CN103487515A - 一种乳制品中全氟化合物的免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，尤其涉及乳制品以及水体中全氟化合物检测方法的新技术。步骤为：第一步，人工抗原的合成。第二步，多克隆抗体的筛选与鉴定。第三步，免疫亲和柱的研制。第四步，超高效液相色谱串联质谱检测方法的建立和优化。该技术提供一种快速检测环境中全氟化合物残留的方法，更好地提高了检测灵敏度，保证了对样品检测的准确性。适应当前对全氟化合物残留检测的需要，便于开展对环境中实际样品中全氟化合物的残留检测。

Description

一种乳制品中全氟化合物的免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，尤其涉及乳制品以及水体中全氟化合物检测方法的新技术。 

背景技术

全氟化合物(Perfluorinated compounds，PFCs)以其优良的热稳定性、化学稳定性、高表面活性及疏水疏油性能，被大量应用于聚合物添加剂、润滑剂等诸多工业生产和生活用品中。全氟辛烷磺酸(Perfluorooctane Sulphonate，PFOS)和全氟辛酸(Perfluorooctanoic Acid，PFOA)是代表性的PFCs。 

2009年5月联合国环境规划署及《关于持久性有机污染物(POPs)的斯德哥尔摩公约》第四次缔约方大会就减少并最终禁止使用9种严重危害人类健康与自然环境的有毒化学物质达成共识。这9种新的POPs就包括PFOS及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟。由于PFCs的C-F键能极大，在正常环境条件下很难降解，不能被传统的污水处理方法有效去除。Alexander G.P.估算1970-2002年间全球全氟辛基磺酰化合物的产量为9.6-12.25万吨，其中海洋表层中存在量估计为235-1770吨。所以PFCs所造成的全球性环境污染已成事实。 

随着我国乳业的快速发展，乳制品产量和人均消费量大幅度增加，人们对乳品的安全问题提出更高的要求。乳品中全氟化合物污染对人体健康的危害，属于长时期、微剂量、慢性细微毒性效应，可以导致人体生理生化或者自然免疫功能缺陷、致畸、致癌、致突变等问题。控制乳制品中PFCs污染，确保乳品安全，正日益受到关注，其中奶牛饲料原料和饮用水受PFCs污染是导致牛乳制品中PFCs残留的重要原因。 

对于PFOS/PFOA等PFCs造成的环境污染，尽管目前国内外已经做了许多研究工作，可是深度和广度仍远远不够，分析方法尚不够成熟，复杂环境、生物及食品样品的分析方法需要进一步完善，经国家标准化管理委员会网站查询表明，未见PFCs残留检测标准方法。PFCs检测方法研究中对样品的前处理是一个至关重要的环节。因为PFCs具有疏水疏油的双重性，属于痕量环境污染物，而且环境基质如生物样品往往都成分复杂，所以样品前处理较困难，已成为制约环境监测和深入研究这类物质环境行为的重要因素之一。 

目前用于PFOS/PFOA环境样品前处理的技术主要有液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)。LLE是传统的萃取方法，尽管方法成熟，可是存在如界面易乳化，耗费溶剂，操作烦琐，实验误差大的缺点。SPE是当前主流的萃取手段，反相C18柱及离子交换HLB柱是使用较多 的SPE柱。这些SPE柱尽管萃取效果好于LLE，可仍然存在一些缺点：SPE柱价格较高，虽然理论上可以重复使用，但由于环境样品的复杂性，往往很少重复使用，使用成本较大；商品化SPE柱的填料易被复杂样品污染堵塞，柱效下降；PFCs极性差别大，反相或离子交换SPE填料并不适合所有的PFCs萃取，如反相吸附剂对小分子极性化合物没有足够的保留，复合弱离子交换吸附剂尽管兼顾离子交换和反相机制，效果好于反相吸附剂，可是对于组织中C10以上全氟酸的回收率却低于50％。近年来，针对LLE、SPE萃取技术的不足，科学家们不断地改进，已形成了液-固萃取、加速溶剂萃取、超声萃取、固相微萃取等新技术。 

免疫亲合色谱(Immunoaffinity Chromatography，IAC)是一项颇具发展潜力的样品前处理技术，其原理是利用抗原与抗体之间的高亲合、高特异而且可逆的“锁-钥匙”结合特性和柱层析色谱的差速迁移理论建立的分离富集方法。IAC具有选择性高、富集能力强、可重复使用的优点，能够满足痕量小分子化合物的检测要求。 

IAC在农药、兽药残留等领域应用的研究较多，部分IAC已经商品化。在环境科学领域，与IAC相关的免疫检测技术研究已经取得一定成果，而有关IAC用于乳制品样品前处理的研究报道却很少。Weilin L.Shelver最近报道了用于环境多溴联苯醚(PBDEs)检测的酶联免疫吸附方法(ELISA)，检测限与GC-NCI-MS相当，可达到0.1ppb。研究数据表明ELISA可用于环境、生物样品的PBDEs检测，回收率与仪器方法相当。然而，ELISA方法存在不能区分相似结构PBDEs的缺点，这恰说明抗体的宽识别能力，提示IAC技术实际应用的可行性。E.Eljarrat报道了用于二噁英提取的IAC技术。该技术可以选择性提取五种ppt级的二噁英，并且与传统的前处理方法相比，IAC可以使处理速度提高20倍，节约100倍的有机溶剂。 

综上所述，有关与PFCs相似小分子化合物如长链脂肪酸或环境有机污染物如溴代联苯醚、二噁英等的人工抗原合成、特异性抗体筛选、IAC柱的制备与应用等技术已经比较成熟，可以为本课题所借鉴。经查新检索，尚未见用于PFCs的免疫检测方法及样品前处理IAC的研究报道。 

发明内容

本发明的目的是制备免疫亲合色谱的抗体，实现色谱前处理中PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的富集浓缩；运用液相色谱-质谱连用对乳制品中PFCs进行试验参数探索，定性定量分析并建立典型PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的标准曲线，提供最佳分离鉴定效果。 

一方面，本发明提供了一种制备PFCs及其衍生物免疫亲合色谱柱的方法，该方法的具体步骤为： 

(1)人工抗原的合成 

a、PFOS/PFOA等PFCs及其结构类似物二羧基或二磺酸基PFCs，通过混合酸酐法与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工抗原。 

b、人工抗原的纯化及鉴定：采用透析的方式进行纯化；通过HPLC、MS、SDS-PAGE凝胶电泳、IR等鉴定手段对所合成的人工抗原进行鉴定，判定偶联效果，计算结合比。 

(2)多克隆抗体的筛选与鉴定 

将合成的PFCs-BSA人工抗原注入大白兔，约间隔7-10天注射一次，30天后，取血清进行抗体的特性鉴定。抗体特性及效价采用包被PFCs-OVA的间接竞争ELISA方法，利用酶标羊抗兔抗体进行测定。对于阳性高效价的抗体血清进行收集，并经聚丙烯凝胶电泳或琼脂双扩进行抗体纯化。纯化后抗体效价、特异性测定采用ELISA进行测定。 

(3)IAC柱的研制 

将抗体与活化的SepharoseCL-4B偶联，乙醇胺封闭未偶联的活性位点，获得特异性免疫吸附剂。将免疫吸附剂装柱，平衡，然后进行柱容量、选择性、富集效率、稳定性测试，洗脱条件的建立，回收率、重复性测定等。 

在本发明的优选实施过程中，前述的柱容量、选择性、富集效率、稳定性测试，洗脱条件的建立过程如下： 

(1)柱容量的选择：分别将含3ng、20ng、100ng、150ng、300ng的PFOS标准品的50mL2％乙腈溶液分别添加到本试验制备的亲和柱上，以2mL/min的流速流出，然后用10mL水溶液洗涤杂质，用4mL乙腈洗脱，自然重力流出，收集洗脱液，30℃氮气吹干，用10％乙腈水溶液复溶并定容至1mL，涡动1min，0.22um的针孔式滤膜过滤。LC-MS检测。结果表明，自制免疫亲和柱的回收率受到不同上样量的影响而变化，从具体数据可知，自制柱上样100ng的时回收率能达到87.9％以上，可满足应用要求。 

(2)上样体积的优化：分别将含100ng的PFOS标准品10mL、30mL、50mL、70mL的PBS溶液分别添加到本试验制备的亲和柱上。以2mL/min的流速流出，然后用10mL 10％甲醇水溶液洗涤杂质，用1mL甲醇洗脱，自然重力流出，收集洗脱液，30℃氮气吹干。用10％乙腈水溶液复溶并定容至1mL，涡动1min，0.22阳的针孔滤膜过滤，LC-MS检测。结果表明，自制亲和柱的上样体积在50～70mL时回收率高、没有显著差异，考虑到尽量缩短操作时间，选择50mL为最佳上样体积。 

(3)上样流速的优化：分别将含100ng的PFOS标准品50mL的PBS溶液加到本试验制备的亲和柱上，以0.5mL/min、1mL/min、2mL/min、3mL/min、4mL/min、5mL/min、的流速流出， 然后用10mL 10％甲醇-水溶液洗涤杂质，用1mL甲醇洗脱，自然重力流出。收集洗脱液，30℃氮气吹于，用10％乙腈-水溶液复溶，并定容至1mL，涡动1min，0.22μm的针孔滤膜过滤，LC-MS检测。结果表明，自制亲和柱在上样流速2～3mL/min时回收率较高，故选择该上样流速为最佳上样流速。 

(4)洗脱溶液的优化 

将含100ng的PFOS标准品50mL的PBS溶液加到本实验制备的PFOS亲和柱上，10mL 10％甲醇-水溶液洗涤杂质。分别用1mL 80％甲醇-水溶液、1mL纯甲醇、4mL纯甲醇、4mL纯乙腈进行洗脱。收集洗脱液，30℃氮气吹干，用10％乙腈-水溶液复溶并定容至1mL，涡动1min，0.22μm的针孔滤膜过滤，LC-MS检测。结果表明，4mL纯乙腈作为洗脱溶剂的效果最佳。PFOS的回收率达91.3％～96.7％。 

另一方面，本发明提供了一种超高效液相色谱串联质谱法测定乳品中全氟化合物的检测方法。方法的具体条件为： 

(1)样品前处理方式为：将样品过滤纸取200mL，利用固相萃取仪进行净化分离萃取，收集洗脱液，将洗脱液氮吹至干，7∶3甲醇水定容1mL，涡旋振荡后用高速冷冻离心机离心，过亲和柱后，供上机测定。 

(2)超高效液相色谱条件为： 

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈ 2.1*50mm，或相当色谱柱。 

流动相：①A：5mmol/L乙酸铵5％甲醇溶液；②流动相B：100％甲醇。梯度洗脱程序如下： 

柱温：45℃。 

进样量：10μL。 

(3)串联质谱条件为： 

离子源：ESI，离子化方式ES(-)。 

毛细管电压：2.5kV。 

离子源温度：120℃。 

脱气溶剂温度：350℃。 

碰撞气流速：0.35mL/min。 

扫描模式：多反应(MRM)。 

碰撞能量、锥孔电压如下： 

使用本发明提供的方法检测乳制品中残留的十种全氟化合物见附图1。使用该方法进行加标回收实验，固相萃取法的加标量为0.4～12.0ng时，平均加标回收率范围为81.0％～133.5％之间，相对标准偏差在1.4％～7.9％之间，如下表所示： 

附图说明

附图1表示十种全氟化合物标准物质色谱图 

具体实施方式

下面结合本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。 

实施例1PFOS免疫亲合柱的制备 

1.抗体的准备 

用反应缓冲液(0.1mol/L，NaHCO₃，0.5mol/LNaCI，pH8.3)稀释抗体溶液。准备10mL的2mg/mL抗体溶液。 

2.亲合柱的制备 

参照溴化氰(CNBr)活化的SepharoseCL 4B胶产品说明书，具体操作步骤如下： 

(1)将2g CNBr活化的SepharoseCL4B干胶悬浮于20mL 1moL/L HCL中溶胀，然后用约200mL 1mmol/L HCL清洗溶胀后的胶。 

(2)将上一步已经洗涤的填料用200mL的反应缓冲液(0.1mol/L NaHCO₃，pH 8.1)清洗充分，将胶加入10mL 2mg/mL的PFOS抗体反应缓冲液溶液中，室温温和搅拌2h，静置，收集反应上清，紫外分光光度计测定洗脱液中未偶联蛋白含量，经测定，本次制备PFOS抗体与凝胶的偶联率是97.2％ 

(3)用反应缓冲液洗涤上一步反应后的胶，将胶加入10mL 0.1mol/L pH8.0的Tris-HCL缓冲液中，室温下温和搅拌反应2h。 

(4)用600mL 0.1mol/L醋酸缓冲液(pH4.5)和0.1mol/LTris-HCL(pH 8.先后交替洗涤处理后的胶。洗涤后的凝胶用200mL PBS充分平衡后装柱，装到1mL的柱管中，高度为0.5cm，装柱缓冲液体PBS(含0.02％叠氮钠)，装好的柱子用堵头封住柱底部，贮存于4℃。 

实施例2使用PFOS免疫亲合色谱柱处理牛乳样品并使用LC-MS检测分析 

本发明制备的亲合柱使用条件为：上样体积为50mL，上样流速为2～3mL/min，洗脱溶剂采用4mL乙腈。对未检出PFOS的牛乳样品，分别添加0.01、0.4和2.0ug/kg三个水平含量的PFOS，每个水平作5次平均试验，检测回收率及精密度。 

采用如下样本处理方法： 

对未检出PFOS的牛乳样品，分别添加0.01、0.4和2.0ug/L三个水平含量的PFOS，将牛乳放置在36℃回温，于7000r/min离心15min，弃上层乳脂和下层沉淀，移取中间层50mL用于上样(相当于PFOS总添加量为0.5ng、20ng、100ng)。用移液管移取50mL试样到泵流操 作架上的50mL注射器中，调节压力泵，控制试样以2～3mL/min稳定的流速。通过本试验制备的亲和柱。排干液体后取下50mL的注射器，装上10mL注射器。注射器内加入10mL 10％甲醇-水溶液，以3～4mL/min稳定的流速洗柱，排干液体后，加入4mL乙腈，洗脱已特异性结合于柱上的PFOS，流速调整为1～2mL/min，收集洗脱液于玻璃试管中，30℃氮气吹干，用10％乙腈-水溶液复溶并定容至1mL，涡动1min，0.22μm的针孔滤膜过滤，LC-MS检测。回收率及变异数据见下表： 

实际样本的加标测定试验结果表明，使用本发明制备的免疫亲和柱，PFOS的三个添加量的回收率在88.8％～94.4％，变异系数为2.9％～6.7％。 

实施例3超高效液相色谱串联质谱法测定全氟化合物的标准物质 

准确吸取1mL的标准溶液于100mL容量瓶中，用7∶3甲醇水定容，充分摇匀，得到0.1mg/L的标准工作溶液。用7∶3甲醇水逐级稀释得到0.05mg/L、0.005mg/L、0.001mg/L、0.0005mg/L、0.0002mg/L、0.00005mg/L的标准工作溶液，按质量浓度由稀至浓顺序依次检测。 

使用本发明提供的超高效液相色谱条件为： 

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C₁₈ 2.1*50mm，或相当色谱柱。 

流动相：①A：5mmol/L乙酸铵5％甲醇水溶液；②流动相B：100％甲醇。梯度洗脱程序如下： 

柱温：45℃。 

进样量：10μL。 

使用的串联质谱条件为： 

离子源：ESI，离子化方式ES(-)。 

毛细管电压：2.5kV。 

离子源温度：120℃。 

脱气溶剂温度：350℃。 

碰撞气流速：0.35mL/min。 

扫描模式：多反应(MRM)。 

碰撞能量、锥孔电压如下： 

以定量离子峰面积对质量浓度作图供超高效液相色谱串联质谱测定，十种标准物质的图谱见附图1。

Claims (10)

1.一种乳制品中全氟化合物的免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，其特征在于，制备免疫亲合色谱的抗体，实现色谱前处理中PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的富集浓缩；运用液相色谱-质谱连用对乳制品PFCs进行定性定量分析并建立典型PFCs及其衍生物全氟辛烷磺酸盐和全氟辛基磺酰氟的标准曲线，提供最佳分离鉴定效果。

2.根据权利要求1所述的免疫亲合色谱-超高效液相色谱-质谱连用快速检测方法，其特征在于，制备了适用于PFCs及其衍生物的免疫亲合色谱柱。

3.根据权利要求2所述的PFCs及其衍生物的免疫亲合色谱柱，其特征在于，色谱柱制备的具体步骤包括：人工抗原的合成、多克隆抗体的筛选与鉴定以及IAC柱的研制。

4.根据权利要求3所述的人工抗原的合成，具体包括：a、PFOS/PFOA等PFCs及其结构类似物二羧基或二磺酸基PFCs，通过混合酸酐法与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)、鸡卵清白蛋白(OVA)偶联合成人工抗原；b、人工抗原的纯化及鉴定：采用透析的方式进行纯化；通过HPLC、MS、SDS-PAGE凝胶电泳、IR等鉴定手段对所合成的人工抗原进行鉴定，判定偶联效果，计算结合比。

5.根据权利要求3所述的多克隆抗体的筛选，具体为：将合成的PFCs-BSA人工抗原注入大白兔，约间隔7-10天注射一次，30天后，取血清进行抗体的特性鉴定。抗体特性及效价采用包被PFCs-OVA的间接竞争ELISA方法，利用酶标羊抗兔抗体进行测定。对于阳性高效价的抗体血清进行收集，并经聚丙烯凝胶电泳或琼脂双扩进行抗体纯化。纯化后抗体效价、特异性测定采用ELISA进行测定。

6.根据权利要求3所述的IAC柱的研制，具体为：将抗体与活化的SepharoseCL-4B偶联，乙醇胺封闭未偶联的活性位点，获得特异性免疫吸附剂。将免疫吸附剂装柱，平衡，然后进行柱容量、选择性、富集效率、稳定性测试，洗脱条件的建立，回收率、重复性测定等。

7.根据权利要求1所述的运用液相色谱-质谱连用对乳制品PFCs进行定性定量分析，其特征在于，乳制品的前处理方式为：将样品过滤纸取200mL，利用固相萃取仪进行净化分离萃取，收集洗脱液，将洗脱液氮吹至干，7∶3甲醇水定容1mL，涡旋振荡后用高速冷冻离心机离心，供上机测定。

8.根据权利要求1所述的运用液相色谱-质谱连用对乳制品PFCs进行定性定量分析，其特征在于，高效液相色谱分析方法具体为：

色谱柱：Eclipse Plus C18 2.1*50mm

流动相：①A：5mmol/L乙酸铵5％甲醇水溶液；②流动相B：100％甲醇

梯度洗脱程序：

柱温：45℃

进样量：10μL

串联质谱条件具体为：

离子源：ESI，离子化方式ES(-)。

毛细管电压：2.5kV。

离子源温度：120℃。

脱气溶剂温度：350℃。

碰撞气流速：0.35mL/min。

扫描模式：多反应(MRM)。

碰撞能量、锥孔电压：

9.根据权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱仪分析方法，其特征在于，固相萃取法的加标量为0.4～12.0ng时，平均加标回收率范围为81.0％～133.5％之间，相对标准偏差在1.4％～7.9％之间。

10.根据权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱仪分析方法，其特征在于，所测定的十种全氟化合物最低检出限为0.014～0.076pg/ml。