CN106124678A

CN106124678A - 鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法

Info

Publication number: CN106124678A
Application number: CN201610369188.6A
Authority: CN
Inventors: 郭萌萌; 谭志军; 翟毓秀; 吴海燕; 赵春霞; 李兆新; 彭吉星
Original assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Current assignee: Yellow Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy of Fishery Sciences
Priority date: 2016-05-30
Filing date: 2016-05-30
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2036-05-30
Also published as: CN106124678B

Abstract

本发明公开了一种鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法，属于水产品检测技术领域。方法采用通过式Oasis PRiME HLB固相萃取净化策略，简化样品前处理程序，去除样品基质中脂肪和磷脂等杂质干扰组分，实现了多种全氟化合物及其前体物质的同步提取；同时，利用液相色谱‑四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱的优势，不仅通过获得精确质量数及丰富的碎片离子信息增强了复杂基质的定性能力，还改善了高分辨质谱的定量效果，实现了一次进样同时确证18种PFCs和21种前体物质的高通量定性筛查，并获得了高灵敏的定量结果。

Description

鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法

技术领域

本发明属于水产品检测技术领域，具体涉及一种鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法。

背景技术

全氟化合物(Perfluorinated Compounds，PFCs)是一类新型持久性有机污染物，具有多器官毒性和疑似致癌性。其中，全氟辛烷磺酸(盐)及全氟辛基磺酰氟已被列入《斯德哥尔摩公约》优控名单，在全球范围内限制使用。而除PFCs自身外，PFCs前体物质已被证实是生物体内PFCs污染的主要来源。更重要的是，PFCs前体物质不仅产量巨大，应用和分布范围极为广泛，自然条件下可通过不同方式富集于生物体内并转化为毒性更大和半衰期更长的全氟羧酸和全氟磺酸等PFCs，加之前体物质自身或者转化中间体亦具有生物学毒性，这些都构成了前体物质暴露的潜在危害。因此，PFCs前体物质的生态行为、环境归宿、生物蓄积及安全风险已受到越来越多的研究关注，而如何构建PFCs及其前体物质的高灵敏检测技术是实现这些目标的首要基础，也是国际社会极力解决的关键问题之一。

目前，国内外针对生物基质中PFCs和前体物质的检测方法，多采用液相色谱-串联四极杆质谱法进行分析，但常采用不同的前处理方法或不同的仪器条件进行分类检测，最新的研究报道实现了鱼和贻贝中14种PFCs和10种前体物质的同时检测，但采用了两种色谱梯度洗脱条件分别测定PFCs和前体物质，鱼肉中 24种目标化合物的检出限为0.2～3.1μg/kg。由此，现有方法仍存在前处理过程复杂、检出限偏高的不足，一方面难以实现多种全氟化合物及其前体物质简单方便的同步提取，另一方面也难以实现通过一次进样即可完成几十种目标化合物的同时检测。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法。本发明采用90％乙腈提取目标物，高速离心沉淀基质蛋白，再用通过式Oasis PRiMEHLB固相萃取小柱去除脂肪、磷脂等基质干扰物，实现了多种PFCs及其前体物质的同步提取程序；同时，在优化色谱、质谱条件的基础上，利用QExactive质谱将四极杆与静电场轨道阱高分辨质谱相结合的优势，不仅通过获得精确质量数及丰富的碎片离子信息增强了复杂基质的定性能力，还改善了高分辨质谱的定量效果，实现了一次进样同时确证18种PFCs和21种前体物质的高通量定性筛查，并获得了高灵敏的定量结果。本发明方法提高了PFCs及其前体物质测定方法的准确性和可靠性，为复杂基质中多组分PFCs及其前体物质的快速筛查和定性确证提供了新技术手段。

本发明是通过以下技术方案实现的:

一种鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法，其特征在于，包括以下步骤:

(1)样品提取：准确称取匀浆试样于离心管中，加入内标物，静置后加入乙腈水溶液，涡旋混合，超声提取、离心，移取上清液至比色管中，再用乙腈水溶液定容；

(2)样品净化：取提取液直接加载到Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液，准确移取定体积的流出液氮气吹至定体积的1/8体积，再用50％(体积比)甲醇水溶液定容，高速离心，吸取上清液过0.2μm滤膜后得样品待测液；

(3)液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱测定：在优化的色谱、质谱条件下，将全氟化合物及其前体物质的混合标准溶液和样品待测液进样依次测定，以标准溶液中一级全扫描精确质量数提取的各组分及其相应内标物的面积比值为纵坐标，各组分的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，将样品溶液的峰面积代入线性回归方程，从而获得样品中目标物的含量；

(4)定量分析和定性确证：采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式(Full MS/dd-MS²)，设定涵盖目标化合物的质量数范围150-1000m/z进行一级全扫描，并以每个化合物的理论质量数建立二级扫描的目标列表；

在扫描过程中，当一级全扫描发现目标列表里的母离子时，且信号强度超过预设值后，就会触发数据依赖子离子扫描模式，进而获得对应母离子精确质量数的二级离子全扫描质谱信息。按照欧盟EC/657/2002关于质谱定性需要4个确证点(IdentificationPoint，IP)的要求，选择一级全扫描精确质量数作为定量离子，同时选择二级子离子全扫描中1个丰度相对较高的特征离子作为定性离子，即一个母离子，一个子离子的确证点即可达到4.5，其中高分辨质谱的母离子IP为2.0，子离子IP为2.5，从而实现同时定量分析和定性确证。

进一步，所述步骤(1)中乙腈水溶液的浓度为90％(体积比)。

进一步，所述步骤(2)中对定体积的流出液进行氮气吹干的温度为40℃。

进一步，所述步骤(3)中优化的色谱条件为：Waters BEH C18分析色谱柱 2.1×100mm，1.7μm；延迟色谱柱：Waters C18色谱柱2.1mm×50mm，5μm；柱温：40℃；流速：0.25mL/min；进样量：10μL；流动相：A为5％的甲醇水溶液且含5mmol/L乙酸铵，B为95％的甲醇水溶液且含5mmol/L乙酸铵；洗脱梯度：0～0.5min，10％B；0.5～3.0min，10％～50％B；3.0～5.0min，50％～80％B；5.0～8.0min，80％～85％B；8.0～12.0min，85％～100％B；12.0～16.0min，100％B；16.1～18.0，10％B。

进一步，所述步骤(3)中优化的质谱条件为：加热电喷雾离子源，负离子模式；喷雾电压：-3.0kV；毛细管温度320℃；加热器温度：50℃；鞘气：40arb；辅助气：5arb；扫描模式：Full Scan-ddMS²；采集范围m/z 150-1000；一级全扫描分辨率为70000FWHM，C-trap最大容量：3×10⁶，C-trap最大注入时间：200ms；数据依赖二级子离子扫描分辨率为17500FWHM，C-trap最大容量：1×10⁵，C-trap最大注入时间：50ms，39种目标化合物的质谱定性和定量离子见表1。

表1. 39种目标化合物与内标物的质谱分析参数

本发明与现有技术相比的有益效果：

(1)本发明技术方案利用通过式Oasis PRiME HLB固相萃取净化策略，省去现有技术中常规固相萃取净化方法的活化和淋洗步骤，直接上样吸附杂质成分，从而简化样品前处理程序，且不损失目标组分，实现了18种PFCs及其21种前体物质的同步提取；

(2)本发明技术方案选用均含5mmol/L乙酸铵的5％甲醇水溶液和95％甲醇水溶液为流动相，同时调整色谱的梯度洗脱条件，不仅确保化合物离子化过程稳定，而且使干扰组分在目标组分之后洗脱时基线分离，从而实现了一次进样即可完成全氟化合物及其前体物质的同时分离和测定。

(3)本发明技术方案采用QExactive质谱的Full MS/dd-MS²扫描模式，通过一级全扫描获得精确质量数及二级数据依赖性扫描获得丰富的碎片离子信息，不仅增强了复杂基质的定性能力，还改善了高分辨质谱的定量能力，实现了一次进样同时完成高通量定性筛查和高灵敏准确定量。本发明方法中39种目标化合物的检出限为0.02～0.50μg/kg，部分化合物的灵敏度比现有技术提高一个数量级。

(4)本发明第一次实现18种PFCs及其21种前体物质的同时确证和测定，拓展了生物基质中全氟化合物的检测种类，为全氟化合物及其前体物质的同时检测提供了新技术手段。

附图说明

图1为全氟化合物及其前体物质和内标物混合标准溶液提取离子色谱图。

图2为未经PRiME HLB净化(A)和经PRiME HLB净化(B)的空白鱼肉样品的总离子流比较图。

图3为0.5μg/L标准溶液(A)和0.62μg/kg阳性样品(B)中PFOS的二级质谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案做进一步解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。

实施例

1、本实施例选用的仪器和试材

(1)Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统及DionexUltiMate3000超高效液相色谱系统(Thermo-Fisher公司)；T18 basic均质机(IKA公司)；XW-80A旋涡混合器(上海医大仪器厂)；Himac CR 22GⅡ高速离心机(Hitachi 公司)；N-EVAP112氮吹仪(Organomation公司)；Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)；固相萃取装置(Supelco公司)。

(2)标准物质：(1)18种PFCs：全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟癸酸、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟十三烷酸、全氟十四烷酸、全氟十六烷酸、全氟十八烷酸、全氟丁烷磺酸、全氟己烷磺酸、全氟庚烷磺酸、全氟辛烷磺酸、全氟癸烷磺酸；(2)21种PFCs前体物质：6:2氟调聚酸、8:2氟调聚酸、10:2氟调聚酸、3:3氟调聚酸、5:3氟调聚酸、7:3氟调聚酸、6:2氟调聚不饱和酸、8:2氟调聚不饱和酸、10:2氟调聚不饱和酸、6:2全氟辛烷单磷酸酯、8:2全氟癸烷单磷酸酯、6:2全氟辛烷二磷酸酯、8:2全氟癸烷二磷酸酯、全氟辛烷磺酰胺、N-甲基全氟辛烷磺酰胺、N-乙基全氟辛烷磺酰胺、N-甲基全氟辛烷磺酰胺乙醇、N-乙基全氟辛烷磺酰胺乙醇、全氟辛烷磺酰胺乙酸、N-甲基全氟辛烷磺酰胺乙酸、N-乙基全氟辛烷磺酰胺乙酸；(3)内标物质：¹³C₄-全氟辛酸、¹³C₄-全氟辛烷磺酸、¹³C₈-全氟辛烷磺酰胺、[¹³C₂]6:2氟调聚酸、[¹³C₂]8:2氟调聚酸、[¹³C₂]10:2氟调聚酸、[¹³C₂]6:2氟调聚不饱和酸、[¹³C₂]8:2氟调聚不饱和酸、[¹³C₂]6:2全氟辛烷单磷酸酯、[¹³C₂]6:2全氟辛烷二磷酸酯、N-甲基全氟辛烷磺酰胺-D₃、N-甲基全氟辛烷磺酰胺-D₃(WellingtonLabortories公司)。

(3)甲醇、乙腈(HPLC级，Merk公司)；甲酸、乙酸铵(HPLC级，Fluka公司)；超纯水(18.2MΩ.cm)；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200mg/6mL，Waters公司)，其他未作特殊说明的试剂均为分析纯。

2、样品预处理步骤:

(1)样品提取：准确称取2.5g匀浆试样于15mL聚丙烯离心管中，加入内标物(各2ng)，静置5min后加入9mL 90％乙腈水溶液，涡旋混合1min，超声提取10min，8 000r/min离心5min，移取上清液至10mL比色管中，再用90％乙腈水溶液定容至10mL；

(2)样品净化：取5mL提取液直接加载到Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液。准确移取4.00mL流出液在40℃下氮气吹至约0.5mL，再用50％甲醇水溶液定容至1.00mL，以12 000r/min高速离心10min，吸取上清液过0.2μm滤膜后得样品待测液；

3、仪器分析条件：

液相色谱条件：Waters BEH C₁₈分析色谱柱(2.1×100mm，1.7μm)；延迟色谱柱：Waters C₁₈色谱柱(2.1mm×50mm，5μm)；柱温：40℃；流速：0.25mL/min；进样量：10μL；流动相：A为5％的甲醇水溶液(含5mmol/L乙酸铵)，B为95％的甲醇水溶液(含5mmol/L乙酸铵)；洗脱梯度：0～0.5min，10％B；0.5～3.0min，10％～50％B；3.0～5.0min，50％～80％B；5.0～8.0min，80％～85％B；8.0～12.0min，85％～100％B；12.0～16.0min，100％B；16.1～18.0，10％B。

质谱条件：加热电喷雾离子源(HESI)，负离子模式；喷雾电压：-3.0kV；毛细管温度320℃；加热器温度：50℃；鞘气：40arb；辅助气：5arb；扫描模式：Full Scan-ddMS²；采集范围m/z150-1000；一级全扫描(Full MS)分辨率为70000FWHM，C-trap最大容量(AGCtarget)：3×10⁶，C-trap最大注入时间：200ms；数据依赖二级子离子扫描(dd-MS²)分辨率为17500FWHM，C-trap最大容量(AGC target)：1×10⁵，C-trap最大注入时间：50ms。39种目标化合物的质谱定性和定量离子见表1。

表1. 39种目标化合物与内标物的质谱分析参数

4、仪器分析条件的优化

(1)色谱条件的优化：为了获得更好的灵敏度和峰形，本发明比较了Kinetex XB-C₁₈(2.1mm×100mm，2.6μm)和Waters BEH C₁₈(2.1×100mm，1.7μm)两款分析色谱柱，WatersBEH C₁₈虽然柱压较高，但由于粒径更小，从而改善了分离效果、提高了柱效。在HESI负离子模式下，在流动相中加入乙酸铵有助于提高目标物的离子化效率，本发明最初选用甲醇和5mmol/L乙酸铵溶液为流动相进行梯度洗脱，但在重复性测定实验中发现，同一样品溶液连续进样2次获得的独立测定结果的绝对差值超过15％，可能是由于目标化合物在梯度洗脱条件下离子化不稳定造成的。因此，选用均含5mmol/L乙酸铵的5％甲醇水溶液和95％甲醇水溶液为流动相，同时调整色谱的梯度洗脱条件。优化后的色谱条件不仅确保化合物离子化过程稳定，而且使干扰组分在目标组分之后洗脱时基线分离，从而实现了一次进样即可完成全氟化合物及其前体物质的同时分离和测定(图1)，比现有技术中针对全氟化合物和前体物质分两次进样且采用不同洗脱条件的色谱方法更为简化、方便。

(2)质谱条件的优化：本发明以流动注射方式对39种目标化合物在负离子模式下进行一级全扫描，采用Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式(Full MS/dd-MS²)，设定涵盖目标化合物的质量数范围(150-1000m/z)进行一级全扫描，并以每个化合物的理论质量数(见表1)建立二级扫描的目标列表。按照欧盟EC/657/2002关于质谱定性需要4个确证点(Identification Point，IP)的要求，本发明选择一级全扫描精确质量数作为定量离子，同时选择二级子离子全扫描中1个丰度相对较高的特征离子作为定性离子，即一个母离子，一个子离子(高分辨质谱的母离子IP为2.0，子离子IP为2.5)的确证点即可达到4.5，从而实现同时定量和定性确证。39种目标化合物的特征离子见表1。

5、样品预处理方法的优化

由于乙腈的溶解性好、渗透力强且具有良好的沉淀蛋白作用，为水产品基质中有机污染物的常用提取试剂。本发明选用80％乙腈水溶液、90％乙腈水溶液及纯乙腈考察目标物的提取效果，实验结果表明，以平均回收率计算，其提取率的大小顺序为90％乙腈水溶液(～86％)>80％乙腈水溶液(～72％)>乙腈(～63％)，因此选用90％乙腈水溶液为提取剂。

脂肪和磷脂类化合物是鱼肉基质中污染物分析的主要干扰因素，这些物质不仅干扰LC-MS/MS分析，还会影响色谱柱固定相的活性位点并降低其分辨率，甚至污染质谱仪。因此本发明拟增加快速、有效的净化除脂步骤，以利于提高方法的灵敏度和延长色谱柱、质谱仪的使用寿命。实验采用通过式SPE净化策略，以Oasis PRiME HLB固相萃取小柱净化样品，无需活化和淋洗步骤，样液直接加载至SPE柱以吸附脂肪和磷脂类化合物，不仅有效净化样品溶液，并显著提高了样品分析通量。通过比较OasisPRiME HLB柱净化前后的空白鱼肉样品的全扫描总离子流图(图2)，可以看出，经过OasisPRiME HLB净化以后的鱼肉样品，以基质成分的强度估算，基质成分减少了约75％。

6、灵敏度、准确度和精密度

在高分辨质谱的分析中，其提取的精确质量数色谱图无基线噪音，因此采用传统信噪比方法无法科学定义方法的检出限。本实施例采用基质标准溶液进行逐级稀释的方法确定仪器的最低检出浓度，重复进样三次，以测试结果的标准偏差确定检出限。取适量PFCs及其前体物质的混合标准溶液和内标溶液，配制一系列浓度梯度的标准溶液进行依次测定，以各组分和内标物的面积比值为纵坐标，各组分的质量浓度为横坐标进行线性回归分析，得出线性回归方程、线性范围和相关系数(表2)。结果表明，39种化合物的线性良好，检出限为0.02～0.50μg/kg，适用于全氟化合物及其前体物质的高灵敏定量分析。

表2. 39种目标化合物的线性范围、回归方程、相关系数和检出限

分别选取鲤鱼、大菱鲆和罗非鱼的肌肉为测试基质，分别添加相当于0.5μg/kg、2.0μg/kg和10.0μg/kg浓度的目标物混合标准溶液进行测定，每个浓度设6个平行。同时做空白试验，扣除本底值后计算加标回收率和相对标准偏差。结果显示，39种目标物在鲤鱼肌肉中的加标回收率在62.3％～116％之间，相对标准偏差为8.2％～13.9％；在大菱鲆肌肉中的加标回收率在65.7％～122％之间，相对标准偏差为9.1％～18.8％；在罗非鱼肌肉中的加标回收率在61.7％～108％之间，相对标准偏差为6.93％～15.5％。结果说明，该方法的准确度与精密度满足日常监测的筛查要求。

7、实际样品的筛查

应用本方法定性筛查了90个鱼肉样品(鲤鱼、草鱼、大菱鲆、乌鳢、罗非鱼和河鲀鱼等)，结果显示鱼肉中PFOS检出率达80％以上，但平均含量仅为0.38μg/kg，远低于欧盟针对生物体中PFOS的环境质量标准限量9.1μg/kg，同时发现四分之一的PFOS阳性样品存在其前体物质PFOSA和N-EtFOSE的复合污染。其中，一个PFOS阳性样品定性确证的二级质谱图如图3所示。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其他的变体及改型。

Claims

1.一种鱼肉中全氟化合物及其前体物质的快速筛查方法，其特征在于它包括以下步骤:

(2)样品净化：取提取液直接加载到Oasis PRiME HLB固相萃取柱上，保持一秒一滴的流速，收集全部流出液；准确移取定体积的流出液氮气吹至定体积的1/8体积，再用50％(体积比)甲醇水溶液定容后高速离心，吸取上清液过0.2μm滤膜后得样品待测液；

(4)定量分析和定性确证：采用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱的一级母离子全扫描加数据依赖的二级子离子扫描模式，设定涵盖目标化合物的质量数范围150-1000m/z进行一级全扫描，并以每个化合物的理论质量数建立二级扫描的目标列表；在扫描过程中，当一级全扫描发现目标列表里的母离子时，且信号强度超过预设值后，就会触发数据依赖子离子扫描模式，进而获得对应母离子精确质量数的二级离子全扫描质谱信息；按照欧盟EC/657/2002关于质谱定性需要4个确证点的要求，选择一级全扫描精确质量数作为定量离子，同时选择二级子离子全扫描中1个丰度相对较高的特征离子作为定性离子，即一个母离子，一个子离子的确证点即可达到4.5，其中高分辨质谱的母离子IP为2.0，子离子IP为2.5，从而实现同时定量分析和定性确证。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中乙腈水溶液的浓度为90％(体积比)。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中对定体积的流出液进行氮气吹干的温度为40℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中优化的色谱条件为：WatersBEH C18分析色谱柱2.1×100mm，1.7μm；延迟色谱柱：Waters C18色谱柱2.1mm×50mm，5μm；柱温：40℃；流速：0.25mL/min；进样量：10μL；流动相：A为5％的甲醇水溶液且含5mmol/L乙酸铵，B为95％的甲醇水溶液且含5mmol/L乙酸铵；洗脱梯度：0～0.5min，10％B；0.5～3.0min，10％～50％B；3.0～5.0min，50％～80％B；5.0～8.0min，80％～85％B；8.0～12.0min，85％～100％B；12.0～16.0min，100％B；16.1～18.0，10％B。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中优化的质谱条件为：加热电喷雾离子源，负离子模式；喷雾电压：-3.0kV；毛细管温度320℃；加热器温度：50℃；鞘气：40arb；辅助气：5arb；扫描模式：Full Scan-ddMS²；采集范围m/z 150-1000；一级全扫描分辨率为70000FWHM，C-trap最大容量：3×10⁶，C-trap最大注入时间：200ms；数据依赖二级子离子扫描分辨率为17500FWHM，C-trap最大容量：1×10⁵，C-trap最大注入时间：50ms，39种目标化合物的质谱定性和定量离子见表1；

表1.39种目标化合物与内标物的质谱分析参数