，M為1以上6以下之整數)胺基酸的聚胜肽；且對體抑素受體具有親和性。
此處，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述經附加糖鏈之胺基酸置換之胺基酸為相當於SRIF14中之19位之胺基酸。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(E)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(E)之聚胜肽之N末端側的上述N個胺基酸中之任一者。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(F)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(F)之聚胜肽之C末端側的上述M個胺基酸中之任一者。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(E)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，進而，附加於N末端側之上述N個胺基酸之序列係以X-Y-表示，此處，X表示L個(此處，L為1以上6以下之整數)任意之胺基酸之序列，又，Y為選自由以下之(1)~(15)所組成之群中之序列：(1)Lys、(2)Arg-Lys、(3)Glu-Arg-Lys、(4)Arg-Glu-Arg-Lys、(5)Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(6)Ala-Pro-Arg- Glu-Arg-Lys、(7)Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(8)Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(9)Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(10)Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(11)Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(12)Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(13)Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(14)Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、及(15)於上述序列(2)~(14)中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加的序列。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於表示附加於上述(E)之聚胜肽之N末端側的上述N個胺基酸之序列的X-Y-中代表X的L個胺基酸中之任一者。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：附加於N末端側之上述N個胺基酸係經由連結子(linker)而連結於該N末端側。
又，本發明之附加糖鏈之聚胜肽之另一實施態樣中，特徵在於，本發明之附加糖鏈之聚胜肽係於選自由以下之(A)~(F)所組成之群中之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換：(A)包含以序列編號2表示之胺基酸序列的SRIF28；(B)於包含以序列編號2表示之胺基酸序列之SRIF28中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加的聚胜肽；(C)SRIF28之類似物；(D)相對於包含以序列編號2表示之胺基酸序列之SRIF28，具有80%以上之同源性的聚胜 肽；(E)於(A)~(D)中，於N末端側進而含有J個(此處，J為1以上6以下之整數)胺基酸的聚胜肽；及(F)於(A)~(D)中，於C末端側進而含有K個(此處，K為1以上6以下之整數)胺基酸的聚胜肽；且對體抑素受體具有親和性。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於上述經附加糖鏈之胺基酸置換之胺基酸為選自由下述者所組成之群中的至少1個胺基酸：相當於SRIF28中之1位之胺基酸、相當於5位之胺基酸、相當於9位之胺基酸、相當於12位之胺基酸、相當於13位之胺基酸、相當於14位之胺基酸、及相當於19位之胺基酸。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(E)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(E)之聚胜肽之N末端側的上述J個胺基酸之任一個。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(F)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(F)之聚胜肽之C末端側的上述K個胺基酸之任一個。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述對體抑素受體之親和性係對選自由SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、及SSTR5所組成之群中之受體中的至少2種以上受體具有親和性。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽對至少SSTR1及SSTR4中之任一者具有親和性。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽對SSTR1及SSTR4之兩者具有親和性。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽對SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、及SSTR5之全部具有親和性。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽與SRIF28相比，具有增大之血中穩定性。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述各附加糖鏈之胺基酸為附加糖鏈之Asn或附加糖鏈之Cys。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈與胺基酸不經由連結子而結合。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈包含4個以上之糖。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈為雙鏈複合型糖鏈、三鏈複合型糖鏈、或四鏈複合型糖鏈。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈為雙鏈複合型糖鏈。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述雙鏈複合型糖鏈為選自由二唾液酸糖鏈、單唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、二乙醯葡糖胺(diGlcNAc)糖鏈、及二甘露糖糖鏈所組成之群中之糖鏈。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈為下述式所表示之糖鏈， [式中，R1及R2相同或不同，表示下述式： Ac表示乙醯基]。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述糖鏈於非還原末端具有至少1個唾液酸，上述唾液酸之羧基經碳數1~30之烷基胺基、苄基、胺基、或胺基乙基胺基修飾。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽具有複數個附加糖鏈之胺基酸，且上述各附加糖鏈之胺基酸中之糖鏈均相同。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽具有相當於SRIF28中之17位之Cys與28位之Cys的Cys，進而，該等Cys相互以雙硫鍵結合。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽之C末端經醯胺化。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：在上述附加糖鏈之聚胜肽之N末端導入有疊氮基。
又，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽之一實施態樣中，特徵在於：上述附加糖鏈之聚胜肽經標記。
又，本發明之另一態樣係關於一種醫藥組合物，其特徵在於包含：(I)上述所記載之附加糖鏈之聚胜肽及/或藥學上可容許之其鹽、及(II)藥理學上可容許之載體。
又，於本發明之醫藥組合物之一實施態樣中，特徵在於：於上述附加糖鏈之聚胜肽中，糖鏈實質上均勻。
又，於本發明之醫藥組合物之一實施態樣中，特徵在於：其係用於治療或預防與體抑素相關之疾病。
又，於本發明之醫藥組合物之一實施態樣中，特徵在於上述與體抑素相關之疾病為選自由下述者所組成之群中的至少1種疾病：肢端肥大症、巨人症、阿茲海默氏症及其他形態之癡呆症、癌、激素產生性腫瘤(hormone producing tumor)、內分泌腫瘤、類癌、VIP瘤、胰島瘤、升糖素瘤、庫欣氏病、激素分泌異常、糖尿病及其併發症、疼痛、關節炎、腹瀉、胃潰瘍、炎症性腸病、急躁性腸症候群、消化道阻塞、腸塞(ileus)、術後再狹窄、放射線損傷、眼疾、乾眼病、青光眼、角膜實質炎、虹膜炎、白內障、以及結膜炎。
又，本發明之另一態樣係關於一種與體抑素相關之疾病之治療或預防方法，其特徵在於：投予有效量之上述所記載之附加糖鏈之聚胜肽。
又，於本發明之治療或預防方法之一實施態樣中，特徵在於上述與體抑素相關之疾病為選自由下述者所組成之群中的至少1種疾病：肢端肥大症、巨人症、阿茲海默氏症及其他形態之癡呆症、癌、激素產生性腫瘤、內分泌腫瘤、類癌、VIP瘤、胰島瘤、升糖素瘤、庫欣氏病、激素分泌異常、糖尿病及其併發症、疼痛、關節炎、腹瀉、胃潰瘍、炎症性腸病、急躁性腸症候群、消化道阻塞、腸塞、術後再狹窄、放射線損傷、眼疾、乾眼病、青光眼、角膜實質炎、虹膜炎、白內障、以及結膜炎。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽對體抑素受體具有親和性，並且與體抑素相比具有提高之血中穩定性。又，本發明之附加糖鏈之聚胜肽藉由具有上述特徵而可用於體抑素相關疾病之治療。
又，本發明之附加糖鏈之體抑素中所附加之糖鏈於活體內容易分解，因此不會因其積累而對活體產生藥害。
又，本發明之附加糖鏈之體抑素中所附加之糖鏈之一部分或全部為存在於包括人之哺乳類、鳥類等活體內之糖鏈或其改變體，即便投予至體內，表現副作用或抗原性之可能性亦較低。發生過敏反應或產生抗體，或因此無法獲得藥效等之擔憂較少。
進而，本發明中所使用之糖鏈多為相對較短者，因此可不經過複雜之製造步驟而獲得均勻之結構者。因此，可大規模且穩定地獲得具有醫藥品水準之高品質之體抑素活性的附加糖鏈之聚胜肽。
於本說明書中，所謂「體抑素」，係指包含14個胺基酸序列之SRIF14、或包含28個胺基酸序列之SRIF28。
再者，於本說明書中，將SRIF28之胺基酸序列中的N末端之Ser設為1位，將C末端之Cys設為28位。此處，SRIF14與SRIF28之胺基酸序列中的15位至28位之胺基酸序列完全一致。再者，SRIF28之胺基酸序列之15位為Ala，使SRIF14之胺基酸序列(序列編號1)中的N末端之Ala與 SRIF28之15位對應而設為15位。再者，SRIF14及SRIF28於17位之Cys與28位之Cys間具有雙硫鍵。
SRIF14具有下述之胺基酸序列(序列編號1)。再者，於下述胺基酸序列中，「Ala15」之15係表示15位之Ala。Ala15-Gly16-Cys17-Lys18-ASn19-Phe20-Phe21-Trp22-Lys23-Thr24-Phe25-Thr26-Ser27-Cys28
SRIF28具有下述之胺基酸序列(序列編號2)。Ser1-Ala2-Asn3-Ser4-Asn5-Pro6-Ala7-Met8-Ala9-Pro10-Arg11-Glu12-Arg13-Lys14-Ala15-Gly16-Cys17-Lys18-Asn19-Phe20-Phe21-Trp22-Lys23-Thr24-Phe25-Thr26-Ser27-Cys28
於本說明書中，所謂「胺基酸」，係於其最廣泛之含義上使用，不僅包含天然之胺基酸，亦包含如胺基酸變異體及衍生物等之非天然胺基酸。若為業者則可理解，考慮該廣泛之定義，本說明書中之胺基酸例如可列舉：天然蛋白原性L-胺基酸；D-胺基酸；胺基酸變異體及衍生物等經化學修飾之胺基酸；甘白胺酸、β-丙胺酸、鳥胺酸等天然非蛋白原性胺基酸；及具有作為胺基酸之特徵的業界所公知之特性的化學合成之化合物等。作為非天然胺基酸之示例，可列舉：α-甲基胺基酸(α-甲基丙胺酸等)、D-胺基酸、組胺酸式之胺基酸(2-胺基-組胺酸、β-羥基-組胺酸、高組胺酸、α-氟甲基-組胺酸及α-甲基-組胺酸等)、側鏈中具有多餘之亞甲基之胺基酸(「高」胺基酸)及側鏈中之羧酸官能基胺基酸經磺酸基置換之胺基酸(磺丙胺酸等)。已知對體抑素受體具有親和性之某些體抑素類似物包含非天 然胺基酸。於較佳之態樣中，本發明之化合物中所含之胺基酸僅由天然胺基酸構成。
於本說明書中，於胺基酸之1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加之情形時，對於所置換等之胺基酸之個數，只要可保持對體抑素受體之親和性則並無特別限定，為1~9個，較佳為1~5個，更佳為1~3個左右或者為整體長度的20%以內，較佳為10%以內。所置換或附加之胺基酸可為天然之胺基酸、非天然之胺基酸或胺基酸類似物，較佳為天然之胺基酸。作為胺基酸之1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加所得之體抑素胜肽的示例，例如可列舉：22位之Trp經D體之Trp(D-Trp)置換所得之體抑素胜肽、使19位之Asn缺失所得者(J.Med.Chem,2001,44,2238-2246)、將25位之Phe置換為Tyr所得者、將8位之Met置換為Leu所得者(Endocrinology,1982,10：1049-1051)等。
於本發明中，所謂「SRIF14或SRIF28之類似物」，係指結構上與體抑素類似之聚胜肽及/或具有與體抑素重複之結構之聚胜肽，例如可列舉：體抑素之胺基酸之1個或數個胺基酸經保存性置換之聚胜肽、體抑素改變體、對體抑素受體具有親和性之體抑素之片段、對體抑素受體具有親和性之伸長體抑素。
於本說明書中，所謂「胺基酸之1個或數個胺基酸經保存性置換」，係指於胺基酸置換中，原來之胺基酸與所置換之胺基酸的親水性指數及/或疏水性指數類似之置換，且於此種置換之前後，對體抑素受體之親和性不會產生明 顯之降低或消失。
於本說明書中，所謂「體抑素改變體」，係指體抑素之改變體，包含體抑素天然存在之變異體、或對體抑素進行人工改變而成之化合物，作為此種改變，例如可列舉：體抑素之1個或複數個胺基酸殘基之烷基化、醯化(例如乙醯化)、醯胺化、羧基化、酯形成、雙硫鍵形成、糖基化、脂質化、磷酸化、氫氧化、標記成分之結合等。
於本說明書中，所謂「對體抑素受體具有親和性之體抑素之片段」，係指自體抑素之N末端及/或C末端缺失1個或1個以上之胺基酸，且維持對體抑素受體之親和性的胜肽。
於本說明書中，所謂「對體抑素受體具有親和性之伸長體抑素」，係指於SRIF28或SRIF14之N末端及/或C末端附加有1個或1個以上之胺基酸，且維持對體抑素受體之親和性的胜肽。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽包括：在包含與以序列編號1表示之胺基酸序列具有80%以上之同源性之胺基酸序列的聚胜肽、包含與以序列編號2表示之胺基酸序列具有80%以上之同源性之胺基酸序列的聚胜肽、或於該等聚胜肽之N末端或C末端進而附加有胺基酸的聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，且對體抑素受體具有親和性的附加糖鏈之聚胜肽。
與序列編號1或序列編號2具有同源性之聚胜肽只要對體抑素受體具有親和性，則可較佳地具有80%以上、85%以上、90%以上、95%以上之同源性。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽如上所述般，亦包含於SRIF 14或SRIF28之N末端及/或C末端進而附加有胺基酸之聚胜肽。
於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中，對於進而附加於SRIF14之N末端之胺基酸，只要可維持對體抑素受體之親和性則並無特別限制，例如可附加1個以上20個以下之胺基酸。
此處，進而附加於SRIF14之N末端之胺基酸可以X-Y-表示。再者，Y為直接結合於SRIF14之聚胜肽中的N末端胺基酸之胺基酸，Y包含以下之(1)~(15)中之任一胺基酸序列：(1)Lys、(2)Arg-Lys、(3)Glu-Arg-Lys、(4)Arg-Glu-Arg-Lys、(5)Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(6)Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(7)Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(8)Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(9)Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(10)Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(11)Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(12)Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(13)Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、 (14)Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、及(15)於上述序列(2)~(14)中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加之序列。
又，X為1以上6以下之任意之胺基酸，表示1個、2個、3個、4個、5個或6個任意之胺基酸。X較佳為附加糖鏈之胺基酸，更佳為附加糖鏈之Asn或附加糖鏈之Cys。
於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中，對於進而附加於SRIF28之N末端之胺基酸，只要可維持對體抑素受體之親和性則並無特別限制，例如可附加1個以上6個以下之任意之胺基酸，可附加1個、2個、3個、4個、5個、或6個任意之胺基酸。進而附加於SRIF28之N末端之胺基酸較佳為附加糖鏈之胺基酸，更佳為附加糖鏈之Asn或附加糖鏈之Cys。又，1個以上6個以下之任意之胺基酸亦可將其全部設為附加糖鏈之胺基酸。
於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中，對於進而附加於SRIF14或SRIF28之C末端之胺基酸，只要可維持對體抑素受體之親和性則並無特別限制，例如可附加1個以上6個以下之任意之胺基酸，可附加1個、2個、3個、4個、5個或6個任意之胺基酸。進而附加於SRIF14或SRIF28之C末端之胺基酸較佳為附加糖鏈之胺基酸，更佳為附加糖鏈之Asn或附加糖鏈之Cys。又，1個以上6個以下之任意之胺基酸亦可將其全部設為附加糖鏈之胺基酸。
於本說明書中，「於體抑素之N末端側(SRIF28之1位或SRIF14之15位)進而附加有1個或數個胺基酸之胜肽」之情 形時，於SRIF28中，係指於作為N末端的1位之Ser上進而附加有任意之胺基酸或附加糖鏈之胺基酸者。又，於SRIF14中，係指於作為N末端的15位之Ala上進而附加有任意之胺基酸或附加糖鏈之胺基酸者。
同樣地，「於C末端側(SRIF28或SRIF14之28位)進而附加有1個或數個胺基酸之胜肽」之情形時，係指於SRIF28或SRIF14的28位之Cys上進而附加任意之胺基酸或附加糖鏈之胺基酸者。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽亦可於其N末端或C末端經由連結子進而附加胺基酸。作為此種連結子，例如可列舉：兩末端具有胺基及羧基以可將胺基酸與胜肽結合的烷基鏈或聚乙二醇鏈等。作為此種連結子，例如可列舉：-NH-(CH2)n-CO-(式中，n為整數，只要不阻礙目標之連結子功能則並無限定，較佳為表示1~15之整數)或-NH-(CH2CH2O)m-CH2CH2-CO-(式中，m為整數，只要不阻礙目標之連結子功能則並無限定，較佳為表示1~7之整數)等。更具體而言，可列舉：-NH-(CH2)11-CO-(C12linker)或-NH-(CH2CH2O)3-CH2CH2-CO-(PEGlinker)等。又，經由連結子而附加於附加糖鏈之聚胜肽的胺基酸並無特別限定，較佳為附加糖鏈之胺基酸。作為附加糖鏈之胺基酸，例如可列舉：附加糖鏈之Asn或附加糖鏈之Cys。
又，於本發明之一實施態樣中，附加糖鏈之聚胜肽亦可於其N末端導入疊氮基。若使附加糖鏈之聚胜肽之N末端疊氮化，則可利用疊氮化物-炔[3+2]環加成反應或 Staudinger反應等選擇性地導入各種分子，故而較佳。使附加糖鏈之聚胜肽疊氮化之方法並無特別限制，例如可藉由對固相合成中合成於樹脂上之糖胜肽之N末端，使用縮合劑使疊氮基取代脂肪酸縮合而獲得。作為疊氮基取代脂肪酸，可列舉：4-疊氮基丁酸、5-疊氮基-戊酸(5-Azido-pentanoic acid)、6-疊氮基己酸。
又，於本發明之一實施態樣中，附加糖鏈之聚胜肽亦可於其N末端附加標記化合物。作為本發明中所使用之標記化合物，例如可列舉但並不限定於以下者：生物素(Biotin)、螢光色素、金屬離子螯合劑等。可使標記化合物與糖胜肽之N末端直接結合，亦可經由連結子而與糖胜肽之N末端結合。例如，藉由將生物素作為標記化合物而附加於糖胜肽之N末端，可利用與抗生物素蛋白之較強之結合，而應用於研究用試劑、臨床檢查藥、或導彈療法(missile therapy)。
再者，標記化合物於本發明之附加糖鏈之聚胜肽上之附加可藉由先前業者眾所周知之方法進行。例如，可於固相合成中之樹脂上之附加糖鏈之聚胜肽的N末端，使用縮合劑使標記化合物縮合。
本發明之「附加糖鏈之聚胜肽」之特徵在於：至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換。
於本說明書中，「附加糖鏈之聚胜肽」包含體抑素之至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換的聚胜肽、上述體抑素類似物中至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換的 聚胜肽等，即便分別進而使附加糖鏈之胺基酸以外之胺基酸之1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加，亦包含於本發明之附加糖鏈之聚胜肽內。該等胜肽之C末端經醯胺化之胜肽(例如，具有Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2(序列編號3)之胺基酸序列之SRIF14NH2、或具有Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-NH2(序列編號4)之胺基酸序列之SRIF28NH2)的至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換之胜肽亦包含於本發明之附加糖鏈之聚胜肽內。進而，該等胜肽之鹽亦包含於附加糖鏈之聚胜肽內。
於本說明書中，鹽可為酸加成鹽或鹼加成鹽中之任一者。通常用以形成酸加成鹽之酸為鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、磷酸等無機酸及對甲苯磺酸、甲磺酸、草酸、對溴苯基磺酸、甲酸、琥珀酸、檸檬酸、苯甲酸、乙酸等有機酸。作為鹼加成鹽，可列舉：氫氧化銨或鹼金屬氫氧化物或鹼土金屬氫氧化物、碳酸鹽、重碳酸鹽等由無機鹼衍生之鹽。尤佳為藥學上可容許之鹽。
於本說明書中，所謂「附加糖鏈之胺基酸」，係指結合有糖鏈之胺基酸，此處，糖鏈與胺基酸亦可經由連結子而結合。糖鏈與胺基酸之結合部位並無特別限制，較佳為於糖鏈之還原末端結合胺基酸。
結合糖鏈之胺基酸之種類並無特別限定，可使用天然胺基酸、非天然胺基酸中之任一種。就附加糖鏈之胺基酸與 於活體內以糖胜肽(糖蛋白)之形式而存在者具有相同或類似之結構的觀點而言，附加糖鏈之胺基酸較佳為附加N-結合型糖鏈等糖鏈之Asn、附加O-結合型糖鏈等糖鏈之Ser及附加O-結合型糖鏈等糖鏈之Thr，尤佳為附加糖鏈之Asn。
又，於糖鏈與胺基酸經由連結子而結合之情形時，就與連結子之結合容易性之觀點而言，附加糖鏈之胺基酸的胺基酸較佳為天冬胺酸或麩胺酸等分子內具有2個以上羧基之胺基酸，離胺酸、精胺酸、組胺酸、色胺酸等分子內具有2個以上胺基之胺基酸，絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸等分子內具有羥基之胺基酸，半胱胺酸等分子內具有硫醇基之胺基酸，天冬醯胺酸、麩醯胺酸等分子內具有醯胺基之胺基酸。尤其是就反應性之觀點而言，較佳為天冬胺酸、麩胺酸、離胺酸、精胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸。
再者，對於本發明之任意之附加糖鏈之聚胜肽，可認為於糖鏈結構、糖鏈以外之結構、糖鏈之附加部位及糖鏈之附加數相同之情形時，在附加糖鏈之胺基酸為附加糖鏈之Asn(不經由連結子)之情況與附加糖鏈之Cys(經由連結子)之情況下，本發明之附加糖鏈之聚胜肽之血中半衰期無較大差異。
於糖鏈與胺基酸經由連結子而結合之情形時，作為連結子，可廣泛地使用該領域中一直使用者，例如可列舉：-NH-(CO)-(CH2)a-CH2-(式中，a為整數，只要不阻礙目標之連結子功能則並無限定，較佳為表示0~4之整數)、 C1-10聚亞甲基、-CH2-R-(此處，R為自選自由烷基、經置換之烷基、烯基、經置換之烯基、炔基、經置換之炔基、芳基、經置換之芳基、碳環基、經置換之碳環基、雜環基及經置換之雜環基所組成之群中之基中使1個氫原子脫離而生成之基)、-(CO)-(CH2)a-(CO)-(式中，a為整數，只要不阻礙目標之連結子功能則並無限定，較佳為表示0~4之整數)等。
於附加糖鏈之胺基酸中，當糖鏈與體抑素骨架上之胺基酸係經由連結子而結合時，連結子於糖鏈側之末端包含胺基酸亦較佳。胺基酸之種類並無特別限定，作為較佳例，可列舉Asn。
再者，本發明之附加糖鏈之聚胜肽並不由其記載(例如，「胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換之附加糖鏈之聚胜肽」之記載)而對製造方法作任何限定，利用後述之A法或B法中之任一方法所製造的附加糖鏈之聚胜肽均包含於「胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換之附加糖鏈之聚胜肽」中。又，只要最終結構一致，則例如下述者亦包含於本發明之附加糖鏈之聚胜肽內：使未結合有胺基酸之糖鏈直接或經由連結子而結合於胜肽上之胺基酸而成的附加糖鏈之聚胜肽；於附加糖鏈之聚胜肽中，藉由對所附加之糖鏈進而附加糖或糖鏈而使已附加之糖鏈伸長的附加糖鏈之聚胜肽；使1個或數個胺基酸與附加糖鏈之胺基酸之胺基及/或羧基結合，進而使其與1個或複數個體抑素片段連結而成的附加糖鏈之聚胜肽；使結合有胺基酸之糖鏈經由連結子 而結合於胜肽上之胺基酸而成的附加糖鏈之聚胜肽等。
於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中，關於經附加糖鏈之胺基酸置換之胺基酸之數，只要根據血中穩定性或生長激素等之分泌抑制等生理活性、最終之附加糖鏈之聚胜肽中所存在的胺基酸之個數或糖鏈附加前後附加糖鏈之聚胜肽之分子量等而適當調節即可。例如，較佳為置換1~10個，更佳為置換1~5個，進而較佳為置換1~3個。就簡便性之觀點而言，若以1個置換可獲得所期望之活性，則較佳為選擇1個置換。再者，於本發明之一態樣中，較佳為置換2個以上，例如較佳為置換2~5個，更佳為置換2~3個。通常，於體抑素之1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換所得的附加糖鏈之聚胜肽中，將附加糖鏈之胺基酸以外之1個以上胺基酸進而以附加糖鏈之胺基酸置換之情形時，有血中穩定性增大，對體抑素受體之親和性減少之傾向。然而，另一方面由於附加糖鏈之聚胜肽的血中穩定性增大，故而可補償或增大減少之體抑素活性。
又，於附加糖鏈之聚胜肽中具有複數條糖鏈之情形時，糖鏈彼此於附加糖鏈之聚胜肽之胺基酸序列中，可附加於連續之胺基酸，亦可隔開間隔地附加於胺基酸。若將糖鏈配置得較密，則血漿中濃度不會急遽上升，就此方面而言較佳。又，就生物可用度之觀點而言，關於附加糖鏈之位置，與較密地附加於連續之胺基酸相比，隔開間隔地附加複數條糖鏈之情況較佳。
於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中，將胺基酸以附加糖鏈 之胺基酸置換之部位尤其可根據對複數種體抑素受體之親和性之觀點而適當調節。
於本發明之一態樣中，關於將胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換之部位，就附加糖鏈之聚胜肽對體抑素受體之親和性之中，對複數種SSTR1~SSTR5之受體具有親和性之觀點而言，例如可列舉：相當於SRIF14中之19位之胺基酸，進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第1個、第2個、第3個、第6個、第10個、及第14個之胺基酸，以及進而附加於SRIF14之C末端側之胺基酸中自C末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸。可較佳地列舉：進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第3個、第6個、第10個、及第14個之胺基酸。
又，同樣地，就對複數種SSTR1~SSTR5之受體具有親和性之觀點而言，可列舉：相當於SRIF28中之1位、5位、9位、12位、13位、14位、及19位之胺基酸，以及進而附加於SRIF28之C末端之胺基酸中自C末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸。可較佳地列舉：相當於SRIF28之1位、5位、9位、及12位之胺基酸。
又，尤其是作為將本發明之附加糖鏈之聚胜肽的2個以上胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換之情形的示例，就附加糖鏈之聚胜肽對複數種體抑素受體具有親和性之觀點而言，例如可列舉將以下等胺基酸置換：進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第10個及第14個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端之胺基酸中自N 末端側起附加於第6個及第10個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第2個及第14個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第14個及第15個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第14個、第15個、及第16個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第6個、第10個、及第14個之胺基酸。較佳可列舉將以下等胺基酸置換：進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第10個及第14個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端之胺基酸中自N末端側起附加於第6個及第10個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第14個及第15個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第14個、第15個、及第16個之胺基酸；進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第6個、第10個、及第14個之胺基酸。
又，同樣地，作為將2個以上胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換之情形的示例，就附加糖鏈之聚胜肽對複數種體抑素受體具有親和性之觀點而言，可列舉將以下等胺基酸置換：相當於SRIF28中之1位與5位之胺基酸；相當於5位與9位之胺基酸；相當於1位與13位之胺基酸；相當於1位之胺基酸與進而附加於1位之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第1個之胺基酸；相當於1位之胺基酸與進而附加於 1位之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第1個及第2個之胺基酸；相當於1位、5位、及9位之胺基酸；較佳為將以下胺基酸置換：相當於1位與5位之胺基酸；相當於5位與9位之胺基酸；相當於1位之胺基酸與進而附加於1位之N末端側之胺基酸中附加於第1個之胺基酸；相當於1位之胺基酸與進而附加於1位之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第1個及第2個之胺基酸；相當於1位、5位、及9位之胺基酸。
於本發明之一態樣中，關於將胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換之部位，就附加糖鏈之聚胜肽的血中穩定性之觀點而言，例如可列舉：相當於SRIF14中之19位之胺基酸，進而附加於SRIF14之N末端之胺基酸中自N末端側起附加於第1個、第2個、第3個、第6個、第10個、第14個之胺基酸，進而附加於SRIF14之C末端側之胺基酸中自C末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸。較佳可列舉：相當於SRIF14中之19位之胺基酸，進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸，進而附加於SRIF14之C末端側之胺基酸中自C末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸。更佳為相當於SRIF14中之19位之胺基酸，進而附加於SRIF14之N末端側之胺基酸中自N末端側起附加於第1個之胺基酸，以及進而附加於SRIF14之C末端側之胺基酸中自C末端側起附加於第1個之胺基酸。
又，同樣地，就附加糖鏈之聚胜肽的血中穩定性之觀點 而言，例如為選自由相當於SRIF28中之1位、5位、9位、12位、13位、14位、及19位之胺基酸，以及進而附加於SRIF28之C末端之胺基酸中自C末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸所組成之群中的1個以上之胺基酸；較佳為選自由相當於SRIF28中之13位、14位、及19位之胺基酸，以及進而附加於SRIF28之C末端之胺基酸中自C末端側起附加於第1個、及第2個之胺基酸所組成之群中的1個以上之胺基酸；尤佳為選自由相當於SRIF28中之14位、及19位之胺基酸，以及進而附加於SRIF28之C末端之胺基酸中自C末端側起附加於第1個之胺基酸所組成之群中的1個以上之胺基酸。尤其是將與SRIF28之N末端相距較遠之部位的胺基酸置換亦較佳。
此處，所謂「相當於特定之胺基酸之胺基酸」，只要於附加糖鏈之聚胜肽中無胺基酸附加、缺失等，則係指與SRIF14或SRIF28之胺基酸序列對應之同一位置之胺基酸。又，於附加糖鏈之聚胜肽之胺基酸序列內存在胺基酸附加、缺失之情形時，係指位於考慮到因胺基酸附加、缺失而引起之胺基酸序列上之移動的位置之胺基酸。例如，於自1位至4位具有Ser1-Ala2-Asn3-Ser4-之序列的附加糖鏈之聚胜肽中，於在2位與3位之胺基酸之間附加1個胺基酸(Trp)之情形時(Ser-Ala-Trp-Asn-Ser-)，所謂相當於3位之胺基酸(Asn)之胺基酸，係指附加糖鏈之聚胜肽中因Trp插入而向C末端側移動1位之胺基酸(Asn)。
於本發明之一態樣中，由附加糖鏈之胺基酸置換之胺基 酸較佳為選自除相當於SRIF28中之17位、21位、22位、23位、及28位之胺基酸以外之胺基酸中的1個以上之胺基酸，尤其更佳為選自除相當於SRIF28中之17位、22位、23位、及28位之胺基酸以外之胺基酸中的1個以上之胺基酸。
於本發明之一態樣中，於2個以上胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換之情形時，將胺基酸以附加糖鏈之胺基酸置換之部位可採用上述任一組合，但並不限定於此。例如下述等組合亦包含於本發明之較佳之一態樣中：1個部位自上述較佳之部位中選擇，其他部位自SRIF14或SRIF28之任意之部位中選擇的組合；1個部位自上述較佳之部位中選擇，其他部位自進而附加於體抑素之N末端(SRIF28中之1位、或SRIF14中之15位)或C末端之1個或數個胺基酸之任意之部位中選擇的組合。
於本發明之一態樣中，關於附加糖鏈之胺基酸以外的產生胺基酸缺失、置換或附加之部位，例如較佳為自除相當於SRIF28中之17位、22位、23位、及28位之胺基酸以外之胺基酸中選擇的1個以上之胺基酸。
於本說明書中，所謂「糖鏈」，係指1個以上之單元糖(單糖及/或其衍生物)連接而成之化合物。於2個以上之單元糖連接之情形時，各單元糖彼此之間係藉由糖苷鍵之脫水縮合而結合。作為此種糖鏈，例如除活體中所含之單糖類及多糖類(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、木糖、N-乙醯葡糖胺(GlcNAc)、N-乙醯半乳胺糖(GalNAc)、唾液 酸以及該等之複合物及衍生物)以外，亦可列舉分解之多糖、糖蛋白、蛋白多糖(Proteoglycan)、糖胺聚多糖(glycosaminoglycan)、糖脂質等自複合活體分子分解或衍生之糖鏈等廣範圍者，但並不限定於該等。糖鏈可為直鏈型，亦可為支鏈型。
又，於本說明書中，「糖鏈」亦包含糖鏈之衍生物，作為糖鏈之衍生物，例如可列舉構成糖鏈之糖為下述者之糖鏈：具有羧基之糖(例如，C-1位經氧化而成為羧酸之醛糖酸(例如，D-葡萄糖經氧化而成之D-葡萄糖酸)、末端之C原子成為羧酸之糖醛酸(D-葡萄糖經氧化而成之D-葡糖醛酸))、具有胺基或胺基之衍生物(例如，經乙醯化之胺基)之糖(例如，N-乙醯基-D-葡糖胺、N-乙醯基-D-半乳胺糖等)、具有胺基及羧基兩者之糖(例如，N-乙醯神經胺糖酸(唾液酸)、N-乙醯胞壁酸等)、經脫氧化之糖(例如，2-脫氧-D-核糖)、含有硫酸基之硫酸化糖、含有磷酸基之磷酸化糖等，但並不限定於該等。
於本發明中，較佳之糖鏈為，將該糖鏈附加於體抑素之情形(以附加糖鏈之胺基酸之形態與體抑素之胺基酸進行置換之情形)時，可使體抑素之血中穩定性增大，且不使對體抑素受體之親和性消失之糖鏈。於本發明之某態樣中，較佳之糖鏈為，將該糖鏈附加於體抑素之情形(以附加糖鏈之胺基酸之形態與體抑素之胺基酸進行置換之情形)時，可維持對體抑素之複數種受體之親和性之糖鏈，進而較佳為可維持對體抑素之全部受體之親和性之糖鏈。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽中之糖鏈並無特別限定，可為於活體內以複合糖類(糖胜肽(或糖蛋白)、蛋白多糖、糖脂質等)之形式存在之糖鏈，亦可為於活體內不以複合糖類之形式存在之糖鏈。
就將本發明之附加糖鏈之聚胜肽投予至活體之觀點而言，於活體內以複合糖類之形式存在之糖鏈較佳。作為此種糖鏈，可列舉：於活體內以糖胜肽(或糖蛋白)之形式與胜肽(或蛋白質)結合之糖鏈即N-結合型糖鏈、O-結合型糖鏈等。較佳為使用N-結合型糖鏈。作為N-結合型糖鏈，例如可列舉：高甘露糖(high mannoside)型、複合(complex)型、混成(hybrid)型，尤佳為複合型。
作為本發明中所使用之較佳之複合型糖鏈，例如可列舉下述通式所表示之糖鏈： [式中，R1及R2相同或不同，表示下述式： Ac表示乙醯基]。
再者，於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中，即便糖鏈為於活體內以複合糖類之形式存在之糖鏈，亦可以O-結合型及N-結合型以外之方法與體抑素胜肽結合。例如，如上所述，糖鏈經由連結子結合於Cys或Lys者亦包含於本發明之附加糖鏈之聚胜肽中。
於本發明之一態樣中，本發明之附加糖鏈之聚胜肽中之糖鏈較佳為包含4個以上、例如5個以上、7個以上、尤其是9個以上、11個以上之糖之糖鏈。
於本發明之較佳之一態樣中，本發明之附加糖鏈之聚胜肽中之糖鏈為包含5~11個、9~11個或11個糖之糖鏈。
於本發明之較佳之一態樣中，本發明之附加糖鏈之聚胜肽中之糖鏈為雙鏈之複合型糖鏈。複合型糖鏈之特徵在於：包含2種以上之單糖，且具有以下所示之基本結構與以Galβ1-4GlcNAc所表示之乳糖胺結構。
所謂雙鏈複合型糖鏈，係指於基本結構之末端之2個甘露糖上分別結合有包含0~3糖的單鏈糖鏈。作為雙鏈複合型糖鏈，例如較佳為以下所示之二唾液酸糖鏈、
單唾液酸糖鏈、
[化7A] 去唾液酸糖鏈、 二乙醯葡糖胺糖鏈、[化9] 二甘露糖糖鏈、 等，更佳為二唾液酸糖鏈。
又，本發明之複合型糖鏈除上述之雙鏈複合型糖鏈以外，亦包含三鏈之複合型糖鏈(三分支型複合型糖鏈)、四鏈之複合型糖鏈(四分支型複合型糖鏈)。例如，作為三 鏈、四鏈之複合型糖鏈，可列舉以下之結構式所表示的三唾液酸糖鏈、 下述結構式： 所表示之四唾液酸糖鏈。又，作為三鏈複合型糖鏈及四鏈複合型糖鏈，亦可列舉：自該等三唾液酸糖鏈或四唾液酸糖鏈之非還原末端失去1個或複數個糖之糖鏈。
進而，本發明之複合型糖鏈亦包含附有海藻糖者。作為附有海藻糖之複合型糖鏈，可列舉以下之結構式： 所表示之含有海藻糖之複合型糖鏈。又，亦可列舉自該等含有海藻糖之複合型糖鏈之非還原末端失去1個或複數個糖之糖鏈。
又，於本說明書中，「二唾液酸糖鏈」、「單唾液酸糖鏈」、「去唾液酸糖鏈」、「二乙醯葡糖胺糖鏈」、「二甘露糖糖鏈」、「雙鏈複合型糖鏈」、「三鏈複合型糖鏈」、「四鏈複合型糖鏈」、「含有海藻糖之複合型糖鏈」除上述化學式所表示者以外，亦包含結合形式與化學式所示之示例不同者，此種糖鏈亦可較佳地用作本發明之糖鏈。作為此種糖鏈，例如可列舉：於二唾液酸糖鏈或單唾液酸糖鏈中，唾液酸與半乳糖以(α2→3)鍵結合者。
又，於糖鏈之非還原末端具有唾液酸之糖鏈之情形時，亦可使用唾液酸之羧基經修飾之糖鏈。作為唾液酸之羧基 之修飾，較佳為使羧基之負電荷消失或轉換為正電荷之基，例如可列舉：碳數1~30之烷基胺基、苄基、胺基、胺基乙基胺基等。藉由導入該等修飾基而使唾液酸之羧基之負電荷消失(苄基、胺基等)或轉換為正電荷(胺基乙基胺基等)，可謀求控制附加糖鏈之聚胜肽之血中清除率或體內分佈。
又，本發明中所使用之高甘露糖型糖鏈係於上述之複合型糖鏈之基本結構上進而結合2個以上甘露糖之糖鏈。由於高甘露糖型糖鏈之體積較大，故而藉由使高甘露糖型糖鏈結合於胜肽，可使血中穩定性進一步提高。較佳為如哺乳類之高甘露糖型糖鏈般包含5~9個甘露糖之糖鏈，亦可為如酵母之高甘露糖型糖鏈般包含更多之甘露糖之糖鏈。作為可較佳地用於本發明之高甘露糖型糖鏈，例如可列舉：高甘露糖-5(M-5)、 高甘露糖-9(M-9)等。
於本發明中，作為較佳之糖鏈，例如可列舉：與於人體內以與蛋白質結合之糖蛋白之形式存在之糖鏈(例如，「FEBS LETTERS Vol.50,No.3,Feb.1975」中所記載之糖鏈)具有相同結構之糖鏈(所構成之糖之種類及其等之結合形式相同之糖鏈)、或自其非還原末端失去1個或複數個糖之糖鏈，該等糖鏈記載於以下。
於本發明之較佳之一態樣中，本發明之附加糖鏈之聚胜肽中的附加糖鏈之胺基酸中的糖鏈之結構可設為實質上相同，或亦可具有不同之糖鏈結構。將附加糖鏈之聚胜肽中的糖鏈之結構設為實質上相同時，例如較佳為90%以上相同、或99%以上相同，最佳為糖鏈之結構完全相同。再者，於本說明書中，所謂糖胜肽中之糖鏈之結構相同，係指於附加有2條以上之糖鏈的附加糖鏈之聚胜肽中，對該糖鏈彼此進行比較之情形時，構成糖鏈之糖之種類、結合順序、及結合形式於糖胜肽內相同。又，於本發明之較佳之一態樣中，較佳為本發明之附加糖鏈之聚胜肽之糖鏈均勻。於本說明書中，所謂附加糖鏈之聚胜肽中糖鏈均勻，係指於附加糖鏈之聚胜肽間對糖鏈進行比較之情形時，胜肽中之糖鏈附加部位、構成糖鏈之各糖之種類、結合順序、及糖間之結合形式於糖胜肽間相同，係指至少90%以上、較佳為95%以上、更佳為99%以上之糖鏈之結構均勻。尤其是包含糖胜肽間糖鏈均勻之糖胜肽的組合物等之品質固定，尤其於醫藥品之製造或檢定(assay)等領域中較佳。對於均勻之糖鏈之比例，例如可藉由使用HPLC(high performance liquid chromatography，高效液相層析法)、毛細管電泳(capillary electrophoresis)、NMR(nuclear magnetic resonance，核磁共振)、質譜分析等之方法而測定。
於本發明中，較佳之附加糖鏈之聚胜肽例如為後述之實施例1~66中製造的附加糖鏈之聚胜肽(序列編號5~37、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、110、 112、114、116、118、120、123~129、133~135、138~141、148、155、160)。即，於以下之SRIF28之胺基酸序列：Ser1-Ala2-Asn3-Ser4-Asn5-Pro6-Ala7-Met8-Ala9-Pro10-Arg11-Glu12-Arg13-Lys14-Ala15-Gly16-Cys17-Lys18-Asn19-Phe20-Phe21-Trp22-Lys23-Thr24-Phe25-Thr26-Ser27-Cys28(序列編號2)中：(a1)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例1)(序列編號5)；(a2)將5位之Asn置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例2)(序列編號6)；(a3)將9位之Ala置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例3)(序列編號7)；(a4)將12位之Glu置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例4)(序列編號8)；(a5)將13位之Arg置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例5)(序列編號9)；(a6)將14位之Lys置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例6)(序列編號10)；(a7)將15位之Ala置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例7)(序列編號11)；(a8)將16位之Gly置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例8)(序列編號12)；(a9)將18位之Lys置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例9)(序列編號13)； (a10)將19位之Asn置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例10)(序列編號14)；(a11)將21位之Phe置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例11)(序列編號15)；(a12)將26位之Thr置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例12)(序列編號16)；(a13)於28位之Cys之C末端側進而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例13)(序列編號17)；(a14)於28位之Cys之C末端側進而附加有附加Thr-二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例14)(序列編號18)；(a15)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且將22位之Trp置換為D體之Trp的附加糖鏈之聚胜肽(實施例15)(序列編號19)；(a16)將9位之Ala置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且將22位之Trp置換為D體之Trp的附加糖鏈之聚胜肽(實施例16)(序列編號20)；(a17)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且於N末端側進而附加有1個附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例20)(序列編號21)；(a18)將1位之Ser及5位之Asn置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例21)(序列編號22)；(a19)將1位之Ser及13位之Arg置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例22)(序列編號23)；(a20)將5位之Asn及9位之Ala置換為附加二唾液酸糖鏈之 Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例23)(序列編號24)；(a21)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且於N末端側進而附加有2個附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例24)(序列編號25)；(a22)將1位之Ser、5位之Asn、及9位之Ala置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例25)(序列編號26)；(a23)將1位之Ser置換為附加單唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例26)(序列編號27)；(a24)將1位之Ser置換為附加去唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例27)(序列編號28)；(a25)將1位之Ser置換為附加去唾液酸糖鏈之Cys，且於N末端側進而附加有1個附加去唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例28)(序列編號29)；(a26)將1位之Ser置換為附加去唾液酸糖鏈之Cys，且於N末端側進而附加有2個附加去唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例29)(序列編號30)；(a27)將5位之Asn置換為附加二唾液酸糖鏈之Asn的附加糖鏈之聚胜肽(實施例30)(序列編號31)；(a28)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Asn的附加糖鏈之聚胜肽(實施例31)(序列編號32)；(a29)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且將19位之Asn置換為附加GlcNAc之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例32)(序列編號33)； (a30)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且將19位之Asn置換為附加二甘露糖糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例33)(序列編號34)；(a31)於1位之Ser之N末端側進而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例34)(序列編號89)；(a32)將11位之Arg置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例35)(序列編號91)；(a33)將20位之Phe置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例36)(序列編號93)；(a34)將24位之Thr置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例37)(序列編號95)；(a35)將25位之Phe置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例38)(序列編號97)；(a36)將27位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例39)(序列編號99)；(a37)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且將25位之Phe被Tyr取代的附加糖鏈之聚胜肽(實施例41)(序列編號103)；(a38)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且C末端經醯胺化的附加糖鏈之聚胜肽(實施例42)(序列編號105)；(a39)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且該附加二唾液酸糖鏈之Cys經生物素化的附加糖鏈之聚胜肽(實施例44)(序列編號110)；(a40)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且該附 加二唾液酸糖鏈之Cys係經由PEG連結子且經生物素化的附加糖鏈之聚胜肽(實施例45)(序列編號112)；(a41)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且於該附加二唾液酸糖鏈之Cys之N末端導入有疊氮基的附加糖鏈之聚胜肽(實施例46)(序列編號114)；(a42)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且12位之Glu經附加二唾液酸糖鏈之Cys置換的附加糖鏈之聚胜肽(實施例47)(序列編號116)；(a43)將1位之Ser置換為附加二乙醯葡糖胺糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例50)(序列編號123)；(a44)將1位之Ser置換為附加二甘露糖糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例51)(序列編號124)；(a45)將19位之Asn置換為附加二甘露糖糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例52)(序列編號125)；(a46)將1位之Ser置換為附加N-乙醯葡糖胺之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例53)(序列編號126)；(a47)將19位之Asn置換為附加N-乙醯葡糖胺之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例54)(序列編號127)；(a48)將1位之Ser置換為附加三唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例55)(序列編號128)；(a49)將1位之Ser置換為附加四唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例56)(序列編號129)；(a50)將1位之Ser置換為具有經胺基乙基胺基修飾之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實 施例57)(序列編號133)；(a51)將1位之Ser置換為具有經胺基修飾之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例58)(序列編號134)；(a52)將1位之Ser置換為具有經苄基保護之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例59)(序列編號135)；(a53)將1位之Ser置換為具有經十六烷基胺基修飾之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例60)(序列編號138)；(a54)將1位之Ser置換為具有經胺基修飾之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys，且於N末端側進而附加有1個具有經胺基修飾之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例61)(序列編號139)；(a55)將1位之Ser置換為具有經苄基保護之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys，且於N末端側進而附加有1個具有經苄基保護之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例62)(序列編號140)；(a56)將1位之Ser置換為附加有附加二唾液酸糖鏈之Asn之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例63)(序列編號141)；(a57)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Asn，且將19位之Asn置換為附加二甘露糖之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例64)(序列編號148)；(a58)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Cys，且於N 末端側進而附加有具有經胺基乙基胺基修飾之二唾液酸糖鏈之附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例65)(序列編號155)；(a59)將1位之Ser置換為附加二唾液酸糖鏈之Asn，且於N末端側進而附加有3個附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例66)(序列編號160)。
又，於SRIF14之胺基酸序列：Ala15-Gly16-Cys17-Lys18-Asn19-Phe20-Phe21-Trp22-Lys23-Thr24-Phe25-Thr26-Ser27-Cys28(序列編號1)中：(a60)於15位之Ala之N末端側進而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例17)(序列編號35)；(a61)於15位之Ala之N末端側進而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys-Arg-Lys-的附加糖鏈之聚胜肽(實施例18)(序列編號36)；(a62)於15位之Ala之N末端側進而經由C12連結子而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例19)(序列編號37)；(a63)於15位之Ala之N末端側進而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys-Lys-的附加糖鏈之聚胜肽(實施例40)(序列編號101)；(a64)於15位之Ala之N末端側進而經由PEG連結子而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys的附加糖鏈之聚胜肽(實施例43)(序列編號107)；(a65)於15位之Ala之N末端側進而附加有附加二唾液酸糖 鏈之Cys-附加二唾液酸糖鏈之Cys-Arg-Lys-的附加糖鏈之聚胜肽(實施例48)(序列編號118)；(a66)於15位之Ala之N末端側進而附加有附加二唾液酸糖鏈之Cys-附加二唾液酸糖鏈之Cys-附加二唾液酸糖鏈之Cys-Arg-Lys-的附加糖鏈之聚胜肽(實施例49)(序列編號120)。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽可藉由在業者公知之胜肽合成方法中加入糖鏈附加步驟而製造。附加糖鏈時，亦可使用利用以轉麩胺醯胺酶(transglutaminase)為代表之酶之方法，但於此情形時，存在需要大量進行附加之糖鏈、最終步驟後之純化變得繁雜、糖鏈之附加位置及可附加之糖鏈受限制等問題，因此即便可用於檢定用途等之少量之合成，但對於醫藥品製造等大規模之製造而言，有時亦難謂為實用之方法。
作為本發明之附加糖鏈之聚胜肽的簡便之製造方法且糖鏈之結構均勻之附加糖鏈之聚胜肽的穩定之製造方法之具體例，以下例示如下方法：使用附加糖鏈之Asn作為附加糖鏈之胺基酸，應用固相合成、液相合成等公知之胜肽合成方法而製造附加糖鏈之聚胜肽的方法(A法)；及依據公知之胜肽合成方法製造體抑素之任意之胺基酸經Cys置換之胜肽，其後，藉由化學合成對Cys附加糖鏈，而製造附加糖鏈之聚胜肽的方法(B法)。以該等製造方法為參考，業者可製造各種附加糖鏈之聚胜肽，所獲得之附加糖鏈之聚胜肽及其製造方法尤其於醫藥品製造之領域中非常有 用。
又，該等A法及B法亦可組合2種以上而進行。若為用於檢定等之少量之合成，則亦可進而於上述之方法中組合利用轉移酶之糖鏈伸長反應。再者，A法記載於國際公開第2004/005330號說明書(US 2005222382(A1))，B法記載於國際公開第2005/010053號說明書(US 2007060543(A1))，其揭示內容係藉由參照而整體併入本說明書中。又，關於A法及B法中所使用之糖鏈結構均勻之糖鏈之製造，記載於國際公開第03/008431號說明書(US 2004181054(A1))、國際公開第2004/058984號說明書(US 2006228784(A1))、國際公開第2004/058824號說明書(US 2006009421(A1))、國際公開第2004/070046號說明書(US 2006205039(A1))、國際公開第2007/011055號說明書等中，其揭示內容係藉由參照而整體併入本說明書中。
製造附加糖鏈之聚胜肽之方法(A法)
附加糖鏈之聚胜肽例如可藉由概略過程示於以下的使用附加糖鏈之Asn之固相合成而製造。
(1)使胺基氮經脂溶性保護基保護之胺基酸的羧基與樹脂(resin)結合。於此情形時，由於胺基酸之胺基氮由脂溶性保護基保護，故而可防止胺基酸彼此之自縮合，使樹脂與胺基酸反應而結合。
(2)使所獲得之反應物之脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(3)使該游離胺基、與胺基氮經脂溶性保護基保護之任意之 胺基酸的羧基進行醯胺化反應。
(4)使上述脂溶性保護基脫離而形成游離胺基。
(5)重複進行上述(3)及(4)之步驟1次以上，藉此獲得任意數之任意胺基酸連結而成的末端結合有樹脂，其他端具有游離胺基的胜肽。
(6)最後，利用酸切斷樹脂，藉此可獲得具有所期望之胺基酸序列之胜肽。
此處，若於(1)中，使用胺基氮經脂溶性保護基保護的附加糖鏈之Asn代替胺基氮經脂溶性保護基保護之胺基酸，使該天冬醯胺酸部分之羧基與樹脂之羥基反應，則可獲得於C末端具有附加糖鏈之Asn之胜肽。
又，若於(2)之後、或者重複進行(3)與(4)1次以上之任意次數之後，於(3)中，使用胺基氮經脂溶性保護基保護之附加糖鏈之Asn代替胺基氮經脂溶性保護基保護之胺基酸，則可對任意之部位附加糖鏈。
又，若於(1)及(3)中之任一步驟中，2次以上代替胺基氮經脂溶性保護基保護之胺基酸而使用胺基氮經脂溶性保護基保護之附加糖鏈之Asn，則可獲得於任意之2個部位以上附加有糖鏈之胜肽。
若於使附加糖鏈之胺基酸結合之後，使脂溶性保護基脫離而形成游離胺基，其後立即進行步驟(6)，則可於獲得N末端具有附加糖鏈之Asn之胜肽。
作為樹脂(resin)，只要為通常於固相合成中所使用之樹脂(resin)即可，例如可使用以氯而官能化之2-氯三苯甲基 氯樹脂(Merck公司製造)、或以胺基而官能化之Amino-PEGA Resin(Merck公司製造)、具有羥基之NovaSyn TGT Alcohol Resin(Merck公司製造)、Wang Resin(Merck公司製造)、HMPA-PEGA Resin(Merck公司製造)等。又，亦可使Amino-PEGA Resin與胺基酸之間存在連結子，作為此種連結子，例如可列舉：4-羥基甲基苯氧基乙酸(HMPA)、4-(4-羥基甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁基乙酸(HMPB)等。亦可使用預先使C末端之胺基酸與樹脂結合之H-Cys(Trt)-Trityl NovaPEG樹脂(Merck公司製造)等。
又，於將C末端進行醯胺化之情形時，例如較佳為使用以胺基而官能化之Rink-Amide-PEGA Resin(Merck公司製造)。利用酸切斷該樹脂與胜肽，藉此可使胜肽之C末端胺基酸醯胺化。
關於樹脂與胺基氮經脂溶性保護基保護之胺基酸之結合，例如於使用具有羥基之樹脂或以氯而官能化之樹脂時，係使胺基酸之羧基與樹脂進行酯鍵結。又，於使用以胺基而官能化之樹脂之情形時，係使胺基酸之羧基藉由醯胺鍵而與樹脂鍵結。
再者，2-氯三苯甲基氯樹脂可防止於在固相合成中使胜肽鏈伸長時位於末端之Cys外消旋化，就此方面而言較佳。
作為胺基酸，可使用所有胺基酸，例如可列舉：作為天然胺基酸的絲胺酸(Ser)、天冬醯胺酸(Asn)、纈胺酸(Val)、白胺酸(Leu)、異白胺酸(Ile)、丙胺酸(Ala)、酪胺 酸(Tyr)、甘胺酸(Gly)、離胺酸(Lys)、精胺酸(Arg)、組胺酸(His)、天冬胺酸(Asp)、麩胺酸(Glu)、麩醯胺酸(Gln)、蘇胺酸(Thr)、磺丙胺酸(Cys)、甲硫胺酸(Met)、苯丙胺酸(Phe)、色胺酸(Trp)、脯胺酸(Pro)。
又，亦可使用上述天然胺基酸之D體。
作為脂溶性保護基，例如可列舉：9-茀基甲氧基羰基(Fmoc)、第三丁氧基羰基(Boc)、苄基、烯丙基、烯丙氧基羰基、乙醯基等碳酸酯系或醯胺系之保護基等。為將脂溶性保護基導入至胺基酸中，例如於導入Fmoc基之情形時，可藉由添加9-茀基甲基-N-丁二醯亞胺基碳酸酯與碳酸氫鈉進行反應而導入。反應可於0~50℃、較佳為室溫下進行約1~5小時左右。
作為經脂溶性保護基保護之胺基酸，亦可使用市售者。例如可列舉：Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Asn-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-AIa-OH、Fmoc-Tyr-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Arg-OH、Fmoc-His-OH、Fmoc-Asp-OH、Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gln-OH、Fmoc-Thr-OH、Fmoc-Cys-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Trp-OH、Fmoc-Pro-OH。
又，作為經脂溶性保護基保護且側鏈中導入有保護基的胺基酸，例如可列舉：Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Cys(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc- His(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH。
又，欲於附加糖鏈之聚胜肽之胺基酸序列中附加連結子之情形時，可藉由於固相合成之過程中，代替上述經脂溶性保護基保護之胺基酸而使用經脂溶性保護基保護之連結子，而於較佳之位置插入連結子。
於使用2-氯三苯甲基氯樹脂之情形時，可藉由使用二異丙基乙胺(DIPEA)、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等鹼而進行酯化。又，於使用具有羥基之樹脂之情形時，作為酯化觸媒，例如可使用1-均三甲苯磺醯基-3-硝基-1,2,4-三唑(MSNT)、二環己基碳二醯亞胺(DCC)、二異丙基碳二醯亞胺(DIC)等公知之脫水縮合劑。胺基酸與脫水縮合劑之使用比例係相對於前者1重量份，後者通常為1~10重量份，較佳為2~5重量份。
酯化反應例如較佳為藉由在固相管柱中添入樹脂，利用溶劑將該樹脂洗淨，其後添加胺基酸之溶液而進行。作為洗淨用溶劑，例如可列舉：二甲基甲醯胺(DMF)、2-丙醇、二氯甲烷等。作為溶解胺基酸之溶劑，例如可列舉：二甲基亞碸(DMSO)、DMF、二氯甲烷等。酯化反應可於0~50℃、較佳為室溫下進行約10分鐘~30小時左右、較佳為15分鐘~24小時左右。
此時，使用乙酸酐等使固相上之未反應之羥基乙醯化而進行封端亦較佳。
脂溶性保護基之脫離例如可藉由利用鹼進行處理而進行。作為鹼，例如可列舉：哌啶、啉等。此時，較佳為於溶劑之存在下進行。作為溶劑，例如可列舉：DMSO、DMF、甲醇等。
游離胺基與胺基氮經脂溶性保護基保護之任意之胺基酸之羧基的醯胺化反應較佳為於活化劑及溶劑之存在下進行。
作為活化劑，例如可列舉：二環己基碳二醯亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺鹽酸鹽(WSC/HCl)、疊氮基磷酸二苯酯(DPPA)、羰基二咪唑(CDI)、氰基膦酸二乙酯(DEPC)、苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基鏻(DIPCI)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三吡咯烷基鏻(PyBOP)、1-羥基苯并三唑(HOBt)、羥基琥珀醯亞胺(HOSu)、二甲基胺基吡啶(DMAP)、1-羥基-7-疊氮苯并三唑(HOAt)、羥基鄰苯二甲醯亞胺(HOPht)、五氟苯酚(Pfp-OH)、2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)、1-[雙(二甲基胺基)亞甲基]-5-氯-1H-苯并三唑鎓3-氧化物六氟磷酸鹽(HCTU)、O-(7-疊氮苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲六氟膦酸鹽(HATU)、O-苯并三唑-1-基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸鹽(TBTU)、3,4-二氫-3-羥基-4-氧代-1,2,3-苯并三(Dhbt)等。
活化劑之使用量較佳為相對於胺基氮經脂溶性之保護基保護之任意之胺基酸，設為1~20當量，較佳為設為1~10當量，進而較佳為設為1~5當量。
作為溶劑，例如可列舉：DMSO、DMF、二氯甲烷等。反應可於0~50℃、較佳為室溫下進行約10~30小時左右、較佳為15分鐘~24小時左右。脂溶性保護基之脫離可以與上述相同之方式進行。
要自樹脂(resin)切斷胜肽鏈，較佳為利用酸進行處理。作為酸，例如可列舉：三氟乙酸(TFA)、氟化氫(HF)等。
如此，可獲得將所期望之位置以附加糖鏈之Asn置換的附加糖鏈之聚胜肽。又，使如此般經純化之附加糖鏈之聚胜肽，如後文中所述般形成經脫保護之Cys彼此間之雙硫鍵。
再者，於本發明之一實施態樣中，於固相合成所使用之附加糖鏈之Asn中的糖鏈上之非還原末端包含唾液酸之情形時，為防止因酸處理而將唾液酸切斷，較佳為將該唾液酸之羧基藉由保護基進行保護。作為保護基，例如可列舉：苄基、烯丙基、二苯基甲基等。保護基之導入及保護基之脫離之方法可藉由公知之方法而進行。又，保護基之脫離較佳為於將藉由固相合成所製造的附加糖鏈之聚胜肽自樹脂切斷之後進行。自樹脂切斷之後，藉由於附加糖鏈之聚胜肽中形成雙硫鍵而使附加糖鏈之聚胜肽環化之情形時，保護基之脫離可於雙硫鍵形成步驟之前進行，亦可於雙硫鍵形成步驟之後進行。
製造附加糖鏈之聚胜肽之方法(B法)
附加糖鏈之聚胜肽亦可藉由下述方法而製造：首先合成胜肽鏈，其後對所合成之胜肽鏈附加糖鏈。具體而言，藉 由固相合成法、液相合成法、利用細胞進行合成之方法、對天然存在者進行分離萃取之方法等，製造於欲附加糖鏈之位置含有Cys之胜肽。此處，對於形成雙硫鍵之位於預定位置之Cys等不附加糖鏈之Cys利用例如乙醯胺甲基(Acm)加以保護。又，將不附加糖鏈且亦不用於形成雙硫鍵之Cys導入至附加糖鏈之聚胜肽中之情形時，可在糖鏈附加步驟及雙硫鍵形成步驟期間，藉由保護基對Cys進行保護，其後進行脫保護而導入Cys。作為此種保護基，例如可列舉：第三丁基(tBu)或4-甲氧基苄基。
又，於對附加糖鏈之聚胜肽中之Cys附加不同之糖鏈之情形時，可使首先導入糖鏈之Cys無保護，將其次導入不同糖鏈之Cys以StBu等加以保護，藉此導入不同之糖鏈。具體而言，可於藉由固相合成等合成胜肽時，使第一欲導入糖鏈之Cys無保護，且使用Fmoc-Cys(StBu)-OH等使第二欲導入糖鏈之Cys成為具有保護基之Cys。其後，於保持StBu等保護基之狀態下，對無保護之Cys導入糖鏈。繼而，將StBu基等脫保護，對藉此成為無保護之Cys導入不同之糖鏈。再者，第一欲導入糖鏈之Cys及第二欲導入糖鏈之Cys可設為1個或複數個。
再者，關於StBu基之脫保護，可藉由使用三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、二硫蘇糖醇(DTT)、三丁基膦等還原劑進行反應而脫保護。上述反應可於通常0~80℃、較佳為5~60℃、進而較佳為10~35℃下進行。反應時間通常較佳為30分鐘~5小時左右。反應結束後，可適當地利用公知之 方法(例如，高效液相層析法(HPLC)進行純化。
導入不同之糖鏈時，較佳為自對於Cys之脫保護步驟中之還原條件或HPLC等指純化步驟中之酸性條件更穩定之糖鏈開始導入。尤其是於導入含有唾液酸之糖鏈時，較佳為首先自不含唾液酸之糖鏈或唾液酸殘基數較少之糖鏈開始導入。
又，欲於附加糖鏈之聚胜肽之胺基酸序列中附加連結子之情形時，例如可於固相合成之過程中，代替經脂溶性保護基保護之胺基酸而使用經脂溶性保護基保護之連結子，藉此於所合成之聚胜肽的較佳之位置插入連結子。
其次，藉由使鹵乙醯化複合型糖鏈衍生物與上述所獲得之含有無保護之Cys的胜肽反應，而使糖鏈與無保護之Cys之硫醇基反應而結合於胜肽。上述反應可於磷酸緩衝液、Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane，三羥甲基胺基甲烷)-鹽酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、或該等之混合溶液中，於通常0~80℃、較佳為10~60℃、進而較佳為15~35℃下進行。反應時間通常為10分鐘~24小時，較佳通常30分鐘~5小時左右。反應結束後，可適當地利用公知之方法(例如，HPLC)進行純化。
鹵乙醯化複合型糖鏈衍生物例如為將複合型天冬醯胺酸結合型糖鏈之1位之碳上鍵結之羥基以-NH-(CH2)a-(CO)-CH2X(X為鹵素原子，a為整數，只要不阻礙目標之連結子功能則並無限定，較佳為表示0~4之整數)置換而成之化合物。
具體而言，使鹵乙醯化複合型糖鏈衍生物與含有Cys之胜肽於磷酸緩衝液中、室溫下進行反應。反應結束後，利用HPLC進行純化，藉此可獲得經附加糖鏈之Cys置換的附加糖鏈之聚胜肽。
又，亦可於DMSO、DMF、甲醇、乙腈之類的有機溶劑與上述緩衝液之混合溶液中進行反應。此時，關於有機溶劑之比率，可以0~99%(v/v)之範圍添加至上述緩衝液中。於緩衝液中之溶解性較低的含有無保護之Cys之胜肽藉由添加此種有機溶劑，可提高於反應溶液中之溶解性，故而較佳。
又，亦可於DMSO、DMF、甲醇、乙腈之類的有機溶劑或其等之混合溶液中進行反應。此時，較佳為於鹼之存在下進行。作為鹼，例如可列舉：DIPEA、三乙胺、吡啶、2,4,6-三甲基吡啶等。
又，亦可於將胍鹽酸鹽或尿素添加至緩衝溶液而成之混合溶液中進行反應。再者，胍鹽酸鹽或尿素可以最終濃度成為1 M~8 M之方式添加至上述緩衝液中。藉由添加胍鹽酸鹽或尿素，亦可提高於緩衝液中之溶解性較低的胜肽之溶解性，故而較佳。
進而，為防止含有無保護之Cys之胜肽形成經由雙硫鍵之二聚物，亦可將三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)或二硫蘇糖醇(DTT)添加至緩衝液中進行反應。TCEP或DTT可以最終濃度成為10 μM~10 mM之方式添加至緩衝液中。
又，使糖鏈與目標之Cys結合之後，對經Acm等保護之 Cys的保護基進行脫保護。於保護基為Acm基之情形時，可藉由在水、甲醇、乙酸、或該等之混合溶液中使用碘、乙酸汞(II)、硝酸銀(I)、或乙酸銀(I)等進行反應而脫保護。
上述反應可於通常0~80℃、較佳為5~60℃、進而較佳為10~35℃下進行。反應時間通常較佳為5分鐘~24小時左右。反應結束後，可藉由DTT或鹽酸等進行處理，然後適當地利用公知之方法(例如，HPLC)進行純化。
如此，可獲得將所期望之位置以附加糖鏈之Cys置換的附加糖鏈之聚胜肽。又，使如此般經純化之附加糖鏈之聚胜肽，如後文中所述般形成經脫保護之Cys彼此間之雙硫鍵。
又，藉由上述A法及B法製作的附加糖鏈之聚胜肽可利用使用空氣及/或氧氣、碘、DMSO、經氧化及還原之麩胱苷肽之混合物、鐵氰酸鉀、愛耳門氏試劑(Ellman's Reagent)(5,5'-二硫代雙(2-硝基苯甲酸))、三氟乙酸鉈(III)、以及烷基三氯矽烷亞碸等的業者眾所周知之方法而形成Cys彼此之雙硫鍵。
再者，於形成Cys-Cys間之雙硫鍵時，對於不希望進行雙硫鍵結合的附加糖鏈之聚胜肽中之Cys藉由保護基加以保護。作為此種保護基，可使用Acm、tBu、4-甲氧基苄基、4-甲基苄基等於氧化條件下穩定之保護基。
又，於B法中，雙硫鍵之形成亦可於導入糖鏈之前進行。但是，於對欲進行雙硫鍵結合之Cys導入有保護基之 情形時，脫保護步驟先於雙硫鍵形成步驟。
(活性)
本發明之附加糖鏈之聚胜肽對體抑素受體具有親和性。於本說明書中，所謂「對體抑素受體具有親和性」，係表示對體抑素受體SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、及SSTR5中之至少一者具有親和性。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽較佳為對2種以上之體抑素受體具有親和性，更佳為對3種以上之受體具有親和性，進而較佳為對4種以上之受體具有親和性，最佳為與天然之體抑素(SRIF28及SRIF14)同樣地對SSTR1~SSTR5之5種受體全部具有親和性。尤佳為對至少SSTR1及SSTR4中之任一者具有親和性，且對其他SSTR具有親和性。
如此，藉由本發明之附加糖鏈之聚胜肽對體抑素受體具有親和性，而對體抑素受體具有體抑素活性(促效劑活性)及拮抗劑活性。
例如，對各體抑素受體之親和性可使用如實施例67-1及67-2所示的體外(in vitro)之競爭性結合實驗等進行測定。
利用競爭性結合實驗之親和性之測定可使標記配體與試驗物質競爭性地與受體結合，求出由試驗物質投予引起之標記配體之游離，藉此測定試驗物質之親和性(例如，50%抑制濃度：IC50值或結合抑制常數：Ki值)。
例如，體抑素活性(促效劑活性)可藉由如實施例67-3及67-4所示的使用體抑素受體表現細胞之體外之cAMP(cyclic adenosine monophosphate，環腺苷酸)產生抑制試驗進行評 價。
cAMP產生抑制試驗可藉由對體抑素受體表現細胞處置附加糖鏈之聚胜肽或者作為對照化合物之SRIF14或SRIF28，培養一定時間後，測定細胞內積累之cAMP量，與對照化合物進行比較而進行評價。cAMP量之測定可藉由酶免疫測定法(EIA，enzyme immunoassay)等公知之方法測定。
例如，體抑素活性(促效劑活性)可藉由如實施例86及實施例87所示之體內(in vivo)之GH產生抑制試驗進行評價。
GH產生抑制試驗例如可以如下所述之方式實施。對未禁食狀態下之大鼠皮下投予附加糖鏈之聚胜肽。對大鼠於全身麻醉下投予GH游離促進劑，其後以5分鐘左右進行採血。以所採集之血液作為血漿樣品，藉由酶免疫測定法(EIA)等公知之方法測定GH濃度。又，自投予有不含附加糖鏈之聚胜肽的生理鹽水之大鼠獲得血漿樣品作為對照，對所測定之GH濃度進行比較，藉此可對體抑素活性進行評價。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽即便因於其結構上附加糖鏈而導致對各受體之親和性一定程度地衰減，但由於血中半衰期延長，因此亦可維持與未附加糖鏈之天然存在之體抑素(以下，有時稱為「未附加糖鏈之體抑素」)同等之體抑素活性，於較佳情況下可具有增大之體抑素活性。若考慮該血中半衰期之延長，則例如於藉由實施例67-1及67-2中記載之方法進行測定之情形時，本發明之附加糖鏈之聚胜 肽對各受體之Ki值與不具有糖鏈之SRIF14之Ki值的比較佳為1000：1~0.3：1之範圍內，更佳為100：1~0.3：1之範圍內，進而較佳為10：1~0.3：1之範圍內。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽的血中穩定性較佳為與天然存在之體抑素(未附加糖鏈之體抑素)同等或其以上。血中穩定性可使用業者所公知之方法進行測定，例如可以血漿中之穩定性或血中半衰期、AUC(藥物血漿中濃度-時間曲線下面積)等為指標進行判斷。又，腎臟清除率或肝臟清除率之減小亦有助於血中穩定性之增大。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽與不具有糖鏈之SRIF28相比，血中半衰期增大，例如於藉由實施例68所示之實驗方法測定之情形時，其半衰期與SRIF28相比增大4倍以上、較佳為10倍以上、更佳為20倍以上、進而較佳為30倍以上。
又，本發明之附加糖鏈之聚胜肽例如於藉由實施例85所示之實驗方法進行測定之情形時，與SRIF28相比具有較佳為4倍以上、更佳為10倍以上、進而較佳為20倍以上之血中穩定性。
(醫藥組合物)
其次，對含有本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分之醫藥組合物進行說明。
含有本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分之醫藥組合物對與體抑素相關之疾病之治療或預防有效。如上所述般，體抑素已知具有各種作用，與該等作用相關之疾病亦 多種多樣。例如，與體抑素相關之疾病中，例如包含肢端肥大症、巨人症、阿茲海默氏症及其他形態之癡呆症、癌、激素產生性腫瘤、內分泌腫瘤(例如，類癌、VIP瘤、胰島瘤、升糖素瘤)、庫欣氏病、激素分泌異常、糖尿病及其併發症、疼痛、關節炎、腹瀉、胃潰瘍、炎症性腸病、急躁性腸症候群、消化道阻塞、腸塞、術後再狹窄、放射線損傷、眼疾(例如，乾眼病、青光眼、角膜實質炎、虹膜炎、白內障、結膜炎)等。含有本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分之醫藥組合物對上述疾病尤其是肢端肥大症、癡呆症、癌、激素產生性腫瘤、內分泌腫瘤、庫欣氏病、激素分泌異常、糖尿病併發症、腹瀉、消化道阻塞、腸塞、放射線損傷、眼疾、以及各種腫瘤或腸相關疾病、伴隨激素產生過剩之消化系統症狀之治療或預防有效。
上述醫藥組合物係使用通常所用之填充劑、增量劑、結合劑、賦濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑等稀釋劑或賦形劑，製成通常之醫藥組合物之形態之製劑。
作為此種醫藥組合物，例如可列舉：片劑、丸劑、散劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑、膠囊劑、栓劑、吸入劑、滴眼劑、注射劑等。
醫藥組合物中所含的本發明之附加糖鏈之聚胜肽之量並無特別限定，可自較廣之範圍內適當選擇，通常較佳為醫藥組合物中含有本發明之附加糖鏈之聚胜肽1~70重量%。
含有本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分之醫藥組 合物可進而含有其他有效成分，亦可與含有其他有效成分之醫藥組合物組合使用。又，含有本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分之醫藥組合物可以藥學上可容許之鹽之形式含有附加糖鏈之聚胜肽，亦可進而含有不同之1種以上的本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分。又，亦可與含有不同之1種以上的本發明之附加糖鏈之聚胜肽作為有效成分之醫藥組合物組合使用。又，作為醫藥組合物中可含有之其他成分，可列舉業者眾所周知之藥學上可容許之載體等。
又，作為使用本發明之附加糖鏈之聚胜肽之治療，例如可包含放射線治療，又，於用以遍及全身地測定表現SSTR1~SSTR5中任一者之細胞及組織之分佈的閃爍圖術(scintigraphy)中亦有用。利用放射性掃描或磁共振之體外圖像化的使用可使體內之半定量檢測成為可能。
經放射性標記之附加糖鏈之聚胜肽例如可用於對人體內，於健康狀態下不含實質之量之SSTR1~SSTR5的組織內表現SSTR1~SSTR5中任一者的惡性腫瘤進行治療性處置。又，可將經標記之附加糖鏈之聚胜肽製成含有對於用於閃爍圖術或用於抑制腫瘤有效之量之組合物而投予。此種標記之示例有碘(123I、125I、131I)、銦(111In)、碳(11C)、氟(18F)、鎝(99mTc)、釔(90Y)等不同之同位素或螢光標記。標記可藉由業者眾所周知之方法實施，可含於附加糖鏈之聚胜肽中，或直接與附加糖鏈之聚胜肽結合，或者與適當之化合物結合且將其結合於附加糖鏈之聚胜肽。例如，酪 胺酸之碘化中可藉由使用氯胺-T之方法等而進行標記。
作為本發明之醫藥組合物之投予方法，並無特別限制，可利用與各種製劑形態、患者之年齡、性別、疾病之狀態、其他條件對應之方法進行投予。作為片劑、丸劑、液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑及膠囊劑之情形之投予方法，例如可列舉經口投予。又，於注射劑之情形時，可單獨或與葡萄糖、胺基酸等通常之輔液混合後投予至靜脈內、肌肉內、皮內、皮下或腹腔內。於栓劑之情形時，投予至直腸內。於滴眼劑之情形時，應用於結膜囊等眼組織。於吸入劑之情形時，應用於支氣管或肺。
上述醫藥組合物之投予量只要根據用法、患者之年齡、性別、疾病之程度、其他條件適當選擇即可，例如，可設定為相對於體重1 kg，本發明之附加糖鏈之聚胜肽成為0.1~900 nmol、較佳為1~100 nmol、更佳為1~10 nmol之投予量。
上述醫藥組合物之投予次數只要根據用法、患者之年齡、性別、疾病之程度、其他條件適當選擇即可，例如3次/1天、2次/1天、1次/1天，進而根據其血中穩定性，亦可選擇頻度更少之投予次數(例如，1次/週、1次/月等)。較佳為上述醫藥組合物之投予次數為1次以下/1天。
本發明之附加糖鏈之聚胜肽中所附加之糖鏈可於體內之代謝系統中容易地分解。又，於本發明之一態樣中，該糖鏈具有於活體內以糖胜肽(或糖蛋白)之形式結合而存在之結構。因此，本發明之附加糖鏈之聚胜肽及含有該胜肽作 為有效成分之醫藥組合物即便投予至活體內，亦不會表現副作用或抗原性，因過敏反應或產生抗體而無法獲得藥效之擔憂較少等優點。
進而，本發明之附加糖鏈之聚胜肽就可穩定且簡便地大量供給，就提供品質穩定之高品質醫藥品之觀點而言亦非常有用。
又，本發明亦提供一種與體抑素相關之疾病之治療或預防方法，其特徵在於：投予有效量之本發明之附加糖鏈之聚胜肽。
再者，本說明書中所用之用語係用以說明特定之實施態樣而使用，並非意欲限定發明。
又，本說明書中所使用之「含」之用語，除根據文中前後邏輯明顯應作不同理解之情形以外，均意指所記述之事項(構件、步驟、要素、數字等)存在，並不排除其以外之事項(構件、步驟、要素、數字等)之存在。
只要無不同之定義，則本文中所使用之全部用語(包含技術用語及科學用語)具有與本發明所屬之技術之業者所廣泛理解的用語相同之含義。本文中所使用之用語只要未明示出不同之定義，則應解釋為具有與本說明書及相關技術領域中之含義同等之含義者，不應理想化或以過度形式化之含義加以解釋。
本發明之實施態樣有一面參照模式圖一面進行說明之情形，但於模式圖之情形時，存在為使說明較為明確而誇張地表達之情況。
請理解第一、第二等用語係用以表達多種要素，但該等要素不應受該等用語之限定。該等用語僅係用於將一個要素與其他要素進行區別，例如於不脫離本發明之範圍之情況下，可將第一要素記為第二要素，同樣地，可將第二要素記為第一要素。
以下，參照實施例更詳細地說明本發明。然而，本發明可藉由各種態樣而具體表現，不可解釋為限定於本文中所記載之實施例者。
[實施例]
再者，以下對本說明書中之附加糖鏈之聚胜肽之記載方法進行說明。
例如，記作S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28之情形時，表示SRIF28之聚胜肽之1位之Ser(S1)與5位之Asn兩者均由附加二唾液酸糖鏈之Cys(C(disialo))置換。
又，記作S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28之情形時，表示SRIF28之聚胜肽之1位之Ser(S1)由附加二唾液酸糖鏈之Cys(C(disialo))置換，進而，22位之Trp由D-Trp置換。
又，記作C(disialo)-R-K-SRIF14之情形時，表示於SRIF14之N末端側附加有附加糖鏈之Cys-Arg-Lys-。
又，記作29C(disialo)-SRIF28或30C(disialo)-SRIF28之情形時，表示於SRIF28之C末端即28位之Cys上進而附加有1個附加二唾液酸糖鏈之Cys者(29C(disialo)-SRIF28)、或於SRIF28之C末端即28位之Cys上進而附加有-W-附加二唾液酸糖鏈之Cys(W表示結合於28位之Cys的任意胺基酸) 者(30C(disialo)-SRIF28)。
又，記作S1-2C(disialo)-SRIF28之情形時，表示將存在於SRIF28之聚胜肽之N末端的1位之Ser置換為連續之2個附加二唾液酸糖鏈之Cys。
再者，「disialo」係表示二唾液酸糖鏈，「monosialo」係表示單唾液酸糖鏈，「asialo」係表示去唾液酸糖鏈，「diGlcNAc」係表示二乙醯葡糖胺糖鏈，「GlcNAc」係表示N-乙醯葡糖胺，「diMan」係表示二甘露糖糖鏈，「trisialo」係表示三唾液酸糖鏈，「tetrasialo」係表示四唾液酸糖鏈。又，記作(disialo(aminoethylamide))之情形時，表示二唾液酸糖鏈之唾液酸之羧基經胺基乙基胺基保護。代替「aminoethylamide」而記作「Bn」、「amide」、「hexadecylamide」者係分別表示糖鏈上之唾液酸之羧基經苄基、胺基、十六烷基胺基修飾。
實施例1 S1C(disialo)-SRIF28之合成 1-1硫醇之糖鏈修飾反應
將下述式(1)所表示之胜肽1(序列編號38)(APC公司製造)(60.6 mg，18.3 μmol)與下述式(a)所表示之化合物a(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)(85.8 mg，36.6 μmol，相對於胜肽1為2.0當量)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，5.5 mL)中，於室溫下反應30分鐘。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1%乙酸(AcOH)水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(2)所表示之糖胜肽2(序列編號39)(60.5 mg，10.9 μmol，產率59%)。
ESI-MS：(m/z)C229H358N50O102S4之計算值：[M+3H]3+ 1858.3、[M+4H]4+ 1394.0、[M+5H]5+ 1115.4，實測值1858.1、1393.8、1115.2。
1-2 Acm基之脫保護
於利用上述1-1中記載之方法獲得之糖胜肽2(51.2 mg，9.19 μmol)中添加乙酸銀(I)(18.8 mg，113 μmol)之水溶液 (3.7 mL)，於室溫下反應40分鐘。添加溶解於200 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為7.4，3.7 mL)之DTT(43.6 mg，282 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(0.92 mL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(3)所表示之糖胜肽3(序列編號40)(29.2 mg，5.38 μmol，產率58%)。
ESI-MS：(m/z)C223H348N48O100S4之計算值：[M+3H]3+ 1810.9、[M+4H]4+ 1358.4、[M+5H]5+ 1086.9、[M+6H]6+ 906.0，實測值1810.7、1358.3、1086.6、905.7。
1-3雙硫鍵之形成
將利用上述1-2中記載之方法獲得之糖胜肽3(29.2 mg，5.38 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，10.8 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=77：23→64：36，17分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶 液進行純化，而獲得包含下述式(4)所表示之化合物(S1C(disialo)-SRIF28)(序列編號5)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1C(disialo)-SRIF28(17.2 mg，3.17 μmol，產率59%)。
ESI-MS：(m/z)C223H346N48O100S4之計算值：[M+3H]3+ 1810.2、[M+4H]4+ 1357.9、[M+5H]5+ 1086.5，實測值1810.0、1357.5、1086.4。
實施例2 N5C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(5)所表示之化合物(胜肽5)(序列編號41)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(6)所表示之化合物(N5C(disialo)-SRIF28)(序列編號6)。
[化23]
實施例3 A9C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(7)所表示之化合物(胜肽7)(序列編號42)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(8)所表示之化合物(A9C(disialo)-SRIF28)(序列編號7)。
實施例4 E12C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(9)所表示之化合物(胜肽9)(序列編號43)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(10)所表示之化合物(E12C(disialo)-SRIF28)(序列編號8)。
[化27]
實施例5 R13C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(11)所表示之化合物(胜肽11)(序列編號44)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(12)所表示之化合物(R13C(disialo)-SRIF28)(序列編號9)。
實施例6 K14C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(13)所表示之化合物(胜肽13)(序列編號45)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(14)所表示之化合物(K14C(disialo)-SRIF28)(序列編號10)。
實施例7 A15C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(15)所表示之化合物(胜肽15)(序列編號46)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(16)所表示之化合物(A15C(disialo)-SRIF28)(序列編號11)。
實施例8 G16C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(17)所表示之化合物(胜肽17)(序列編號47)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(18)所表示之化合物(G16C(disialo)-SRIF28)(序列編號12)。
[化34]
實施例9 K18C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(19)所表示之化合物(胜肽19)(序列編號48)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(20)所表示之化合物(K18C(disialo)-SRIF28)(序列編號13)。
實施例10 N19C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(21)所表示之化合物(胜肽21)(序列編號49)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(22)所表示之化合物(N19C(disialo)-SRIF28)(序列編號 14)。
實施例11 F21C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(23)所表示之化合物(胜肽23)(序列編號50)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(24)所表示之化合物(F21C(disialo)-SRIF28)(序列編號15)。
實施例12 T26C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(25)所表示之化合物(胜肽25)(序列編號51)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(26)所表示之化合物(T26C(disialo)-SRIF28)(序列編號16)。
實施例13 29C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(27)所表示之化合物(胜肽27)(序列編號52)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(28)所表示之化合物(29C(disialo)-SRIF28)(序列編號17)。
實施例14 30C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(29)所表示之化合物(胜肽29)(序列編號53)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(30)所表示之化合物(30C(disialo)-SRIF28)(序列編號18)。
實施例15 S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28之合成
使用下述式(31)所表示之化合物(胜肽31)(序列編號54)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(32)所表示之化合物(S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28)(序列編號19)。
實施例16 A9C(disialo)-D-Trp22-SRIF28之合成
使用下述式(33)所表示之化合物(胜肽33)(序列編號55)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(34)所表示之化合物(A9C(disialo)-D-Trp22-SRIF28)(序列編號20)。
實施例17 C(disialo)-SRIF14之合成
使用下述式(35)所表示之化合物(胜肽35)(序列編號56)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(36)所表示之化合物(C(disialo)-SRIF14)(序列編號35)。
實施例18 C(disialo)-R-K-SRIF14之合成
使用下述式(37)所表示之化合物(胜肽37)(序列編號57)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(38)所表示之化合物(C(disialo)-R-K-SRIF14)(序列編號36)。
實施例19 C(disialo)-C12linker-SRIF14之合成 19-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法合成下述式(39)所表示的處於結合於樹脂之狀態的經保護之胜肽39(序列編號58)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，使用HCTU作為縮合劑，使Fmoc-12-胺基十二烷酸及Fmoc-Cys(Trt)-OH依序縮合。縮合後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。藉此，使胺基酸側鏈之保護基(Acm基以外)脫離，並且將胜肽與樹脂切斷。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=60：40→36.2：63.8，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽之一部分進行純化，而獲得下述式(40)所表示之化合物(胜肽40)(序列編號59)(11.2 mg)。
ESI-MS：(m/z)C97H144N22O23S3之計算值：[M+2H]2+ 1042.3、[M+3H]3+ 695.2，實測值1042.0、695.0。
19-2硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述19-1中記載之方法獲得之胜肽40(6.8 mg，3.3 μmol)與上述式(a)所表示之化合物a(19.1 mg，8.15 μmol)溶解於包含7 M胍鹽酸鹽與330 μM TCEP之0.2 M磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.96 mL)中，於室溫下反應2小時。利用HPLC確認原料消失之後，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→50：50，25分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(41)所表示之化合物(糖胜肽41)(序列編號60)(7.1 mg，1.6 μmol，產率50%)。
ESI-MS：(m/z)C183H283N29O85S3之計算值：[M+3H]3+ 1449.5、[M+4H]4+ 1087.4、[M+5H]5+ 870.1，實測值1449.3、1087.2、870.0。
19-3 Acm基之脫保護
於利用上述19-2中記載之方法獲得之糖胜肽41(10.3 mg，2.37 μmol)中添加乙酸銀(I)(9.7 mg，58 μmol)之水溶液(0.95 mL)，於室溫下反應30分鐘。添加溶解於100 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.95 mL)之DTT(22.3 mg，145 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(0.95 mL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→50：50，25分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式42所表示之糖胜肽42(序列編號61)(5.8 mg，1.4 μmol，產率59%)。
ESI-MS：(m/z)C177H273N27O83S3之計算值：[M+3H]3+ 1402.1、[M+4H]4+ 1051.8、[M+5H]5+ 841.7，實測值1401.9、1051.7、841.5。
19-4雙硫鍵之形成
將利用上述19-3中記載之方法獲得之糖胜肽42(5.8 mg，1.4 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，3.5 mL)中，於室溫下反應30小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=70：30→50：50，25分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得包含下述式43所表示之化合物(C(disialo)-C12linker-SRIF14)(序列編號37)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→50：50，25分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得C(disialo)-C12linker-SRIF14(3.6 mg，0.86 μmol，產率61%)。
ESI-MS：(m/z)C177H271N27O83S3之計算值：[M+3H]3+ 1401.5、[M+4H]4+ 1051.3、[M+5H]5+ 841.3，實測值1401.2、1051.2、841.1。
實施例20 S1-2C(disialo)-SRIF28之合成 20-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法將經保護之胜肽合成於樹脂上。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=72：28→68.5：31.5，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽之一部分進行純化，而獲得下述式(44)所表示之胜肽44(序列編號62)(30.7 mg)。
ESI-MS：(m/z)C146H224N44O41S5之計算值：[M+3H]3+ 1138.3、[M+4H]4+ 854.0、[M+5H]5+ 683.4，實測值1138.2、853.9、683.1。
20-2硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述20-1中記載之方法獲得之胜肽44(45.8 mg，13.4 μmol)與上述式(a)所表示之化合物a(125.8 mg，53.7 μmol，相對於胜肽44為4.0當量)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，4.0 mL)中，於室溫下反應30分鐘。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A： 0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=83：17→72：28，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式45所表示之糖胜肽45(序列編號63)(44.5 mg，5.61 μmol，產率42%)。
ESI-MS：(m/z)C318H502N58O165S5之計算值：[M+5H]5+ 1588.6、[M+6H]6+ 1324.0、[M+7H]7+ 1135.0、[M+8H]8+ 993.3、[M+9H]9+ 883.0，實測值1588.6、1324.0、1135.0、993.2、883.0。
20-3 Acm基之脫保護
於利用上述20-2中記載之方法獲得之糖胜肽45(44.5 mg，5.61 μmol)中添加乙酸銀(I)(14.8 mg，88.7 μmol)之水溶液(2.2 mL)，於室溫下反應30分鐘。添加溶解於200 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，2.2 mL)之DTT(33.2 mg，215 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(561 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=83：17→72：28，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(46)所表示之糖胜肽46(序 列編號64)(34.4 mg，4.41 μmol，產率79%)。
ESI-MS：(m/z)C312H492N56O163S5之計算值：[M+4H]4+ 1950.0、[M+5H]5+ 1560.2、[M+6H]6+ 1300.3，實測值1949.8、1560.1、1300.2。
20-4雙硫鍵之形成
將利用上述20-3中記載之方法獲得之糖胜肽46(34.4 mg，4.41 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，8.8 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=77：23→65：35，16分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得包含下述式(47)所表示之化合物(S1-2C(disialo)-SRIF28)(序列編號21)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG- 120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=83：17→72：28，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1-2C(disialo)-SRIF28(20.1 mg，2.58 μmol，產率58%)。
ESI-MS：(m/z)C312H490N56O163S5之計算值：[M+4H]4+ 1949.5、[M+5H]5+ 1559.8、[M+6H]6+ 1300.0，實測值1949.4、1559.7、1299.9。
實施例21 S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(48)所表示之化合物(胜肽48)(序列編號65)代替胜肽44，除此以外，以與實施例20相同之方式合成下述式(49)所表示之化合物(S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28)(序列編號22)。
實施例22 S1C(disialo)．R13C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(50)所表示之化合物(胜肽50)(序列編號66)代替胜肽44，除此以外，以與實施例20相同之方式合成下述 式(51)所表示之化合物(S1C(disialo)．R13C(disialo)-SRIF28)(序列編號23)。
實施例23 N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(52)所表示之化合物(胜肽52)(序列編號67)代替胜肽44，除此以外，以與實施例20相同之方式合成下述式(53)所表示之化合物(N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28)(序列編號24)。
實施例24 S1-3C(disialo)-SRIF28之合成 24-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL、600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法將經保護之胜肽合成於樹脂上。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，50×250 mm，流速：43.7 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=73：27→65：35，14分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽之一部分進行純化，而獲得下述式(54)所表示之胜肽54(序列編號68)(41.7 mg)。
ESI-MS：(m/z)C149H229N45O42S6之計算值：[M+3H]3+ 1172.7、[M+4H]4+ 879.8、[M+5H]5+ 704.0，實測值1172.5、879.4、703.9。
24-2硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述24-1中記載之方法獲得之胜肽54(10.7 mg，3.04 μmol)與上述式(a)所表示之化合物a(36.6 mg，15.6 μmol，相對於胜肽54為5.2當量)溶解於包含10 μM TCEP之33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.91 mL)中，於室溫下反應100分鐘。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→70：30，5分鐘，繼而A：B=70：30→65：35，12分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(55)所表示之糖胜肽55(序列編號69)(11.7 mg，1.14 μmol，產率38%)。
ESI-MS：(m/z)C407H646N66O228S6之計算值：[M+5H]5+ 2061.8、[M+6H]6+ 1718.4、[M+7H]7+ 1473.0、[M+8H]8+ 1289.0、[M+9H]9+ 1145.9、[M+10H]10+ 1031.4，實測值2061.8、1718.2、1472.9、1289.0、1145.8、1031.3。
24-3 Acm基之脫保護
於利用上述24-2中記載之方法獲得之糖胜肽55(11.7 mg，1.14 μmol)中添加乙酸銀(I)(4.7 mg，28 μmol)之水溶液(0.46 mL)，於室溫下反應2小時。添加溶解於200 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為7.4，0.46 mL)之DTT(11.3 mg，73 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(0.11 mL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→70：30，5分鐘，繼而70：30→55：45，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(56)所表示之糖胜肽56(序列編號70)(7.4 mg，0.73 μmol，產率64%)。
ESI-MS：(m/z)C401H636N64O226S6之計算值：[M+6H]6+ 1694.7、[M+7H]7+ 1452.7、[M+8H]8+ 1271.3、[M+9H]9+ 1130.1、[M+10H]10+ 1017.2，實測值1694.6、1452.5、1271.4、1130.0、1017.2。
24-4雙硫鍵之形成
將利用上述24-3中記載之方法獲得之糖胜肽56(7.4 mg，0.73 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，1.8 mL)中，於室溫下反應25小時。使用
HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→70：30，5分鐘，繼而70：30→69.3：30.7，5分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，藉此獲得包含下述式(57)所表示之化合物(S1-3C(disialo)-SRIF28)(序列編號25)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→40：60，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1-3C(disialo)-SRIF28(4.7 mg，0.46 μmol，產率63%)。
ESI-MS：(m/z)C401H634N64O226S6之計算值：[M+3H]3+ 3387.7、[M+4H]4+ 2541.0、[M+5H]5+ 2033.0、[M+6H]6+ 1694.3、[M+7H]7+ 1452.4，實測值3387.6、2540.9、2032.7、1694.2、1452.3。
實施例25 S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(58)所表示之胜肽58(序列編號71)代替胜肽 54，除此以外，以與實施例24相同之方式合成下述式(59)所表示之化合物(S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28)(序列編號26)。
實施例26 S1C(monosialo)-SRIF28之合成
使用下述式(b)所表示之化合物b(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(60)所表示之化合物(S1C(monosialo)-SRIF28)(序列編號27)。
於最終產物中，具有下述式b1之糖鏈之附加糖鏈之聚胜肽與具有下述式b2之糖鏈之附加糖鏈之聚胜肽的比為45：55。再者，藉由使用結構相同之單唾液酸糖鏈衍生物，可製造具有實質上均勻之糖鏈結構的附加糖鏈之聚胜肽。
實施例27 S1C(asialo)-SRIF28之合成
使用下述式(c)所表示之化合物c(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(61)所表示之化合物(S1C(asialo)-SRIF28)(序列編號28)。
[化80]
實施例28 S1-2C(asialo)-SRIF28之合成 28-1硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述20-1中記載之方法獲得之胜肽44(21.2 mg，6.21 μmol)與化合物c(44.5 mg，25.3 μmol，相對於胜肽44為4.1當量)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，1.9 mL)中，於室溫下反應1小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=77：23→62：38，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(62)所表示之糖胜肽62(序列編號72)(24.0 mg，3.54 μmol，產率57%)。
[化82]
ESI-MS：(m/z)C274H434N54O133S5之計算值：[M+4H]4+ 1694.3、[M+5H]5+ 1355.6、[M+6H]6+ 1129.8，實測值1694.3、1355.6、1130.0。
28-2 Acm基之脫保護
於利用上述28-1中記載之方法獲得之糖胜肽62(24.0 mg，3.54 μmol)中添加乙酸銀(I)(6.0 mg，36 μmol)之水溶液(1.4 mL)，於室溫下反應3小時。添加溶解於500 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.57 mL)之DTT(14.0 mg，90.8 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(0.35 mL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→65：35，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(63)所表示之糖胜肽63(序列編號73)(20.1 mg，3.03 μmol，產率86%)。
ESI-MS：(m/z)C268H424N52O131S5之計算值：[M+4H]4+ 1658.7、[M+5H]5+ 1327.2，實測值1658.8、1327.0。
28-3雙硫鍵之形成
將利用上述28-2中記載之方法獲得之糖胜肽63(20.1 mg，3.03 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，6.1 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=77：23→65：35，16分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得包含下述式(64)所表示之化合物(S1-2C(asialo)-SRIF28)(序列編號29)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=92：8→80：20，16分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1-2C(asialo)-SRIF28(11.0 mg，1.66 μmol，產率55%)。
ESI-MS：(m/z)C268H422N52O131S5之計算值：[M+4H]4+ 1658.2、[M+5H]5+ 1326.8、[M+6H]6+ 1105.8、[M+7H]7+ 948.0、[M+8H]8+ 829.6，實測值1658.1、1326.7、1105.6、947.8、829.4。
實施例29 S1-3C(asialo)-SRIF28之合成 29-1硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述24-1中記載之方法獲得之胜肽54(21.3 mg，6.06 μmol)與化合物c(53.4 mg，30.3 μmol，相對於胜肽54為5.0當量)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，1.8 mL)中，於室溫下反應1小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→70：30，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(65)所表示之糖胜肽65(序列編號74)(39.3 mg，4.59 μmol，產率76%)。
ESI-MS：(m/z)C341H544N60O180S6之計算值：[M+4H]4+ 2140.2、[M+5H]5+ 1712.3、[M+6H]6+ 1427.1，實測值2140.2、1712.4、1427.2。
29-2 Acm基之脫保護
於利用上述29-1中記載之方法獲得之糖胜肽65(39.3 mg，4.59 μmol)中添加乙酸銀(I)(18.7 mg，112 μmol)之水溶液(1.8 mL)，於室溫下反應90分鐘。添加溶解於200 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，1.8 mL)之DTT(43.4 mg，28.1 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(0.46 mL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→68：32，18分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(66)所表示之糖胜肽66(序列編號75)(27.6 mg，3.28 μmol，產率71%)。
ESI-MS：(m/z)C335H534N58O178S6之計算值：[M+4H]4+ 2104.6、[M+5H]5+ 1683.9、[M+6H]6+ 1403.4，實測值2104.6、1684.0、1403.3。
29-3雙硫鍵之形成
將利用上述29-2中記載之方法獲得之糖胜肽66(27.6 mg，3.28 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，8.2 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=72：28→70.5：29.5，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得包含下述式(67)所表示之化合物(S1-3C(asialo)-SRIF28)(序列編號30)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=96：4→82：18，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1-3C(asialo)-SRIF28(14.5 mg，1.72 μmol，產率52%)。
ESI-MS：(m/z)C335H532N58O178S6之計算值：[M+4H]4+ 2104.1、[M+5H]5+ 1683.5、[M+6H]6+ 1403.1，實測值2103.7、1683.3、1403.0。
實施例30 N5N(disialo)-SRIF28之合成
30-1糖胜肽之固相合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Trt)-OH(72.5 mg，120 μmol)與DIPEA(104.6 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法，合成下述式(68)所表示的處於結合於樹脂之狀態的經保護之胜肽68(序列編號76)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進 行。
繼而，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，將下述式(d)所表示之化合物d(大塚化學股份有限公司製造)(411.9 mg，150.4 μmol)、DMSO-DMF(1/1，v/v，871 μL)溶液、TBTU(64.2 mg，200 μmol)、及DIPEA(52.3 μL，300 μmol)依序添加於樹脂中，於室溫下振盪3小時而使之縮合。
利用DMF洗淨後，重複1次該縮合操作。利用DMF及二氯甲烷對樹脂進行洗淨後，以DMF中之20%之哌啶振盪20分鐘而使Fmoc基脫保護並利用DMF對樹脂進行洗淨，藉此使經保護之下述式(69)所表示之化合物(胜肽69)(序列編號77)於樹脂上合成。
於該樹脂上，使用HOBt/DIC作為縮合劑，使Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Ala、Fmoc-Ser(tBu)-OH依序縮合。縮合後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，A：B=70：30]對該粗胜肽進行純化，而獲得下述式(70)所表示之糖胜肽70(序列編號78)(29.1 mg，5.26 μmol)。
ESI-MS：(m/z)C235H357N47O100S3之計算值：[M+3H]3+ 1846.6、[M+4H]4+ 1385.2、[M+5H]5+ 1108.4，實測值1846.5、1385.1、1108.3。
30-2雙硫鍵之形成
利用上述30-1中記載之方法獲得之糖胜肽70(12.2 mg，2.20 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，5.5 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→66：35，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(71)所表示之糖胜肽71(序列編號79)(8.3 mg，1.5 μmol，產率68%)。
ESI-MS：(m/z)C235H355N47O100S3之計算值：[M+3H]3+ 1846.5、[M+4H]4+ 1384.7、[M+5H]5+ 1108.0，實測值1846.5、1384.7、1108.1。
30-3苄基之脫保護
將利用上述30-2中記載之方法獲得之糖胜肽71(7.5 mg，1.4 μmol)溶解於50 mM氫氧化鈉水溶液(20.6 mL)中，於0℃下反應80分鐘。添加200 mM乙酸水溶液(5.1 mL)，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度
A：B=73：27→66.3：33.7，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對混合溶液進行純化，而獲得包含下述式(72)所表示之化合物(N5N(disialo)-SRIF28)(序列編號31)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=80：20→60：40，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得N5N(disialo)-SRIF28(1.4 mg，產率19%)。
ESI-MS：(m/z)C221H343N47O100S3之計算值：[M+3H]3+ 1785.9、[M+4H]4+ 1339.6、[M+5H]5+ 1071.9，實測值1785.7、1339.5、1071.8。
實施例31 S1N(disialo)-SRIF28之合成 31-1糖胜肽之固相合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Trt)-OH(72.5 mg，120 μmol)與DIPEA(104.6 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合 成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法，合成下述式(73)所表示的處於結合於樹脂之狀態的經保護之胜肽73(序列編號80)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
繼而，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，將化合物d(420.2 mg，153.3 μmol)、DMSO-DMF(1/1，v/v，871 μL)溶液、TBTU(64.2 mg，200 μmol)、及DIPEA(52.3 μL，300 μmol)依序添加於樹脂中，於室溫下振盪2小時而使之縮合。利用DMF洗淨後，重複1次該縮合操作。利用DMF及二氯甲烷對樹脂進行洗淨後，以DMF中之20%之哌啶振盪20分鐘而使Fmoc基脫保護並利用DMF對樹脂進行洗淨，藉此使經保護之下述式(74)所表示之胜肽74(序列編號81)於樹脂上合成。
利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。於 濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，A：B=71：29]對該粗胜肽進行純化，而獲得下述式(75)所表示之糖胜肽75(序列編號82)(65.7 mg，11.8 μmol)。
ESI-MS：(m/z)C236H358N48O100S3之計算值：[M+4H]4+ 1392.0、[M+5H]5+ 1113.8，實測值1391.9、1113.8。
31-2雙硫鍵之形成
將利用上述31-1中記載之方法獲得之糖胜肽75(20.3 mg，3.65 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，9.0 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=72：28→67：33，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(76)所表示之糖胜肽76(序列編號83)(17.0 mg，3.06 μmol，產率84%)。
[化97]
ESI-MS：(m/z)C236H356N48O100S3之計算值：[M+4H]4+ 1391.5、[M+5H]5+ 1113.4，實測值1391.3、1113.2。
31-3苄基之脫保護
將利用上述31-2中記載之方法獲得之糖胜肽76(7.0 mg，1.3 μmol)溶解於50 mM氫氧化鈉水溶液(19.1 mL)中，於0℃下反應1小時。添加200 mM乙酸水溶液(9.6 mL)，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=85：15→77.5：22.5，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對混合溶液進行純化，而獲得下述式(77)所表示之化合物(S1N(disialo)-SRIF28)(序列編號32)(2.7 mg，0.50 μmol，產率40%)。
ESI-MS：(m/z)C222H344N48O100S3之計算值：[M+3H]3+ 1794.9、[M+4H]4+ 1346.4、[M+5H]5+ 1077.3、[M+6H]6+ 897.9，實測值1794.7、1346.2、1077.2、897.7。
實施例32 S1C(disialo)．N19C(GlcNAc)-SRIF28之合成 32-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法將經保護之胜肽合成於樹脂上。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=72：28→64：36，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽之一部分進行純化，而獲得下述式(78)所表示之胜肽78(序列編號84)(28.9 mg)。
ESI-MS：(m/z)C146H226N42O39S6之計算值：[M+3H]3+ 1129.7、[M+4H]4+ 847.5，實測值1129.5、847.4。
32-2硫醇之糖鏈修飾與StBu基之脫保護
將利用上述32-1中記載之方法獲得之胜肽78(10.0 mg，2.95 μmol)與下述式(e)所表示之化合物e(經溴乙醯胺化之單糖：大塚化學股份有限公司製造)(2.0 mg，5.90 μmol，相對於胜肽78為2.0當量)溶解於包含20 μM TCEP之33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.89 mL)中，於室溫下反應2小時。
反應後，添加溶解於0.1 M磷酸緩衝液(pH值為7.4，3.0 mL)之DTT(45.5 mg，295 μmol)，於室溫下反應3小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→65：35，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶 液進行純化，而獲得下述式(79)所表示之糖胜肽79(序列編號85)(6.8 mg，1.9 μmol，產率64%)。
ESI-MS：(m/z)C152H234N44O45S5之計算值：[M+3H]3+ 1187.0、[M+4H]4+ 890.5，實測值1187.0、890.5。
32-3硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述32-2中記載之方法獲得之胜肽79(6.8 mg，1.9 μmol)與上述式(a)所表示之化合物a(22.4 mg，9.56 μmol，相對於胜肽79為5.0當量)溶解於包含7.6 mM DTT之0.1 M磷酸緩衝液(pH值為7.4，2.0 mL)中，於室溫下反應2小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=85：15→65：35，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(80)所表示之糖胜肽80(序列編號86)(3.4 mg，0.58 μmol，產率31%)。
ESI-MS：(m/z)C238H373N51O107S5之計算值：[M+5H]5+ 1165.2、[M+6H]6+ 971.2、[M+7H]7+ 832.6、[M+8H]8+ 728.6，實測值1165.2、971.1、832.6、728.6。
32-4 Acm基之脫保護
於利用上述32-3中記載之方法獲得之糖胜肽80(3.8 mg，0.65 μmol)中添加乙酸銀(I)(2.7 mg，16 μmol)之水溶液(262 μL)，於室溫下反應1小時。添加溶解於100 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，426 μL)之DTT(10.0 mg，64.8 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(66 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→60：40，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(81)所表示之糖胜肽81(序列編號87)(2.5 mg，0.44 μmol，產率67%)。
ESI-MS：(m/z)C232H363N49O105S5之計算值：[M+3H]3+ 1894.0、[M+4H]4+ 1420.7、[M+5H]5+ 1136.8，實測值1893.8、1420.6、1136.7。
32-4雙硫鍵之形成
將利用上述32-3中記載之方法獲得之糖胜肽81(2.5 mg， 0.44 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，1.1 mL)中，於室溫下反應一整夜。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→70：30，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(82)所表示之化合物(S1C(disialo)．N19C(GlcNAc)-SRIF28)(序列編號33)(1.5 mg，0.26 μmol，產率59%)。
ESI-MS：(m/z)C232H361N49O105S5之計算值：[M+3H]3+ 1893.3、[M+4H]4+ 1420.2、[M+5H]5+ 1136.4，實測值1893.5、1420.1、1136.3。
實施例33 S1C(disialo)．N19C(diMan)-SRIF28之合成
使用下述式(f)所表示之化合物f(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)代替化合物e，除此以外，以與實施例32相同之方式合成下述式(83)所表示之化合物(S1C(disialo)．N19C(diMan)-SRIF28)(序列編號34)。
[化105]
實施例34C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(84)所表示之化合物(胜肽84)(序列編號88)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(85)所表示之化合物(C(disialo)-SRIF28)(序列編號89)。
實施例35 R11C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(86)所表示之化合物(胜肽86)(序列編號90)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(87)所表示之化合物(R11C(disialo)-SRIF28)(序列編號91)。
實施例36 F20C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(88)所表示之化合物(胜肽88)(序列編號92)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(89)所表示之化合物(F20C(disialo)-SRIF28)(序列編號93)。
實施例37 T24C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(90)所表示之化合物(胜肽90)(序列編號94)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(91)所表示之化合物(T24C(disialo)-SRIF28)(序列編號95)。
實施例38 F25C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(92)所表示之化合物(胜肽92)(序列編號96)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(93)所表示之化合物(F25C(disialo)-SRIF28)(序列編號97)。
實施例39 S27C(disialo)-SRIF28之合成
使用下述式(94)所表示之化合物(胜肽94)(序列編號98)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(95)所表示之化合物(S27C(disialo)-SRIF28)(序列編號99)。
實施例40 C(disialo)-K-SRIF14之合成
使用下述式(96)所表示之化合物(胜肽96)(序列編號100)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(97)所表示之化合物(C(disialo)-K-SRIF14)(序列編號101)。
實施例41 S1C(disialo)-F25Y-SRIF28之合成
使用下述式(98)所表示之化合物(胜肽98)(序列編號102)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(99)所表示之化合物(S1C(disialo)-F25Y-SRIF28)(序列編號103)。
實施例42 S1C(disialo)-SRIF28-醯胺之合成
使用下述式(100)所表示之化合物(胜肽100)(序列編號104)代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(101)所表示之化合物(S1C(disialo)-SRIF28-醯胺)(序列編號105)。
[化123]
實施例43 C(disialo)-PEGlinker-SRIF14之合成 43-1胜肽之合成
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將利用上述19-1中記載之方法獲得的結合於樹脂之經保護之胜肽39(序列編號58)(50 μmol)之Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用HCTU作為縮合劑，使Fmoc-NH-(PEG)2-COOH(Merck公司製造)及Fmoc-Cys(Trt)-OH依序縮合。藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下3小時振盪。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=74：26→69：31，1分鐘，繼而69：31→62：38，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽之一部分進行純化，而獲得下述式(102)所表示之化合物(胜肽102)(序列編號 106)(43.1 mg)。
ESI-MS：(m/z)C94H138N22O26S3之計算值：[M+2H]2+ 1045.2、[M+3H]3+ 697.1，實測值1045.0、697.0。
43-2 C(disialo)-PEGlinker-SRIF14之合成
使用利用上述43-1中記載之方法獲得之胜肽102代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(103)所表示之化合物(C(disialo)-PEGlinker-SRIF14)(序列編號107)。
實施例44 Biotin-S1C(disialo)-SRIF28之合成 44-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加包含Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理 而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法合成下述式(104)所表示的處於結合於樹脂之狀態的經保護之胜肽104(序列編號108)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用HCTU作為縮合劑，使生物素縮合。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。藉此，使胺基酸側鏈之保護基(Acm基以外)脫離，並且將胜肽與樹脂切斷。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。利用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→61：39，18分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽進行純化，而獲得下述式(105)所表示之胜肽105(序列編號109)。
[化128]
ESI-MS：(m/z)C153H233N45O42S5之計算值：[M+3H]3+ 1179.4、[M+4H]4+ 884.8、[M+5H]5+ 708.0，實測值1179.2、884.4、707.9。
44-2 Biotin-S1C(disialo)-SRIF28之合成
使用利用上述44-1中記載之方法獲得之胜肽114代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(106)所表示之化合物(Biotin-S1C(disialo)-SRIF28)(序列編號110)。
實施例45 Biotin-PEGlinker-S1C(disialo)-SRIF28之合成 45-1胜肽之合成
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將上述44-1中 獲得的結合於樹脂之經保護之胜肽104(序列編號108)之Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用HCTU作為縮合劑，使Fmoc-NH-(PEG)2-COOH(Merck公司製造)及生物素依序縮合。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。利用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→61：39，22分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽進行純化，而獲得下述式(107)所表示之胜肽107(序列編號111)。
ESI-MS：(m/z)C162H250N46O46S5之計算值：[M+3H]3+ 1247.1、[M+4H]4+ 935.6、[M+5H]5+ 748.7，實測值1246.9、935.4、748.6。
45-2 Biotin-PEGlinker-S1C(disialo)-SRIF28之合成
使用利用上述45-1中記載之方法獲得之胜肽107代替胜 肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(108)所表示之化合物(Biotin-PEGlinker-S1C(disialo)-SRIF28)(序列編號112)。
實施例46 Azido-S1C(disialo)-SRIF28之合成 46-1胜肽之合成
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將上述44-1中獲得的結合於樹脂之經保護之胜肽104(序列編號108)之Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用HCTU作為縮合劑，使5-疊氯基-戊酸(5-Azido-pentanoic acid)縮合。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。利用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=70：30→60：40，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽進行純化，而獲得下述式(109)所表示之胜肽109(序列 編號113)。
ESI-MS：(m/z)C148H226N46O41S4之計算值：[M+3H]3+ 1145.6、[M+4H]4+ 859.5、[M+5H]5+ 687.8，實測值1145.5、859.2、687.5。
46-2 Azido-S1C(disialo)-SRIF28之合成
使用利用上述46-1中記載之方法獲得之胜肽109代替胜肽1，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(110)所表示之化合物(Azido-S1C(disialo)-SRIF28)(序列編號114)。
實施例47 S1C(disialo)．E12C(disialo)-SRIF28之合成
合成並使用下述式(111)所表示之化合物(胜肽111)(序列編號115)代替胜肽44，除此以外，以與實施例20相同之方 式合成下述式(112)所表示之化合物(S1C(disialo)．E12C(disialo)-SRIF28)(序列編號116)。
實施例48 2C(disialo)-R-K-SRIF14之合成
合成並使用下述式(113)所表示之化合物(胜肽113)(序列編號117)代替胜肽44，除此以外，以與實施例20相同之方式合成下述式(114)所表示之化合物(2C(disialo)-R-K-SRIF14)(序列編號118)。
實施例49 3C(disialo)-R-K-SRIF14之合成
合成並使用下述式(115)所表示之化合物(胜肽115)(序列編號119)代替胜肽54，除此以外，以與實施例24相同之方式合成下述式(116)所表示之化合物(3C(disialo)-R-K-SRIF14)(序列編號120)。
實施例50 S1C(diGlcNAc)-SRIF28之合成 50-1硫醇之糖鏈修飾反應
將胜肽1(序列編號38)(APC公司製造)(25.0 mg，7.56 μmol)與下述式(h)所表示之化合物h(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)(15.6 mg，15.1 μmol，相對於胜肽1為2.0當量)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，2.3 mL)中，於室溫下反應30分鐘。
[化140]
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，A：B=75：25→62：38，13分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(117)所表示之糖胜肽117(序列編號121)(25.6 mg，6.01 μmol，產率79%)。
ESI-MS：(m/z)C195H304N48O76S4之計算值：[M+3H]3+ 1556.0、[M+4H]4+ 1167.3，實測值1555.7、1167.0。
50-2 Acm基之脫保護
於利用上述50-1中記載之方法中獲得之糖胜肽117(28.3 mg，6.07 μmol)中添加乙酸銀(I)(12.5 mg，74.5 μmol)之水 溶液(2.4 mL)，於室溫下反應30分鐘。添加溶解於200 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為7.4，2.4 mL)之DTT(28.8 mg，187 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(0.6 mL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=73：27→60：40，13分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(118)所表示之糖胜肽118(序列編號122)(19.8 mg，4.38 μmol，產率72%)。
ESI-MS：(m/z)C189H294N46O74S4之計算值：[M+3H]3+ 1508.6、[M+4H]4+ 1131.7、[M+5H]5+ 905.6，實測值1508.3、1131.5、905.4。
50-3雙硫鍵之形成
將利用上述50-2中記載之方法獲得之糖胜肽118(19.8 mg，4.38 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，8.8 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度 A：B=73：27→60：40，13分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行部分純化，而獲得包含下述式(119)所表示之化合物(S1C(diGlcNAc)-SRIF28)(序列編號123)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→78：22，12分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1C(diGlcNAc)-SRIF28(11.9 mg，2.63 μmol，產率60%)。
ESI-MS：(m/z)C189H292N46O74S4之計算值：[M+3H]3+ 1508.0、[M+4H]4+ 1131.2、[M+5H]5+ 905.2，實測值1507.7、1131.0、905.0。
實施例51 S1C(diMan)-SRIF28之合成
使用化合物f代替化合物h，除此以外，以與實施例50相同之方式合成下述式(120)所表示之化合物(S1C(diMan)-SRIF28)(序列編號124)。
實施例52 N19C(diMan)-SRIF28之合成
使用胜肽21代替胜肽1，使用化合物f代替化合物h，除此以外，以與實施例50相同之方式合成下述式(121)所表示之化合物(N19C(diMan)-SRIF28)(序列編號125)。
實施例53 S1C(GlcNAc)-SRIF28之合成
使用化合物e代替化合物h，除此以外，以與實施例50相同之方式合成下述式(122)所表示之化合物(S1C(GlcNAc)-SRIF28)(序列編號126)。
實施例54 N19C(GlcNAc)-SRIF28之合成
使用胜肽21代替胜肽1，使用化合物e代替化合物h，除此以外，以與實施例50相同之方式合成下述式(123)所表示之化合物(N19C(GlcNAc)-SRIF28)(序列編號127)。
實施例55 S1C(trisialo)-SRIF28之合成
使用下述式(i)所表示之化合物i(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(124)所表示之化合物(S1C(trisialo)-SRIF28)(序列編號128)。
實施例56 S1C(tetrasialo)-SRIF28之合成
使用下述式(j)所表示之化合物j(經溴乙醯胺化之低聚糖：大塚化學股份有限公司製造)代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(125)所表示之化合物(S1C(tetrasialo)-SRIF28)(序列編號129)。
實施例57 S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28之合成 57-1經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈衍生物之合成
於下述式(k)所表示之化合物k(大塚化學股份有限公司製造)(204.1 mg，92.1 μmol)中添加水(2 mL)、N-(2-胺基乙基)胺基甲酸第三丁酯(tert-Butyl N-(2-Aminoethyl)carbamate)(0.29 mL，0.18 mmol)，於室溫下攪拌1小時。冷凍乾燥後，於所獲得之冷凍乾燥物中添加DMF(5 mL)、HATU(349 mg，921 μmol)、DIPEA(161 μL，921 μmol)，於37℃下反應18小時。於溶液中添加甲苯(50 mL)，過濾回收所析出之沈澱物。將沈澱物溶解於DMF(5 mL)中，使 用凝膠過濾純化[管柱：Sephadex G-25，20×200 mm，流速：30 mL/h]進行純化，將目標組分回收並進行冷凍乾燥，藉此獲得下述式(l)所表示之化合物l(152.4 mg，60.8 μmol，產率66%)。
MALDI-MS：(m/z)C98H166N10O64之計算值：[M+Na]+ 2530.0，實測值2529.4。
將化合物l(100 mg，39.8 μmol)與碳酸氫銨(31.4 mg，398 μmol)溶解於水(1 mL)中，於室溫下反應7天。冷凍乾燥後，對所獲得之冷凍乾燥物依序添加水(1 mL)、DCC(41.0 mg，199 μmol)、溶解於DMF(1 mL)之溴乙酸(27.7 mg，199 μmol)。於冰浴冷卻下反應1小時後，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：8.0 mL/min，展開溶劑水：乙腈=84：16]對溶液進行純化而獲得下述式(m)所表示之化合物m(經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈衍生物：100 mg，38.2 μmol，產率96%)。
MALDI-MS：(m/z)(m/z)C100H168BrN11O64之計算值：[M+Na]+ 2648.9，實測值2648.5。
57-2硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述57-1中記載之方法獲得之化合物m(14.2 mg，5.40 μmol)與胜肽1(15.0 mg，4.53 μmol)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，1.3 mL)中，於室溫下反應30分鐘。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1%乙酸(AcOH)水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=86：14→82：18，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(126)所表示之糖胜肽126(序列編號130)(13.4 mg，2.29 μmol，產率51%)。
ESI-MS：(m/z)C243H386N54O104S4之計算值：[M+4H]4+ 1465.1、[M+5H]5+ 1172.2、[M+6H]6+ 977.0，實測值1464.9、1172.1、977.1。
57-3 Boc基之脫保護
將利用上述57-2中記載之方法獲得之糖胜肽126(13.4 mg，2.29 μmol)溶解於95% TFA水溶液(458 μL)中，於室溫下振盪5分鐘。添加50 mM乙酸銨水溶液(pH值為6.8，33 mL)之後，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈， 梯度A：B=73：27→65：35，10分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(127)所表示之糖胜肽127(序列編號131)(12.7 mg，98 μmol，產率98%)。
ESI-MS：(m/z)C233H370N54O100S4之計算值：[M+4H]4+ 1415.1、[M+5H]5+ 1132.2、[M+6H]6+ 943.7、[M+7H]7+ 809.0，實測值1414.9、1132.1、943.6、808.9。
57-4 Acm基之脫保護
於利用上述57-3中記載之方法獲得之糖胜肽127(12.7 mg，2.25 μmol)中添加乙酸銀(I)(9.2 mg，55 μmol)之水溶液(0.9 mL)，於室溫下反應30分鐘。其後，添加溶解於200 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.9 mL)之DTT(21.2 mg，137 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(225 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=73：27→60：40，13分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(128)所表示之糖胜肽128(序列編號132)(5.2 mg，0.94 μmol，產率42%)。
ESI-MS：(m/z)C227H360N52O98S4之計算值：[M+4H]4+ 1379.5、[M+5H]5+ 1103.8、[M+6H]6+ 920.0、[M+7H]7+ 788.7，實測值1379.4、1103.7、919.9、788.6。
57-5雙硫鍵之形成
將利用上述57-4中記載之方法獲得之糖胜肽128(5.2 mg，0.94 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，1.9 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=70：30→65：35，13分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得包含下述式(129)所表示之化合物(S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28)(序列編號133)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=92：8→85：15 14分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28(3.8 mg，0.69 μmol，產率73%)。
ESI-MS：(m/z)C227H358N52O98S4之計算值：[M+3H]3+ 1838.3、[M+4H]4+ 1379.0、[M+5H]5+ 1103.4、[M+6H]6+ 919.6、[M+7H]7+ 788.4，實測值1838.0、1378.5、1103.2、919.5、788.2。
實施例58 S1C(disialo(amide))-SRIF28之合成 58-1經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈衍生物之合成
於化合物k(大塚化學股份有限公司製造)(152 mg，68.6 μmol)中依序添加DMF(1.9 mL)、溴化鋰(357 mg，4.12 mmol)、苯甲醯甲基氯(273 mg，1.37 mmol)，於37℃下反應。10小時後，添加水(19 mL)並藉由過濾將析出物除去。於濾液中添加25%銨水(5 mL)，於室溫下反應18小時之後，添加100 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，80 mL)進行中和。使用HPLC[管柱：YMC Hydrosphere C18(5 μm)，20×250 mm，流速：8.0 mL/min，展開溶劑0.1% TFA水：乙腈=98：2→92：8，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對溶液進行純化並進行冷凍乾燥，藉此獲得下述式(n)所表示之化合物n(60.9 mg，27.4 μmol，產率40%)。
MALDI-MS：(m/z)C84H140N8O60之計算值：[M+Na]+ 2243.8，實測值2243.6。
將所獲得之中間體n(37.3 mg，16.8 μmol)與碳酸氫銨(13.3 mg，168 μmol)溶解於水(0.37 mL)中，於室溫下反應7天。冷凍乾燥後，於所獲得之冷凍乾燥物中依序添加水(0.37 mL)、DCC(17.3 mg，84 μmol)、溶解於DMF(0.37 mL)之溴乙酸(11.7 mg，84 μmol)。使用HPLC[管柱：YMC Hydrosphere C18(5 μm)，20×250 mm，流速：8.0 mL/min，展開溶劑0.1% TFA水：乙腈=98：2→92：8，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對冰浴冷卻下反應1小時後之溶液進行純化，而獲得下述式(o)所表示之化合物o(經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈衍生物：29.0 mg，12.4 μmol，產率74%)。
[化160]
MALDI-MS：(m/z)C86H142BrN9O60之計算值：[M+Na]+ 2362.7，實測值2362.5。
58-2 S1C(disialo(amide))-SRIF28之合成
使用利用上述58-1中記載之方法獲得之化合物o代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(130)所表示之化合物(S1C(disialo(amide))-SRIF28)(序列編號134)。
實施例59 S1C(disialo(Bn))-SRIF28之合成 59-1經溴乙醯胺化之具有苄基保護基之二唾液酸糖鏈之合成
於化合物a(28.9 mg，12.3 μmol)中依序添加DMF(0.58 mL)、溴化鋰(21.5 mg，248 μmol)、苄基溴(14.6 μL，122 μmol)，於30℃下反應20小時。進而添加苄基溴(14.6 μL，122 μmol)反應20小時。於反應液中添加甲苯(30 mL)，離心分離(10,000 xg、10分鐘)之後，將沈澱物溶解於水(100 μL)中並使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：8.0 mL/min，展開溶劑水：乙腈=95：5→70：30，20分鐘，線性濃度梯度溶出]進行純化，而獲得下述式(g)所表示之化合物g(經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈：7.6 mg，3.0 μmol，產率24%)。
MALDI-MS：(m/z)C100H152BrN7O62之計算值：[M+Na]+ 2544.8，實測值2544.4。
實施例59-2 S1C(disialo(Bn))-SRIF28之合成
使用化合物g代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(131)所表示之化合物(S1C(disialo(Bn))-SRIF28)(序列編號135)。
[化163]
實施例60 S1C(disialo(hexadecylamide))-SRIF28之合成 60-1經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈衍生物之合成
於化合物k(大塚化學股份有限公司製造)(140 mg，63.0 μmol)中添加水(1.5 mL)、甲醇(1.5 mL)、十六烷基胺(300 mg，126 μmol)，於室溫下攪拌1小時。冷凍乾燥後，於所獲得之冷凍乾燥物中添加DMF(5 mL)、HATU(239 mg，630 μmol)、DIPEA(110 μL，630 μmol)，於37℃下反應。18小時後，於溶液中添加二乙醚(100 mL)，並過濾回收所析出之沈澱物。將該沈澱物溶解於DMF(5 mL)中，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：8.0 mL/min，展開溶劑水：乙腈=40：60→10：90，30分鐘，線性濃度梯度溶出]進行純化，藉此獲得下述式(p)所表示之化合物p(71.1 mg，26.6 μmol，產率42%)。
MALDI-MS：(m/z)C116H204N8O60之計算值：[M+Na]+ 2692.3，實測值2691.9。
將所獲得之化合物p(71.7 mg，26.6 μmol)與碳酸氫銨(21.8 mg，266 μmol)溶解於水(0.7 mL)、甲醇(0.7 mL)中，於室溫下反應。7天後，進行冷凍乾燥，於所獲得之冷凍乾燥物中依序添加水(0.7 mL)、甲醇(0.7 mL)、DCC(27.4 mg，133 μmol)、溶解DMF(0.7 mL)之溴乙酸(18.5 mg，133 μmol)。於冰浴冷卻下反應1小時後，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：8.0 mL/min，展開溶劑水：乙腈=40：60→10：90，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對溶液進行純化而獲得下述式(q)所表示之化合物q(經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈：24.9 mg，8.9 μmol，產率33%)。
MALDI-MS：(m/z)C118H206BrN9O60之計算值：[M+Na]+ 2811.2，實測值2811.0。
60-2硫醇之糖鏈修飾反應
將胜肽1(10.4 mg，3.14 μmol)溶解於包含30 μM TCEP之0.5 M磷酸緩衝液(pH值為7.4，62 μL)。於該溶液中添加利用上述60-1中記載之方法獲得之化合物q(79.4 mg，28.5 μmol)之DMSO(3.7 mL)溶液，於室溫下反應20分鐘。使用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=50：50→22：78，14分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(132)所表示之糖胜肽132(序列編號136)(6.4 mg，1.1 μmol，產率35%)。
ESI-MS：(m/z)C261H424N52O100S4之計算值：[M+3H]3+ 2007.2、[M+4H]4+ 1505.7、[M+5H]5+ 1204.7、[M+6H]6+ 1004.1，實測值2007.4、1505.5、1204.8、1004.0。
60-3 Acm基之脫保護
於利用上述60-2中記載之方法獲得之糖胜肽132(6.4 mg，1.1 μmol)中添加乙酸銀(I)(3.8 mg，23 μmol)之水溶 液(0.8 mL)，於室溫下反應40分鐘。其後，添加溶解於200 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，377 μL)之DTT(8.8 mg，57 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(106 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=48：52→38：62，3分鐘，繼而38：62→30：70，8分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(133)所表示之糖胜肽133(序列編號137)(3.2 mg，0.54 μmol，產率49%)。
ESI-MS：(m/z)C255H414N50O98S4之計算值：[M+3H]3+ 1959.9、[M+4H]4+ 1470.1、[M+5H]5+ 1176.3、[M+6H]6+ 980.4，實測值1959.6、1469.9、1176.1、980.5。
60-3雙硫鍵之形成
將利用上述60-2中記載之方法獲得之糖胜肽133(3.2 mg，0.54 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，1.1 mL)中，於室溫下反應2天。使用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=48：52→38：62，3分鐘，繼而38：62→30：70，8分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(134)所表示之化合物(S1C(disialo(hexadecylamide))-SRIF28)(序列編號138)(2.8 mg，0.48 μmol，產率89%)。
ESI-MS：(m/z)C255H412N50O98S4之計算值：[M+3H]3+ 1959.2、[M+4H]4+ 1469.6、[M+5H]5+ 1175.9、[M+6H]6+ 980.1，實測值1958.9、1469.4、1175.7、979.9。
實施例61 S1-2C(disialo(amide))-SRIF28之合成
使用化合物o代替化合物c，除此以外，以與實施例28相同之方式合成下述式(135)所表示之化合物(S1-2C(disialo(amide))-SRIF28)(序列編號139)。
實施例62 S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28之合成
使用化合物g代替化合物c，除此以外，以與實施例28相同之方式合成下述式(136)所表示之化合物(S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28)(序列編號140)。
實施例63 S1C(Asn(disialo))-SRIF28之合成
使用下述式(r)所表示之化合物r(經溴乙醯化之附加糖鏈之Asn：大塚化學股份有限公司製造)代替化合物a，除此以外，以與實施例1相同之方式合成下述式(137)所表示之化合物(S1C(Asn(disialo))-SRIF28)(序列編號141)。
[化172]
實施例64 S1N(disialo)．N19C(diMan)-SRIF28之合成 64-1糖胜肽之固相合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Trt)-OH(72.5 mg，120 μmol)與DIPEA(104.6 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法合成處於結合於樹脂之狀態之經保護之下述式(138)所表示的胜肽138(序列編號142)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
其次，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，將化合物d(141.0 mg，51.5 μmol)、DMSO-DMF(1/1，v/v，1.1 mL)溶液、TBTU(21.2 mg，66.0 μmol)、及DIPEA(17.2 μL，98.7 μmol)依序添加於樹脂中，於室溫下振盪4小時而使之縮合。利用 DMF洗淨後，重複1次該縮合操作。利用DMF及二氯甲烷對樹脂進行洗淨後，以DMF中之20%之哌啶振盪20分鐘而使Fmoc基脫保護並利用DMF對樹脂進行洗淨，藉此合成下述式(139)所表示的處於結合於樹脂之狀態的經保護之胜肽139(序列編號143)。
利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，A：B=70：30]對該粗胜肽進行純化，而獲得下述式(140)所表示之糖胜肽140(序列編號144)(5.8 mg，1.1 μmol)。
ESI-MS：(m/z)C241H367N49O101S4之計算值：[M+4H]4+ 1424.8、[M+5H]5+ 1140.0，實測值1424.6、1139.9。
64-2硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述64-1中記載之方法獲得之糖胜肽140(10.8 mg，1.90 μmol)與化合物f(5.3 mg，5.1 μmol)溶解於包含141 μM TCEP之100 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，0.8 mL)，於室溫下反應24小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，A：B=75：25→60：40，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(141)所表示之糖胜肽141(序列編號145)(4.9 mg，0.74 μmol，產率39%)。
ESI-MS：(m/z)C277H426N52O127S4之計算值：[M+3H]3+ 2216.0、[M+4H]4+ 1662.2、[M+5H]5+ 1330.0，實測值2215.6、1661.9、1330.1。
64-3 Acm基之脫保護
於利用上述64-2中記載之方法獲得之糖胜肽141(4.9 mg，0.74 μmol)中添加乙酸銀(I)(1.5 mg，9.0 μmol)之水溶液(148 μL)，於室溫下反應1.5小時。添加溶解於200 mM 磷酸緩衝液(pH值為7.4，145 μL)之DTT(3.5 mg，23 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(37 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=74：26→64：36，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(142)所表示之糖胜肽142(序列編號146)(3.7 mg，0.57 μmol，產率77%)。
ESI-MS：(m/z)C271H416N50O125S4之計算值：[M+3H]3+ 2168.6、[M+4H]4+1626.7、[M+5H]5+ 1301.5，實測值2168.6、1626.4、1301.3。
64-4雙硫鍵之形成
將利用上述64-3中記載之方法獲得之糖胜肽142(3.7 mg，0.54 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，1.4 mL)中，於室溫下反應31小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→60：40，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(143)所表示之糖胜肽143(序列 編號147)(2.9 mg，0.45 μmol，產率78%)。
ESI-MS：(m/z)C271H414N50O125S4之計算值：[M+3H]3+ 2167.9、[M+4H]4+ 1626.2、[M+5H]5+ 1301.1，實測值2167.9、1626.0、1301.2。
64-5苄基之脫保護
將利用上述64-4中記載之方法獲得之糖胜肽143(2.9 mg，0.45 μmol)溶解於50 mM氫氧化鈉水溶液(13.6 mL)中，於0℃下反應1小時。添加200 mM乙酸水溶液(3.4 mL)，使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→60：40，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對混合溶液進行純化，而獲得包含下述式144所表示之化合物(S1N(disialo)．N19C(diMan)-SRIF28)(序列編號148)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，4.6×250 mm，流速：0.7 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→85：15，2分鐘，繼而85：15→65：35，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得S1N(disialo)．N19C(diMan)-SRIF28(1.6 mg，0.25 μmol，產率57%)。
ESI-MS：C257H402N50O125S4之計算值：[M+3H]3+ 2107.8、[M+4H]4+ 1581.1、[M+5H]5+ 1265.1，實測值2107.9、1580.9、1265.1。
實施例65 C(disialo(aminoethylamide))．S1C(disialo)-SRIF28之合成 65-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法合成處於結合於樹脂之狀態之經保護之下述式(145)所表示的胜肽145(序列編號149)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
[化180]
取樹脂之一部分(50 μmol)，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。利用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=73：27→63：37，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽進行純化，而獲得下述式(146)所表示之胜肽146(序列編號150)(30.4 mg)。
ESI-MS：(m/z)(m/z)C150H232N44O41S6之計算值：[M+3H]3+ 1167.7、[M+4H]4+ 876.0，實測值1167.5、875.9。
65-2糖鏈衍生物中之Boc基之脫保護
將化合物m(50.0 mg，19.0 μmol)溶解於95% TFA水(2.5 mL)中，於室溫下進行振盪。10分鐘後，添加二乙醚(15 mL)，對所析出之沈澱進行離心分離(10,000 xg，10分鐘)。將沈澱物溶解於水中進行冷凍乾燥，藉此獲得下述 式(s)所表示之化合物s(經溴乙醯胺化之二唾液酸糖鏈：46.0 mg，18.9 μmol，產率99%)。
ESI-MS：(m/z)C90H152BrN11O60之計算值：[M+2H]2+ 1215.1、[M+3H]3+ 810.4，實測值1214.9、810.3。
65-3硫醇之糖鏈修飾
將利用上述65-1中記載之方法獲得之胜肽146(20.6 mg，5.89 μmol)與利用上述65-2中記載之方法獲得之化合物s(28.6 mg，11.8 μmol)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，1.8 mL)中，於室溫下反應30分鐘。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=74：26→64：36，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(147)所表示之糖胜肽147(序列編號 151)(17.1 mg，2.93 μmol，產率50%)。
ESI-MS：(m/z)C240H383N55O101S6之計算值：[M+3H]3+ 1950.1、[M+4H]4+ 1462.8、[M+5H]5+ 1170.5、[M+6H]6+ 975.6，實測值1949.9、1462.6、1170.3、975.4。
65-4 StBu基之脫保護
於上述65-3中記載之方法獲得之糖胜肽147(17.1 mg，2.93 μmol)中添加溶解於0.1 M磷酸緩衝液(pH值為7.4，3.4 mL)之DTT(52.9 mg，343 μmol)，於室溫下反應3小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=95：5→75：25，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(148)所表示之糖胜肽148(序列編號152)(8.6 mg，1.5 μmol，產率51%)。
ESI-MS：(m/z)C236H375N55O101S5之計算值：[M+3H]3+ 1920.7、[M+4H]4+ 1440.8、[M+5H]5+ 1152.8、[M+6H]6+ 960.9、[M+7H]7+ 823.7，實測值1920.5、1440.6、1152.7、960.6、823.6。
65-5硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述65-4中記載之方法獲得之胜肽148(6.2 mg，1.1 μmol)與化合物a(3.8 mg，1.6 μmol)溶解於包含1.6 mM DTT之0.36 M磷酸緩衝液(pH值為7.4，339 mL)中，於室溫下反應2.5小時。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(149)所表示之糖胜肽149(序列編號153)(6.4 mg，0.80 μmol，產率73%)。
ESI-MS：(m/z)C322H514N62O163S5之計算值：[M+4H]4+ 2006.5、[M+5H]5+ 1605.4、[M+6H]6+ 1338.0，實測值2006.6、1605.3、1338.0。
65-6 Acm基之脫保護
於利用上述65-5中記載之方法獲得之糖胜肽149(8.2 mg，1.0 μmol)中添加乙酸銀(I)(2.1 mg，13 μmol)之水溶液(225 μL)，於室溫下反應1小時。添加溶解於100 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，204 μL)之DTT(4.8 mg，31 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(51 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(150)所表示之糖胜肽150(序列編號154)(5.5 mg，0.70 μmol，產率70%)。
ESI-MS：(m/z)C316H504N60O161S5之計算值：[M+4H]4+ 1971.0、[M+5H]5+ 1577.0、[M+6H]6+ 1314.3，實測值1970.6、1576.8、1314.2。
65-7雙硫鍵之形成
將利用上述65-6中記載之方法獲得之糖胜肽150(5.4 mg，0.69 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為 8.0)-DMSO(1/1，v/v，1.7 mL)中，於室溫下反應一整夜。使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→65：35，30分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得包含下述式151所表示之化合物(C(disialo(aminoethylamide))．S1C(disialo)-SRIF28)(序列編號155)之組分。
使用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=90：10→75：25，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對該組分進行進一步純化，而獲得C(disialo(aminoethylamide))．S1C(disialo)-SRIF28(3.1 mg，0.40 μmol，產率58%)。
ESI-MS：C316H502N60O161S5之計算值：[M+4H]4+ 1970.5、[M+5H]5+ 1576.6、[M+6H]6+ 1314.0、[M+7H]7+ 1126.4、[M+8H]8+ 985.8、[M+9H]9+ 876.3，實測值1970.3、1576.4、1313.9、1126.4、985.5、876.1。
實施例66 S1-4C(disialo)-SRIF28之合成 66-1胜肽之合成
取2-氯三苯甲基氯樹脂(100 μmol)置於固相合成用管柱中，利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加Fmoc-Cys(Acm)-OH(49.7 mg，120 μmol)與DIPEA(104.5 μL，600 μmol)之二氯甲烷(3.0 mL)溶液，振盪1小時。利用二氯甲烷及DMF洗淨後，藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF洗淨後，使用Prelude(商標)胜肽合成機，以利用Fmoc法之胜肽固相合成法，合成下述式(152)所表示的處於樹脂之狀態之經保護之胜肽152(序列編號156)。縮合反應係使用HCTU作為縮合劑於DMF中進行。
藉由利用DMF中之20%之哌啶進行處理而將Fmoc保護基除去。利用DMF及二氯甲烷洗淨後，添加TFA：水：三異丙基矽烷：乙二硫醇(=90：2.5：5：2.5)，於室溫下振盪3小時。將樹脂過濾除去，於濾液中添加經冷卻之二乙醚，而以沈澱之形式獲得粗胜肽。利用HPLC[管柱：SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG-120(5 μm)，50×250 mm，流速： 43.7 mL/min，展開溶劑A：0.1% TFA水，B：0.09% TFA/10%水/90%乙腈，梯度A：B=75：25→65：35，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對粗胜肽進行純化，而獲得下述式(153)所表示之胜肽153(序列編號157)(127.2 mg)。
ESI-MS：(m/z)C152H234N46O43S7之計算值：[M+3H]3+ 1207.1、[M+4H]4+ 905.6、[M+5H]5+ 724.6，實測值1206.9、905.1、724.5。
66-2硫醇之糖鏈修飾反應
將利用上述66-1中記載之方法獲得之胜肽153(30.4 mg，8.40 μmol)與化合物a(128 mg，54.7 μmol)溶解於33 mM磷酸緩衝液(pH值為7.4，2.5 mL)中，於室溫下反應一整夜。使用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=82：18→71：29，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(154)所表示之糖胜肽154(序列編號158)(30.9 mg，2.44 μmol，產率29%)。
ESI-MS：(m/z)C496H790N74O291S7之計算值：[M+6H]6+ 2112.7、[M+7-H]7+ 1811.1，實測值2112.8、1811.0。
66-3 Acm基之脫保護
於利用上述66-2中記載之方法獲得之糖胜肽154(30.9 mg，2.44 μmol)中添加乙酸銀(I)(5.0 mg，30 μmol)之水溶液(0.98 mL)，於室溫下反應20分鐘。其後，添加溶解於200 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為7.4，0.98 mL)之DTT(11.8 mg，76.5 μmol)及100 mM抗壞血酸水溶液(244 μL)，迅速利用過濾器進行過濾。使用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：0.1% AcOH水，B：0.09% AcOH/10%水/90%乙腈，梯度A：B=82：18→70：30，20分鐘，線性濃度梯度溶出]對濾液進行純化，而獲得下述式(155)所表示之糖胜肽155(序列編號159)(20.6 mg，1.64 μmol，產率67%)。
ESI-MS：(m/z)C490H780N72O289S7之計算值：[M+5H]5+ 2506.6、[M+6H]6+ 2089.0、[M+7H]7+ 1790.7，實測值2506.5、2088.8、1790.4。
66-4雙硫鍵之形成
將利用上述66-3中記載之方法獲得之糖胜肽155(20.6 mg，1.64 μmol)溶解於100 mM之Tris-鹽酸緩衝液(pH值為8.0)-DMSO(1/1，v/v，2.1 mL)中，於室溫下反應2天。其後，使用HPLC[管柱：SHISEIDO Proteonavi(5 μm)，20×250 mm，流速：7.0 mL/min，展開溶劑A：10 mM乙酸銨水溶液，B：10 mM乙酸銨-乙腈(1/9，v/v)，梯度A：B=75：25→72：28，15分鐘，線性濃度梯度溶出]對反應溶液進行純化，而獲得下述式(156)所表示之S1-4C(disialo)-SRIF28(序列編號160)(11.6 mg，0.93 μmol，產率57%)。
ESI-MS：(m/z)C490H778N72O289S7之計算值：[M+5H]5+ 2506.2、[M+6H]6+ 2088.7、[M+7H]7+ 1790.5，實測值2506.1、2088.6、1790.4。
表1-1至表1-7中示出利用實施例1~66中記載之方法獲得 的附加糖鏈之SRIF胜肽之MS圖譜資料(ESI-MS)。分子質量係藉由使用MassLynx Version 4.1(Waters公司製造)，進行多價蛋白質譜分析之反卷積(deconvolution)而獲得。
實施例67-1 受體結合親和性之算出
利用下述之方法進行競爭性結合實驗，算出受體結合親和性。
競爭性結合實驗中所使用之試劑與其正式化學名如下所述。HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸)、BSA(bovine serum albumin，牛血清白蛋白)。
競爭性結合實驗係委託Ricerca Biosciences公司進行實驗及資料分析。將所使用之受體亞型及受體膜標本示於表2。各結合實驗中共通地使用[125I]Tyr11-體抑素14(Tyr11-SRIF14)作為標記配體，使用體抑素-14(SRIF14)作為非標記配體，使用包含5 mM MgCl2、1 mM CaCl2、0.1% BSA且pH值為7.4的25 mM HEPES作為緩衝液。試驗物質係以0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、或1000 nM之濃度使用，與膜標本混合而製成反應液。又，將反應液中所添加之標記配體及非標記配體之濃度示於表2。關於反應液之培養條件，若為SSTR2，則設為25℃下4小時，若為SSTR1、SSTR3、SSTR4、SSTR5，則設為25℃下2小時。各次實驗分別使用SRIF14作為陽性對照。資料分析係使用MathIQTM(ID Business Solutions公司，UK)，利用非線性最小平方法，以結合抑制率之數值資料為基礎而求出50%抑制濃度(IC50值)。結合抑制常數(Ki值)係藉由Cheng,Y等人之方法(Biochem Pharmacol，22,3099-3108，1973)而算出。
將實施結合實驗之化合物及結合實驗之結果示於表3A。又，以相同之方式對作為對照化合物之奧曲肽、SRIF14及SRIF28進行評價。再者，關於奧曲肽，由於將最高濃度設定為100 nM，故而於SSTR1、及SSTR4下無法算出IC50值，記為>100 nM。
再者，圖1A及圖1B係表示與表3A中之化合物名稱對應的附加糖鏈之胜肽(糖鏈附加體)之結構的一例。
[表9]
作為對照之奧曲肽與SSTR2、SSTR3、SSTR5之各受體結合，SRIF14及SRIF28與全部SSTR結合。如表3A所示，本發明之化合物與全部SSTR牢固地結合。陽性對照之 SRIF14對SSTR1之結合親和性以Ki值計為0.362 nM，相對於此，本發明之具有1條或2條糖鏈之化合物為0.704~147 nM，表現出優異之結合親和性。又，本發明之具有3條糖鏈之化合物(實施例24、25、29之化合物)亦顯示3.49 nM、16.9 nM、及57.3 nM，具有優異之結合親和性。再者，由於其血中半衰期延長而生物可用度(生物利用率：BA(bioavailability))亦大幅度增大，因此即便於結合親和性之Ki值稍高之情形時，亦可於活體內對受體有效地發揮作用。同樣地，SRIF14對SSTR2、SSTR3及SSTR4之結合親和性以Ki值計分別為0.00755 nM、0.0450 nM、0.273 nM，相對於此，本發明之化合物分別為0.0119~3.33 nM、0.0531~3.77 nM、0.564~40.5 nM，均表現出優異之結合親和性。又，SRIF14對SSTR5之結合親和性為0.326 nM，相對於此，本發明之化合物表現出高達8.33 nM之結合親和性。
可知，實施例1~6、10、13~19、26、27、30、及31之化合物為對SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5之全部受體具有結合親和性之1條糖鏈修飾體。同樣地，可知實施例20~23、及28為對SSTR1~SSTR5之全部受體具有親和性之2條糖鏈修飾體，實施例24、25、及29為對SSTR1~SSTR5之全部受體具有親和性之3條糖鏈修飾體。
實施例67-2 受體結合親和性之算出-2
對表3B所示之各化合物，利用實施例67-1中記載之方法進行競爭性結合實驗，算出受體結合親和性。又，以相同 之方式對作為對照化合物之SRIF14及SRIF28進行評價。將結合實驗之結果示於表3B。
再者，圖1C及圖1D係表示與表3B中之化合物名稱對應的附加糖鏈之胜肽之結構的一例。
[表10]
如表3B所示，作為對照之SRIF14及SRIF28與SSTR1~SSTR5之全部受體結合。此處，由於試驗實施次數等與實 施例67-1不同，故而SRIF14對各受體之Ki值不同，為2.5倍至13.2倍之較高之數值。實施例1、7、8、9、26、27、32、33、34、35、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65及66之化合物對SSTR1之Ki值為1.46~100 nM，同樣對SSTR2之Ki值為0.0536~6.51 nM，對SSTR3之Ki值為0.160~7.44 nM，對SSTR4之Ki值為1.39~59.0 nM，對SSTR5之Ki值為0.310~95.0 nM，對全部受體均表現出較高之結合親和性。實施例12之化合物對SSTR2及SSTR5之Ki值為SRIF14之280~1600倍，但對SSTR1、SSTR3及SSTR4為17.9、7.44、24.1 nM之Ki值，可認為結合親和性得以保持。實施例38之化合物對SSTR1、SSTR2、SSTR3之Ki值為SRIF14之310~5300倍，親和性顯著降低，但對SSTR4及SSTR5為110、33.0 nM之Ki值，可認為結合親和性得以保持。實施例49之化合物對SSTR2及SSTR4之Ki值為SRIF14之170倍及46倍以上，但對SSTR1、SSTR3、SSTR5分別為270 nM、14.0 nM、23.0 nM之Ki值，可認為結合親和性得以保持。
實施例67-3 使用受體表現細胞之促效劑活性評價-1
體抑素受體為G蛋白共軛受體(GPCR，G-protein coupled receptor)。SSTR1~SSTR5均經由作為G蛋白之亞族之Gi/Go而抑制腺苷酸環化酶活性，從而使細胞內cAMP濃度降低。於本實驗體系中，使用各體抑素受體表現細胞，算出試驗物質之cAMP產生抑制作用之IC50值，對促效劑活性進 行評價。又，以相同之方式對作為對照化合物之SRIF14、SRIF28進行評價。
本實驗中所使用之試劑與其正式化學名如下所述。DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium，達爾伯克氏改良伊格爾氏培養基)、IBMX(3-isobuty1-1-methylxanthine，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、HBSS(Hank's Buffered Salt Solution，漢克氏平衡鹽緩衝溶)。
對SSTR2~SSTR5之評價係於以下之條件下進行實驗。作為緩衝液，使用包含0.3% BSA、0.5 mM IBMX之DMEM，以104 cells/well(細胞/孔)播種表3C所示之受體表現細胞。試驗物質係以0.00001 nM、0.0001 nM、0.001 nM、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、或1000 nM之濃度與10 μM佛司可林(forskolin)混合而處置，於室溫下反應30分鐘。反應後，利用0.2 N之HCl使細胞溶解，使用Cayman公司之cyclic AMP EIA套組(Cayman，582002)測定積累於細胞內之cAMP量。
對SSTR1之評價係委託Cerep公司進行實驗。作為緩衝液，使用包含20 mM HEPES(pH值為7.4)、500 μM IBMX之HBSS，以104 cells/well播種SSTR1受體表現細胞。試驗物質係以0.001 nM、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、或100 nM之濃度與1 μM NKH477混合而處置，於37℃下反應20分鐘。反應後，使用Cisbio公司之cAMP dynamic2套組(cisbio，62AM4PE)測定積累於細胞內之cAMP量。
[表11]
將使用實施例1、18、27、28、57及58之化合物作為糖鏈附加體時的促效劑活性評價試驗之實驗結果(IC50(nM))示於表3D及圖1E。關於對照化合物之SRIF14及SRIF28之IC50，對SSTR1為0.83~0.89 nM，又，對SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5分別為0.0076~0.073 nM、0.029~0.21 nM、0.015~0.074 nM、0.066~0.12 nM。糖鏈附加體之化合物對SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5之促效劑活性之IC50為1.0~2.4 nM、0.041~0.10 nM、0.12~0.30 nM、0.039~0.085 nM、0.043~0.081 nM，對SSTR1~SSTR5之全部受體均表現出優異之促效劑活性。根據實施例67-1及實施例67-2所示之結果，可明確該等化合物具有受體結合能力，且可明確該等化合物藉由與受體結合而發揮促效劑活性。
[表12]
實施例67-4 使用受體表現細胞之促效劑活性評價-2
使用表3E中記載之各化合物作為糖鏈附加體，以與實施例67-3相同之方式實施促效劑活性評價試驗。將實驗結果示於表3E。再者，表3E中，記載「-(連字符)」之欄係表示未實施。
於表3E中，糖鏈附加體之化合物對SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、SSTR5之促效劑活性之IC50分別為1.2~22 nM、0.019~1.4 nM、0.039~3.8 nM、0.033~1.6 nM、0.031~1.1 nM，對SSTR1~SSTR5之受體均表現出促效劑活 性。根據實施例67-1及實施例67-2所示之結果，可明確該等化合物具有受體結合親和性，該等化合物係藉由與受體結合而發揮促效劑活性。
實施例68 使用大鼠之藥物動力學試驗1
為了確認本發明之附加糖鏈之聚胜肽(糖鏈附加體)與未附加糖鏈之SRIF28相比，藥物血漿中濃度-時間曲線下面積(AUC)、血中半衰期(t1/2)、平均滯留時間(MRT)、及生物利用率等藥物動力學特性改善，而使用大鼠進行靜脈內投予及皮下投予之藥物動力學分析。
68-1投予液及試劑之製備
將糖鏈附加體(S1C(disialo)-SRIF28)溶解於日本藥典生理鹽水(大塚製藥工廠公司製造)中製備40 μM溶液，作為投予液。PBS溶液係將磷酸鹽緩衝液(Sigma公司製造之P4417)1錠溶解於超純水200 mL中而製備。EDTA-PBS係利用PBS將EDTA-2Na(和光純藥工業公司製造)以成為2 mg/mL之方式溶解而製備。含有抑肽酶之EDTA-PBS液係利用EDTA-PBS將抑肽酶(和光純藥工業公司製造之010-11834)以成為0.142 mg/mL之方式溶解而製備，用作對所採集之血液之抗凝血劑。
68-2血漿樣品之製備
將上述68-1中所製備之投予液，於未禁食狀態下以1 mL/kg之用量使用注射筒及26G注射針(均為TERUMO公司製造)投予至雄性之SD系大鼠(Crl：CD(SD)，Charles River Japan股份有限公司，6週齡，n=3，體重161.3~239.3 g)的尾靜脈或背部皮下(以S1C(disialo)-SRIF28計為40 nmol/kg)。於投予前、投予後2分鐘、5分鐘、15分鐘、30分鐘、1小時、2小時、4小時、8小時後，自大鼠頸部靜脈採血。將所採集之血液0.2 mL與上述68-1中所製備之含有抑肽酶之EDTA-PBS液0.2 mL迅速混合，於冰上放置30分鐘以上。離心分離(1,870xg，4℃，10分鐘)後，採集上清液250 μL，而製成血漿樣品。作為空白血漿，使用對自未經處置之大鼠頸部靜脈採集之血液以相同之方式進行處理而獲得之血漿。血漿樣品在用於測定之前係冷凍保存。再者，晶片及試管係使用BM Equipment公司之低吸附性者。
68-3血漿中濃度測定
使用Phoenix Pharmaceuticals公司之體抑素EIA套組(Phoenix Pharmaceuticals Inc，EK-060-03)對上述68-2中獲得之血漿樣品中的S1C(disialo)-SRIF28之血漿中濃度進行測定。使用EIA套組附帶分析緩衝液，將血漿樣品稀釋5倍、20倍、100倍、400倍、1600倍，而製成測定樣品。用以製作校準曲線之標準液係以如下方式製備。首先，使用EIA套組附帶分析緩衝液，將上述68-2中獲得之空白血漿與血漿樣品同樣地稀釋，而製成標準液製備用之分析緩衝液(例如，於將血漿樣品稀釋100倍之情形時，於EIA套組附帶分析緩衝液中添加1/100量之空白血漿而製成標準液製備用分析緩衝液)。利用PBS溶液對S1C(disialo)-SRIF28進行稀釋而製備100 μM溶液，由100 μM溶液製備2 μM溶液。使用標準液製備用分析緩衝液，將所獲得之2 μM S1C(disialo)-SRIF28溶液分階段地稀釋，而製備20 nM、10 nM、2 nM、0.4 nM、0.08 nM、0.04 nM之標準液。使所獲得之結果乘以稀釋率，進而乘以作為抗凝血劑處理之利用含有抑肽酶之EDTA-PBS液之稀釋率2，藉此算出血漿中濃度。作為對照，使用未附加糖鏈之SRIF28代替糖鏈附加體進行相同之操作。將所獲得之血漿中之S1C(disialo)-SRIF28濃度推移示於圖2。
68-4藥物動力學參數之算出
根據所獲得之S1C(disialo)-SRIF28濃度推移，使用矩分析方法，藉由梯形法算出AUC。又，利用外推法求出靜脈內投予時之預測初期濃度(C0)，進而根據t1/2、MRT、及皮下投予時之實測值求出最高血漿中濃度(Cmax)。將所獲得之藥物動力學參數示於表4。
如根據圖2及表4所示之結果所判明般，S1C(disialo)-SRIF28與未附加糖鏈之SRIF28相比，t1/2及MRT顯著延長，又，確認到AUC及Cmax增加。可認為該等情況之原因在於，藉由形成糖鏈附加體而對血液中之分解活性之抗性增加。可明確糖鏈附加體與非糖鏈附加體相比，活體中之穩定性提高。又，可認為AUC及Cmax增加之主要原因除本 發明之生物利用率提高以外，於該等活體中之穩定性提高亦為一個原因。
實施例69 使用大鼠之藥物動力學試驗2
使用S1C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)-SRIF28及S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。作為對照，使用未附加糖鏈之SRIF28代替糖鏈附加體。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖3。
實施例70 使用大鼠之藥物動力學試驗3
使用S1C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．R13C(disialo)-SRIF28及S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。作為對照，使用未附加糖鏈之SRIF28代替糖鏈附加體。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖4。
實施例71 使用大鼠之藥物動力學試驗4
使用S1C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)-SRIF28、A9C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28、及S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖5。
實施例72 使用大鼠之藥物動力學試驗5
使用S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、及 S1-3C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖6。
根據實施例69~72之藥物動力學試驗中獲得的血漿中之化合物濃度推移，以與實施例68相同之方式算出各化合物之藥物動力學參數。又，使用所獲得之參數，藉由以下之數式算出生物利用率。將結果示於表5A。
BA(%)=(AUC(sc)/Dose(sc))/(AUC(iv)/Dose(iv))
AUC(sc)：皮下投予時之AUC(min．nM)
Dose(sc)：皮下投予時之投予量(nmol/kg)
AUC(iv)：靜脈內投予時之AUC(min．nM)
Dose(iv)：靜脈內投予時之投予量(nmol/kg)
[表15]
根據表5A所示之結果可判明，本發明之糖鏈附加體係隨著修飾糖鏈之條數增加而其生物利用率增加。即，判明非糖鏈附加體為5%，但附加1條糖鏈的附加糖鏈之聚胜肽為 37~60%，平均增加至50%，有間隔地附加有2條糖鏈者為77~85%，平均增加至81%，有間隔地附加有3條糖鏈者增加至91%。又，比較附加糖鏈之間隔較密者判明，附加1條者增加37%，附加2條者增加至55%，附加3條者增加至69%(實施例1、20、及24之化合物)。根據該等結果，證明藉由本發明之糖鏈修飾，生物利用率提高。
皮下投予時生物利用率增加之主要原因存在各種藥物動力學變動因子。作為其中一個原因，可考慮化合物之血中穩定性、或向血中之(自投予部位之)轉移性。如表5A所示，可確認皮下投予時之AUC隨著修飾糖鏈條數之增加而增大(1條：2209 min．nM，2條(有間隔)：3400 min．nM，3條(有間隔)：4015 min．nM)，該皮下投予時之AUC係用以推測皮下投予時之血中轉移性的指標，因而推測血中轉移性之提高有助於生物利用率之增加。
又，隨著修飾糖鏈之條數增加，確認到靜脈內及皮下投予時之t1/2及MRT之延長作用(例如靜脈內投予時之t1/2：1條：19.0 min，2條(有間隔)：27.2 min，3條(有間隔)：39.8 min)，推測血液中之穩定性提高。另一方面，靜脈內投予時之AUC並未獲得與修飾糖鏈條數成比例之增大(1條：4453 min．nM，2條(有間隔)：4198 min．nM，3條(有間隔)：4402 min．nM)，可認為並非僅因化合物之修飾糖鏈條數增加而引起的血中穩定性增加貢獻於生物利用率之增加。
關於皮下投予時之Cmax，與非糖鏈附加體相比，直至修 飾糖鏈條數為2條為止(0條：4.47 nM，1條：30.5 nM，2條(有間隔)：35.6 nM)均增加，但當為3條(有間隔)(24.8 nM)時反而減少。考慮自投予部位(本實施例中為皮下投予)之血中轉移之情形時，作為AUC增加之主要原因，可推測迅速向血液中轉移、或者雖緩慢但持續向血液中轉移之兩種形式。推測前者具有避免於投予部位分解之優點，但只要於穩定性上無問題，則後者之形式之血中轉移性更高。可認為生物利用率較高之修飾有3條糖鏈者的Cmax減少的情況，係顯示並非急遽而緩慢且持續之血中轉移性的結果。根據該等情況，可認為本發明之修飾糖鏈條數之增加並不會引起血漿中濃度急遽上升，而顯示出持續之血中轉移性(通常亦可稱為吸收延遲效果)。
根據表5A所示之結果可判明，作為修飾位置，於隔開間隔之情形與較密之情形時，t1/2及MRT並無顯著差異(例如靜脈內投予時之t1/2：2條(密)：28.8 min，2條(有間隔)：27.2 min，3條(密)：38.5 min，3條(有間隔)：39.8 min)。
又，關於AUC，於靜脈內投予時，糖鏈修飾較密時AUC增大。即，於2條糖鏈之情形時，與隔開間隔之化合物21、化合物22、化合物23之4029~4465 min．nM相比，較密之化合物20為7306 min．nM，於3條糖鏈之情形時，與隔開間隔之化合物25之4402 min．nM相比，較密之化合物24為5660 min．nM。
另一方面，關於生物利用率，糖鏈修飾位置隔開間隔者與較密者相比提高。即，於2條糖鏈之情形時，與較密之 化合物20之55%相比，隔開間隔之化合物21、化合物22、化合物23為77~85%(平均值81%)，於3條糖鏈之情形時，與較密之化合物24之69%相比，隔開間隔之化合物25為91%。根據該等情況，可認為作為本發明之進行糖鏈修飾之位置，與較密地修飾複數條相比，隔開間隔地修飾複數條之方式更有助於提高生物利用率。
實施例73 使用大鼠之藥物動力學試驗7
使用S1C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo(amide))-SRIF28、S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖7。
實施例74 使用大鼠之藥物動力學試驗8
使用S1C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo(Bn))-SRIF28、S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖8。
實施例75 使用大鼠之藥物動力學試驗9
使用S1C(disialo)-SRIF28、R13C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖9。
實施例76 使用大鼠之藥物動力學試驗10
使用S1C(disialo)-SRIF28、E12C(disialo)-SRIF28、N19C(disialo)-SRIF28、29C(disialo)-SRIF28、S1C(monosialo)- SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖10。
實施例77 使用大鼠之藥物動力學試驗11
使用S1C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28、C(disialo)-SRIF14作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖11。
實施例78 使用大鼠之藥物動力學試驗12
使用C(disialo)-SRIF14、C(disialo)-C12linker-SRIF14、C(disialo)-PEGlinker-SRIF14作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖12。
實施例79 使用大鼠之藥物動力學試驗13
使用SRIF28、S1C(disialo)-SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28、S1C(diGlcNAc)-SRIF28、S1C(diMan)-SRIF28、S1C(GlcNAc)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖13。
實施例80 使用大鼠之藥物動力學試驗14
使用S1C(disialo)-SRIF28、S1C(tetrasialo)-SRIF28、S1C(trisialo)-SRIF28、S1C(Asn(disialo))-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之 化合物濃度推移示於圖14。
實施例81 使用大鼠之藥物動力學試驗15
使用SRIF28、S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、S1-3C(disialo)-SRIF28、S1-4C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖15。
實施例82 使用大鼠之藥物動力學試驗16
使用SRIF14、C(disialo)-SRIF14、C(disialo)-K-SRIF14、C(disialo)-R-K-SRIF14、2C(disialo)-R-K-SRIF14、3C(disialo)-R-K-SRIF14作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖16。
實施例83 使用大鼠之藥物動力學試驗17
使用S1C(asialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28、S1-3C(asialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃度推移示於圖17。
實施例84 使用大鼠之藥物動力學試驗18
使用S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28、C(disialo(aminoethylamide)．S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28、S1-2C(disialo(amide))-SRIF28作為糖鏈附加體，除此以外，以與實施例68相同之方式實施藥物動力學試驗。將所獲得之血漿中之化合物濃 度推移示於圖18。
根據實施例73~84之藥物動力學試驗7~18中獲得的血漿中之化合物濃度推移，以與實施例68相同之方式，算出各化合物之藥物動力學參數。將所獲得之藥物動力學參數示於表5B~表5F。
[表16]
根據表5B所示之結果可判明，S1C(disialo)-SRIF28、E12C(disialo)-SRIF28、R13C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28、N19C(disialo)-SRIF28、29C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28於靜脈內投予時，與非糖鏈附加體之SRIF28相比t1/2延長13~18倍，AUC增加8~23倍。又，與非糖鏈附加體之SRIF14相比，C(disialo)-SRIF14、C(disialo)-K-SRIF14、C(disialo)-R-K-SRIF14於靜脈內投予時t1/2延長33~38倍，AUC增加44~55倍。又，C(disialo)-C12linker-SRIF14、C(disialo)-PEGlinker-SRIF14與非糖鏈附加體之SRIF14相比，t1/2延長22~33倍，AUC增加14~30倍。即，認為與實施例68之情形同樣，藉由進行糖鏈修飾，血液中之穩定性提高。
[表17]
根據表5C所示之結果可判明，將進行修飾之糖鏈之大小變更為GlcNAc(單糖)、diMan(5糖)、diGlcNAc(7糖)、asialo(9糖)、monosialo(10糖)、disialo(11糖)、trisialo(14糖)、tetrasialo(17糖)之情形時，依賴於進行修飾之糖鏈之大小而皮下投予時之t1/2、AUC、生物利用率分別增加2~17倍、3~120倍、2~11倍。根據上述情況，可明確藉由變更進行修飾之糖鏈之大小，不僅使血中穩定性提高，且使其增加率具有變化。又，已知該等糖鏈之中，二甘露糖糖鏈或去唾液酸糖鏈等可與特定之蛋白質進行相互作用，因此認為亦可利用於對特定蛋白質、或者具有特定蛋白質的器官或細胞之尋靶(targeting)。又，附加有作為非還原末端之唾液酸之修飾而例如藉由對羧基導入胺基乙基胺基(aminoethylamide)、胺基(amide)、Bn等從而使電荷變更之糖鏈的S1C(disialo(amide))-SRIF28、S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28、S1C(disialo(Bn))-SRIF28於靜脈內投予時，與非糖鏈附加體相比，t1/2延長11~14倍，AUC增加7~12倍，血中穩定性提高。該等情況表明唾液酸之羧基會對血中滯留性造成很大影響，顯示出可藉由使羧基之負電荷消失(disialo(Bn)、disialo(amide))、或轉換成正電荷(disialo(aminoethylamide))而控制血中清除率或體內分佈之可能性(利用法)。
根據表5D所示之結果可判明，於SRIF14上修飾有1條disialo糖鏈之C(disialo)-R-K-SRIF14、修飾有2條之2C(disialo)-R-K-SRIF14、修飾有3條之3C(disialo)-R-K-SRIF14於靜脈內投予時，與非糖鏈附加體相比t1/2分別延長38倍、63倍、71倍，又，AUC分別增加55倍、42倍、36倍。同樣地，於SRIF28上修飾有1條disialo糖鏈之S1C(disialo)-SRIF28、修飾有2條之S1-2C(disialo)-SRIF28、修飾有3條之S1-3C(disialo)-SRIF28、修飾有4條之S1-4C(disialo)-SRIF28於靜脈內投予時，與非糖鏈附加體相比t1/2分別延長13倍、21倍、30倍、48倍，又，AUC分別增加11倍、12倍、12倍、15倍。可明確，SRIF14及SRIF28任一者均隨著進行修飾之disialo糖鏈之條數增加而血中穩定性提高。
根據表5E所示之結果可判明，於SRIF28上修飾有1條asialo糖鏈之S1C(asialo)-SRIF28、修飾有2條之S1-2C(asialo)-SRIF28、修飾有3條之S1-3C(asialo)-SRIF28於靜脈內投予時，與非糖鏈附加體相比t1/2分別延長10倍、6倍、5倍，又，AUC分別增加10倍、6倍、6倍。可明確於進行修飾之糖鏈為asialo糖鏈之情形時，血中穩定性亦提高。
[表20]
根據表5F所示之結果可判明，S1-2C(disialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28、C(disialo(aminoethylamide))．S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28、S1-2C(disialo(amide))-SRIF28於靜脈內投予時，與非糖鏈附加體相比t1/2分別延長6~21倍，AUC分別增加6~12倍。即，藉由對SRIF28修飾糖鏈，而使血中穩定性提高。又，隨著唾液酸糖鏈條數之增加，靜脈內投予及皮下投予時均t1/2、AUC、Cmax、BA增加。另一方面，於使唾液酸之羧基之負電荷消失之情形(2C(disialo(Bn))、2C(disialo(amide)))或鄰接地追加正電荷之情形(C(disialo(aminoethylamide))．S1C(disialo))時，儘管皮下投予時之t1/2延長，但AUC或Cmax均不增加。唾液酸之羧基會對血中滯留性或血中轉移造成大的影響，因此顯示出可藉由對糖鏈末端之電荷進行轉換，而控制血中清除率或體內分佈之可能性(利用法)。
實施例85 使用大鼠血漿之血漿中穩定性試驗 85-1處置液、試劑及大鼠血漿之製備
將糖鏈附加體及未附加糖鏈之SRIF28溶解於PBS溶液中製備2 μM溶液，作為處置液。10% TFA係利用水將三氟乙酸(和光純藥工業公司製造之208-02746)以成為10 v/v%之方式溶解而製備。大鼠血漿係由Wistar系大鼠(Crlj：Wistar，雄性，Charles River Japan股份有限公司，7週齡)，製成加肝素之血漿(肝素：日本藥典肝素鈉注射液(持田製藥))而製備。
85-2血漿添加樣品之製備
於大鼠血漿0.27 mL(n=3)中迅速混合上述85-1中製備之糖鏈附加體處置液0.03 mL而製成血漿添加樣品，於37℃恆溫槽中進行保溫。混合後，於0分鐘、及1~24小時為止期間經時採集血漿添加樣品0.04 mL，與0.01 mL之10% TFA迅速混合。離心分離(20,000xg，4℃，10分鐘)後，採集上清液0.04 mL，作為血漿中穩定性測定樣品。取樣時間係設定為0小時、1小時、2小時、4小時，或0小時、4小時、8小時、24小時。作為空白血漿，係使用除使用PBS溶液作為處置液以外以相同之方式進行處理而獲得之血漿。血漿樣品在用於測定之前係冷凍保存。每次實驗分別使用未附加糖鏈之SRIF28作為陽性對照。
85-3樣品中濃度測定及血漿中穩定性指數之算出
利用與實施例68-3之血漿中濃度測定相同之方法，測定上述85-2中獲得之血漿中穩定性測定樣品中所殘留的糖鏈附加體之濃度。將混合後0分鐘之糖鏈附加體濃度設為100%，以百分率(%)表示時間經過後之殘留率，根據以下之指數式(1)之消失速度常數，使用算出式(2)算出半衰期。其後，將每次實驗之未附加糖鏈之SRIF28的半衰期設為1，算出糖鏈附加體之血漿中穩定性指數(PS index)。將結果示於表6及圖19。又，將血漿中穩定性指數為20以上者記為>20。再者，於圖19中，即便對於血漿中穩定性指數超過20者，亦以20作為上限而進行記載。
殘留率(%)=100．e(k．t) (1)
e：自然對數之底數
k：消失速度常數
t：時間(小時)
半衰期(小時)=0.693/k (2)
根據圖19所示之結果可判明，本發明之附加糖鏈之聚胜肽與SRIF28相比，血漿中穩定性增加。即，於1位、5位、9位、12位附加有1條糖鏈者(實施例1、2、3、4之化合物)為SRIF28之4.5倍~6.7倍，於13位附加有糖鏈者為15.9倍(實施例5之化合物)、於14位附加有糖鏈者為19.1倍(實施 例6之化合物)，於30位附加有糖鏈者為16.8倍(實施例14之化合物)。又，於19位、C末端側進而附加有1個附加糖鏈之胺基酸者為20倍以上(實施例10、13之化合物)。表示隨著附加糖鏈之位置自1位向C末端側移動，而血漿中穩定性增加。
實施例86 使用大鼠之GH產生抑制試驗
本發明之附加糖鏈之聚胜肽如實施例67所示般，對SSTR之各受體具有親和性。另一方面，亦可見對各SSTR之親和性衰減者，但為證明即便於此種情形時，亦由於實施例68~85中所示之血中半衰期之延長或生物利用率之增大等而於活體內對受體顯示有效之藥理學作用，而以使用大鼠之體內試驗之形式，實施本發明之附加糖鏈之聚胜肽之投予對於生長激素(GH)產生之效果的評價試驗。可認為血液中之GH產生量之增加係經由GH之旁分泌作用，對各種器官引起細胞增殖或分化系統、生物合成系統活化或抑制，而對活體反應造成影響。自下丘腦釋出之體抑素可抑制自腦下垂體前葉向血液中分泌GH。本實驗體系係設為以血中GH產生量為指標，可對糖鏈附加體對SSTR之藥理作用、及糖鏈附加體投予後之血中殘留進行評價之試驗體系而實施。
86-1 投予液及試劑之製備
使用S1C(disialo)-SRIF28、N19C(disialo)-SRIF28及29C(disialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，溶解於日本藥典生理鹽水(大塚製藥工廠公司製造)中製備1~100 μM溶液，作 為投予液。又，作為GH游離促進劑，係使用GRF(GH釋出激素，Growth hormone releasing factor)。GRF係利用注射用水(Lot.09H18C，扶桑藥品工業公司製造)1 mL將GRF注射液(注射用GRF Sumitomo 50，Lot.2006C，大日本住友製藥公司製造)溶解後，以成為2 μg/mL之方式利用生理鹽水稀釋25倍而製備。採血時，用作抗凝血劑之肝素係直接以原液之狀態使用日本藥典肝素鈉注射液(Lot.B084，持田製藥公司製造)。
86-2血漿樣品之製備
將上述86-1中所製備之投予液，於未禁食狀態下以1 mL/kg之用量使用注射筒及26G注射針(均為TERUMO公司製造)投予至雄性之SD系大鼠(Crl：CD(SD)，Charles River Japan股份有限公司，6週齡，n=3，體重145.2~163.9 g)之背部皮下。作為對照組，係以相同之方式投予不含附加糖鏈之聚胜肽之生理鹽水(媒劑組)。其後，即糖鏈附加體投予後5~6分鐘期間，使用注射筒及注射針將作為全身麻醉劑之戊巴比妥鈉(Somunopentyl，Lot.0608101，共立製藥公司製造)以成為50 mg/kg之方式投予至腹腔內。於糖鏈附加體投予後1小時，即於麻醉下經過50分鐘以上之狀態下，使用注射筒及注射針將作為GH游離促進劑之GRF以1 mL/kg之用量投予至尾靜脈。於GRF投予後5分鐘，使用添入有肝素之注射筒及注射針自大鼠頸部靜脈進行採血。將所採集之血液0.4 mL於冰上放置20分鐘以上之後，進行離心分離(1,870xg，4℃，10分鐘)，採集上清液100 μL，作 為血漿樣品。作為空白血漿，係使用對自未經處置之大鼠頸部靜脈採集之血液以相同之方式進行處理而獲得之血漿。血漿樣品在用於測定之前係冷凍保存。
86-3血漿中GH濃度之測定
使用SPI-Bio公司之大鼠生長激素EIA套組(Rat Growth Hormone EIA Kit)(SPI-Bio，A05104)，對上述86-2中獲得的血漿樣品中之GH濃度進行測定。使用EIA套組附帶分析緩衝液將血漿樣品稀釋20倍、100倍、500倍，作為測定樣品。用以製作校準曲線之標準液係依據隨附之說明書利用蒸餾水製備40 ng/mL溶液之後，使用分析緩衝液分階段地稀釋，而製備20 ng/mL、10 ng/mL、5 ng/mL、2.5 ng/mL、1.25 ng/mL、0.63 ng/mL、0.31 ng/mL。使所獲得之結果乘以稀釋率，藉此算出GH濃度。將所獲得之血漿樣品中GH濃度示於表7。
根據表7所示之結果可判明，本發明之糖鏈附加體抑制 了大鼠之GH產生。實施例1、實施例10、實施例13之糖鏈附加體於藉由實施例67-1之方法進行測定之情形時，對各受體之Ki值與不具有糖鏈之SRIF14之Ki值的比顯示為100：1~1.3：1(實施例25之化合物)之範圍內。又，實施例1之糖鏈附加體於藉由實施例68~72之方法進行測定之情形時，血中半衰期顯示為增大10倍以上。本實施例表明，糖鏈附加體於活體內亦可有效地發揮藥理學作用。
又，本發明之糖鏈附加體即便於在GRF投予之1小時前投予之情形時，亦具有GH產生抑制作用。
又，於實施例1、實施例10、及實施例13之糖鏈附加體間，對於大鼠GH產生能力有效之投予量相差10倍左右。上述情況與藉由實施例67-1之方法進行測定時，其等之受體親和性以Ki值計具有10倍左右之差的情況類似。表明於糖鏈附加體之親和性稍微衰減之情形時，亦具有藥理學活性。
實施例87 使用大鼠之GH產生抑制試驗2
以與實施例86-1~86-3相同之方式，實施以下所示之糖鏈附加體之化合物的大鼠GH產生抑制試驗。作為糖鏈附加體，係使用S1C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)-SRIF28、A9C(disialo)-SRIF28、E12C(disialo)-SRIF28、R13C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28、S1C(disialo(Bn))-SRIF28、S1C(disialo(amide))-SRIF28、S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28、S1C(monosialo)-SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28、C(disialo)- R-K-SRIF14、S1-2C(asialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28、及S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28。將所獲得之血漿樣品中GH濃度示於表8。
根據表8所示之結果可判明，本發明之附加糖鏈之聚胜肽抑制了大鼠之GH產生。S1C(disialo)-SRIF28於本試驗體系中自1 nmol/kg起即開始抑制GH產生，於3~10 nmol/kg時表現出82~99%之GH產生抑制效果。可認為其係由於如實施例67-1及67-2及實施例68~85所示般對SSTR1~SSTR5具有親和性，且血中滯留性提高之緣故。
於實施例67-1及67-2中與S1C(disialo)-SRIF28顯示同等之親和性的N5C(disialo)-SRIF28、A9C(disialo)-SRIF28、E12C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)-D-Trp-SRIF28、S1C(disialo(Bn))-SRIF28及C(disialo)-R-K-SRIF14以10 nmol/kg顯示95~99%之GH產生抑制效果，顯示出與S1C(disialo)-SRIF28同等之效果。
根據實施例68~85之方法所示之結果，S1C(monosialo)-SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28及S1C(disialo(amide))-SRIF28之皮下投予時之AUC為S1C(disialo)-SRIF28之1/3~1/2，又，S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28為1/7。另一方面，藉由實施例67-1及67-2所示之方法，該等均顯示出高於S1C(disialo)-SRIF28之親和性。因此，可認為於本實驗體系中，S1C(monosialo)-SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28、S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28及S1C(disialo(amide))-SRIF28以10 nmol/kg抑制70~99%之GH產生，顯示出與S1C(disialo)-SRIF28同等之效果。
藉由實施例67-1及67-2所示之方法，R13C(disialo)- SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28及S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28顯示出低於S1C(disialo)-SRIF28之親和性。另一方面，根據實施例68~85之方法所示之結果，其等為皮下投予時之AUC提高至S1C(disialo)-SRIF28之1.8倍至2.8倍之化合物。於本實驗體系中，R13C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28及S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28藉由投予10或100 nmol/kg而顯示出GH產生抑制活性。該等結果表明，即便於受體親和性降低之情形時，藉由血中穩定性增大亦可補償或增大體抑素之活性。
實施例88 消化道阻塞模型中之藥效試驗
如實施例86及實施例87所示般，已證實本發明之附加糖鏈之聚胜肽即便於大鼠活體內，亦可作為促效劑而有效地發揮作用。繼而，為證明其即便於疾病模型中亦顯示有效性，而實施大鼠消化道阻塞模型中之評價。於腸塞等消化道阻塞中，因消化道之組織損傷、以及水或電解質等之吸收能力降低而表現出腹脹感、嘔吐、腹痛等消化系統症狀。已知該病態係由消化道內容物之通過障礙、或消化液或生理活性物質向消化道內釋出所引起。體抑素係經由在消化系統中表現之SSTR而抑制各種消化液之分泌、或促進水/電解質之吸收，藉此顯示使消化道內容物減少等作用，且認為對症狀改善有效。本實驗體系係設為以腸道阻塞後之空腸中的腸液重量之變化為指標，而對腸液之吸收 促進或分泌抑制作用進行評價之試驗體系而實施。又，測定作為逸脫酶之澱粉酶(胰腺)、乳酸鹽脫氫酶(LDH，肝臟)及肌胺酸磷酸轉移酶(CPK，骨骼肌、心肌等)之血液參數作為組織損傷時之指標。
實施例88-1 消化道阻塞模型之製作
本試驗係委託Mitsubishi Chemical Medience公司實施。將雄性之SD系大鼠(Crl：CD(SD)Charles River Japan股份有限公司，8週齡，n=5以上，體重251.1~278.1 g)禁食12小時以上。藉由使大鼠吸入2%異氟烷及一氧化二氮：氧氣=7：3而進行麻醉誘導，手術過程中維持該狀態。將腹部正中切開，用縫合線將距離十二指腸提肌約10 cm處之空腸結紮。其後，將切開部迅速縫合，禁食直至投予化合物為止。假處置組係進行不對空腸結紮，將腹部正中切開後縫合切開部之處置。
實施例88-2 化合物之製備及投予
使用S1C(disialo)-SRIF28、C(disialo)-R-K-SRIF14、S1-2C(asialo)-SRIF28作為糖鏈附加體，溶解於日本藥典生理鹽水(大塚製藥工廠公司製造)中製備40 μM溶液，作為投予液。自消化道阻塞手術起18小時後，以1 mL/kg之用量使用注射筒及25G注射針(均為TERUMO公司製造)對頸背部進行皮下投予。作為媒劑組，以相同之方式投予不含附加糖鏈之聚胜肽的生理鹽水。又，投予奧曲肽作為對照。
實施例88-3 腸液重量之測定
於化合物投予1小時後，於吸入麻醉下將腹部正中切 開，自腹部大靜脈採集血液1.5 mL。然後，摘出十二指腸提肌側之結紮空腸。用紙巾將空腸表面之液體及血液除去，將附著於空腸上之神經、血管、脂肪切除之後，切取長度6 cm，測定濕重。其後，於36度下乾燥24小時，測定幹重。腸液重量(mg)係以濕重-幹重而算出。將所獲得之空腸之腸液重量示於表9。
如由表9所明確，媒劑與假處置相比，腸液重量顯著增加，確認隨著進行結紮而使消化道阻塞，產生腸液之分泌亢進。體抑素或奧曲肽於此種消化道阻塞模型中具有抑制腸液向腸道內分泌及促進腸液向腸組織側吸收之作用已有揭示(Scand J Gastroenterol.1995 May；30(5)：464-9.)，於本實驗體系中亦確認到奧曲肽具有該作用。S1C(disialo)-SRIF28、C(disialo)-R-K-SRIF14、S1-2C(asialo)-SRIF28中任一者與媒劑相比，均確認到腸液重量之增加，明確本發明之糖鏈附加體亦顯示抑制腸液分泌、促進水/電解質之吸收等有效性。又，可知與S1C(disialo)-SRIF28相比，S1-2C(asialo)-SRIF28於實施例83及84中皮下投予時之AUC為 1/2，但於實施例67-1中，對SSTR1~SSTR5之親和性較S1C(disialo)-SRIF28高1.7~2.9倍左右。可認為該情況係即便血漿中濃度較低之情形時，由於受體親和性提高因而本模型中之藥效亦類似的原因。又，同樣地，可認為係C(disialo)-R-K-SRIF14雖與S1C(disialo)-SRIF28之皮下投予時之AUC相比略少，但由於受體親和性高0.7~2.4倍左右故而藥效類似的原因。
實施例88-4 血液參數之測定
使用實施例88-3中所採集之血液，使用自動分析裝置7170(日立製作所)測定澱粉酶濃度(IU/L)、LDH濃度(IU/L)及CPK濃度(IU/L)。測定方法係分別使用BG5B法、UV-rate法及JSCC法。將所獲得之結果示於表10。
根據表10可明確，媒劑與假處置相比，澱粉酶活性、LDH活性增加，推測隨著消化道阻塞而產生消化系統之組織損傷。S1C(disialo)-SRIF28及C(disialo)-R-K-SRIF14與媒劑相比，澱粉酶活性為低值。另一方面，奧曲肽之澱粉酶活性與媒劑同等。根據實施例67-1及67-2可明確，S1C(disialo)-SRIF28、C(disialo)-R-K-SRIF14、及S1- 2C(sialo)-SRIF28對SSTR1~SSTR5之全部受體具有結合親和性，相對於此，奧曲肽為對SSTR2、SSTR3、SSTR5具有特異性親和性之化合物。由於據報告大鼠胰腺中表現SSTR1~SSTR5之全部受體(J Histochem Cytochem.2004 Mar；52(3)：391-400.)，故而可想到糖鏈附加體藉由作用於與奧曲肽不同之受體，而減輕組織損傷之可能性。又，奧曲肽、C(disialo)-R-K-SRIF14與媒劑相比，LDH活性為低值。此外，對於各參數均無因投予糖鏈附加體而惡化者。
圖1A~圖1D係表示本發明之一實施形態之附加糖鏈之聚胜肽的各化合物名稱、及具有該化合物名稱之附加糖鏈之聚胜肽的胺基酸序列資訊的圖。又，圖1E係表示使用SRIF14、SRIF28、及本發明之一實施形態之附加糖鏈之聚胜肽對體抑素受體表現細胞進行處置時關於cAMP產生抑制作用(促效劑活性)的IC50之值的圖。
圖2係表示將SRIF28及S1C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予或皮下投予時各聚胜肽之血漿中之濃度之推移的圖。圖2中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖3係表示將SRIF28、S1C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的 圖。圖3中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖4係表示將SRIF28、S1C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．R13C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖4中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖5係表示將S1C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)-SRIF28、A9C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)-SRIF28、N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)．N5C(disialo)．A9C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖5中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖6係表示將S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、S1-3C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖6中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖7係表示將S1C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo(amide))-SRIF28、S1C(disialo(aminoethylamide))-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖7中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖8係表示將S1C(disialo)-SRIF28、S1C(disialo)-D-Trp22-SRIF28、S1C(disialo(Bn))-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖8中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖9係表示將S1C(disialo)-SRIF28、R13C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖9中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖10係表示將S1C(disialo)-SRIF28、E12C(disialo)-SRIF28、N19C(disialo)-SRIF28、29C(disialo)-SRIF28、S1C(monosialo)-SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖10中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜 肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖11係表示將S1C(disialo)-SRIF28、K14C(disialo)-SRIF28、C(disialo)-SRIF14向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖11中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖12係表示將C(disialo)-SRIF14、C(disialo)-C12linker-SRIF14、C(disialo)-PEGlinker-SRIF14向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖12中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖13係表示將SRIF28、S1C(disialo)-SRIF28、S1C(asialo)-SRIF28、S1C(diGlcNAc)-SRIF28、S1C(diMan)-SRIF28、S1C(GlcNAc)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖13中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖14係表示將S1C(disialo)-SRIF28、S1C(trisialo)-SRIF28、S1C(tetrasialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、S1C(Asn(disialo))-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖14中，左側之 圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖15係表示將SRIF28、S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、S1-3C(disialo)-SRIF28、S1-4C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖15中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖16係表示將SRIF14、C(disialo)-SRIF14、C(disialo)-K-SRIF14、C(disialo)-R-K-SRIF14、2C(disialo)-R-K-SRIF14、3C(disialo)-R-K-SRIF14向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖16中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖17係表示將S1C(asialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28、S1-3C(asialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖17中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖18係表示將S1C(disialo)-SRIF28、S1-2C(disialo)-SRIF28、S1-2C(asialo)-SRIF28、S1-2C(disialo(amide))- SRIF28、S1-2C(disialo(Bn))-SRIF28、C(disialo(aminoethylamide))-S1C(disialo)-SRIF28向大鼠進行靜脈內投予及皮下投予時血漿中之濃度之推移的圖。圖18中，左側之圖為表示進行靜脈內投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖，右側之圖為表示進行皮下投予時各聚胜肽之血漿中濃度之推移的圖。
圖19係表示對本發明之一實施形態之附加糖鏈之聚胜肽，進行使用大鼠血漿之血漿中穩定性試驗之結果的圖。
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<120> 附加糖鏈之聚胜肽及含有該聚胜肽之醫藥組合物
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<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 二硫化物
<222> (3)..(14)
<223>
<400> 1
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 2
<210> 3
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 二硫化物
<222> (3)..(14)
<223>
<220>
<221> 殘基的轉譯後修飾
<222> (14)..(14)
<223> 醯胺化
<400> 3
<210> 4
<211> 28
<212> RPT
<213> 人工序列
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 殘基的轉譯後修飾
<222> (28)..(28)
<223> 醯胺化
<400> 4
<210> 5
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 5
<210> 6
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (5)..(5)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 6
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (9)..(9)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 7
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (12)..(12)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 8
<210> 9
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (13)..(13)
<223>
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 9
<210> 10
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (14)..(14)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 10
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (15)..(15)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 11
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (16)..(16)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 12
<210> 13
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (18)..(18)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 13
<210> 14
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 14
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (21)..(21)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (26)..(26)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 16
<210> 17
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (29)..(29)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 17
<210> 18
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (30)..(30)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 18
<210> 19
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223>
<220>
<221> 其他特徵
<222> (22)..(22)
<223> D-Trp
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 19
<210> 20
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (9)..(9)
<223>
<220>
<221> 其他特徵
<222> (22)..(22)
<223> D-Trp
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 20
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (18)..(29)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 21
<210> 22
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (5)..(5)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 22
<210> 23
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (13)..(13)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 23
<210> 24
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (5)..(5)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (9)..(9)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 24
<210> 25
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (19)..(30)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 25
<210> 26
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (5)..(5)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (9)..(9)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 26
<210> 27
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加單唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 27
<210> 28
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 28
<210> 29
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (18)..(29)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<400> 29
<210> 30
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (19)..(30)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<400> 30
<210> 31
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (5)..(5)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 31
<210> 32
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<400> 32
<210> 33
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加GlcNAc
<400> 33
<210> 34
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 34
<210> 35
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (4)..(15)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 35
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (6)..(17)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 36
<210> 37
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (4)..(15)
<223>
<220>
<221> 非連串殘基
<222> (1)..(2)
<223> Cys與Ala經由C12連結子結合
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 37
<210> 38
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 38
<210> 39
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 39
<210> 40
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 40
<210> 41
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 41
<210> 42
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 42
<210> 43
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 43
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 44
<210> 45
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 45
<210> 46
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 46
<210> 47
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 47
<210> 48
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 48
<210> 49
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 49
<210> 50
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 50
<210> 51
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 51
<210> 52
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 52
<210> 53
<211> 3()
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 53
<210> 54
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 其他特徵
<222> (22)..(22)
<223> D-Trp
<400> 54
<210> 55
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 其他特徵
<222> (22)..(22)
<223> D-Trp
<400> 55
<210> 56
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> Acm
<400> 56
<210> 57
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (6)..(6)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<400> 57
<210> 58
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (3)..(3)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (8)..(8)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (9)..(9)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (10)..(10)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> 樹脂
<400> 58
<210> 59
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> Acm
<220>
<221> 非連串殘基
<222> (1)..(2)
<223> Cys與Ala經由C12連結子結合
<400> 59
<210> 60
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> Acm
<220>
<221> 非連串殘基
<222> (1)..(2)
<223> Cys與Ala經由C12連結子結合
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 60
<210> 61
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 非連串殘基
<222> (1)..(2)
<223> Cys與Ala經由C12連結子結合
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 61
<210> 62
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<400> 62
<210> 63
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 63
<210> 64
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 64
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<212> PRT
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<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
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<220>
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<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (30)..(30)
<223> Acm
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 70
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> Acm
<400> 72
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (30)..(30)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 糖基化位點
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<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
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<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
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<220>
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<222> (2)..(2)
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<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加去唾液酸糖鏈
<400> 75
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<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (9)..(9)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<221> 化學成分結合位點
<222> (8)..(8)
<223> OtBu
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<221> 化學成分結合位點
<222> (9)..(9)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (24)..(24)
<223> 樹脂
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
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<400> 78
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (5)..(5)
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<400> 79
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<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (2)..(2)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (16)..(16)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (21)..(21)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
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<220>
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<220>
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<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> 樹脂
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (3)..(3)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (11)..(11)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
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<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (26)..(26)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> tBu
<220>
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<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> 樹脂
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<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<400> 82
<210> 83
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<400> 83
<210> 84
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> StBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 84
<210> 85
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加GlcNAc
<400> 85
<210> 86
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加GlcNAc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 86
<210> 87
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加GlcNAc
<400> 87
<210> 88
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<400> 88
<210> 89
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (18)..(29)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 89
<210> 90
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 90
<210> 91
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (11)..(11)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 91
<210> 92
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
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<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
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<400> 92
<210> 93
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (20)..(20)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 93
<210> 94
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 94
<210> 95
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (24)..(24)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 95
<210> 96
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 96
<210> 97
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (25)..(25)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 97
<210> 98
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 98
<210> 99
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (27)..(27)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 99
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (5)..(5)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (16)..(16)
<223> Acm
<400> 100
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (5)..(16)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 101
<210> 102
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 102
<210> 103
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 103
<210> 104
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 殘基的轉譯後修飾
<222> (28)..(28)
<223> 醯胺化
<400> 104
<210> 105
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 殘基的轉譯後修飾
<222> (28)..(28)
<223> 醯胺化
<400> 105
<2l0> 106
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> Acm
<220>
<221> 非連串殘基
<222> (1)..(2)
<223> Cys與Ala經由PEG連結子結合
<400> 106
<210> 107
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (4)..(15)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 非連串殘基
<222> (1)..(2)
<223> Cys與Ala經由PEG連結子結合
<400> 107
<210> 108
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (3)..(3)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (11)..(11)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (24)..(24)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (26)..(26)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> 樹脂
<400> 108
<210> 109
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> 生物素
<400> 109
<210> 110
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> 生物素
<400> 110
<210> 111
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> 生物素經由PEG連結子結合於Cys
<400> 111
<210> 112
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> 生物素經由PEG連結子結合於Cys
<400> 112
<210> 113
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> 疊氮基戊醯基結合於Cys
<400> 113
<210> 114
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> 疊氮基戊醯基結合於Cys
<400> 114
<210> 115
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<400> 115
<210> 116
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (12)..(12)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 116
<210> 117
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (7)..(7)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<400> 117
<210> 118
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (7)..(18)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 118
<210> 119
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (8)..(8)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
<223> Acm
<400> 119
<210> 120
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (8)..(19)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 120
<210> 121
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加diGlcNAc糖鏈
<400> 121
<210> 122
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加diGlcNAc糖鏈
<400> 122
<210> 123
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加diGlcNAc糖鏈
<400> 123
<210> 124
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 124
<210> 125
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 125
<210> 126
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加GlcNAc
<400> 126
<210> 127
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加GlcNAc
<400> 127
<210> 128
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加三唾液酸糖鏈
<400> 128
<210> 129
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加四唾液酸糖鏈
<400> 129
<210> 130
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(Boc-aminoethylamide)糖鏈
<400> 130
<210> 131
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<400> 131
<210> 132
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<400> 132
<210> 133
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<400> 133
<210> 134
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(amide)糖鏈
<400> 134
<210> 135
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<400> 135
<210> 136
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(hexadecylamide)糖鏈
<400> 136
<210> 137
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(hexadecylamide)糖鏈
<400> 137
<210> 138
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(hexadecylamide)糖鏈
<400> 138
<210> 139
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (18)..(29)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(amide)糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加Disialo(amidc)糖鏈
<400> 139
<210> 140
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (18)..(29)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<400> 140
<210> 141
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Asn(disialo)
<400> 141
<210> 142
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (2)..(2)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (3)..(3)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (10)..(10)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (11)..(11)
<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (16)..(16)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (21)..(21)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (25)..(25)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (26)..(26)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> 樹脂
<400> 142
<210> 143
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (3)..(3)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (5)..(5)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (11)..(11)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (24)..(24)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (26)..(26)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> 樹脂
<400> 143
<210> 144
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<400> 144
<210> 145
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 145
<210> 146
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 146
<210> 147
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加經苄基保護之二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 147
<210> 148
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (17)..(28)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (19)..(19)
<223> 附加diMan糖鏈
<400> 148
<210> 149
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (2)..(2)
<223> StBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (5)..(5)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (6)..(6)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (12)..(12)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (13)..(13)
<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (19)..(19)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (20)..(20)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (23)..(23)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (24)..(24)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (25)..(25)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (28)..(28)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> 樹脂
<400> 149
<210> 150
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (2)..(2)
<223> StBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<400> 150
<210> 151
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (2)..(2)
<223> StBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<400> 151
<210> 152
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<400> 152
<210> 153
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (18)..(18)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 153
<210> 154
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 154
<210> 155
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (18)..(29)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加Disialo(aminoethylamide)糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 155
<210> 156
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Fmoc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (1)..(1)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (2)..(2)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (3)..(3)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (4)..(4)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (6)..(6)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (7)..(7)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (8)..(8)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (14)..(14)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (15)..(15)
<223> OtBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (16)..(16)
<223> Pbf
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (17)..(17)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (20)..(20)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (21)..(21)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (22)..(22)
<223> Trt
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (25)..(25)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (26)..(26)
<223> Boc
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (27)..(27)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (29)..(29)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (30)..(30)
<223> tBu
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (31)..(31)
<223> 樹脂
<400> 156
<210> 157
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (20)..(20)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<400> 157
<210> 158
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (20)..(20)
<223> Acm
<220>
<221> 化學成分結合位點
<222> (31)..(31)
<223> Acm
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (4)..(4)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 158
<210> 159
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (4)..(4)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 159
<210> 160
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化學合成
<220>
<221> 二硫化物
<222> (20)..(31)
<223>
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (1)..(1)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (2)..(2)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (3)..(3)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<220>
<221> 糖基化位點
<222> (4)..(4)
<223> 附加二唾液酸糖鏈
<400> 160

Claims (35)

  1. 一種附加糖鏈之聚胜肽，其特徵在於，其係於選自由以下之(A)~(F)所組成之群中之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換：(A)包含以序列編號1表示之胺基酸序列的SRIF14；(B)於包含以序列編號1表示之胺基酸序列之SRIF14中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加的聚胜肽；(C)SRIF14之類似物；(D)相對於包含以序列編號1表示之胺基酸序列之SRIF14，具有80%以上之同源性的聚胜肽；(E)於(A)~(D)中，於N末端側進而含有N個(此處，N為1以上20以下之整數)胺基酸的聚胜肽；及(F)於(A)~(D)中，於C末端側進而含有M個(此處，M為1以上6以下之整數)胺基酸的聚胜肽；且對體抑素受體具有親和性。
  2. 如請求項1之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述經附加糖鏈之胺基酸置換之胺基酸為相當於SRIF14中之19位之胺基酸。
  3. 如請求項1之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(E)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(E)之聚胜肽之N末端側的上述N個胺基酸之任一個。
  4. 如請求項1之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(F)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(F)之聚胜肽之C末端側的上述M個胺基酸之任一個。
  5. 如請求項1之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(E)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，進而，附加於N末端側之上述N個胺基酸之序列係以X-Y-表示，此處，X係表示L個(此處，L為1以上6以下之整數)任意之胺基酸之序列，又，Y為選自由以下之(1)~(15)所組成之群中之序列：(1)Lys、(2)Arg-Lys、(3)Glu-Arg-Lys、(4)Arg-Glu-Arg-Lys、(5)Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(6)Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(7)Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(8)Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(9)Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(10)Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、 (11)Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(12)Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(13)Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、(14)Ser-Ala-Asn-Ser-Asn-Pro-Ala-Met-Ala-Pro-Arg-Glu-Arg-Lys、及(15)於上述序列(2)~(14)中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加之序列。
  6. 如請求項5之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於表示附加於上述(E)之聚胜肽之N末端側的上述N個胺基酸之序列的X-Y-中代表X的L個胺基酸之任一個。
  7. 如請求項3之附加糖鏈之聚胜肽，其中附加於N末端側之上述N個胺基酸係經由連結子而連結於該N末端側。
  8. 一種附加糖鏈之聚胜肽，其特徵在於，其係於選自由以下之(A)~(F)所組成之群中之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換：(A)包含以序列編號2表示之胺基酸序列之SRIF28；(B)於包含以序列編號2表示之胺基酸序列之SRIF28中，1個或數個胺基酸缺失、經置換或附加的聚胜肽；(C)SRIF28之類似物；(D)相對於包含以序列編號2表示之胺基酸序列之SRIF28，具有80%以上之同源性的聚胜肽；(E)於(A)~(D)中，於N末端側進而含有J個(此處，J為1以上6以下之整數)胺基酸的聚胜肽；及 (F)於(A)~(D)中，於C末端側進而含有K個(此處，K為1以上6以下之整數)胺基酸的聚胜肽；且對體抑素受體具有親和性。
  9. 如請求項8之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述經附加糖鏈之胺基酸置換之胺基酸為選自由下述者所組成之群中的至少1個胺基酸：相當於SRIF28中之1位之胺基酸、相當於5位之胺基酸、相當於9位之胺基酸、相當於12位之胺基酸、相當於13位之胺基酸、相當於14位之胺基酸、及相當於19位之胺基酸。
  10. 如請求項8之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(E)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(E)之聚胜肽之N末端側的上述J個胺基酸之任一個。
  11. 如請求項8之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽係於上述(F)之聚胜肽中，至少1個胺基酸經附加糖鏈之胺基酸置換，此處，上述經附加糖鏈之胺基酸置換之至少1個胺基酸存在於上述(F)之聚胜肽之C末端側的上述K個胺基酸之任一個。
  12. 如請求項1至11中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述對體抑素受體之親和性係對選自由SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、及SSTR5所組成之群中之受體 中的至少2種以上受體具有親和性。
  13. 如請求項12之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽對至少SSTR1及SSTR4中之任一者具有親和性。
  14. 如請求項12之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽對SSTR1及SSTR4之兩者具有親和性。
  15. 如請求項12之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽對SSTR1、SSTR2、SSTR3、SSTR4、及SSTR5之全部具有親和性。
  16. 如請求項1至15中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽與SRIF28相比，具有增大之血中穩定性。
  17. 如請求項1至16中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述各附加糖鏈之胺基酸為附加糖鏈之Asn或附加糖鏈之Cys。
  18. 如請求項1至17中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈與胺基酸不經由連結子而結合。
  19. 如請求項1至18中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈包含4個以上之糖。
  20. 如請求項1至19中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈為雙鏈複合型糖 鏈、三鏈複合型糖鏈、或四鏈複合型糖鏈。
  21. 如請求項1至19中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈為雙鏈複合型糖鏈。
  22. 如請求項20或21之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述雙鏈複合型糖鏈為選自由二唾液酸糖鏈、單唾液酸糖鏈、去唾液酸糖鏈、二乙醯葡糖胺糖鏈及二甘露糖糖鏈所組成之群中之糖鏈。
  23. 如請求項1至18中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中於上述各附加糖鏈之胺基酸中，糖鏈為下述式所表示之糖鏈： [式中，R1及R2相同或不同，表示下述式： Ac表示乙醯基]。
  24. 如請求項1至20中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述糖鏈於非還原末端具有至少1個唾液酸，上述唾液酸之羧基經碳數1~30之烷基胺基、苄基、胺基、或胺基乙基胺基修飾。
  25. 如請求項1至24中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽具有複數個附加糖鏈之胺基酸，且上述各附加糖鏈之胺基酸中之糖鏈均相同。
  26. 如請求項1至25中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽具有相當於SRIF28中之17位之Cys與28位之Cys的Cys，進而，該等Cys相互以雙硫鍵結合。
  27. 如請求項1至26中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽之C末端經醯胺化。
  28. 如請求項1至26中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中於上述附加糖鏈之聚胜肽之N末端導入有疊氮基。
  29. 如請求項1至28中任一項之附加糖鏈之聚胜肽，其中上述附加糖鏈之聚胜肽經標記。
  30. 一種醫藥組合物，其特徵在於包含：(I)如請求項1至29中任一項之附加糖鏈之聚胜肽及/或 藥學上可容許之其鹽、及(II)藥理學上可容許之載體。
  31. 如請求項30之醫藥組合物，其中於上述附加糖鏈之聚胜肽中，糖鏈實質上均勻。
  32. 如請求項30或31之醫藥組合物，其係用於治療或預防與體抑素相關之疾病。
  33. 如請求項30之醫藥組合物，其中上述與體抑素相關之疾病為選自由下述者所組成之群中的至少1種疾病：肢端肥大症、巨人症、阿茲海默氏症及其他形態之癡呆症、癌、激素產生性腫瘤、內分泌腫瘤、類癌、VIP瘤、胰島瘤、升糖素瘤、糖尿病及其併發症、疼痛、關節炎、腹瀉、胃潰瘍、炎症性腸病、急躁性腸症候群、庫欣氏病、激素分泌異常、消化道阻塞、腸塞、術後再狹窄、放射線損傷、眼疾、乾眼病、青光眼、角膜實質炎、虹膜炎、白內障、以及結膜炎。
  34. 一種與體抑素相關之疾病之治療或預防方法，其特徵在於：投予有效量之如請求項1至29中任一項之附加糖鏈之聚胜肽。
  35. 如請求項34之治療或預防方法，其中上述與體抑素相關之疾病為選自由下述者所組成之群中的至少1種疾病：肢端肥大症、巨人症、阿茲海默氏症及其他形態之癡呆症、癌、激素產生性腫瘤、內分泌腫瘤、類癌、VIP瘤、胰島瘤、升糖素瘤、庫欣氏病、激素分泌異常、糖尿病及其併發症、疼痛、關節炎、腹 瀉、胃潰瘍、炎症性腸病、急躁性腸症候群、消化道阻塞、腸塞、術後再狹窄、眼疾、放射線損傷、乾眼病、青光眼、角膜實質炎、虹膜炎、白內障、以及結膜炎。
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