CN115876940A - 一种肌肽的检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肌肽的检测方法及其应用，该方法包括：(1)配制样品：对照样品和供试样品的配制；(2)色谱条件：检测仪器：高效液相系统；色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相：无机相含磷酸盐、庚烷磺酸钠，调pH值至2.5‑6，有机相为甲醇；(3)测定方法：取对照样品溶液和供试样品溶液过滤后，注入进样器，按照公式计算供试样品中肌肽纯度。本发明的检测方法分析速度快，灵敏度高，分离度较高；线性关系良好，保留时间重复性高，适于肌肽精确定量；采用等度洗脱，单泵液相即可进行检测，使用便捷，实用性强，适用于工业生产；不需要柱前衍生，操作简单，节省时间；适用于酶促法生产肌肽的生产工艺。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种肌肽的检测方法及其应用。
背景技术
L-肌肽，简称肌肽，英文Carnosine，主要存在于动物骨骼肌与大脑中，是由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的活性二肽，分子量226.24，分子式C9H14N4O3。它能维持机体pH值平衡，去除自由基使细胞抗氧化，维持细胞寿命，因而被广泛应用于食品添加、化妆品、保健品及药品领域。
目前，肌肽的生产方法主要有提取法、化工合成法和酶促法几种。提取法主要利用蛋白酶酶解肌肉组织，提取其中含有的微量肌肽；化工合成法主要有酰基叠氮法、酰氯氨解法、混合酸酐法和三甲基硅保护组氨酸法等方法，生成产物复杂；酶促法是以三磷酸腺苷ATP为能量供体，利用酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸合成肌肽。
无论使用上述何种方法，都会在制备纯品的过程中或多或少产生杂质。目前针对肌肽及相关杂质的检测方法较少，且没有统一标准。如果检测方法不得当，相关物质不能得到有效分离，一些风险杂质会被包含在主峰中。因此，开发一种能将肌肽及其相关杂质有效分离的分析检测方法可大大降低其使用风险，具有十分重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肌肽的检测方法及其应用，其可以克服现有技术的缺陷，能够快速、稳定、准确地检测肌肽含量及相关杂质含量，尤其适用于酶促法生产肌肽的检测。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种肌肽的检测方法，包括以下步骤：
(1)配制样品：
对照样品：称取肌肽标准样品作为对照样品，置于容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度得对照样品；
供试样品：称取肌肽结晶样品作为供试样品，置于容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度；
(2)色谱条件：
检测仪器：高效液相系统；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18)；
流动相：无机相含磷酸盐、庚烷磺酸钠，调节pH值至2.5-6；有机相为甲醇；
检测波长：204nm；
检测温度：30℃；
进样量：20μl；
检测流速：1.0ml/min；
(3)测定方法：取对照样品溶液和供试样品溶液过滤后，注入进样器，按照下列公式计算供试样品中肌肽纯度：
其中，公式中c代表供试样品纯度，cSD代表对照样品纯度，A代表供试样品峰面积，ASD代表对照峰面积，m代表供试样品质量，mSD代表对照样品质量。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中，流动相中无机相磷酸盐浓度为5-50mM，庚烷磺酸钠浓度为1-2mM，调整pH值为2.5-6，有机相为甲醇，无机相和有机相体积比为95:5-99:1。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中，无机相磷酸盐浓度为10mM，庚烷磺酸钠浓度为1mM，调整pH值3.5-4.5，有机相甲醇，无机相和有机相的体积比为97:3。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中，流动相的配制：配制含有10mM KH2PO4和1mM庚烷磺酸钠的水溶液，调整pH值为3.5-4.5，混匀脱气作为无机相，有机相为甲醇，无机相和有机相的体积比为97:3。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中的色谱检测时，检测温度：30℃；进样量：20μl；检测流速：1.0ml/min。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)采用等度洗脱，使用单泵液相进行检测。
一种肌肽的检测方法的应用。
优选地，上述技术方案中，应用于酶促法生产的肌肽的检测。
优选地，上述技术方案中，应用于检测β-丙氨酸和/或L-组氨酸。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
(1)本检测方法分析速度快，使用常规十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18)，肌肽保留时间5-10分钟。
(2)本检测方法肌肽峰型较佳，灵敏度高，且其它物质的分离度较高，有效避免了其它杂质的影响；且在一定范围内线性关系良好，保留时间重复性高，适于肌肽精确定量。
(3)本检测方法可采用等度洗脱，使用单泵液相即可进行检测，使用便捷，实用性强，适用于工业生产。
(4)本检测方法不需要柱前衍生，操作简单，节省时间。
(5)本检测方法还可检测β-丙氨酸和L-组氨酸等物质，尤其适用于酶促法生产肌肽的生产工艺。
附图说明
图1为肌肽波长扫描图，扫描波段190-370nm。
图2为实施例3对照样品肌肽HPLC色谱图。
图3为肌肽外标法曲线。
图4为实施例3供试样品肌肽HPLC色谱图。
图5为实施例4酶促反应液HPLC色谱图，含有肌肽和其它反应杂质。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1色谱条件考察
(1)肌肽波长扫描
取纯品肌肽配制成1mg/ml的溶液，使用岛津LC-16高效液相系统进行波长扫描，扫描波段190-370nm，见图1。图谱显示，肌肽在204nm有最大吸收峰，故选择204nm为检测波长。
(2)色谱柱选择
分别使用反向C18色谱柱、磺酸基强阳离子色谱柱和正向氨基键合硅胶色谱柱进行实验。使用正向氨基键合硅胶色谱柱时肌肽保留时间短于2分钟，使用磺酸基强阳离子色谱柱时肌肽上不易和L-His和ATP分离，使用离子对试剂后可在反向C18色谱柱上保留时间超过5分钟，拖尾因子0.96，峰型基本对称，且拖尾因子2.6和杂质分离有效分离，故选择反向C18色谱柱，参见图2(Kromasil C18色谱柱数据)。
选用岛津WondaSil C18-WR色谱柱、Waters C18-ODS以及Kromasil C18色谱柱等品牌反向C18色谱柱，物质保留时间稍有不同，但未发现对结果有明显影响。
(3)柱温选择
检测温度在常规检测温度20-40℃范围内效果良好，与其他杂质分离度较佳，峰型较佳。肌肽保留时间随温度升高而缩短。
(4)流动相选择
a.无机相的选择
选择磷酸盐和醋酸盐配制缓冲液进行实验，增加盐浓度保留时间缩短，主峰和各杂质分离度降低。使用醋酸盐基线较差、肌肽峰型较差，使用磷酸盐峰型对称、不拖尾。调整磷酸盐使用比例(缓冲液含庚烷磺酸钠1mM)，肌肽保留时间见表1。在磷酸盐浓度5-50mM范围内，肌肽与其他杂质分离度均较好、峰型较佳。
表1.磷酸盐浓度选择
| 磷酸盐浓度[mM] | 5 | 10 | 20 | 50 | 80 |
| 肌肽保留时间[min] | 11.8 | 8.1 | 5.9 | 4.8 | 3.3 |
| 分离度 | 3.3 | 2.6 | 2.2 | 1.5 | 0.43 |
| 拖尾因子 | 0.892 | 0.959 | 1.107 | 1.193 | 1.308 |
在pH值2.5-6.0范围内改变磷酸盐pH值，对肌肽进行测定，分离度均较好。在pH值3.5-4.5范围内，峰型较佳。
表2.pH值选择(10mM磷酸盐)
| pH值 | 2.5 | 3.5 | 4.5 | 6.0 |
| 肌肽保留时间[min] | 13.2 | 10.8 | 8.1 | 5.4 |
| 分离度 | 3.0 | 3.2 | 2.6 | 1.8 |
| 拖尾因子 | 1.566 | 1.218 | 0.959 | 1.401 |
b.有机相的选择
使用甲醇和乙腈作为有机相进行实验，使用甲醇时峰型较佳，故选择甲醇。表3记录了调整不同甲醇使用比例时(缓冲液含10mM磷酸盐，1mM庚烷磺酸钠)肌肽的保留时间。甲醇比例1-5％时，肌肽与其他杂质分离度较好、峰型较佳。
表3.甲醇浓度选择
| 甲醇比例[％] | 1 | 3 | 5 | 10 | 20 |
| 肌肽保留时间[min] | 10.8 | 8.1 | 5.3 | 3.0 | 2.7 |
| 分离度 | 2.9 | 2.6 | 2.2 | 1.0 | 0.38 |
| 拖尾因子 | 0.899 | 0.959 | 1.193 | 1.318 | 1.068 |
c.离子对试剂的选择
选用庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠、四丁基氢氧化铵、四丁基溴化铵等分别作为离子对试剂进行检测，其中庚烷磺酸钠、辛烷磺酸钠可以延长肌肽保留时间，考虑峰型、与杂质的分离度等因素，选择庚烷磺酸钠作为离子对试剂。庚烷磺酸钠浓度1-2mM时，肌肽与其他杂质分离度较好、峰型较佳，见表4。
表4.离子对试剂影响
| 庚烷磺酸钠浓度[mM] | 0 | 1 | 2 | 3 |
| 肌肽保留时间[min] | 1.9 | 8.1 | 10.7 | 16.0 |
| 分离度 | 0.24 | 2.6 | 2.2 | 3.2 |
| 拖尾因子 | 1.442 | 0.959 | 0.862 | 峰型较差 |
综上，确定流动相组成为磷酸盐、庚烷磺酸钠和甲醇，磷酸盐浓度5-50mM，甲醇浓度1-5％，庚烷磺酸钠1-2mM。见表5。
表5.流动相组成
实施例2方法学建立
(1)专属性
取纯水和肌肽水解溶液进样，图谱显示溶剂水无干扰，其它杂质无干扰，分离度均符合要求，理论塔板数3000以上。
(2)线性范围
精密称取肌肽标准样品(对照样品)250.09mg装入50ml容量瓶中，定容配制成标准液。精密量取该标准液配制成不同浓度样品进行检测。以浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标作图。结果表明：肌肽浓度在1-1000μg/ml数据线性关系较好，回归方程为：y＝61335.48x-25015.10，R2值为0.99960，标准曲线见图3。
(3)回收率
精密称取肌肽样品5份，每份5-10mg，分别使用50ml容量瓶定容配制成溶液，使用液相检测，结果回收率在98.0-102％范围内，平均值100.26％，详情见表6。
表6.肌肽回收率
| 样品编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 理论值[μg/ml] | 0.1392 | 0.1139 | 0.1158 | 0.1595 | 0.1342 |
| 实测值[μg/ml] | 0.1411 | 0.1147 | 0.1159 | 0.1602 | 0.1325 |
| 回收率[％] | 101.38 | 100.67 | 100.12 | 100.41 | 98.70 |
(4)样品稳定性考察
配制检测溶液(对照样品)，每隔1小时进行检测，记录峰面积，见表7，检测RSD为0.429％。
表7.样品稳定性
(5)耐用性
使用3个厂家的3根色谱柱(岛津WondaSil C18-WR色谱柱、WatersC18-ODS以及Kromasil C18色谱柱)进行检测，未发现该方法在纯度、分离度和保留时间上有较大偏差。
实施例3肌肽样品检测
配制供试样品：精密称取未知浓度肌肽结晶干燥样品5.14mg，置于50ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度。
配制对照样品：精密称取已知肌肽对照样品5.05mg(纯度99.3％)，置于50ml容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度。
配制流动相：配制含有10mM KH2PO4和1mM庚烷磺酸钠的水溶液，混匀脱气作为无机相，有机相为甲醇，占比3％。
液相检测条件如下：
检测仪器：岛津LC-16高效液相系统；
色谱柱：Kromasil C18；
检测波长：204nm；
检测温度：30℃；
进样量：20μl；
检测流速：1.0ml/min。
取上述供试样品和对照样品分别注入进样器，进样体积各20μl。对照样品检测结果如图2，保留时间8.061分钟为肌肽峰；供试样品检测结果如图4，保留时间8.062分钟为肌肽峰，与供试样品保留时间基本一致。
按照下列公式计算供试样品中肌肽纯度：
公式中c代表供试样品纯度，cSD代表对照样品纯度，A代表供试样品峰面积，ASD代表对照峰面积，m代表供试样品质量，mSD代表对照样品质量。按照公式计算出供试样品纯度96.08％。
实施例4检测肌肽酶促反应液样品
配制供试样品：稀释的肌肽酶促反应液。
对照样品和检测条件同实施例3。
取肌肽酶促反应液稀释样品和对照样品分别注入进样器，进样体积各20μl。供试样品检测结果如图5，8.1分钟峰为肌肽，与对照肌肽样品保留时间基本一致，与其它杂质分离度良好。1.2、1.3、1.9、2.5和5.6分钟峰分别为ATP、ADP、β-丙氨酸、AMP和L-组氨酸。说明使用此检测方法肌肽与反应液中其它杂质有效分离，可应用于反应过程及结果检测。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1.一种肌肽的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)配制样品：
对照样品：称取肌肽标准样品作为对照样品，置于容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度得对照样品；
供试样品：称取肌肽结晶样品作为供试样品，置于容量瓶中，加水超声溶解并稀释至刻度；
(2)色谱条件：
检测仪器：高效液相系统；
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18)；
流动相：无机相含磷酸盐和庚烷磺酸钠，调pH值至2.5-6；有机相为甲醇；
检测波长：204nm；
(3)测定方法：取对照样品溶液和供试样品溶液过滤后，注入进样器，按照下列公式计算供试样品中肌肽纯度：
其中，公式中c代表供试样品纯度，cSD代表对照样品纯度，A代表供试样品峰面积，ASD代表对照峰面积，m代表供试样品质量，mSD代表对照样品质量。
2.根据权利要求1所述的一种肌肽的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相中无机相磷酸盐浓度为5-50mM、庚烷磺酸钠浓度为1-2mM，pH值为2.5-6，有机相甲醇，无机相和有机相的体积比为95:5-99:1。
3.根据权利要求2所述的一种肌肽的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，无机相中磷酸盐浓度为10mM，庚烷磺酸钠浓度为1mM，pH值2.5-6；有机相甲醇，无机相和有机相的体积比为97:3。
4.根据权利要求3所述的一种肌肽的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中，流动相的配制：配制含有10mM KH2PO4和1mM庚烷磺酸钠的水溶液，调整pH值为3.5-4.5，混匀脱气作为无机相，有机相为甲醇，无机相和有机相的体积比为97:3。
5.根据权利要求1所述的一种肌肽的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的色谱检测时，检测温度：30℃；进样量：20μl；检测流速：1.0ml/min。
6.根据权利要求1所述的一种肌肽的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)采用等度洗脱，使用单泵液相进行检测。
7.根据权利要求1-6所述的一种肌肽的检测方法的应用。
8.根据权利要求7所述的一种肌肽的检测方法的应用，其特征在于，应用于酶促法生产的肌肽的检测。
9.根据权利要求7所述的一种肌肽的检测方法的应用，其特征在于，应用于检测β-丙氨酸和/或L-组氨酸。
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