CN110672732B - 百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定性、定量测定方法。采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的百日咳毒素产品和百白破疫苗活性蛋白百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的定量方法。本方法首次从复杂的疫苗基质中筛查出可用于各活性疫苗蛋白定性和定量分析的特征肽段，这些肽段与其它所报道的蛋白肽段不同，不能通过蛋白检索库获得，也不能通过这些疫苗蛋白的氨基酸序列简单得出。可实现不同生产厂家、不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的同时定量。

Description

百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的测定方法

技术领域

本发明具体涉及一种百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白百日咳毒素(PT)五种亚基(S1-S5)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)的定性、定量测定方法。本发明属于疫苗质量评价技术领域。

背景技术

百日咳是一种由百日咳杆菌引起的急性呼吸道传染病，其临床特征为咳嗽逐渐加重，呈典型的阵发性、痉挛性咳嗽，咳嗽并伴随出现深长的鸡啼样吸气性吼声，病程长达2～3个月，故有百日咳之称。为了预防百日咳疾病，中国和世界卫生组织先后发展了百日咳毒素产品和百日咳-破伤风-白喉(百白破)联合疫苗。自从广泛实施免疫接种后，本病的发生率已大幅度减少。无论是百日咳毒素产品还是百白破疫苗，百日咳毒素(PT,pertussistoxin)、丝状血凝素(FAH，Filamentous hemagglutinin)、黏附素(PRN，pertactin)、菌毛蛋白(FIM，fimbrial)和腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT)均为其中的主要活性蛋白。这些成分的含量测定对百日咳毒素产品和百白破疫苗的质量评价至关重要。目前，无论是中国药典，还是世界上其它国家药典，均无百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素、黏附素和菌毛蛋白的含量测定方法。含量测定方法的缺失造成百日咳毒素产品和百白破疫苗质量评价造成了困扰。有文献报道用ELISA方法测定百日咳毒素产品和百白破疫苗中功能性蛋白的含量。但该方法受样品基质组成、测试条件、抗体质量的影响较大，从而导致方法重复性较差。此外，该方法难以解读影响疫苗质量差异的原因，从而无法为疫苗生产提供指导和改进建议。

评价方法的稳定性、准确性直接影响疫苗的质量安全。因此，建立一种稳定、准确、抗干扰能力强且可用于疫苗生产指导的百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素(PRN，pertactin)、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素定性和定量分析的方法，对百日咳毒素产品和百白破疫苗的质量评价尤为重要。

发明内容

本发明的目的是为改善百日咳毒素(PT,pertussis toxin)、丝状血凝素(FAH，Filamentous hemagglutinin)、黏附素(PRN，pertactin)、菌毛蛋白(FIM，fimbrial)和腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT)含量测定方法缺失的现状，克服ELISA方法测试疫苗毒素重复性差的问题，提供以上成分的含量测定方法，并用于百日咳毒素产品和百白破疫苗中以上蛋白的含量测定以及百日咳毒素亚基完整性的评价。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

百日咳毒素产品中百日咳毒素5种亚基的定性鉴别方法，包括以下步骤：

(1)取百日咳毒素产品进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将百日咳毒素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

百日咳毒素产品中百日咳毒素5种亚基的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)取百日咳毒素产品进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据百日咳毒素各亚基特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中百日咳毒素各亚基的含量，通过待测液体积与百日咳毒素产品体积的换算，得到百日咳毒素产品中各亚基的含量。

百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基的定性检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将百日咳毒素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据百日咳毒素各亚基特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中百日咳毒素各亚基的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中各亚基的含量。

百白破疫苗中丝状血凝素的定性检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将丝状血凝素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

百白破疫苗中丝状血凝素的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据丝状血凝素特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中丝状血凝素的含量，通过待测液体积与百日咳疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中丝状血凝素的含量。

百白破疫苗中黏附素的定性检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将黏附素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

百白破疫苗中黏附素的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据黏附素特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中黏附素的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中黏附素的含量。

百白破疫苗中菌毛蛋白的定性检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将菌毛蛋白标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

百白破疫苗中菌毛蛋白的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据菌毛蛋白特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中菌毛蛋白的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中菌毛蛋白的含量。

百白破疫苗中腺苷酸环化酶毒素的定性检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将腺苷酸环化酶毒素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

百白破疫苗中腺苷酸环化酶毒素的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据腺苷酸环化酶毒素特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中腺苷酸环化酶毒素的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中腺苷酸环化酶毒素的含量。

同时定性检测百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的方法，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液；

(2)将百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准品溶液和步骤(1)所得酶解液分别进行高效液相色谱串联质谱检测，通过离子对质核比(m/z)及各待测组分的特征肽段的保留时间进行定性鉴别。

同时定量检测百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

(2)将步骤(1)所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素各特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的含量。

上述各待测物质的特征肽段如下所示：

百日咳毒素S1亚基特征肽段为：SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR；

百日咳毒素S2亚基特征肽段为：GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK；

百日咳毒素S3亚基特征肽段为：DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR；

百日咳毒素S4亚基特征肽段为：LGAAASSPDAHVPFCFGK、QLTFEGKPALELIR、AVFMQQRPLR、RPGSSPMEVMLR；

百日咳毒素S5亚基特征肽段为：IYSPADVAGLPTHLYK、IYSPADVAGLPTHLYK(带3个电荷)、NFTVQELALK；

丝状血凝素的特征肽段为：ATPIAAGAR、LTAAVALLNK、AALIEAGGNAR、TPLPVSLTALDNR；

黏附素的特征肽段为：TASGTTIK、FLGTVTVK、VLPEPVK、GANVTVQR；

菌毛蛋白的特征肽段为：VVQLPK、TPFIIK、AYFEPGPTTDYSTGDLR；

腺苷酸环化酶毒素的特征肽段为：SAVGTEAR、SVDVFVDR、ITGDAQANVLR、GVFLSLGK、ILGTDDALTVHDWYR。

以上肽段非特殊说明，在ESI+离子源中均带2个电荷。

优选的，上述定性检测中，待测组分的任意三条及以上特征肽段与标准品相应的特征肽段的保留时间进行对比进行定性鉴别。

优选的，所述百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素各特征肽段的色谱峰面积为至少三条特征肽段峰面积之和。百日咳毒素S1特征肽段的色谱峰峰面积为百日咳毒素S1特征肽段任意三条及以上的特征肽段峰面积之和。百日咳毒素S2特征肽段的色谱峰峰面积为百日咳毒素S2特征肽段中任意三条及以上的特征肽段峰面积之和。百日咳毒素S3特征肽段的色谱峰峰面积为百日咳毒素S3特征肽段中任意三条及以上的特征肽段峰面积之和。百日咳毒素S4特征肽段的色谱峰峰面积为百日咳毒素S4特征肽段中任意三条及以上的特征肽段峰面积之和。百日咳毒素S5特征肽段的色谱峰峰面积为百日咳毒素S5三条特征肽段峰面积之和。丝状血凝素特征肽段的色谱峰峰面积为丝状血凝素任意三条及以上特征肽段峰面积之和。黏附素特征肽段的色谱峰峰面积为黏附素任意三条及以上特征肽段峰面积之和。菌毛蛋白特征肽段的色谱峰峰面积为菌毛蛋白三条特征肽段峰面积之和。腺苷酸环化酶毒素特征肽段的色谱峰峰面积为腺苷酸环化酶毒素任意三条及以上特征肽段峰面积之和。

优选的，所述前处理的方法为：百日咳毒素产品或百白破疫苗加入碳酸氢铵溶液；加入蛋白质变性剂溶液，高温孵育；加入二硫键断裂试剂溶液和碳酸氢铵溶液，高温反应；冷却至室温后，加入碘代乙酰胺溶液，于室温下避光反应；加入胰蛋白酶溶液，反应过夜后，加入酸性溶液；离心处理，得到酶解液。

优选的，所述高效液相色谱串联质谱检测的条件为：

色谱条件：采用C18色谱柱或者C8色谱柱；柱温为30℃；流动相A为含离子交换剂的水溶液；流动相B有两种形式：1)离子交换剂与有机溶剂的混合液；或2)离子交换剂、有机溶剂和水的混合液；梯度为0-8min，5％B-40％B；8-8.1min，40％B-100％B；8.1-10min，100％B；10-10.1min，100％B-5％B；10.1-15min，5％B；流速：0.2～0.5mL/min；

质谱条件：离子源：ESI+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；

加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV。

优选的，所述换算方法为：所取样品的体积V₁，定容后待测液体积为V₂，由标准工作曲线得出待测液中待测组份的含量C_测，则待测样品中待测组分的含量C＝C_测×V₂/V₁。

进一步优选的，所述样品前处理的具体方法为：取100μL百日咳毒素产品或百白破疫苗加入100μL蛋白质变性剂溶液，置于柱温箱中，60-80℃孵育15分钟；加入10μL二硫键断裂试剂溶液和270μL碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60分钟；冷却至室温后，加入10μL碘代乙酰胺溶液，于室温下避光反应；加入5μL胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜后，加入5μL酸性溶液；14000r/min离心15分钟，得上清液，即酶解液。

进一步优选的，样品前处理方法中所述胰蛋白酶溶液为用1mL浓度为100mmol/L碳酸氢铵溶液溶解20μg胰蛋白酶所得溶液，即浓度为20μg/mL。

进一步优选的，色谱条件中所述离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，或酸和盐的混合物；所述盐为甲酸铵或乙酸铵，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸。

流动相A中，离子交换剂选择盐时，离子交换剂水溶液浓度为0～20mmol/L；

离子交换剂选择酸时，酸与水的体积比为0～10:100～1000；

流动相B中，离子交换剂为酸时，离子交换剂、有机溶剂、水的体积比为1～2:200～1000:0～1000；

离子交换剂为盐时，盐溶于水中形成盐水溶液，有机溶剂：盐水溶液的体积比为100～60：0～40，其中盐水溶液的浓度为0～20mmol/L。

进一步优选的，流动相B中有机溶剂包括甲醇、乙腈和乙醇。

进一步优选的，样品前处理方法中所述蛋白变性剂溶液为尿素、十二烷基磺酸钠、辛烷磺酸钠和RapiGest^SF溶液中的一种，所述蛋白变性剂的浓度为10mmol/L-10mol/L；所述酸性溶液为甲酸、乙酸、三氟乙酸水溶液中的一种；甲酸、乙酸、三氟乙酸与水的体积比为100～1:0～100；二硫键断裂试剂溶液为二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦又称TCEP，所述二硫键断裂试剂溶液的浓度为10mmol/L～2mol/L。

进一步优选的，样品前处理方法中碳酸氢铵溶液浓度为10-500mmol/L；进一步优选为50～200mmol/L。

进一步优选的，样品前处理方法中碘代乙酰胺溶液，浓度为10mmol/L-2mol/L，进一步优选为1mol/L。

优选的，标准工作曲线的绘制方法为：

(1)标准储备液配置：取百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准品固体分别用碳酸氢铵水溶液溶解成浓度为60，153，125，143和100μg/mL的标准储备液；

(2)制备标准溶液：分别取各蛋白标准品储备液于低吸附蛋白组学专用离心管中，混合均匀后按酶解步骤酶解，酶解后用水定容各酶解液溶液到1mL，分别得6个浓度的标准溶液；

(3)绘制标准工作曲线：将上述标准溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述标准品的色谱图，根据标准溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线；

所述色谱峰面积为至少三条特征肽段的色谱峰面积之和。

质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1和表2。

表1百日咳毒素(PT)亚基S1-S5质谱检测参数

*为定量离子

表2 PRN、FAH、FIM和ACT质谱检测参数

*为定量离子

本发明采用高效液相色谱串联质谱方法，建立了一种高通量、高选择性、高灵敏度的百日咳毒素产品和百白破疫苗活性蛋白百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的定量方法。本方法具有以下优势：1)本方法首次将高效液相色谱串联质谱用于了百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素同时定量，解决了原有百日咳毒素产品和百白破疫苗质量控制方法重复性差、选择性差等问题，弥补了ELISA方法不能用于不同厂家疫苗蛋白含量对比的缺陷，以及ELISA方法每种蛋白的检出需单独制备抗体、单独检测的不足；2)与其它已报到的高效液相色谱串联质谱定量蛋白相比，本方法应用对象(百日咳毒素产品和百白破疫苗)基质更为复杂，本方法通过基质筛查、重复性考察、线性考察等一系列考察，最终首次从复杂的疫苗基质中筛查出可用于各活性疫苗蛋白定性和定量分析的特征肽段，这些肽段其它所报道的蛋白肽段不同，不能通过蛋白检索库获得，也不能通过这些疫苗蛋白的氨基酸序列简单得出。所得肽段峰面积与蛋白浓度所得工作曲线可实现不同生产厂家、不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的同时定量。

本发明的有益效果：

1.本发明具有一法多用的特点。传统的疫苗蛋白定量方法，如ELISA法，无法用于不同厂家疫苗产品中活性蛋白的含量比较。本发明既可以实现多种产品(百日咳毒素产品和百白破疫苗)中百日咳毒素的5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的含量测定，又可以用于比较同一厂家不同批次百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的含量、评估产品批次重复性，还可以用于不同厂家百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定量定性分析，可为相关产品质量控制标准的建立提供参考。

2、高选择性和抗基质干扰。本发明通过一系列实验，包括酶解重复性考察、进行重复性考察、线性考察和基质筛查等实验，筛选出百日咳毒素5种亚基(S1，S2，S3，S4和S5)、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的特征肽段；所得特征肽段与已报到的其它蛋白肽段不同，不可以通过搜查已有蛋白库获得这些肽段。由于活性蛋白可酶解得到较多不同肽段，因此本方法所得肽段不能从活性蛋白的氨基酸序列推断获得，而需通过大量实验寻找和验证所得。本发明优化所得特征肽段具有高选择性和抗基质干扰能力，可用于百日咳毒素产品和百白破疫苗中活性蛋白的定量和定性研究。

3、快速。传统的疫苗蛋白定量方法，如ELISA法，需针对不同蛋白分别制备抗体，且一种抗体只能测定一种蛋白，通量较低。本方法可通过一次酶解，一次进样且液相分离和MS检测时间在15分钟内，实现百日咳毒素(PT)的5种亚基(S1-S5)和其它四种活性蛋白(FAH,PRN,FIM和ACT)的同时含量测定；

4、定量同时具有定性功能。本方法不仅可用于5种蛋白的含量测定，还可用于四种蛋白的定性分析，实现四种蛋白肽段完整性鉴定。具体为，对比蛋白标准品和样品中相应蛋白的肽段，定性分析疫苗中相关蛋白的肽段完整性。

5、本发明采用了2种固定相和多种流动相组成，均可实现5种目标蛋白及亚基的同时定量和定性分析，为不同样品提供较好的保留和分离选择性，从而实现一次样品前处理，实现百日咳毒素产品和百白破疫苗中5种不同活性蛋白的同时定量。

附图说明

图1a百日咳毒素(PT)特征肽段基质筛查；图1b丝状血凝素(FAH)特征肽段基质筛查；图1c黏附素(PRN)特征肽段基质筛查；图1d菌毛蛋白(FIM)特征肽段基质筛查；图1e腺苷酸环化酶毒素(ACT)特征肽段基质筛查；

图2a活性蛋白标准品溶液中百日咳毒素(PT)特征肽段谱图，插图为局部放大图；图2b活性蛋白标准品溶液中丝状血凝素(FAH)特征肽段图；图2c活性蛋白标准品溶液中黏附素(PRN)特征肽段谱图；图2d活性蛋白标准品溶液中菌毛蛋白(FIM)特征肽段谱图；图2e活性蛋白标准品溶液中腺苷酸环化酶毒素(ACT)特征肽段谱图；

图3a欧盟百日咳毒素标准品表征；图3b中国百日咳毒素(PT)和欧盟百日咳毒素(PT)肽段对比图；

图4a WHO第一代百日咳毒素(PT)标准品表征；图4b中国百日咳毒素(PT)和WHO第一代百日咳毒素(PT)肽段对比图；

图5a WHO第二代百日咳毒素(PT)标准品表征；图5b中国百日咳毒素(PT)和WHO第二代百日咳毒素(PT)肽段对比图；

图6a英国百日咳毒素(PT)标准品表征；图6b中国百日咳毒素(PT)和英国百日咳毒素(PT)肽段对比图；

图7a厂商1第一批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；图7b厂商1第二批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；图7c厂商1第三批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；

图8a厂商2第一批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；图8b厂商2第二批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；图8c厂商2第三批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；

图9厂商3百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；

图10厂商4百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；

图11厂商5百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定；

图12a厂商6百白破疫苗中百日咳毒素(PT)含量测定；图12b厂商6百白破疫苗中丝状血凝素(FAH)含量测定；图12c厂商6百白破疫苗中黏附素(PRN)含量测定；图12d厂商6百白破疫苗中菌毛蛋白(FIM)含量测定；图12e厂商6腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定；

图13a厂商7百白破疫苗中百日咳毒素(PT)含量测定；图13b厂商7百白破疫苗中丝状血凝素(FAH)含量测定；图13c厂商7百白破疫苗中黏附素(PRN)含量测定；图13d厂商7百白破疫苗中菌毛蛋白(FIM)含量测定；图13e厂商7腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定；

图14a厂商8百白破疫苗中百日咳毒素(PT)含量测定；图14b厂商8百白破疫苗中丝状血凝素(FAH)含量测定；图14c厂商8百白破疫苗中黏附素(PRN)含量测定；图14d厂商8百白破疫苗中菌毛蛋白(FIM)含量测定；图14e厂商8腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定；

图15a厂商9百白破疫苗中百日咳毒素(PT)含量测定；图15b厂商9百白破疫苗中丝状血凝素(FAH)含量测定；图15c厂商9百白破疫苗中黏附素(PRN)含量测定；图15d厂商9百白破疫苗中菌毛蛋白(FIM)含量测定；图15e厂商9腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定；

图16a厂商10百白破疫苗中百日咳毒素(PT)含量测定；图16b厂商10百白破疫苗中丝状血凝素(FAH)含量测定；图16c厂商10百白破疫苗中黏附素(PRN)含量测定；图16d厂商10百白破疫苗中菌毛蛋白(FIM)含量测定；图16e厂商10腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定；

图17a厂商11百白破疫苗中百日咳毒素(PT)含量测定；图17b厂商11百白破疫苗中丝状血凝素(FAH)含量测定；图17c厂商11百白破疫苗中黏附素(PRN)含量测定；图17d厂商11百白破疫苗中菌毛蛋白(FIM)含量测定；图17e厂商11腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。

实施例1

1、实验仪器与设备：高压二元泵、脱气机、自动进样器、柱温箱和三重四级杆质谱仪。

2、实验试剂：中国产百日咳毒素(PT)标准品、丝状血凝素(FAH，Filamentoushemagglutinin)标准品、黏附素(PRN，pertactin)标准品、菌毛蛋白(FIM，fimbrial)标准品、腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT)标准品、二硫苏糖醇(DTT)、碘代乙酰胺(IAA)、碳酸氢铵、RapiGest^TM、胰蛋白酶、甲酸、超纯水和乙腈。

3、检测条件：色谱柱：Bi℃18色谱柱；

流动相：A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件：离子源：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，质谱检测参数见表1。

4、特征肽段基质筛查(即抗基质干扰测试)：

取浓度为60μg/mL百日咳毒素标准品、153μg/mL丝状血凝素、125μg/mL黏附素、143μg/mL菌毛蛋白和100μg/mL腺苷酸环化酶毒素的标准品溶液各20μL分别置于5支不同的低吸附离心管中，按步骤5(3)中步骤c)-h)方法酶解。用步骤3中的液相条件和质谱条件以及表1中PT各亚基的MRM条件分析丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)酶解溶液，若所得MRM图中无响应(响应强度为0)或有响应强度值但仅为基线噪音(即没有色谱峰检出)，则所选百日咳毒素(PT)特征肽段为百日咳毒素(PT)特征肽段，无法从其它基质蛋白酶解得到，即肽段具有特异性和抗基质干扰能力。用上述同样方法测试丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)特征肽段。结果如图1a～1e所示，所有特征肽段在其它蛋白酶解液中均无法检出，即所选肽段具有特异性和抗基质干扰能力。

5、标准曲线绘制：

(1)标准储备液配置：取百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准品固体分别用碳酸氢铵水溶液溶解成浓度为60，153，125，143和100μg/mL的标准储备液。

(2)制备标准溶液：a)分别取各蛋白标准品储备液于低吸附蛋白组学专用离心管中，混合均匀后按酶解步骤酶解，酶解后用水定容各酶解液溶液到1mL，得6个浓度的标准溶液如表3所示；

具体的，浓度1：分别取10μL百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准储备液；混合均匀后按酶解步骤酶解，所得酶解液中百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的质量分别为0.6μg、1.53μg、1.25μg、1.4μg、1.0μg，用水定容各酶解液溶液到1mL，所得标准溶液中各组分浓度为0.6μg/mL、1.53μg/mL、1.25μg/mL、1.4μg/mL、1.0μg/mL。

浓度2：分别取20μL百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准储备液；浓度3：分别取40μL百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准储备液；浓度4：分别取80μL百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准储备液；浓度5：分别取160μL百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准储备液；浓度6：分别取320μL百日咳毒素、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素标准储备液。

表3标准曲线浓度

所述酶解过程为：a)向上述各蛋白混合溶液中加入等体积质量分数为0.1％的Rapigest^TM溶液，放置于柱温箱中，60-80℃孵育15min；b)向上述溶液中各加入10μL浓度为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液和200μL100mmol/L的碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60min；c)冷却至室温，再分别向各离心管中加入10μL 1mol/L碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；d)向各离心管中分别加入5μL浓度为20μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜；e)向各离心管中加入5μL三氟乙酸，37℃反应30min；h)14000r/min离心上述样品15min，取上清液，即得酶解液。

(3)绘制标准工作曲线：将上述标准工作溶液用高效液相色谱串联质谱进行分析，即可得到上述标准品的色谱图，如图2a-2e所示，根据标准溶液浓度与对应色谱峰面积的关系得到标准工作曲线。具体步骤如下：

a)百日咳毒素(PT)S1亚基线性曲线：将同一次进样所得的四条特征肽段SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，百日咳毒素(PT)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得百日咳毒素(PT)S1亚基线性方程，见表4方程(1)。

b)百日咳毒素(PT)S2亚基线性曲线：将同一次进样所得的四条特征肽段GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，百日咳毒素(PT)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得百日咳毒素(PT)S2亚基线性方程，见表4方程(2)。

c)百日咳毒素(PT)S3亚基线性曲线：将同一次进样所得的四条特征肽段DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，百日咳毒素(PT)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得百日咳毒素(PT)S3亚基线性方程，见表4方程(3)。

d)百日咳毒素(PT)S4亚基线性曲线：将同一次进样所得的四条特征肽段DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，百日咳毒素(PT)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得百日咳毒素(PT)S4亚基线性方程，见表4方程(4)。

e)百日咳毒素(PT)S5亚基线性曲线：将同一次进样所得的三条特征肽段IYSPADVAGLPTHLYK、IYSPADVAGLPTHLYK、NFTVQELALK峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，百日咳毒素(PT)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得百日咳毒素(PT)S5亚基线性方程，见表4方程(5)。

f)丝状血凝素(FAH)：将同一次进样所得的四条特征肽段IYSPADVAGLPTHLYK、IYSPADVAGLPTHLYK、NFTVQELALK峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，丝状血凝素(FAH)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得丝状血凝素(FAH)线性方程，见表4方程(6)。

g)黏附素(PRN)：将同一次进样所得的四条特征肽段TASGTTIK,FLGTVTVK,VLPEPVK,GANVTVQR峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，黏附素(PRN)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得黏附素(PRN)线性方程，见表4方程(7)。

h)菌毛蛋白(FIM)：将同一次进样所得的三条特征肽段VVQLPK,TPFIIK,AYFEPGPTTDYSTGDLR峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，菌毛蛋白(FIM)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得菌毛蛋白(FIM)线性方程，见表4方程(8)。

i)腺苷酸环化酶毒素(ACT)：将同一次进样所得的五条特征肽段IYSPADVAGLPTHLYK，IYSPADVAGLPTHLYK，NFTVQELALK峰面积相加(即为对应色谱峰面积)，以对应色峰面积为纵坐标，腺苷酸环化酶毒素(ACT)浓度为横坐标(各浓度点浓度见表3)，线性回归，得腺苷酸环化酶毒素(ACT)线性方程，见表4方程(9)。

6、线性方程准确度：

将标准曲线各浓度点中活性蛋白的对应色谱峰面积值带入线性方程计算出标准浓度点活性蛋白浓度(即C_测)，精确度＝(C_测/C_理论)x 100％，结果见表4。C_理论为表3中各浓度点活性蛋白浓度。精确度值在95％-105％之间，表明线性曲线用于对应活性蛋白的准确定量。

7、灵敏度考察：以各活性蛋白中响应最弱的特征肽段为监测对象，当该肽段的响应大约等于10倍噪音时，对应的蛋白浓度作为该方法定量下限，即LOQ(μg/mL)结果见表4。

表4活性蛋白线性曲线和灵敏度考察

8、酶解重复性和方法重复性考察：

方法重复性测定：取浓度为60μg/mL百日咳毒素(PT)标准品、153μg/mL丝状血凝素(FAH，Filamentous hemagglutinin)、125μg/mL黏附素(PRN，pertactin)、143μg/mL菌毛蛋白(FIM，fimbrial)和100μg/mL腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT的标准品溶液各20μL置于低吸附离心管中混合均匀酶解。所得酶解液进样5次，所得肽段峰面积求相对标准偏差(即进样重复性)值如表4所示。

酶解重复性考察：取浓度为60μg/mL百日咳毒素(PT)标准品、153μg/mL丝状血凝素(FAH，Filamentous hemagglutinin)、125μg/mL黏附素(PRN，pertactin)、143μg/mL菌毛蛋白(FIM，fimbrial)和100μg/mL腺苷酸环化酶毒素(adenylate cyclase toxin，ACT的标准品溶液各20μL置于低吸附离心管中混合均匀酶解，同样操作重复5次。5次所得酶解液分别进样，所得肽段峰面积求相对标准偏差(即酶解重复性)值如表5所示。

表5活性蛋白方法重复性和酶解重复性考察结果

实施例2：欧盟百日咳毒素标准品表征

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

LC-MS条件：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，其他检测条件与实施例1相同。

标准品酶解过程为：取欧盟百日咳毒素(PT)标准品和中国百日咳毒素(PT)标准品各100μL分别置于低吸附离心管中；a)向上述离心管中分别加入等体积8mol/L尿素溶液，然后放置于柱温箱中，60-80℃孵育15min；b)向上述溶液中各加入10μL浓度为200mmol/L的二硫苏糖醇溶液和200μL100mmol/L的碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60min；c)冷却至室温，再分别向各离心管中加入10μL400mmol/L碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；d)向各离心管中分别加入5μL浓度为20μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜；e)向各离心管中加入10μL甲酸，37℃反应30min；f)14000r/min离心上述样品15min，取上清液，用水定容至1mL后用于HPLC-MS/MS分析；

测得欧盟百日咳毒素标准品特征肽段色谱图如图3a所示。欧盟百日咳毒素标准品特征肽段与中国百日咳毒素标准品特征肽段的对比图如图3b所示。从图3b可以看出，两种标准品的特征肽段相同，但不同标准品的相同特征肽段峰面积(即图3b纵坐标值)存在差异。

实施案例3：WHO第一代百日咳毒素(PT)标准品表征

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

LC-MS条件：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，其他检测条件与实施例1相同。

标准品酶解过程为：取欧盟百日咳毒素(PT)标准品和中国百日咳毒素(PT)标准品各100μL分别置于低吸附离心管中；a)向上述离心管中分别加入等体积1mol/L尿素溶液，然后放置于柱温箱中，60-80℃孵育15min；b)向上述溶液中各加入10μL浓度为800mmol/L的二硫苏糖醇溶液和200μL100mmol/L的碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60min；c)冷却至室温，再分别向各离心管中加入10μL 1600mmol/L碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；d)向各离心管中分别加入5μL浓度为20μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜；e)向各离心管中加入10μL乙酸，37℃反应30min；f)14000r/min离心上述样品15min，取上清液，用水定容至1mL后用于HPLC-MS/MS分析；

测得WHO第一代百日咳毒素标准品特征肽段色谱图如图4a所示。WHO第一代百日咳毒素标准品特征肽段与中国百日咳毒素标准品特征肽段的对比图如图4b所示。从图4b可以看出，两种标准品的特征肽段相同，但不同标准品的相同特征肽段峰面积(即图4b纵坐标值)存在差异。

实施案例4：WHO第二代百日咳毒素(PT)标准品表征

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

LC-MS条件：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，其他检测条件与实施例1相同。

标准品酶解过程为：取欧盟百日咳毒素(PT)标准品和中国百日咳毒素(PT)标准品各100μL分别置于低吸附离心管中；a)向上述离心管中分别加入等体积20mg/L十二烷基磺酸钠溶液，然后放置于柱温箱中，60-80℃孵育15min；b)向上述溶液中各加入10μL浓度为10mmol/L的TCEP溶液和200μL100mmol/L的碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60min；c)冷却至室温，再分别向各离心管中加入10μL 1600mmol/L碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；d)向各离心管中分别加入5μL浓度为20μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜；e)向各离心管中加入5μL三氟乙酸，37℃反应30min；f)14000r/min离心上述样品15min，取上清液，用水定容至1mL后用于HPLC-MS/MS分析；

测得WHO第二代百日咳毒素标准品特征肽段色谱图如图5a所示。WHO第二代百日咳毒素标准品特征肽段与中国百日咳毒素标准品特征肽段的对比图如图5b所示。从图5b可以看出，两种标准品的特征肽段相同，但不同标准品的相同特征肽段峰面积(即图5b纵坐标值)存在差异。

实施案例5：英国百日咳毒素(PT)标准品表征

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

LC-MS条件：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，其他检测条件与实施例1相同。

标准品酶解过程为：取欧盟百日咳毒素(PT)标准品和中国百日咳毒素(PT)标准品各100μL分别置于低吸附离心管中；a)向上述离心管中分别加入等体积20mg/L十二烷基磺酸钠溶液，然后放置于柱温箱中，60-80℃孵育15min；b)向上述溶液中各加入10μL浓度为200mmol/L的TCEP溶液和200μL100mmol/L的碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60min；c)冷却至室温，再分别向各离心管中加入10μL 1000mmol/L碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；d)向各离心管中分别加入5μL浓度为20μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜；e)向各离心管中加入5μL三氟乙酸，37℃反应30min；f)14000r/min离心上述样品15min，取上清液，用水定容至1mL后用于HPLC-MS/MS分析；

测得英国百日咳毒素标准品特征肽段色谱图如图6a所示。英国百日咳毒素标准品特征肽段与中国百日咳毒素标准品特征肽段的对比图如图6b所示。从图6b可以看出，两种标准品的特征肽段相同，但不同标准品的相同特征肽段峰面积(即图6b纵坐标值)存在差异。

实施案例6：厂商1第一、二和三批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

LC-MS条件：ES+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3L/min；加热器流速：10L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3kV；质谱检测器检测模式为多离子选择监控(MRM)，其他检测条件与实施例1相同。

标准曲线获得步骤与案例1相同。

样品检测：取百日咳毒素产品100μL，按以下步骤酶解：a)向样品溶液中加入等体积0.1％Rapigest^TM尿素溶液，然后放置于柱温箱中，60-80℃孵育15min；b)向上述溶液中各加入10μL浓度为500mmol/L的二硫苏糖醇溶液和200μL100mmol/L的碳酸氢铵溶液，60-80℃反应60min；c)冷却至室温，再分别向各离心管中加入10μL 1mol/L碘代乙酰胺溶液，室温，避光，反应30min；d)向各离心管中分别加入5μL浓度为20μg/mL的胰蛋白酶溶液，37℃反应过夜；e)向各离心管中加入5μL三氟乙酸，37℃反应30min；f)14000r/min离心上述样品15min，取上清液，用水定容至1mL后用于HPLC-MS/MS分析。

所得样品酶解液定容后用液相色谱串联质谱进行分析检测，将所得百日咳毒素(PT)亚基S1-S5的蛋白特征肽段峰面积分别相加后，分别得到百日咳毒素(PT)S1亚基峰面积、百日咳毒素(PT)S2亚基峰面积、百日咳毒素(PT)S3亚基峰面积百日咳毒素(PT)S4亚基峰面积和百日咳毒素(PT)S5亚基峰面积。将上述峰面积分别带入表3方程(1)-(5)，分别计算出待测溶液中百日咳毒素(PT)亚基S1-S5的浓度。再将待测溶液中百日咳毒素(PT)亚基S1-S5的含量带入计算式(10)，计算得出样品中百日咳毒素(PT)亚基S1-S5的浓度。

样品中百日咳毒素亚基浓度(μg/mL)＝待测溶液中百日咳毒素亚基浓度(μg/mL)x10 (10)

测得厂商1第一批、第二批、第三批百日咳毒素产品色谱图分别如图7a、7b和7c所。各批次中均有百日咳毒素(PT)S1-S5亚基检出，含量如表5所示。但无丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)检出。

表5厂商1第一批、第二批、第三批百日咳毒素精制液中百日咳毒素亚基肽段含量

实施案例7：厂商2第一、二和三批次百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：甲醇(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、标准曲线的获得同实施案例1。样品的酶解和样品中百日咳毒素亚基的含量测定步骤同实施案例6。测得厂商2第一批、第二批、第三批百日咳毒素产品色谱图分别如图8a、8b和8c所示。各批次百日咳毒素产品中均有百日咳毒素(PT)S1-S5亚基检出，含量如表10所示。但无丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)检出。

表6厂商2第一批、第二批、第三批百日咳毒素精制液中百日咳毒素亚基肽段含量

实施案例8：厂商3百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙醇(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、标准曲线的获得同实施案例1。样品的酶解和样品中百日咳毒素亚基的含量测定步骤同实施案例6。测得厂商3百日咳毒素产品色谱图如图9所示。各批次百日咳毒素产品中均有百日咳毒素(PT)S1-S5亚基检出，含量如表10所示。但无丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)检出。各批次中百日咳亚基的相关肽段含量如表7所示。

表7厂商3百日咳毒素精制液中百日咳毒素亚基肽段含量

实施案例9：厂商4百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定

固定相：Bio C8色谱柱；

A-5mM乙酸铵水溶液；B-乙腈：乙酸铵水溶液＝900：100(v/v)，乙酸铵水溶液的浓度为5mM。

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、标准曲线的获得同实施案例1。样品的酶解和样品中百日咳毒素亚基的含量测定步骤同实施案例6。测得厂商4百日咳毒素产品色谱图如图10所示。各批次百日咳毒素产品中均有百日咳毒素(PT)S1-S5亚基检出，含量如表8所示。但无丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)检出。

表8厂商4百日咳毒素精制液中百日咳毒素亚基肽段含量

实施案例10：厂商5百日咳毒素产品中百日咳毒素(PT)含量测定

固定相：同实施例9中所述固定相；

A-三氟乙酸：水(2:10000，v/v)；B-三氟乙酸：乙腈(2:10000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、标准曲线的获得同实施案例1。样品的酶解和样品中百日咳毒素亚基的含量测定步骤同实施案例6。测得厂商5百日咳毒素产品色谱图分别如图11所示。该产品中百日咳毒素(PT)S1-S5亚基均有检出，含量如表9所示。但无丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)检出。

表9厂商5百日咳毒素精制液中百日咳毒素亚基肽段含量

实施案例11：厂商6百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-2mM甲酸铵水溶液；B-乙腈：甲酸铵水溶液＝90：10，甲酸铵水溶液的浓度为2mM。

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、各活性蛋白标准曲线的获得和样品酶解条件同实施案例1。

百日咳毒素亚基S1-S5的含量计算步骤同实施案例6。

丝状血凝素(FAH)的含量计算步骤为：所得样品酶解液用液相色谱串联质谱进行分析检测，将所得丝状血凝素(FAH)的特征肽段峰面积相加得FAH特征肽段峰面积和。将FAH特征肽段峰面积和带入表3方程(6)，计算出待测溶液中丝状血凝素(FAH)的浓度。再将待测溶液中丝状血凝素(FAH)的浓度带入计算式(11)，计算得出样品中丝状血凝素(FAH)的浓度：

样品中丝状血凝素(FAH)浓度(μg/mL)＝待测溶液中丝状血凝素(FAH)浓度(μg/mL)x10(11)

黏附素(PRN)的含量计算步骤为：所得样品酶解液用液相色谱串联质谱进行分析检测，将所得丝状血凝素(FAH)的特征肽段峰面积相加得黏附素(PRN)特征肽段峰面积和。将黏附素(PRN)特征肽段峰面积和带入表3方程(7)，计算出待测溶液中黏附素(PRN)的浓度。再将待测溶液中黏附素(PRN)的浓度带入计算式(12)，计算得出样品中丝状血凝素(FAH)的浓度：

样品中黏附素(PRN)浓度(μg/mL)＝待测溶液中黏附素(PRN)浓度(μg/mL)x10(12)

菌毛蛋白(FIM)的含量计算步骤为：所得样品酶解液用液相色谱串联质谱进行分析检测，将所得菌毛蛋白(FIM)的特征肽段峰面积相加得菌毛蛋白(FIM)特征肽段峰面积和。将菌毛蛋白(FIM)特征肽段峰面积和带入表3方程(8)，计算出待测溶液中菌毛蛋白(FIM)的浓度。再将待测溶液中菌毛蛋白(FIM)的浓度带入计算式(13)，计算得出样品中菌毛蛋白(FIM)的浓度：

样品中菌毛蛋白(FIM)浓度(μg/mL)＝待测溶液中菌毛蛋白(FIM)浓度(μg/mL)x10(13)

腺苷酸环化酶毒素(ACT)的含量计算步骤为：所得样品酶解液用液相色谱串联质谱进行分析检测，将所得菌毛蛋白(FIM)的特征肽段峰面积相加得腺苷酸环化酶毒素(ACT)特征肽段峰面积和。将腺苷酸环化酶毒素(ACT)特征肽段峰面积和带入表3方程(9)，计算出待测溶液中腺苷酸环化酶毒素(ACT)的浓度。再将待测溶液中腺苷酸环化酶毒素(ACT)的浓度带入计算式(14)，计算得出样品中腺苷酸环化酶毒素(ACT)的浓度：

样品中腺苷酸环化酶毒素(ACT)浓度(μg/mL)＝待测溶液中腺苷酸环化酶毒素(ACT)浓度(μg/mL)x10(14)

根据上述步骤测得厂商6百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)色谱图分别如图12a-12e所示。各活性蛋白含量如表10所示。

表10厂商6百白破疫苗中个活性蛋白的含量

--表示有检出但含量过低，无法准确定量

实施案例12：厂商7百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定

固定相：BioC8固定相；

A-乙酸：水(1:1000，v/v)；B-乙酸：甲醇：水(1:800:200，v/v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、各活性蛋白标准曲线的获得和样品酶解方法同实施案例1。各活性蛋白含量测定步骤同实施案例11。测得厂商7百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)色谱图分别如图13a-13e所示。各活性蛋白含量如表11所示。

表11厂商7百白破疫苗中百日咳毒素(PT)亚基肽段、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量

实施案例13：厂商8百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-乙酸：水(1:1000，v/v)；B-乙酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、各活性蛋白标准曲线的获得和样品酶解方法同实施案例1。各活性蛋白含量测定步骤同实施案例11。测得厂商8百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)色谱图分别如图14a-14e所示。各活性蛋白含量如表12所示。

表12厂商8百白破疫苗中各活性蛋白的含量

-表示有检出但含量过低，无法准确定量。

实施案例14：厂商9百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈：水(1:600:400，v/v/v)；

梯度：0-8min 10％B-70％B，8-8.1min 70％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-10％B，10.1-15min 10％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、各活性蛋白标准曲线的获得和样品酶解方法同实施案例1。各活性蛋白含量测定步骤同实施案例11。测得厂商9百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)色谱图分别如图15a-15e所示。各活性蛋白含量如表13所示。

表13厂商9百白破疫苗中各活性蛋白的含量

-表示有检出但无法准确定量，x表示无检出。

实施案例15：厂商10百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、各活性蛋白标准曲线的获得和样品酶解方法同实施案例1。各活性蛋白含量测定步骤同实施案例11。测得厂商10百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)色谱图分别如图16a-16e所示。各活性蛋白含量如表14所示。

表14厂商10百白破疫苗中各活性蛋白的含量

-表示有检出但含量过低无法准确定量。

实施案例16：厂商11百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)含量测定

固定相：同实施例1中所述固定相；

A-甲酸：水(1:1000，v/v)；B-甲酸：乙腈(1:1000，v/v)；

梯度：0-8min 5％B-40％B，8-8.1min 40％-100％B，8.1-10min 100％B,10-10.1min100％-5％B，10.1-15min 5％B；柱温：35℃；流速：0.2-0.5mL/min；进样体积：10μL。

质谱条件、各活性蛋白标准曲线的获得和样品酶解方法同实施案例1。各活性蛋白含量测定步骤同实施案例11。测得厂商10百白破疫苗中百日咳毒素(PT)、丝状血凝素(FAH)、黏附素(PRN)、菌毛蛋白(FIM)和腺苷酸环化酶毒素(ACT)色谱图分别如图17a-17e所示。各活性蛋白含量如表15所示。

表15厂商11白破中百白破疫苗中各活性蛋白的含量

-表示有检出但含量过低，无法准确定量。

上述虽然本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

Claims (3)

1.同时定量检测百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取百白破疫苗进行酶解前处理，得到酶解液，将酶解液定容得到待测液；

（2）将步骤（1）所得酶解液进行高效液相色谱串联质谱检测，根据百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素各特征肽段的色谱峰面积和标准工作曲线得到待测液中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的含量，通过待测液体积与百白破疫苗体积的换算，得到百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的含量；

百日咳毒素S1亚基特征肽段为：SCQVGSSNSAFVSTSSSR、ILAGALATYQSEYLAHR、ANPNPYTSR、SVASIVGTLVR；

百日咳毒素S2亚基特征肽段为：GSGDLQEYLR、NTGQPATDHYYSNVTATR、LLSSTNSR、DGTPGGAFDLK；

百日咳毒素S3亚基特征肽段为：DAPPGAGFIYR、TGQPAADHYYSK、LLASTNSR、GNAELQTYLR；

百日咳毒素S4亚基特征肽段为：LGAAASSPDAHVPFCFGK、QLTFEGKPALELIR、AVFMQQRPLR、RPGSSPMEVMLR；

百日咳毒素S5亚基特征肽段为：IYSPADVAGLPTHLYK、带3个电荷的IYSPADVAGLPTHLYK、NFTVQELALK；

丝状血凝素的特征肽段为：ATPIAAGAR、LTAAVALLNK、AALIEAGGNAR、TPLPVSLTALDNR；

黏附素的特征肽段为：TASGTTIK、FLGTVTVK、VLPEPVK、GANVTVQR；

菌毛蛋白的特征肽段为：VVQLPK、TPFIIK、AYFEPGPTTDYSTGDLR；

腺苷酸环化酶毒素的特征肽段为：SAVGTEAR、SVDVFVDR、ITGDAQANVLR、GVFLSLGK、ILGTDDALTVHDWYR；

所述百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素各特征肽段的色谱峰面积分别为相应蛋白特征肽段中任意三条以上的特征肽段峰面积之和。

2.根据权利要求1所述的同时定量检测百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的方法，其特征在于，所述前处理的方法为：百白破疫苗加入碳酸氢铵溶液；加入蛋白质变性剂溶液，高温孵育；加入二硫键断裂试剂溶液和碳酸氢铵溶液，高温反应；冷却至室温后，加入碘代乙酰胺溶液，于室温下避光反应；加入胰蛋白酶溶液，反应过夜后，加入酸性溶液；离心处理，得到酶解液。

3.根据权利要求1所述的同时定量检测百白破疫苗中百日咳毒素5种亚基、丝状血凝素、黏附素、菌毛蛋白和腺苷酸环化酶毒素的方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱检测的条件为：

色谱条件：采用C18色谱柱或者C8色谱柱；柱温为30℃；流动相A-离子交换剂水溶液；流动相B-离子交换剂和有机溶剂的混合液或者离子交换剂、有机溶剂和水的混合液；梯度为0-8 min，5％B-40％B；8-8.1 min，40％B-100％B；8.1-10 min，100％B；10-10.1 min，100％B-5％B；10.1-15 min，5％B；流速：0.2～0.5 mL/min；

质谱条件：离子源：ESI+模式；质谱仪：三重四级杆质谱仪；雾化器流速：3 L/min；加热器流速：10 L/min；接口温度：200℃；DL温度：235℃；加热模块温度：400℃；干燥气流速：10L/min；接口电压：3 kV；

所述离子交换剂为质谱兼容的酸或盐，或酸和盐的混合物；所述盐为甲酸铵或乙酸铵，所述酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸。

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