CN112345664A - 动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，采用HPLC‑CAD对动物源性食品中的PFCAs进行测定，将通用型CAD检测器用于PFCAs的测定中，省去了UV、FLD测定时衍生的步骤，避免了MS测定时背景干扰大的问题，建立了一种测定动物源性食品中PFCAs尤其是针对全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸的HPLC‑CAD方法，采用QuEChERS前处理方法进行提取和净化，整个检测方法回收率高，精密度好，检测速度快。

Description

动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域。更具体地说，本发明涉及一种动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法。

背景技术

全氟羧酸(Perfluorocarboxylic Acids，PFCAs)(F(CF2)nCOOH,n＝1-13)是一类具有疏水疏油特性的表面活性剂，常作为润滑油、涂料、化妆品和泡沫灭火剂的添加剂。由于其应用范围广，近年来因PFCAs引起的环境问题日益严重。据统计，1951年至2004年间共有3200-7300t PFCAs排放到环境中，且还有逐年增长的趋势。PFCAs的大量使用，使其扩散到各种环境介质和生物体中，且含量逐渐上升。目前，几乎在所有的环境介质(河流、湖泊、污水、底泥、土壤)和生物介质(海产品、蛋类、动物组织、血液)中，均有PFCAs检出。其中，全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid,PFOA)是最常用也是检出率最高的一种PFCAs。因PFCAs的持久性和生物累积性导致的人类健康问题引起了人们的广泛关注。研究发现，PFCAs还具有多种生物毒性，包括生殖毒性、神经毒性和致癌性等。2005年，美国环境保护署(UnitedStates Environmental Protection Agency，EPA)正式将PFOA列为疑似人类致癌物。目前，PFCAs在食品中的研究主要集中在鸡蛋、鱼类、虾类的研究。EPA给出PFOA的参考剂量值为0.333μg/kg·d，其他PFCAs目前还没有标准参考值剂量。研究显示，挪威地区的猪肉、牛肉和鸡肉3种肉类样品中鸡肉的PFCAs浓度最高，猪肉最低。中国对动物源性食品的消耗较大，PFCAs在动物源性食品中的暴露水平和居民健康风险调查不容忽视。由此可见，监测动物源性食品中PFCAs的残留水平具有重大意义。

高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)是目前使用最广泛的PFCAs测定方法。对于PFCAs这类缺少生色团、既无紫外活性又无荧光活性的化合物，无法直接使用紫外检测器(Ultraviolet Detector，UV)或荧光检测器(FluorescenceDetector，FLD)进行分析，需要进行衍生。常用的衍生试剂有3-溴乙酰基香豆素和对溴苯甲酰甲基溴。通过衍生反应，可以解决PFCAs在UV或FLD中无响应的问题。但此类方法也存在一定弊端，如PFCAs转化不完全、有机溶剂消耗大、需外加能量、耗时长等。Ohya等人利用3-乙酰基-7-甲氧基香豆素和四丁基溴铵的沉淀反应制得了荧光衍生试剂3-溴甲基-7-甲氧基香豆素，将其与PFCAs在70℃下反应25min并置于-30℃的环境下2h使多余的衍生剂沉淀析出后，可用荧光检测器检测带上了荧光基团的衍生产物，检测下限为1mmol kg^-1(J.Chromatogr.B 1998,720:1-7)。在此基础上，

等使用简单易得的3-溴乙酰基香豆素作衍生剂，在70℃下与PFCAs反应1h后生成了有荧光吸收的衍生产物，用HPLC-FLD检测，25min内能分离11种PFCAs，检出限可达43-75μg L^-1(Microchim.Acta 2011,172:409-417)。Qiu等利用对溴苯甲酰甲基溴，于70℃下超声反应30min，将PFCAs衍生成其对应的苯甲酰甲基酯，使其带上紫外生色团，用UV进行检测。该反应中PFCAs的转化率为86％-92％，检出限为5μgL^-1(J.Chromatogr.A 2012,1235:132-140)。这些PFCAs衍生反应存在以下问题：(1)衍生反应实质为一个有机反应，不可避免地存在反应物转化不完全的情况；(2)衍生化试剂多数为有机物，且大部分衍生反应需在有机溶剂中进行，因此反应过程中需消耗大量有机试剂；(3)衍生反应通常需外加能量(如超声、加热等)，耗时长(>30min)；(4)反应后还需去除多余的衍生试剂或对生成的产物进一步提纯。

使用相色谱串联质谱(Liquid Chromatography Tandam Mass Spectrometry，LC/MS)可获得较高灵敏度，可以直接测定基质中痕量PFCAs。在专利号为ZL201611237800.0的发明专利中，向垒等人建立了作物中全氟羧酸类化合物的LC/MS分析方法，样品经超声提取，固相萃取净化后，用LC/MS测定，其测定下限为0.002～0.016ng/g(根、叶、果菜，鲜重)。但其不足之处在于，LC/MS仪器的许多peek管路中含有机氟化物，流动相长时间流过(冲刷)后，少量氟化物会溶出，增大PFCAs测定时的背景，影响PFCAs定量分析的准确性。因此，有必要开发一种更通用的检测PFCAs的方法。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，以快速、准确地测定动物源性食品中的PFCAs。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，采用HPLC-CAD对动物源性食品中的PFCAs进行测定。

优选的是，包括如下步骤：

S1、将动物源性食品作为待测样品，采用QuEChERS前处理方法进行提取和净化，得到净化液；

S2、将净化液采用HPLC-CAD进行检测，得到谱图，采用外标法进行定量分析。

优选的是，所述动物源性食品包括猪、牛、羊、鸡肌肉、虾、鱼肉、动物肝脏、牛奶和鲜蛋。

优选的是，所述PFCAs为全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸中的一种或多种。

优选的是，步骤S1中，所述QuEChERS前处理方法包括如下步骤：将待测样品均质后，用乙腈和盐酸振摇提取，然后加入NaCl振摇，离心，在上清液中加入PSA、C18和GCB填料富集净化，再离心，用乙腈定容至25mL，过滤，得到净化液。

优选的是，所述乙腈与待测样品的体积质量比为5mL：1g，所述盐酸的浓度为6mol/L、体积为20μL，所述NaCl与待测样品的质量比为1：1，所述PSA、C18和GCB填料的质量分别为100mg、40mg和20mg。

优选的是，所述HPLC-CAD的检测参数如下：采用产品规格为Waters Symmerrys、150mm×3.9mm×5μm的C8的色谱柱，流速为1mL min-1，进样量为2.5mL，CAD检测器的雾化器温度为35℃、载气压力为35psi，流动相为乙酸铵-乙酸缓冲液与MeOH的混合物。

优选的是，所述乙酸铵的浓度为5mM。

优选的是，所述流动相的pH为4.7-5.1。

优选的是，所述乙酸铵-乙酸缓冲液与所述MeOH的体积百分比为30:70。

本发明至少包括以下有益效果：本发明的动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法采用HPLC-CAD对动物源性食品中的PFCAs进行测定，将通用型CAD检测器用于PFCAs的测定中，省去了UV、FLD测定时衍生的步骤，避免了MS测定时背景干扰大的问题，建立了一种测定动物源性食品中PFCAs尤其是针对全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸的HPLC-CAD方法，采用QuEChERS前处理方法进行提取和净化，整个检测方法回收率高，精密度好，检测速度快。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明中在不同MeOH的含量下全氟辛酸的分离随时间变化的色谱图；

图2为本发明中在不同pH下全氟辛酸的分离随时间变化的色谱图；

图3为本发明中有机相的不同含量下PFCAs的分离随时间变化的色谱图；

图4为本发明中使用不同色谱柱条件下PFCAs的分离随时间变化的色谱图。

附图标记说明：A为甲醇，B为水，C为乙酸，D为乙酸铵-乙酸缓冲液。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例1：

用HPLC-CAD对动物源性食品中的PFCAs进行测定，具体步骤如下：

S1、将鸡肝作为待测样品，均质后，用乙腈和盐酸振摇提取15min，然后加入浓度为6mol/L、体积为20μL的NaCl后振摇10min，再在10000rpm的转速下离心5min，取出上清液并加入100mg的PSA、40mg的C18和20mg的GCB填料富集净化，以10000rpm的转速离心8min后，用乙腈定容至25mL，过滤膜，得到净化液，其中乙腈与待测样品的体积质量比为5mL：1g，盐酸与待测样品的质量比为1：1。

S2、将净化液采用HPLC-CAD进行检测，得到谱图，检测参数如下：

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，150mm×4.6mm；5μm；

流速：1mL/min；

进样量：2.5mL；

流动相：pH为5.4，包括MeOH，MeOH在流动相中所占体积分数为65％；

CAD检测器的雾化器温度为35℃、载气压力为35psi；

然后采用外标法定量。

实施例2：

本实施例与实施例1的不同之处在于，对HPLC-CAD检测参数进行了优化。

(1)流动性中有机相比例的选择：以Agilent ZORBAX SB-C18(150mm×4.6mm；5μm)为色谱柱，在流速为1mL min^-1下，考察甲醇(MeOH)含量对PFCAs分离的影响，PFCAs这里主要设置为全氟丁酸(Perfluorobutyric Acid，C4HF₇O₂)、全氟戊酸(PerfluoropentanoicAcid，C₅HF₉O₂)、全氟己酸(Perfluorohexanoic Acid，C₆HF₁₁O₂)、全氟庚酸(Perfluoroheptanoic Acid，C₇HF₁₃O₂)和全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，C₈HF₁₅O₂)，为方便描述，全氟辛酸化合物中包含8个碳原子因此简称C8，其他PFCAs采用类似描述，C8是五种PFCAs中与C18填料作用最强的化合物，出峰时间最晚，因此用它来优化流动相中有机相与水相的比例，控制样品分析时间，如图1所示，C18色谱柱对C8保留能力太强，即使流动相比例中MeOH体积比达到60％，C8峰仍有拖尾，升高MeOH比例至65％，拖尾情况有所改善，MeOH比例为70％时，拖尾情况已消失，再进一步增加MeOH含量，会使C8保留因子下降，不利于PFCAs分离。

(2)流动相pH的选择：鉴于PFCAs的pKa值小于3，用乙酸改变流动相中水相pH值，在pH为2.2-6.6的范围内考察流动相pH对C8保留的影响。当流动相pH<3时，C8以分子形式存在，C8在C18色谱柱上保留增强，但色谱峰展宽严重，出峰时间太晚。如图2所示，即使调节pH至3.7±0.2，C8出峰时间提前，但峰展宽现象仍很明显。继续增大pH值至4.9±0.2，C8峰形有所改善，但此条件下C18色谱柱对C8的保留能力下降，C8在3min内即出峰，不利于后续PFCAs混合物的分析。

(3)有机相添加剂的选择：在pH 4.9±0.2条件下，MeOH体积分数为70％的条件下，考察了乙酸铵浓度对PFCAs保留的影响，结果如图3所示，乙酸铵的加入不仅增强了C8的保留，也改善了色谱峰形，乙酸铵浓度越大，保留能力越强。然而，当乙酸铵缓冲液浓度超过5mM时，C8出峰时间大于10min，且峰展宽明显(图中未示出)。因此，最终选择的流动相为5mM醋酸铵-醋酸缓冲液(pH 4.9±0.2)/MeOH(30/70，v/v)。此条件下，5种PFCAs可在6min内分离完全，图3中的色谱峰从右至左依次为全氟辛酸、全氟庚酸、全氟己酸、全氟戊酸、全氟丁酸的色谱峰。

(4)色谱柱的选择：固定流速和流动相采用大体积进样，进一步考察色谱柱种类对PFCAs分离的影响。如图4所示，使用C18色谱柱时，溶剂峰对保留能力最弱的C4的定量存在有干扰，而用C8色谱柱，C4和溶剂峰可以完全分离。

本实施例的HPLC-CAD的检测参数如下：

色谱柱：Waters Symmerrys，150mm×3.9mm，5μm；

流速：1mL/min；

进样量：2.5mL；

流动相：pH为4.9，包括MeOH、乙酸铵-乙酸缓冲液，MeOH在流动相中所占体积分数为70％；

CAD检测器的雾化器温度为35℃、载气压力为35psi。

实施例3：

线性关系试验。

(1)标准溶液的配制：分别准确量取适量全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸标准品，选用超纯水作为溶剂，配制成1000mg L^-1的储备液，然后利用储备液制作全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸的混合标准溶液。

(2)称取多份空白动物源性食品基质，分别加入浓度为5-1000μg kg^-1的混合标准溶液，并分别采用与实施例1相同的前处理方法定容至25mL。

(3)再用0.22μm滤头过滤后，用实施例2的检测参数进行HPLC-CAD测定，将分析物浓度的对数与峰面积的对数作图，得到待测样品的校正曲线。全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸这五种PFCAs的线性回归方程及相关系数如下表1所示，五种PFCAs的线性范围均较宽，达两个数量级以上，线性相关系数均大于0.99，且不同PFCAs的校正曲线斜率几乎相同。按S/N＝3和10计算方法的LODs和定量下限(Limits of Quantification，LOQs)，这5种PFCAs的LOQs在5.0和15μg kg^-1之间，LODs范围为1.5-4.4μg kg^-1。说明本发明的检测方法线性良好。

表1 PFCAs线性回归方程及相关系数

实施例4：

精密度实验。

(1)称取多份空白动物源性食品(猪肝、鲜鸡蛋、鸡胸肉)基质，分别加入浓度为15、30μg kg^-1的混合标准溶液，用乙腈和盐酸振摇提取15min，加入NaCl后振摇10min。10000rpm离心5min后，上清液中加入PSA、C18和GCB填料富集净化，以10000rpm离心8min后，用乙腈定容至25mL。

(2)HPLC-CAD测定：所得溶液用0.22μm滤头过滤后，用HPLC-CAD进行测定。通过在一天内对同一样品测定五次或五天内每天对同一样品进行测定，计算日内和日间相对标准偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，来评价本发明的精密度和重现性。

如表2所示，本发明的日内RSD(精密度)为0.9％-4.2％，日间RSD(重现性)在0.9％和4.1％之间，说明本发明的检测精密度和重现性极佳，具有优良的分析性能。

表2 HPLC-CAD法测PFCAs的精密度

综上所述，本发明将通用型CAD检测器用于PFCAs的测定中，省去了UV、FLD测定时衍生的步骤，避免了MS测定时背景干扰大的问题，建立了一种测定动物源性食品中PFCAs尤其是针对全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸的HPLC-CAD方法，回收率高，精密度好，检测速度快。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施例中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的附图。

Claims (10)

1.一种动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，其特征在于，采用HPLC-CAD对动物源性食品中的PFCAs进行测定。

2.如权利要求1所述的动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将动物源性食品作为待测样品，采用QuEChERS前处理方法进行提取和净化，得到净化液；

S2、将净化液采用HPLC-CAD进行检测，得到谱图，采用外标法进行定量分析。

3.如权利要求2所述的动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，其特征在于，所述动物源性食品包括猪、牛、羊、鸡肌肉、虾、鱼肉、动物肝脏、牛奶和鲜蛋。

4.如权利要求2所述的动物源性食品中全氟羧酸类残留量的测定方法，其特征在于，所述PFCAs为全氟丁酸、全氟戊酸、全氟己酸、全氟庚酸和全氟辛酸中的一种或多种。

5.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，步骤S1中，所述QuEChERS前处理方法包括如下步骤：将待测样品均质后，用乙腈和盐酸振摇提取，然后加入NaCl振摇，离心，在上清液中加入PSA、C₁₈和GCB填料富集净化，再离心，用乙腈定容至25mL，过滤，得到净化液。

6.如权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述乙腈与待测样品的体积质量比为5mL：1g，所述盐酸的浓度为6mol/L、体积为20μL，所述NaCl与待测样品的质量比为1：1，所述PSA、C₁₈和GCB填料的质量分别为100mg、40mg和20mg。

7.如权利要求2所述的测定方法，其特征在于，所述HPLC-CAD的检测参数如下：采用产品规格为Waters Symmerrys、150mm×3.9mm×5μm的C₈的色谱柱，流速为1mL min^-1，进样量为2.5mL，CAD检测器的雾化器温度为35℃、载气压力为35psi，流动相为乙酸铵-乙酸缓冲液与MeOH的混合物。

8.如权利要求7所述的测定方法，其特征在于，所述乙酸铵的浓度为5mM。

9.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述流动相的pH为4.7-5.1。

10.如权利要求8所述的测定方法，其特征在于，所述乙酸铵-乙酸缓冲液与所述MeOH的体积百分比为30:70。

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