CN114660219A - 一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种β‑烟酰胺单核苷酸的检测方法，包括以下步骤：(1)色谱条件：色谱柱：填料为氨基键合硅胶；流动相：由无机相和有机相混合得到；检测波长：190～280nm；检测流速：0.8～1.2ml/min；柱温：25～35℃；(2)配制供试样品和对照样品：称取β‑烟酰胺单核苷酸标准样品作为对照样品，称取β‑烟酰胺单核苷酸结晶样品作为供试样品，用流动相溶解定容；(3)测定方法：将对照样品溶液和供试样品溶液过滤后，注入高效液相色谱仪，记录色谱图并计算峰面积。本发明检测方法不易与其它物质重合，分离度较高；在较广范围内线性关系良好，适于NMN精确定量；直接上样，操作简单方便，节省时间；成本较低。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸，简称NMN，分子量334.22，分子式C11H15N2O8P， 结构如下：
NMN作为前体可用于合成人体代谢必不可少的辅酶I(烟酰胺腺嘌呤二 核苷酸，NAD)。研究表明，其对人体细胞修复，减缓衰老有重要作用。近 年来，Nature、Cell等顶级期刊刊登了多篇NMN功效研究的文章，哈佛大学 实验证实补充NMN可将哺乳动物寿命延长30％以上，日本美国等几所大学 及企业已相继开展了临床试验，NMN被看作是“长生不老药”，倍受保健品 药品市场的追捧。近期NMN市场前景良好，但市面上销售的NMN原料以及相关终端产品多种多样，质量参差不齐。而其检测方法较少，且没有统一标 准。
高效液相色谱(HPLC)法分析速度快、重复性高，因此药典中测定物质 含量多采用此法。按固定相和流动相的极性不同，HPLC可分为正相色谱法和 反相色谱法。其中，反向色谱法中非极性固定相C18应用最为广泛。目前， NMN检测多使用C18色谱柱，为延长其保留时间，流动相多加入四丁基季铵 盐，如四丁基氢氧化铵或四丁基溴化铵等。但是NMN在上述条件下保留时间 依然短暂，通常在3分钟以内，易与其它物质重叠，分离度较低。
因此，急需设计一种针对NMN更有效的分析检测方法已解决上述技术难 题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法， 其克服了现有技术的上述缺陷，能够快速、稳定、准确地检测β-烟酰胺单核 苷酸(NMN)含量及相关杂质量。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：填料为氨基键合硅胶；
流动相：由无机相和有机相混合得到，无机相为水或磷酸盐缓冲液，有 机相为甲醇；
检测波长：190～280nm；
检测流速：0.8～1.2ml/min；
进样量：10～20μl；
柱温：25～35℃；
(2)配制供试样品和对照样品：称取β-烟酰胺单核苷酸标准样品作为对 照样品，称取β-烟酰胺单核苷酸结晶样品作为供试样品，用流动相溶解定容；
(3)测定方法：将对照样品溶液和供试样品溶液过滤后，注入高效液相 色谱仪，记录色谱图并计算峰面积。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，无机相和有机相的体积比 为50:50～95:5，等度洗脱。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液的浓度为0～20 mM，pH值4～7。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)的供试样品溶液的浓度为5～1000 μg/ml。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(2)中的氨基键合硅胶的直径为5μm。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中色谱柱的尺寸为150×4.6mm 或250×4.6mm。
优选地，上述技术方案中，所述步骤(1)中，检测波长为266nm。
本发明上述技术方案，具有如下有益效果：
(1)本检测方法使用正向色谱法，NMN保留时间5-10分钟，比较反向 C18填充材料色谱柱，此方法不易与其它物质重合，分离度较高。
(2)本检测方法在较广范围内线性关系良好，适于NMN精确定量。
(3)本方法不需要样品柱前衍生，直接上样，操作简单方便，节省时间； 检测过程在半小时内完成，能快速、精确测量NMN含量。
(4)本方法也无需加入离子对试剂，仅需要水或磷酸盐，以及甲醇，便 宜易得，成本较低。
(5)本方法可检NAD+等物质。
(6)本方法流动相可等度洗脱，使用单泵液相即可进行检测，使用便捷， 实用性强，适用于工业生产。
附图说明
图1为NMN波长扫描图。
图2为NMN外标法曲线。
图3为实施例3供试样品在所述条件下高效液相检测NMN色谱图。
图4为实施例4供试样品在所述条件下高效液相检测NMN和NAD+色谱 图。
图5为对比例所述条件下高效液相检测NMN色谱图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施例进行详细描述，以便于进一步理解本发明。 以下实施例中所有使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。以下实施 例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。
实施例1色谱条件选择
(1)NMN波长扫描
使用岛津LC-16高效液相系统，对纯品NMN溶液(对照样品溶液)进 行波长扫描，见图1。NMN可在190-280nm检测，优选266nm。
(2)色谱柱选择
使用反向C18色谱柱、磺酸基强阳离子色谱柱和正向氨基键合硅胶色谱 柱进行实验，结果NMN在前两种色谱柱上保留时间过短均不超过2分钟，且 不易和杂质分离，在正向氨基键合硅胶色谱柱上保留时间超过5分钟，且和 杂质分离有效分离，故选择正向氨基键合硅胶色谱柱。反向C18色谱柱分离 效果详见对比例1。
(3)柱温选择
调整检测温度，NMN(对照样品溶液)保留时间随温度升高而缩短，检 测温度在25-30℃范围内检测效果良好，与其他杂质分离度较佳。详情见表1。
表1.不同柱温对色谱柱影响
(4)流动相选择
分别选择醋酸盐和磷酸盐配制缓冲液进行实验，使用两种盐均为增加浓 度保留时间缩短，主峰和各杂质分离度降低。使用醋酸盐峰型较差，使用磷 酸盐峰型对称，不拖尾。调整磷酸盐使用比例，NMN保留时间见表2。在磷 酸盐浓度0-20mM范围内，NMN与其他杂质分离度均较好，检测出纯度基本 一致。另外，使用纯水作为无机相时峰型稍差(峰宽)。
表2.磷酸盐浓度对检测影响
| 磷酸盐浓度[mM] | 0 | 5 | 10 | 20 |
| NMN保留时间[min] | 8.4 | 7.16 | 6.7 | 4.3 |
在pH值4-7范围内改变磷酸盐pH值，对NMN进行测定，未发现对检 测结果有较大影响。
分别使用甲醇和乙腈作为有机相进行实验，使用甲醇时峰型较佳，表3 记录了调整不同甲醇使用比例时NMN的保留时间。甲醇比例不超过50％时， NMN与其他杂质分离度较好，检测出的NMN纯度基本一致。但甲醇比例超 过50％时，与NAD+峰分离度降低，检测纯度有偏差。
表3.甲醇浓度对检测影响
| 甲醇比例[％] | 5 | 10 | 20 | 30 | 50 |
| NMN保留时间[min] | 7.12 | 7.16 | 7.3 | 7.5 | 8.2 |
通过以上实验，确定流动相为磷酸盐-甲醇流动相，磷酸盐浓度0-20mM， 甲醇浓度5-50％。
实施例2方法学建立
(1)专属性
使用纯水和含杂质的NMN溶液(对照样品)进样，记录图谱，图谱显示 溶剂水无干扰，NMN和其它杂质的分离度符合要求。
(2)线性范围
精密称取NMN标准样品(对照样品)250.18mg装入50ml容量瓶中， 定容配制成标准液。精密量取该标准液配制成不同浓度样品进行检测，数据 结果见表4。以浓度为横坐标，对应峰面积为纵坐标作图，建立线性标准曲线。 NMN浓度低于5μg/ml，高于2000μg/ml偏差过大，浓度在5-1000μg/ml数 据线性关系较好，回归方程为：y＝17319.23x-6806.36，R2值为0.99996，见图 2标准曲线。
表4.NMN标准曲线
| 浓度[μg/ml] | 峰面积1 | 峰面积2 | 峰面积均值 |
| 1.00 | 64572 | 64572 | 64572 |
| 5.00 | 90117 | 90490 | 90303.5 |
| 25.02 | 433725 | 423069 | 428397 |
| 50.04 | 852234 | 860821 | 856527.5 |
| 100.07 | 1727768 | 1742454 | 1735111 |
| 150.11 | 2507678 | 2620967 | 2564323 |
| 200.14 | 3515262 | 3505065 | 3510164 |
| 500.36 | 8602844 | 8582384 | 8592614 |
| 1000.72 | 17328975 | 17373965 | 17351470 |
| 2001.44 | 32786743 | 33826129 | 33306436 |
| 5003.60 | 79311142 | 76093775 | 77702459 |
(3)准确度
精密称取已知NMN样品(对照样品)5份，使用容量瓶定容配制成溶液， 混匀稀释后进行检测，计算回收率见表5，回收率在98.0-102％之间，平均回 收率99.9％，RSD为0.73％，说明该方法检测NMN有良好的准确度。详情见 表5。
表5.NMN回收率
| 样品编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 理论值[μg/ml] | 538.32 | 78.79 | 230.62 | 280.44 | 780.60 |
| 实测值[μg/ml] | 536.98 | 77.84 | 232.34 | 280.48 | 783.88 |
| 回收率[％] | 99.8 | 98.8 | 100.7 | 100.0 | 100.4 |
(4)样品稳定性考察
配制检测溶液(对照样品)1份，分别在1-6小时进行检测，记录峰面积， 检测RSD为0.40％。
(5)耐用性
使用两个厂家的三根氨基键合硅胶色谱柱(Welch Ultimate XB-NH2 150 mm、250mm和Spherisorb Amino)进行检测，未发现该方法在分离度和保 留时间上有较大偏差。
实施例3
使用高效液相检测NMN样品，条件如下：
检测仪器：岛津LC-16高效液相系统。
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱，Welch Ultimate XB-NH2，150×4.6mm，5 μm。
流动相配制：配制1M KH2PO4溶液，使用H3PO4或KOH调节pH值至 5.5。稀释200倍，配成5mM KH2PO4溶液，取900ml加入100ml甲醇，混 匀脱气。
检测波长：266nm。
检测流速：1.0ml/min。
上样样品：
对照样品：已知NMN对照样品浓度98.5％，精密称取23.76mg装入50ml 容量瓶中，定容配制成对照样品。
供试样品：NMN结晶干燥样品，精密称取25.84mg装入50ml容量瓶中， 定容配制成供试样品。
进样量：20μl。
检测温度：30℃。
供试样品检测结果如图3。其中主峰为NMN峰，保留时间7.16分钟，与 对照样品基本一致。理论塔板数大于5000。杂峰为烟酰胺核糖(NR)、腺苷 酸和烟酰胺等杂质。按照公式计算出NMN纯度98.88％，计算公式如下：
参数介绍：公式中，C为样品浓度，A为检测峰面积值，w为样品质量。
实施例4同时检测NMN和NAD+
使用高效液相检测NMN和NAD+样品，条件如下：
检测仪器：岛津LC-16高效液相系统。
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱，150×4.6mm，5μm。
流动相配制：配制1M KH2PO4溶液，使用H3PO4或KOH调节pH值至 5.5。稀释10倍，配成10mM KH2PO4溶液，取900ml加入100ml甲醇，混 匀脱气。
检测波长：266nm。
检测流速：1.0ml/min。
上样样品：
对照样品：已知NMN样品，精密称取25.40mg装入50ml容量瓶中， 定容配制成对照样品1；已知NAD+样品，精密称取27.3mg装入50ml容量 瓶中，定容配制成对照样品2。
供试样品：NMN结晶干燥样品，精密称取25.84mg装入50ml容量瓶中， 定容配制成供试样品。
进样量：20μl。
检测温度：30℃。
供试样品检测结果如图4。其中6.69分钟峰为NMN，8.83分钟峰为NAD+， 与对照样品1和对照品2两物质保留时间一致，分离度良好。
对比例1：C18检测NMN
使用高效液相检测NMN样品，条件如下：
检测仪器：岛津LC-16高效液相系统。
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱(C18)，150×4.6mm，5μm。
流动相配制：配制20mM KH2PO4和10mM四丁基氢氧化铵混合溶液， 使用H3PO4或KOH调节pH值至5.5。取900ml加入100ml甲醇，混匀脱气。
检测波长：266nm。
检测流速：1.0ml/min。
供试样品：已知NMN样品，配制成100μg/ml溶液。
进样量：20μl。
检测温度：30℃。
检测结果如图5。其中主峰为NMN峰，保留时间1.7分钟。
对比例使用C18反向色谱柱，即使加入了离子对试剂四丁基氢氧化铵， NMN的保留时间依然较短，仅不到2分钟，不易与其它物质分离。
虽然本发明已以实施例公开如上，然其并非用于限定本发明，任何本领 域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种不同的选择和修 改，因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (7)
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：填料为氨基键合硅胶；
流动相：由无机相和有机相混合得到，无机相为水或磷酸盐缓冲液，有机相为甲醇；
检测波长：190～280nm；
检测流速：0.8～1.2ml/min；
进样量：10～20μl；
柱温：25～35℃；
(2)配制供试样品和对照样品：称取β-烟酰胺单核苷酸标准样品作为对照样品，称取β-烟酰胺单核苷酸结晶样品作为供试样品，用流动相溶解定容；
(3)测定方法：将对照样品溶液和供试样品溶液过滤后，注入高效液相色谱仪，记录色谱图并计算峰面积。
2.根据权利要求1所述的一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，无机相和有机相的体积比为50:50～95:5，等度洗脱。
3.根据权利要求1所述的一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，磷酸盐缓冲液的浓度为0～20mM，pH值4～7。
4.根据权利要求1所述的一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)的供试样品溶液的浓度为5～1000μg/ml。
5.根据权利要求1所述的一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中的氨基键合硅胶的直径为5μm。
6.根据权利要求1所述的一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中色谱柱的尺寸为150×4.6mm或250×4.6mm。
7.根据权利要求1所述的一种β-烟酰胺单核苷酸的检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中，检测波长为266nm。
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- 2020-12-23 CN CN202011644714.8A patent/CN114660219A/zh active Pending
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