CN108760931B - 一种酪胺的高效液相色谱检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种酪胺的高效液相色谱检测方法，涉及柱色谱法技术领域。色谱条件为：色谱柱：氨基键合硅胶柱；流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35：65；其中，磷酸盐缓冲液的pH值为2.5‑6.0；流速：0.7‑1.0mL/min；检测波长：205‑225nm；色谱柱柱温：25‑40℃；进行高效液相色谱分析，测定转化液中酪胺含量。本发明方法可快速，准确测定出酪胺的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，出峰时间快，缩短生产过程中的检测时间，准确度高，大大提高了生产效率。
Description
技术领域
本发明涉及柱色谱法技术领域，尤其涉及一种酪胺的高效液相色谱检测方法。
背景技术
酪胺是自然界中存在于一些檞寄生树，腐败的动物组织，裂开的干酪以及麦角菌中。它对子宫和血压的作用同肾上腺素相似，虽毒性和活性都比较小，但作用时间长为他的特点。
现有的文献中，测定酪胺转化液中酪胺的含量为柱前衍生后，用C8柱进行液相检测，此方法需预先处理样品，步骤较为复杂。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种酪胺的高效液相色谱检测方法，该方法可快速，准确测定出酪胺的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，出峰时间快，缩短生产过程中的检测时间，准确度高，大大提高了生产效率。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种酪胺的高效液相色谱检测方法：
色谱条件为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35：65；其中，磷酸盐缓冲液的pH值为2.5-6.0；
流动相流速：0.7-1.0mL/min；
检测波长：205-225nm；
色谱柱柱温：25-40℃；
检测步骤为：
(1)配制流动相，过滤，脱气；
(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取酪胺对照品和酪胺供试品，分别用流动相溶解定容，即得；
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算酪胺的含量。
优选的，磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液。
优选的，流动相流速为0.7mL/min。
优选的，检测波长为215nm。
优选的，色谱柱柱温为30℃。
优选的，磷酸盐缓冲液的pH值为4.0。
优选的，步骤(3)中，对照品溶液的浓度为0.02mg/mL。
优选的，步骤(3)中，供试品溶液的配制为：将含有酪胺的生物转化液0.5ml，用流动相稀释至25ml，再将摇匀后的溶液稀释50倍体积。
优选的，色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
优选的，步骤(4)中，对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
(1)本发明方法可快速，准确测定出酪胺的含量，确保其质量可控，减小误差，节约成本，操作简单，出峰时间快，缩短生产过程中的检测时间，准确度高，大大提高了生产效率。
(2)本发明方法可通过一次高效液相检测，准确测定出转化液中酪胺的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例中酪胺对照品溶液的色谱图；
图2是本发明实施例2中酪胺供试品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种酪胺的高效液相色谱检测方法，步骤如下：
步骤1、酪胺对照品溶于流动相中，按比例稀释，分别相当于每1ml中含18.9776μg、21.3498μg、23.722μg、26.0942μg、28.4664μg的标准溶液；
步骤2、采用液相色谱仪分别对不同浓度的标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制酪胺含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程为y＝72264965.0114x+41605.4，R2＝0.9999；
步骤3、将含有酪胺的生物转化液0.5ml，用流动相稀释至25ml，再将摇匀后的溶液稀释50倍体积，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，采用与标准溶液完全相同的测定条件，并记录峰面积，根据步骤2的标准曲线回归方程y＝72264965.0114x+41605.4，R2＝0.9999计算得出所述酪胺的含量为60.06g/L(外标法测得含量为59.91g/L)。
检测方法的检测参数为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35：65；其中，磷酸盐缓冲液的pH值为2.5-6.0；
流动相流速：0.7-1.0mL/min；
检测波长：205-225nm；
色谱柱柱温：25-40℃。
本发明实施例提供的一种酪胺的高效液相检测方法，可通过一次高效液相检测，准确测定出转化液中酪胺的含量，且与其他杂质峰达到很好的分离效果，节省了人工、时间和溶剂等成本。
以下实施例中，采用的高效液相色谱仪为日本岛津：LC-15C；色谱柱为安捷伦氨基键合硅胶柱5μm 4.6*250mm；进样体积为20μl(定量环)。也可以采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、其他粒径和长度的氨基键合硅胶柱以及其他进样体积，都能达到本发明的目的。
实施例1-3
1.色谱条件：
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(pH4.0)：乙腈＝35：65；(其中，磷酸二氢钾缓冲液的配制为：磷酸二氢钾4.76g溶于700ml超纯水中，用50％磷酸调pH值为4.0)；
流动相流速：0.7ml/min；
检测波长：215nm；
色谱柱柱温：30℃。
2.实验步骤
(1)配制流动相，过滤，脱气；
(2)调节高效液相色谱仪，平衡色谱柱；
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制，称取酪胺对照品51.93mg于25ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度摇匀后再稀释100倍；实施例1-3分别吸取不同生产批次含有酪胺的生物转化液0.5ml，用流动相稀释至25ml，再将摇匀后的溶液稀释50倍体积。
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算结果。
外标法计算酪胺生物转化液中酪胺的含量：
X＝C供试品×对照品的稀释倍数＝(C对照品×A供试品/A对照品)×待测样品的稀释倍数；
式中：C对照品为对照品溶液中酪胺的浓度，单位为mg/ml；
A对照品为对照品溶液色谱图的峰面积或峰高；
A供试品为供试品溶液色谱图的峰面积或峰高；
C供试品为供试品溶液中酪胺的浓度，单位为mg/ml。
具体数值见下表所示，
3.实施例2供试品溶液色谱图见图2所示：5.572min为酪胺的峰，其余的为杂峰，主峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000，且与杂峰分离度良好。对照品溶液色谱图见图1所示，5.564min为酪胺的峰。
4.本发明的方法学考察
(1)线性关系实验
标准溶液的稀释步骤、浓度、峰面积见下表：
由标准浓度及其对应的峰面积得出标准曲线回归方程为：y＝72264965.0114x+41605.4，R2＝0.9999。
(2)重复性试验
取标准溶液20μl注入高效液相色谱仪，重复6针，峰面积分别为1555197、1541136、1542358、1547220、1545632、1544277，平均值为1545970，RSD为0.32％。
(3)转化液稳定性试验
取一份酪胺转化液，于配制后6h、12h、24h进样，其峰面积分别为1939191、1961352、1951460，平均值为1950668，RSD为0.57％。
Claims (10)
1.一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：
色谱条件为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05mol/L磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为35：65；其中，磷酸盐缓冲液的pH值为2.5-6.0；
流动相流速：0.7-1.0mL/min；
检测波长：205-225nm；
色谱柱柱温：25-40℃；
检测步骤为：
(1)配制流动相，过滤，脱气；
(2)调节高效液相色谱仪条件，平衡色谱柱；
(3)对照品溶液和供试品溶液的配制：称取酪胺对照品和酪胺供试品，分别用流动相溶解定容，即得；
(4)将对照品溶液、供试品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，记录色谱图及峰面积，采用外标法计算酪胺的含量。
2.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾缓冲液。
3.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：流动相流速为0.7mL/min。
4.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：检测波长为215nm。
5.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：色谱柱柱温为30℃。
6.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：磷酸盐缓冲液的pH值为4.0。
7.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤(3)中，对照品溶液的浓度为0.02mg/mL。
8.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤(3)中，供试品溶液的配制为：将含有酪胺的生物转化液0.5ml，用流动相稀释至25ml，再将摇匀后的溶液稀释50倍体积。
9.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：色谱柱长度为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
10.根据权利要求1所述的一种酪胺的高效液相色谱检测方法，其特征在于：步骤(4)中，对照品溶液和供试品溶液的色谱柱进样体积均为20μl。
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