CN108535385B - 一种l-亮氨酸的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种L‑亮氨酸的高效液相色谱检测方法,涉及柱色谱法技术领域。色谱条件:色谱柱:氨基键合硅胶柱;流动相:磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37%:63%‑42%:58%;其中,磷酸二氢钾水溶液浓度为0.1‑0.2mol/L,磷酸二氢钾水溶液中含有氨水,氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt%,磷酸二氢钾水溶液pH值为4.2±0.02;流动相流速:0.7‑1.0mL/min;检测波长:210nm;色谱柱柱温:30℃;进行高效液相色谱分析,测定转化液中L‑亮氨酸含量。本发明方法可快速、准确测定出L‑亮氨酸含量,确保其质量可控,减小误差,节约成本,操作简单,检测时间短,准确度高,提高了效率。
Description
技术领域
本发明涉及柱色谱法技术领域,尤其涉及一种L-亮氨酸的高效液相检测方法。
背景技术
酮亮氨酸钙在体内利用非必需氨基酸的氮转化为亮氨酸而发挥作用。亮氨酸为人体8种必需氨基酸之一,属于支链氨基酸。L-亮氨酸是复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料,对于维持危重病人的营养需要,抢救患者的生命起着积极的作用。同时作为支链氨基酸,因其氧化速率较快,在体内分解产生ATP的效率高于其它氨基酸,从而用来补充大运动量引起的能量消耗,减轻由此引起的中枢神经系统的疲劳反应,减少高强度运动造成的蛋白分解。
L-亮氨酸是制备酮亮氨酸钙的起始原料,由于生产前需对原料药进行质量检测。现有技术中公开了采用C18色谱柱,0.01mmol/L磷酸二氢钾:乙腈、甲醇混合的流动相,在线衍生的方法,但该方法检测时间长,一个样品需35min,且需梯度洗脱,对高效液相色谱仪、配制流动相的试剂要求较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,该方法可快速,准确测定出L-亮氨酸的含量,确保其质量可控,减小误差,节约成本,操作简单,检测时间短,准确度高,提高了效率。
为解决上述技术问题,本发明所采取的技术方案是:一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法:
色谱条件为:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:磷酸二氢钾水溶液和乙腈;流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37%:63%-42%:58%;
其中,所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L,磷酸二氢钾水溶液中含有氨水,氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt%,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02;
流动相流速:0.7-1.0mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱柱温:30℃;
检测步骤为:
(1)配制流动相,过滤,脱气;
(2)调节高效液相色谱仪条件,平衡色谱柱;
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制:称取L-亮氨酸对照品和L-亮氨酸供试品,分别用流动相溶解定容,即得;
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,采用外标法计算L-亮氨酸的含量。
优选的,流动相流速为0.7mL/min。
优选的,流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为40%:60%;磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L。
优选的,步骤(3)中,对照品溶液的浓度为0.4mg/mL。
优选的,步骤(3)中,供试品溶液的配制为:含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml,用流动相溶解并稀释至50ml。
优选的,色谱柱长度为250mm,内径为4.6mm,其填料粒径为5μm。
优选的,步骤(4)中,对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于:
(1)本发明方法可快速,准确测定出L-亮氨酸的含量,确保其质量可控,减小误差,节约成本,操作简单,出峰时间快,缩短生产过程中的检测时间,9min即可检测完成(现有方法需35min),准确度高,大大提高了生产效率。
(2)本发明方法可通过一次高效液相检测,准确测定出转化液中L-亮氨酸的含量,且与其他杂质峰达到很好的分离效果,节省了人工、时间和溶剂等成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图;
图1是本发明实施例中L-亮氨酸对照品溶液的色谱图;
图2是本发明实施例2中L-亮氨酸供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,步骤如下:
步骤1、L-亮氨酸对照品溶于流动相中,按比例稀释,分别相当于每1ml中含300μg、400μg、500μg、600μg、700μg的标准溶液;
步骤2、采用液相色谱仪分别对不同浓度的标准溶液进行液相色谱分析,记录分析得到的峰面积,并采用外标法绘制L-亮氨酸含量-峰面积的标准曲线,得出标准曲线回归方程为y=22804x-184098,R2=0.9997;
步骤3、将含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml,用流动相稀释至50ml,利用液相色谱仪进行液相色谱分析,采用与标准溶液完全相同的测定条件,并记录峰面积,根据步骤2的标准曲线回归方程y=22804x-184098,R2=0.9997计算得出所述L-亮氨酸的含量为53.5g/L(外标法测得含量为52.9g/L)。
检测方法的检测参数为:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:磷酸二氢钾水溶液和乙腈;流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37%:63%-42%:58%;
其中,所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L,磷酸二氢钾水溶液中含有氨水,氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt%,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02;
流动相流速:0.7-1.0mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱柱温:30℃。
本发明实施例提供的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,可通过一次高效液相检测,准确测定出转化液中L-亮氨酸的含量,且与其他杂质峰达到很好的分离效果,节省了人工、时间和溶剂等成本。
以下实施例中,采用的高效液相色谱仪为安捷伦1260和沃特斯2489;色谱柱为岛津氨基键合硅胶柱5μm 4.6*250mm;进样体积为20μl(定量环)。也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的氨基键合硅胶柱以及其他进样体积,都能达到本发明的目的。
实施例1-3
1.色谱条件:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:磷酸二氢钾水溶液与乙腈的体积比为40:60;(其中,磷酸二氢钾水溶液的配制为:取磷酸二氢钾13.61g,加水500ml溶解后加入25~28%的氨水5ml,加水稀释至1000ml,混合均匀后用磷酸调pH值至4.2±0.02);
流动相流速:0.7mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱柱温:30℃。
2.实验步骤
(1)配制流动相,过滤,脱气;
(2)调节高效液相色谱仪,平衡色谱柱;
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制,称取L-亮氨酸对照品20.0mg于50ml容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度;实施例1-3分别吸取不同生产批次含有L-亮氨酸的生物转化液供试品0.5ml至50ml容量瓶,用流动相溶解并稀释至刻度。
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,采用外标法计算结果。
外标法计算L-亮氨酸生物转化液中L-亮氨酸的含量:
X=C供试品×对照品的稀释倍数=(C对照品×A供试品/A对照品)×待测样品的稀释倍数;
式中:C对照品为对照品溶液中L-亮氨酸的浓度,单位为mg/ml;
A对照品为对照品溶液色谱图的峰面积或峰高;
A供试品为供试品溶液色谱图的峰面积或峰高;
C供试品为供试品溶液中L-亮氨酸的浓度,单位为mg/ml。
具体数值见下表所示:
3.实施例2供试品溶液色谱图见图2所示:8.177min为L-亮氨酸的峰,其余的为杂峰,L-亮氨酸峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000,且与杂峰分离度良好。对照品溶液色谱图见图1所示,8.122min为L-亮氨酸的峰。
4.本发明的方法学考察
(1)线性关系实验
标准溶液的稀释步骤、浓度、峰面积见下表:
由标准浓度及其对应的峰面积得出标准曲线回归方程为:y=22804x-184098,R2=0.9997。
(2)重复性试验
取标准溶液20μl注入高效液相色谱仪,重复6针,峰面积分别为11758494.5、11756432、11757322、11758032、11756832、11780432,平均值为11761257.42,RSD为0.07%。
(3)转化液稳定性试验
取一份L-亮氨酸转化液,于配制后4h、8h、12h、24h进样,其峰面积分别为11728395、11758850、11748450、11787890,平均值为11755896.3,RSD为0.18%。
Claims (6)
1.一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于:
色谱条件为:
色谱柱:氨基键合硅胶柱;
流动相:磷酸二氢钾水溶液和乙腈;流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为37%:63%-42%:58%;
其中,所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1-0.2mol/L,磷酸二氢钾水溶液中含有氨水,氨水占磷酸二氢钾水溶液的0.5vt%,磷酸二氢钾水溶液的pH值为4.2±0.02;
流动相流速:0.7-1.0mL/min;
检测波长:210nm;
色谱柱柱温:30℃;
检测步骤为:
(1)配制流动相,过滤,脱气;
(2)调节高效液相色谱仪条件,平衡色谱柱;
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制:称取L-亮氨酸对照品和L-亮氨酸供试品,分别用流动相溶解定容,即得;其中,供试品溶液的配制为:含有L-亮氨酸的生物转化液0.5ml,用流动相溶解并稀释至50ml;
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪,记录色谱图及峰面积,采用外标法计算L-亮氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于:流动相流速为0.7mL/min。
3.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于:流动相中磷酸二氢钾水溶液和乙腈的体积百分比为40%:60%;磷酸二氢钾水溶液的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于:步骤(3)中,对照品溶液的浓度为0.4mg/mL。
5.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于:色谱柱长度为250mm,内径为4.6mm,其填料粒径为5μm。
6.根据权利要求1所述的一种L-亮氨酸的高效液相色谱检测方法,其特征在于:步骤(4)中,对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
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