CN111855827B - 多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法 - Google Patents

多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法：(1)标准品的酶解；(2)固相萃取富集目标肽段；(3)高效液相色谱串联质谱分析；(4)绘制标准曲线，得标准工作曲线方程；(5)样品检测，计算得到样品中各特征肽段的浓度；(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率。本发明实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测，其中破伤风蛋白涉及20个监测位点，CRM197涉及16个监测位点。本发明不仅可以检测残留蛋白含量，还可以评价多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合位点的结合率，也可用于多糖或蛋白残余率相同但活性和毒性不同的多糖蛋白结合疫苗的研究，可为改进多糖蛋白结合工艺提供直接的监测方法。

Description

多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法
技术领域
本发明涉及一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，属于疫苗质量评价技术领域。
背景技术
多糖蛋白结合疫苗是将多糖通过化学键与蛋白结合后形成的一类疫苗。用于多糖蛋白结合疫苗的蛋白称为蛋白载体。常用蛋白载体有CRM197蛋白，白喉类毒素(即甲醛脱毒的白喉蛋白)和破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)。常见的多糖蛋白结合疫苗包括四价脑膜炎疫苗(A、C、W、Y)，Hib疫苗和13价肺炎多糖疫苗(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有不同的免疫用途。如23价肺炎疫苗(多糖疫苗)用于2岁以上儿童和成人，对2岁以下儿童免疫效果较差，而13价肺炎疫苗(多糖蛋白结合疫苗)由于有蛋白载体辅助作用，可以很好的激发2岁以下儿童T细胞的免疫反应，从而达到预防多种肺炎病毒入侵的作用。与多糖疫苗相比，多糖蛋白结合疫苗具有制备工艺更复杂，质量控制更困难的问题。多糖蛋白结合疫苗往往需要先生产出质量良好的多糖疫苗和蛋白载体，再通过化学反应生产多糖蛋白结合疫苗。因此多糖质量、蛋白载体质量和多糖蛋白结合率均应作为多糖蛋白结合疫苗的质量控制指标。多糖疫苗的质量控制常常通过测定糖单元含量和多糖分子量分布实现，目前报道的多糖糖单元含量测定方法有衍生-紫外分光光度计法和LC-MS/MS法，多糖分子量分布可用SEC-MALLS测试。单一蛋白载体质量如纯度和含量可使用ELISA或Lowry法测试。多糖与蛋白结合位点的结合率也与多糖蛋白结合疫苗的质量息息相关。对破伤风类毒素和白喉类毒素为载体蛋白的多糖蛋白结合疫苗，其质量还受载体蛋白脱毒工艺的影响。虽然载体蛋白的脱毒、多糖蛋白结合位点的结合率直接影响着多糖蛋白结合疫苗质量，但尚无测试方法报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，可以用于测定以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎疫苗、以破伤风类毒素为载体的Hib疫苗、以破伤风类毒素为载体的13价肺炎疫苗、以CRM197蛋白为载体的13价肺炎疫苗、以CRM197蛋白为载体的4价脑膜炎疫苗、以CRM197蛋白为载体的Hib疫苗中多糖蛋白结合位点的多糖蛋白结合率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素(即甲醛脱毒的破伤风蛋白)或CRM197蛋白为载体的疫苗，包括以下步骤：
(1)标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入胰蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；
(2)固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；
(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；
(4)绘制标准曲线：各特征肽段峰的峰面积与特征肽段的浓度呈线性关系，各特征肽段的浓度与蛋白溶液的浓度相同；配制不同浓度的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，通过步骤(1)、(2)、(3)得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A＝aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；
(5)样品检测：取待检测的多糖蛋白结合疫苗样品溶液，进行步骤(1)、(2)、(3)，得各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；
(6)计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：
多糖结合位点N的多糖结合率W％＝(样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度)/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
多糖结合位点N的蛋白残留率C％＝特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
N代表某一特征肽段；
数值最小的C％作为该样品中残留蛋白率。
所述多糖蛋白结合疫苗包括：以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎疫苗(包括A、W、C、Y)、以破伤风类毒素为载体的Hib疫苗、以破伤风类毒素为载体的13价肺炎疫苗(包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)、以CRM197蛋白为载体的疫苗包括13价肺炎疫苗(包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)、以CRM197蛋白为载体的4价脑膜炎疫苗(包括A、W、C、Y)、以CRM197蛋白为载体的Hib疫苗。
进一步地，所述步骤(1)的具体操作如下：
①取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；
②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入胰蛋白酶，或：加入胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液，37℃反应4～20小时；
⑤加入酸液，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。
进一步地，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGestTM，以溶液形式加入时，浓度为10mmol/L～10mol/L。
进一步地，所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)；以溶液形式加入时，浓度为10mmol/L～2mol/L。
进一步地，所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10mmol/L～2mol/L(加入碘代乙酰胺的目的是：封闭被二硫键断裂试剂打开的二硫键，避免二硫键的再次形成)。
进一步地，所述碳酸氢铵溶液的浓度为10～500mmol/L(加入碳酸氢铵的目的是：为胰蛋白酶提供合适的pH环境，保证胰蛋白酶活性)。
进一步地，所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸，以溶液形式加入时，溶液中酸与水的体积比为1:0.1～1000。
注：加入蛋白变性剂、二硫键断裂试剂、胰蛋白酶、酸液时，可以直接加入，也可以以溶液的形式加入，此为本领域的惯用手段，不再赘述。
进一步地，所述步骤(2)中，固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相(WAX)、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相(SAX)、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离子交换固定相(C18WAX)、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合强阴离子交换固定相(C18SAX)、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合弱阴离子交换固定相(C8WAX)、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合强阴离子交换固定相(C8SAX)。
进一步地，所述步骤(2)中，流动相为酸液-有机溶剂混合液。
进一步地，所述步骤(2)中，所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸。
进一步地，所述步骤(2)中，所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的任意一种或两种以上；
进一步地，所述步骤(2)中，酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000。
进一步地，所述步骤(2)的具体操作如下：
①取混合模式固相萃取柱，填充固定相，用酸液-有机溶剂混合液活化；
②用酸液-水混合液平衡；
③将蛋白酶解液加入固相萃取柱中；
④用酸液-水混合液洗涤固相萃取柱；
⑤用酸液-有机溶剂混合液洗脱目标肽段，得蛋白洗脱液；
⑥用氮气吹干蛋白洗脱液，用酸液-有机溶剂-水混合液溶解，得固相萃取重溶液，用于高效液相色谱串联质谱分析。
优选的，所述步骤(2)的具体操作如下：
①取混合模式固相萃取柱，填充固定相30～100mg，用0.1～2mL酸液-有机溶剂混合液活化；酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000；
②用0.1～2mL酸液-水混合液平衡；酸液-水混合液中，酸液与水的体积比为1:1～1000；
③将蛋白酶解液加入固相萃取柱中；
④用0.1～2mL酸液-水混合液洗涤固相萃取柱；酸液-水混合液中，酸液与水的体积比为1:1～1000；
⑤用0.1～2mL酸液-有机溶剂混合液洗脱目标肽段，得蛋白洗脱液；酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000；
⑥用氮气吹干蛋白洗脱液，用100μL酸液-有机溶剂-水混合液溶解，得固相萃取重溶液，用于高效液相色谱串联质谱分析；酸液-有机溶剂-水混合液中，酸液、有机溶剂、水三者的体积比为1:50:950。
进一步地，所述步骤(3)中，色谱条件如下：
固定相：固定相1和固定相2；
柱温：20～60℃；
流动相：A：离子交换剂水溶液；B：含离子交换剂的有机溶剂溶液或有机溶剂水溶液；
所述固定相1为生物兼容C18色谱柱，所述固定相2为生物兼容C8色谱柱：
所述离子交换剂为质谱兼容的酸、盐，或酸和盐的混合物，所述盐选自甲酸铵、乙酸铵，所述酸选自甲酸、乙酸或三氟乙酸；
所述有机溶剂为可与水互溶的有机溶剂，选自甲醇、乙腈或/和乙醇；
所述流动相A中离子交换剂的浓度为0～20mmol/L；
所述流动相B中离子交换剂的浓度为0～20mmol/L，有机溶剂与水的体积比为60～100：0～40；
梯度：0～8min，5％B～40％B；8～8.1min，40％B～100％B；8.1～10min，100％B；10～10.1min，100％B～5％B；10.1～15min，5％B；
流速：0.2～0.5mL/min；
进样体积：10μL。
进一步地，所述步骤(3)中，质谱条件如下：
离子源：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；
加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；
干燥气流速：10L/min；接口电压：1.5～4kV。
质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1，表2。
进一步地，所述步骤(3)中，破伤风类毒素的特征肽段如表1所示，CRM197蛋白的特征肽段如表2所示。
表1破伤风类毒素的特征肽段、质谱参数(*为定量离子)
Figure BDA0002038192320000051
表2 CRM197蛋白的特征肽段、质谱参数(*为定量离子)
Figure BDA0002038192320000052
Figure BDA0002038192320000061
进一步地，所述步骤(4)中，配制不同浓度的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液的具体方式如下：分别取150μL、120μL、100μL、80μL、50μL、25μL的破伤风类毒素标准溶液或CRM197蛋白标准溶液，分别加入适量的100mmol/L的碳酸氢铵溶液(即分别加入0μL、30μL、50μL、70μL、100μL、125μL的碳酸氢铵溶液)，得150μL的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液。
本发明采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的测定方法，首次实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测，其中破伤风类毒素涉及20个监测位点，CRM197涉及16个监测位点。现有技术中的多糖蛋白质量评价方法，如SEC法，只能测定残留蛋白或残留多糖含量，无法探测导致多糖蛋白结合率高低的原因。本发明的方法不仅可以实现传统SEC方法检测的残留蛋白含量，还可以评价多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合位点的结合率，评价结果可直观显示在蛋白或多糖残余率较高时是哪些位点的结合率降低导致。也可用于多糖或蛋白残余率相同但活性和毒性不同的多糖蛋白结合疫苗的研究，可通过检测多糖蛋白结合位点结合率的不同探索不同结合位点结合率对多糖蛋白结合疫苗有效性和毒性的影响，可为改进多糖蛋白结合工艺提供直接的监测方法。
本发明的方法，可用于评价以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎疫苗(包括A、W、C、Y)、以破伤风类毒素为载体的Hib疫苗、以破伤风类毒素为载体的疫苗包括13价肺炎疫苗(包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)、以CRM197蛋白为载体的4价脑膜炎疫苗(包括A、W、C、Y)、以CRM197蛋白为载体的Hib疫苗和以CRM197蛋白为载体的疫苗包括13价肺炎疫苗(包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)，质量评估的疫苗类型多。
本发明的方法，首次实现了多糖蛋白结合疫苗多糖蛋白结合率的多位点定量监测。多糖蛋白结合率关系着多糖蛋白结合疫苗的有效性和安全性。目前仅体积排阻法可定量分析多糖蛋白结合疫苗中残留蛋白的含量，但该方法仅能获知蛋白残留量并不能给出哪些位点多糖结合率高，哪些位点多糖结合率低。因此，仅有蛋白残留率的数值无从寻找工艺优化的参数，无法为多糖蛋白生产质量的提高以及新型多糖蛋白结合疫苗的生产提供研究方向。本发明的方法不仅可以监测残留蛋白的含量，还可以定量分析各多糖蛋白结合位点的结合率，为改进多糖蛋白结合疫苗工艺、提高多糖蛋白结合疫苗质量和研发新型多糖蛋白结合疫苗提供数据和研究方向。此外，当多糖蛋白结合疫苗残留蛋白率相当，但有效性和毒性相去甚远时，本发明可用于寻找疫苗差异，为提高有效性和减少毒性的工艺优化提供研究方向。
本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。
附图说明
图1：破伤风类毒素标准品的特征肽段谱图。
图2：以破伤风类毒素为载体蛋白的脑膜炎疫苗A(1)、C(2)、W(3)、Y(4)、Hib疫苗(5)、13价肺炎疫苗1(6)、3(7)、4(8)和以破伤风类毒素为载体蛋白的13价肺炎疫苗5(9)、6A(10)、6B(11)、7F(12)、9V(13)、14(14)、18C(15)、19F(16)、19A(17)和23F(18)的特征肽段谱图。
图3：CRM197标准品的特征肽段谱图。
图4：以CRM197为载体蛋白的脑膜炎疫苗A(1)、C(2)、W(3)、Y(4)、Hib疫苗(5)、13价肺炎疫苗1(6)、3(7)、4(8)和以CRM197为载体蛋白的13价肺炎疫苗5(9)、6A(10)、6B(11)、7F(12)、9V(13)、14(14)、18C(15)、19F(16)、19A(17)和23F(18)的特征肽段谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1以破伤风类毒素为载体的多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定
1.实验仪器与设备：高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。
2.实验试剂：破伤风类毒素标准品(1000μg/L)、4价脑膜炎疫苗、TCEP、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵、RapiGestTM、胰蛋白酶、以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎疫苗、Hib疫苗和13价肺炎疫苗。脑膜炎疫苗A、W、C、Y、Hib疫苗、13价肺炎疫苗1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F。
3.检测条件：
色谱条件：
色谱柱：固定相1(生物兼容C18色谱柱)；
流动相：A：乙酸水溶液(乙酸与水的体积比为1:1000)；B：乙酸-乙腈混合液(乙酸与乙腈的体积比为1:1000)；
梯度：0～8min，5％B～40％B；8～8.1min，40％B～100％B；8.1～10min，100％B；10～10.1min，100％B～5％B；10.1～15min，5％B；柱温：35℃；流速：0.2～0.5mL/min；进样体积：10μL。
质谱条件：
离子源：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；
加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；
干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。
质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1。
4.标准曲线绘制：
(1)标准品的酶解：
①取150μL破伤风类毒素溶液，加入150μL RapiGestTM，60℃孵育15分钟；
②加入10μL的0.5mol/L的TCEP溶液，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入10μL的1mol/L的碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入715μL浓度为50mmol/L碳酸氢铵溶液和5μL的0.1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应12小时；
⑤加入5μL的三氟乙酸溶液(三氟乙酸与水的体积比为1:1000)，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。
(2)固相萃取富集目标肽段：
①取聚合物基质WAX固相萃取柱，填充固定相100mg，用1mL甲酸-乙腈混合液活化；甲酸乙腈混合液中，甲酸与乙腈的体积比为1:1000；
②用1mL甲酸-水混合液平衡；甲酸-水混合液中，甲酸与水的体积比为1:1000；
③将蛋白酶解液加入固相萃取柱中；
④用1mL甲酸-水混合液洗涤固相萃取柱；甲酸-水混合液中，甲酸与水的体积比为1:1000；
⑤用1mL甲酸-乙腈混合液洗脱目标肽段，得蛋白洗脱液；甲酸-乙腈混合液中，甲酸与乙腈的体积比为1:1000；
⑥用氮气吹干蛋白洗脱液，用100μL甲酸-乙腈-水混合液溶解，得固相萃取重溶液，用于高效液相色谱串联质谱分析；甲酸-乙腈-水混合液中，甲酸、乙腈、水三者的体积比为1:50:950。
(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析固相萃取重溶液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应(特征肽段谱图如图1所示，如表1所示)，计算各特征肽段峰的峰面积；
(4)绘制标准曲线：配制不同浓度的破伤风类毒素溶液，通过步骤(1)、(2)、(3)得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A＝aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；如表3所示；
配制不同浓度的破伤风类毒素溶液的具体方式如下：分别取150μL、120μL、100μL、80μL、50μL、25μL的破伤风类毒素标准溶液(浓度1000μg/L)，置于低吸附蛋白组学专用离心管中，分别加入适量的100mmol/L的碳酸氢铵溶液(即分别加入0μL、30μL、50μL、70μL、100μL、125μL的碳酸氢铵溶液)，得150μL的破伤风类毒素溶液。
5.样品检测：
(1)以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎疫苗(包括A、W、C和Y)：取样品溶液，进行上述步骤4的(1)、(2)、(3)(固相萃取富集目标肽段步骤中，所用的固定相为聚合物基质的C18WAX柱，所用的酸液为三氟乙酸)，得色谱图(如图2所示)和各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；
计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：
多糖结合位点N的多糖结合率W％＝(样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度)/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
多糖结合位点N的蛋白残留率C％＝特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
N代表某一特征肽段；
数值最小的C％作为该样品中残留蛋白率。
计算结果如表4所示。
(2)以破伤风类毒素为载体的Hib疫苗：取样品溶液，进行上述步骤4的(1)、(2)、(3)(固相萃取富集目标肽段步骤中，所用固定相为聚合物基质的C8WAX柱，所用的酸液为三氟乙酸)，得色谱图(如图2所示)和各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式同上。计算结果如表4所示。
(3)以破伤风类毒素为载体的13价肺炎疫苗(包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)：取样品溶液，进行上述步骤4的(1)、(2)、(3)(固相萃取富集目标肽段步骤中，所用固定相为硅胶基质的的C18SAX柱，所用的酸液为乙酸)，得色谱图(如图2所示)和各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式同上。计算结果如表5所示。
6.线性关系和灵敏度考察：
对标准工作曲线进行线性回归，并对方法进行灵敏度考察，结果见表3。结果表明各标准品在各自的质量范围内线性关系良好，证明本方法在所选线性范围内准确度高，方法灵敏度高。
表3破伤风类毒素载体各特征肽段线性关系、灵敏度和精密度考察(LOQ为定量限)
Figure BDA0002038192320000101
Figure BDA0002038192320000111
7.酶解重复性和方法重复性考察：
方法重复性测定：取浓度为100μg/L的标准品50μL酶解。所得酶解液重复进样6次，将6次所得化合物峰面积求相对标准偏差(即方法重复性)值，如表3所示。
表4以破伤风类毒素为载体的4价脑膜炎和Hib疫苗中多糖蛋白结合位点结合率(-：无结合)
Figure BDA0002038192320000112
表5以破伤风类毒素为载体的13价肺炎疫苗中多糖蛋白结合位点结合率(-：无结合)
Figure BDA0002038192320000121
实施例2以CRM197蛋白为载体的多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定
1.实验仪器与设备：高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。
2.实验试剂：CRM197蛋白标准品(100μg/L)、TCEP、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵、尿素、胰蛋白酶、以CRM197蛋白为载体的脑膜炎疫苗A、W、C、Y、Hib疫苗、13价肺炎疫苗1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F。
3.检测条件：
色谱条件：
色谱柱：固定相2(生物兼容C8色谱柱)；
流动相：A：乙酸水溶液(乙酸与水的体积比为1:1000)；B：乙酸-乙腈混合液(乙酸与乙腈的体积比为1:1000)；
梯度：0～8min，5％B～40％B；8～8.1min，40％B～100％B；8.1～10min，100％B；10～10.1min，100％B～5％B；10.1～15min，5％B；柱温：35℃；流速：0.2～0.5mL/min；进样体积：10μL。
质谱条件：
离子源：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；
加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：250℃；加热模块温度：400℃；
干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。
质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表2。
4.标准曲线绘制：
(1)标准品的酶解：
①取150μLCRM197蛋白溶液，加入150μL RapiGestTM，60℃孵育15分钟；
②加入10μL的0.5mol/L的TCEP溶液，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入10μL的1mol/L的碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入5μL的0.1mg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应12小时；
⑤加入5μL的甲酸溶液(甲酸与水的体积比为1:1000)，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。
(2)固相萃取富集目标肽段：
①取硅胶基质的C18WAX固相萃取柱，填充固定相100mg，用1mL甲酸-甲醇混合液活化；甲酸-甲醇混合液中，甲酸与甲醇的体积比为1:1000；
②用1mL甲酸-水混合液平衡；甲酸-水混合液中，甲酸与水的体积比为1:1000；
③将蛋白酶解液加入固相萃取柱中；
④用1mL甲酸-混合液洗涤固相萃取柱；甲酸-水混合液中，甲酸与水的体积比为1:1000；
⑤用1mL甲酸-甲醇混合液洗脱目标肽段，得蛋白洗脱液；甲酸-甲醇混合液中，甲酸与甲醇剂的体积比为1:1000；
⑥用氮气吹干蛋白洗脱液，用100μL三氟乙酸-甲醇-水混合液溶解，得固相萃取重溶液，用于高效液相色谱串联质谱分析；三氟乙酸-甲醇-水混合液中，三氟乙酸、甲醇、水三者的体积比为1:50:950。
(3)高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析固相萃取重溶液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应(特征肽段如表1所示，谱图如图3所示)，计算各特征肽段峰的峰面积；
(4)绘制标准曲线：配制不同浓度的CRM197蛋白溶液，通过步骤(1)、(2)、(3)得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A＝aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；如表6所示；
配制不同浓度的CRM197蛋白溶液的具体方式如下：分别取150μL、120μL、100μL、80μL、50μL、25μL的CRM197蛋白标准溶液(浓度100μg/L)，置于低吸附蛋白组学专用离心管中，分别加入适量的100mmol/L的碳酸氢铵溶液(即分别加入0μL、30μL、50μL、70μL、100μL、125μL的碳酸氢铵溶液)，得150μL的CRM197蛋白溶液。
5.样品检测：
(1)以CRM197蛋白为载体的4价脑膜炎疫苗(包括A、W、C和Y)：
取样品溶液，进行上述步骤4的(1)、(2)、(3)(固相萃取富集目标肽段步骤中，所用固定相为硅胶基质的C8WAX，所用的酸液为乙酸)，得色谱图(如图4所示)和各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；
计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：
多糖结合位点N的多糖结合率W％＝(样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度)/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
各位点蛋白残留率C％＝特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度×100％；
N代表某一特征肽段；
数值最小的C％作为该样品中残留蛋白率。
计算结果如表7所示。
(2)以CRM197蛋白为载体的Hib疫苗：取样品溶液，进行上述步骤4的(1)、(2)、(3)(固相萃取富集目标肽段步骤中，所用固定相为硅胶基质的SAX，所用的酸液为甲酸)，得色谱图(如图4所示)和各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式同上。计算结果如表7所示。
(3)以CRM197蛋白为载体的13价肺炎疫苗(包括1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19F、19A和23F)：取样品溶液，进行上述步骤4的(1)、(2)、(3)(固相萃取富集目标肽段步骤中，所用固定相为硅胶基质的C18WAX，所用的酸液为甲酸)，得色谱图(如图4所示)和各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式同上。计算结果如表8所示。
6.线性关系和灵敏度考察：
对上述标准工作曲线进行线性回归，并对方法进行灵敏度考察，结果见表6。结果表明各标准品在各自的质量范围内线性关系良好，证明本发明方法在所选线性范围内准确度高，方法灵敏度高。
表6 CRM197蛋白各特征肽段线性关系、灵敏度和精密度考察(LOQ为定量限)
Figure BDA0002038192320000151
7.酶解重复性和方法重复性考察：
方法重复性测定：取浓度为100μg/L的对照品50μL酶解。所得酶解液重复进样6次，将6次所得化合物峰面积求相对标准偏差(即方法重复性)值如表6所示。
表7以CRM197为载体的4价脑膜炎疫苗和Hib疫苗多糖蛋白结合位点结合率(-：无结合)
Figure BDA0002038192320000161
表8以CRM197为载体蛋白的13价肺炎疫苗多糖蛋白结合位点结合率(-：无结合)
Figure BDA0002038192320000162
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (10)

1.一种多糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，所述多糖蛋白结合疫苗是以破伤风类毒素或CRM197蛋白为载体的疫苗，所述破伤风类毒素为甲醛脱毒的破伤风蛋白，其特征在于：包括以下步骤：
（1）标准品的酶解：取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂使蛋白变性；加入二硫键断裂试剂使二硫键断裂；加入碘代乙酰胺溶液；加入蛋白酶酶解，得蛋白酶解液；
（2）固相萃取富集目标肽段：蛋白酶解液通过固相萃取柱，得含目标肽段的蛋白洗脱液；
（3）高效液相色谱串联质谱分析：用高效液相色谱串联质谱分析蛋白洗脱液，得色谱图，色谱图中的特征峰与特征肽段一一对应，计算各特征肽段峰的峰面积；
（4）绘制标准曲线：各特征肽段峰的峰面积与特征肽段的浓度呈线性关系，各特征肽段的浓度与蛋白溶液的浓度相同；配制不同浓度的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，通过步骤（1）、（2）、（3）得到不同蛋白浓度下的各特征肽段峰的峰面积，绘制各特征肽段所对应的特征肽段浓度-特征肽段峰面积曲线，得到标准工作曲线方程通式：A=aC+b，其中，A为特征肽段峰面积，C为特征肽段的浓度，a和b为常数；
（5）样品检测：取待检测的多糖蛋白结合疫苗样品溶液，进行步骤（1）、（2）、（3），得各特征肽段峰面积；将各特征肽段峰面积带入相应的标准工作曲线方程，计算得到样品中各特征肽段的浓度；
（6）计算各特征肽段的多糖结合率、各位点蛋白残留率，计算公式如下：
多糖结合位点N的多糖结合率W%=（样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度-特征肽段N的浓度）/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度 × 100%；
多糖结合位点N的蛋白残留率C%=特征肽段N的浓度/样品溶液中浓度最高的特征肽段的浓度 × 100%；
N代表某一特征肽段；数值最小的C%作为该样品中残留蛋白率。
2.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）的具体操作如下：
①取破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液，加入蛋白质变性剂，60℃孵育15分钟；
②加入二硫键断裂试剂，60℃反应60分钟；
③冷却至室温，加入碘代乙酰胺溶液，在室温、避光条件下反应30分钟；
④加入胰蛋白酶，或：加入胰蛋白酶和碳酸氢铵溶液，37℃反应4～20小时；
⑤加入甲酸、乙酸或三氟乙酸，37℃反应30分钟，得蛋白酶解液。
3.根据权利要求1或2所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述蛋白变性剂选自尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠、RapiGestTM；
或/和：所述二硫键断裂试剂选自二硫苏糖醇、三(2-羧乙基)膦；
或/和：所述碘代乙酰胺溶液的浓度为10 mmol/L～2 mol/L。
4.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）中，固定相选自聚合物基质或硅胶基质的弱阴离子交换固定相WAX、聚合物基质或硅胶基质的强阴离子交换固定相SAX、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合弱阴离子交换固定相C18WAX、聚合物基质或硅胶基质的十八烷基混合强阴离子交换固定相C18SAX、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合弱阴离子交换固定相C8WAX、聚合物基质或硅胶基质的八烷基混合强阴离子交换固定相C8SAX；
流动相为酸液-有机溶剂混合液；
所述酸液选自甲酸、乙酸、三氟乙酸；
所述有机溶剂选自甲醇、乙腈、乙醇、丙酮中的任意一种或两种以上；
或/和：所述酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000。
5.根据权利要求4所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（2）的具体操作如下：
①取混合模式固相萃取柱，填充固定相30～100mg，用0.1～2mL酸液-有机溶剂混合液活化；酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000；
②用0.1～2mL酸液-水混合液平衡；酸液-水混合液中，酸液与水的体积比为1:1～1000；
③将蛋白酶解液加入固相萃取柱中；
④用0.1～2mL酸液-水混合液洗涤固相萃取柱；酸液-水混合液中，酸液与水的体积比为1:1～1000；
⑤用0.1～2mL酸液-有机溶剂混合液洗脱目标肽段，得蛋白洗脱液；酸液-有机溶剂混合液中，酸液与有机溶剂的体积比为1:1～1000；
⑥用氮气吹干蛋白洗脱液，用100 µL酸液-有机溶剂-水混合液溶解，得固相萃取重溶液，用于高效液相色谱串联质谱分析；酸液-有机溶剂-水混合液中，酸液、有机溶剂、水三者的体积比为1:50:950。
6.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中，色谱条件如下：
固定相：固定相1和固定相2；
柱温：20～60 ℃；
流动相：A：离子交换剂水溶液；B：含离子交换剂的有机溶剂溶液或有机溶剂水溶液；
所述固定相1为生物兼容C18色谱柱，所述固定相2为生物兼容C8色谱柱：
所述离子交换剂为质谱兼容的酸、盐，或酸和盐的混合物，所述盐选自甲酸铵、乙酸铵，所述酸选自甲酸、乙酸或三氟乙酸；
所述有机溶剂为可与水互溶的有机溶剂，选自甲醇、乙腈或/和乙醇；
所述流动相A中离子交换剂的浓度为0～20mmol/L；
所述流动相B中离子交换剂的浓度为0～20mmol/L，有机溶剂与水的体积比为60～100：0～40；
梯度：0～8 min，5%B～40%B；8～8.1 min，40%B～100%B；8.1～10 min，100%B；10～10.1min，100%B～5%B；10.1～15 min，5%B；
流速：0.2～0.5 mL/min；
进样体积：10 µL。
7.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中，质谱条件如下：
离子源：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3 L/min；
加热器流速：10 L/min；接口温度：200 ℃；DL温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；
干燥气流速：10 L/min；接口电压：1.5～4 kV。
8.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（3）中，破伤风蛋白的特征肽段如表1所示，CRM197蛋白的特征肽段如表2所示；
表1 破伤风蛋白的特征肽段
特征肽段编号 肽段 1-1 NVDGSGLVSK 1-2 EDNNITLK 1-3 C[+57.021464]NNNNQYVSIDK 1-4 DGNAFNNLDR 1-5 IIPPTNIR 1-6 GIPYAPEYK 1-7 SLEYQVDAIK 1-8 QLLEFDTQSK 1-9 ITMTNSVDDALINSTK_ 1-10 DIIDDFTNESSQK 1-11 VGYNAPGIPLYK 1-12 FIGITELK 1-13 SFLVNQMINEAK 1-14 TASLTDLGGELC[+57.021464]IK 1-15 NILMQYIK 1-16 IYSYFPSVISK 1-17 DFWGNPLR 1-18 GNNLIWTLK 1-19 VNQGAQGILFLQWVR 1-20 SAMLTNLIIFGPGPVLNK
表2 CRM197蛋白的特征肽段
特征肽段编号 肽段 2-1 YDAAGYSVDNENPLSGK 2-2 VTYPGLTK 2-3 VLALK 2-4 VDNAETIK 2-5 ELGLSLTEPLMEQVGTEEFIK 2-6 FGDGASR 2-7 VVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAK 2-8 ALSVELEINFETR 2-9 QYLEEFHQTALEHPELSELK 2-10 TQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIR 2-11 TGFQGESGHDIK 2-12 ITAENTPLPIAGVLLPTIPGK 2-13 LDVNK 2-14 THISVNGR 2-15 IHSNEISSDSIGVLGYQK 2-16 LSLFFEIK
。
9.根据权利要求1所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（4）中，配制不同浓度的破伤风蛋白溶液或CRM197蛋白溶液的具体方式如下：分别取150 µL、120 µL、100 µL、 80 µL、50 µL、25 µL的破伤风类毒素标准溶液或CRM197蛋白标准溶液，分别加入适量的100 mmol/L的碳酸氢铵溶液，得150 µL的破伤风类毒素溶液或CRM197蛋白溶液。
10.根据权利要求1或8所述的糖蛋白结合疫苗中多糖蛋白结合位点结合率的测定方法，其特征在于：所述步骤（4）中，破伤风类毒素各特征肽段的标准工作曲线方程如表3所示；CRM197蛋白各特征肽段的标准工作曲线方程如表6所示；
表3
肽段 线性曲线 NVDGSGLVSK A=6.56C-34.86 EDNNITLK A=248.3C+899.8 C[+57.021464]NNNNQYVSIDK A=24.5C-3083.7 DGNAFNNLDR A=199.4C+12125 IIPPTNIR A=3745C+382336 GIPYAPEYK A=313.4C+66562 SLEYQVDAIK A=15.86C-907.8 QLLEFDTQSK A=103.0C-9148 ITMTNSVDDALINSTK A=162.7C+6536 DIIDDFTNESSQK A=34.4C+390.5 VGYNAPGIPLYK A=176.1C-1387.8 FIGITELK A=179.99C-10792 SFLVNQMINEAK A=141.6-14480 TASLTDLGGELC[+57.021464]IK A=127.6C+9760 NILMQYIK A=96.23C-12718 IYSYFPSVISK A=892.7C+68032 DFWGNPLR A=789.98C+13992 GNNLIWTLK A=317.4X-18947 VNQGAQGILFLQWVR A=77.8C-9553 SAMLTNLIIFGPGPVLNK A=22.22C-2002
表6
肽段 线性曲线 YDAAGYSVDNENPLSGK A=3133.02 C -2234.05 VTYPGLTK A=129013 C + 669502 VLALK A=101106 C - 66967 VDNAETIK A=3024.85 C + 24879 ELGLSLTEPLMEQVGTEEFIK A=6105.7 C + 32109 FGDGASR A=87087 C + 403704 VVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAK A=4450.5 C + 38558.5 ALSVELEINFETR A=2457.2 C + 28156 QYLEEFHQTALEHPELSELK A=4080.1 C - 2496.95 TQPFLHDGYAVSWNTVEDSIIR A= 9597.3 C + 58089 TGFQGESGHDIK A=9374.2 C - 80120 ITAENTPLPIAGVLLPTIPGK A=14919.2 C - 7135.5 LDVNK A=80081.6 C + 14440 THISVNGR A=16227.8 C + 10802 IHSNEISSDSIGVLGYQK A=58496.9 C + 31775 LSLFFEIK A=18511.3 C + 23610
。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11709155B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved chromatography of metal interacting analytes
US11709156B2 (en) 2017-09-18 2023-07-25 Waters Technologies Corporation Use of vapor deposition coated flow paths for improved analytical analysis
US11918936B2 (en) 2020-01-17 2024-03-05 Waters Technologies Corporation Performance and dynamic range for oligonucleotide bioanalysis through reduction of non specific binding
CN113533564B (zh) * 2021-07-08 2023-03-14 谱天（天津）生物科技有限公司 一种用于监测液相质谱分析过程中样品残留程度的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6434925A (en) * 1987-04-24 1989-02-06 Univ Osaka Method for cultivating bordetella pertussis, pertussis toxoid and mixed vaccine thereof
JP2002171971A (ja) * 2000-12-07 2002-06-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体
CN102633898A (zh) * 2012-04-23 2012-08-15 成都欧林生物科技股份有限公司 一种Hib多糖与蛋白结合工艺的优化方法
CN107121416A (zh) * 2017-04-18 2017-09-01 上海理工大学 一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振分析方法
CN108144056A (zh) * 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 多价肺炎球菌多糖结合疫苗及其制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102031998B1 (ko) * 2011-09-04 2019-10-14 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼 당쇄 부가 폴리펩티드 및 당해 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6434925A (en) * 1987-04-24 1989-02-06 Univ Osaka Method for cultivating bordetella pertussis, pertussis toxoid and mixed vaccine thereof
JP2002171971A (ja) * 2000-12-07 2002-06-18 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 抗原およびこの抗原を識別するモノクローナル抗体
CN102633898A (zh) * 2012-04-23 2012-08-15 成都欧林生物科技股份有限公司 一种Hib多糖与蛋白结合工艺的优化方法
CN108144056A (zh) * 2016-12-02 2018-06-12 武汉博沃生物科技有限公司 多价肺炎球菌多糖结合疫苗及其制备方法
CN107121416A (zh) * 2017-04-18 2017-09-01 上海理工大学 一种用于免疫活性肽免疫活性检测的荧光偏振分析方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
19F型肺炎球菌荚膜多糖与载体蛋白P64K结合物的制备及免疫原性;周觉非等;《中国新药杂志》;20120530(第10期);第1131-1134,1185页 *
1型肺炎球菌多糖结合化学特性及结合物免疫原性探究;胡浩等;《中国新药杂志》;20160228(第04期);410-418页 *
Carrier priming with CRM197or diphtheria toxoid has a different impact on the immunogenicity of the respective glycoconjugates:Biophysical and immunochemical interpretation;S.Pecetta等;《Vaccine》;20151231;第314-320页 *

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