CN101726552B - 一种氨基化合物高效液相色谱柱前衍生化试剂及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种氨基化合物高效液相色谱分析检测用柱前衍生化试剂及其衍生条件，属于分析检测领域。本发明以3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯(CNBF)衍生化试剂与氨基化合物进行衍生化反应，提高氨基化合物在高效液相色谱中的可检测性与灵敏度，以达到快速、准确、灵敏的检测氨基化合物的目的。本发明的衍生反应条件温和、快速，且反应不带来干扰峰，检测准确、灵敏、重复性好。该检测方法可用有效地检测食品、饲料、环境样品中的氨基化合物，以及其它医用或化工合氨基的化合物，具有实际推广应用的前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种氨基化合物高效液相色谱柱前衍生化试剂及其衍生条件，属于分析化学领域。
技术背景
含有氨基的化合物就是氨基化合物，氨基化合物和人类日常生活及社会生产发展密切相关，包括食品和饲料中的氨基酸及生物胺、动植物体蛋白质(多肽)、医药氨基用品、氨基化工中间体、含氨基农用化学用品等，是一类对人类及环境至关重要的化合物，也是一类非常需要进行检测跟踪的物质。随着科学技术的发展，这类化合物的检测方法也得到了长足的进步，其中以高效液相色谱(HPLC)为基础的检测方法，是近些年来发展迅速的分析手段之一。HPLC检测法具有检测灵敏度、精确度高，检测所需时间少，检测结果重复性高，高效相色谱柱可反复使用，检测可实现操作自动化等优点，是当前分析化学和生物化学中是必不可少的。但是氨基化合物分为两类，一类是自身化合物分子中带有发色基团，本身具有紫外或荧光吸收，可以直接通过HPLC方法检测；另一类是本身不具有发色基团的，不能直接在高效液相色谱上进样检测，比如氨基酸、生物胺等，这类氨基化合物需要和一些具有强烈紫外/荧光吸收的氨基衍生化试剂进行反应后，才能够被HPLC检测器检测。
目前所用的氨基衍生化试剂有很多种，包括荧光胺(FA)、异硫氰酸苯酯(PITC)、氯甲酸芴甲酯(FMOC-Cl)、6-氨基喹啉基-N-琥珀酰一亚胺基-甲酸酯(AQC)、丹磺酰氯(Dansyl-Cl)、邻苯二甲醛(OPA)、2，4-二硝基氟苯(DNFB)等。经文献检索，文章《湖南化工》1999年4月第2期9-11；《色谱》2004年5月第3期210-215；《分析化学评述与进展》2005年3月第3期398-404等综述了以上氨基衍生化试剂的优缺点。其主要缺点表现在：有的氨基衍生化试剂只能与一级氨反应，而不能与二级氨反应，比如OPA；有的氨基衍生化试剂反应条件苛刻，需要无水环境，比如Dansyl-Cl；有的氨基衍生化试剂反应会形成的副产物，对色谱分离造成干扰，比如 PITC；有的氨基衍生化试剂检测灵敏度低，比如DNFB等。
发明内容
本发明针对高效液相色谱分析氨基化合物所用氨基衍生化试剂的不足和缺陷，提供了一种氨基化合物高效液相色谱分析用柱前衍生化试剂及其衍生条件，提高氨基化合物在高效液相色谱中的可检测性与灵敏度，以达到快速、准确、灵敏的检测氨基化合物的目的。
本发明是通过以下技术方案实现的，以3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯(CNBF)为衍生化试剂与氨基化合物进行衍生化反应，控制反应的体系组成、pH、反应物摩尔比、温度、时间等条件，然后通过高效液相色谱进行分离检测，其步骤如下：
1、确立氨基化合物标样与CNBF进行衍生化反应条件；2、衍生产物HPLC分离检测方法建立；3、氨基化合物样品的前处理；4、样品的衍生化反应；5、样品的检测。
其衍生化反应方程式如下：
其中R1、R2为不同的取代基，包括：氢、烃基、羧基、羟基、硝基、三唑环等杂环取代基。
所述步骤1中的氨基化合物标样与CNBF衍生化反应条件包括：反应物摩尔比、温度、时间、pH。在衍生化反应体系中氨基化合物与CNBF的摩尔比例为1∶1-8.0，最佳比例为1∶3-5；控制反应温度在40-80℃，最佳温度为50-60℃；反应体系pH值7.5-10.0，最佳pH为9.0-9.5；控制反应时间30-80min，最佳反应时间为30-40min。
所述步骤2中的高效液相色谱分离检测方法包括：高效液相色谱柱的选择、流动相的选择、流动相的梯度设定、流动相的流速、检测波长及时间、建立检测标准曲线。其中高效液相色谱柱为普通反向C18色谱柱；流动相有机相为甲醇、乙腈的一种或两种混合，流动相水相为纯水、乙酸-乙酸钠缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、离子对溶液的一种，其pH一般在3-10；流动相梯度根据氨基化合物不同，分别设定；流动相流速为0.4-1ml/min。检测波长一般在230-360nm，检测时间5-60min。
所述步骤3中的氨基化合物样品的前处理包括：动植物蛋白质的酸解而释放游离氨基化合物；氨基化合物的萃取等。其中蛋白质酸解包括用6mol/L浓盐酸在120-150℃水解，也可以用浓硫酸、三氟乙酸等强酸水解；氨基化合物的萃取包括：硼酸缓冲溶液、乙酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液等缓冲溶液萃取，乙醇、乙腈等有机溶剂萃取、固相萃取、浊点萃取等。
所述步骤4中的氨基化合物样品的衍生化反应，按步骤1中的反应条件进行。其中氨基化合物与CNBF的摩尔比例为1∶1-8.0；反应温度在40-80℃；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液或其它碱溶液，pH值7.5-10.0；反应时间30-80min；反应体系中有机溶剂与水溶液比例为1∶0.5-15，最佳比例为1-9；
所述步骤5中的氨基化合物样品的检测，按步骤2中确立的方法检测分析。
与现有衍生化试剂相比，3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯的衍生反应条件温和、快速，衍生反应不会带来干扰峰，检测准确、灵敏、重复性好。用该化合物可有效地检测食品、饲料、环境中的氨基化合物，以及其它医用或化工含氨基的化合物，具有实际推广应用的前景。
以下结合本发明方法内容提供具体实例。
实验例1
以检测啤酒中组胺、色胺、苯乙胺、酪胺、腐胺、亚精胺和精胺7种生物胺为例。确立生物胺标样与CNBF衍生化反应条件为：生物胺与CNBF的摩尔比例为1∶2；反应温度在50℃；反应时间80min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值7.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶5。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为254nm，流动相乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.2)，设梯度洗脱；流速为1ml/min；建立了标准检测曲线。啤酒样品进行除泡、浓缩等前处理后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算啤酒中7种生物胺的含量，检测灵敏度达到0.08μmol/L。生物胺与CNBF衍生化反应方程式如下：
实验例2
以检测啤酒中组胺、色胺、苯乙胺、酪胺、腐胺、亚精胺和精胺7种生物胺为例。确立生物胺标样与CNBF衍生化反应条件为：生物胺与CNBF的摩尔比例为1∶3；反应温度在60℃；反应时间30min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值9.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶9。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为254nm，流动相乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.2)，设梯度洗脱；流速为1ml/min；建立了标准检测曲线。啤酒样品进行除泡、浓缩等前处理后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算啤酒中7种生物胺的含量，检测灵敏度达到0.06μmol/L。
实验例3
以检测啤酒中组胺、色胺、苯乙胺、酪胺、腐胺、亚精胺、精胺7种生物胺为例。确立生物胺标样与CNBF衍生化反应条件为：生物胺与CNBF的摩尔比例为1∶5；反应温度在70℃；反应时间40min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值10.0；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶3。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为254nm，流动相乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH6.2)，设梯度洗脱；流速为1ml/min；建立了标准检测曲线。啤酒样品进行除泡、浓缩等前处理后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算啤酒中7种生物胺的含量，检测灵敏度达到0.07μmol/L。
实验例4
以检测中饲料中甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨18氨基酸为例。确立氨基酸标样与CNBF衍生化反应条件为：氨基酸与CNBF的摩尔比例为1∶3；反应温度在40℃；反应时间80min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值8.0；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶1。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为260nm，流动相乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.9)，设梯度洗脱；流速为0.4ml/min；建立了标准检测曲线。饲料样品用6mol/L的浓盐酸在120℃水解24h后，用C18固相萃取小柱提纯萃取并收集，收集的样品与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算饲料中18种氨基酸的含量，检测灵敏度达到3.1μmol/L。氨基酸与CNBF衍生化反应方程式如下：
实验例5
以检测中饲料中甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨18氨基酸为例。确立氨基酸标样与CNBF衍生化反应条件为：氨基酸与CNBF的摩尔比例为1∶5；反应温度在60℃；反应时间40min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值9.0；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶2。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为260nm，流动相乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.9)，设梯度洗脱；流速为0.4ml/min；建立了标准检测曲线。饲料样品用6mol/L的浓盐酸在120℃水解24h后，用C18固相萃取小柱提纯萃取并收集，收集的样品与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算饲料中18种氨基酸的含量，检测灵敏度达到2.4μmol/L。
实验例6
以检测中饲料中甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、赖氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸、天冬酰氨18氨基酸为例。确立氨基酸标样与CNBF衍生化反应条件为：氨基酸与CNBF的摩尔比例为1∶8；反应温度在80℃；反应时间30min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值9.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶3。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为260nm，流动相乙腈、乙酸-乙酸钠缓冲液(pH4.9)，设梯度洗脱；流速为0.4ml/min；建立了标准检测曲线。饲料样品用6mol/L的浓盐酸在120℃水解24h后，用C18固相萃取小柱提纯萃取并收集，收集的样品与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算饲料中18种氨基酸的含量，检测灵敏度达到2.8μmol/L。
实验例7
以检测中环境水溶液中草甘膦残留为例。确立草甘膦标样与CNBF衍生化反应条件为：草甘膦与CNBF的摩尔比例为1∶2；反应温度在40℃；反应时间80min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值8.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶ 3。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为360nm，流动相乙腈-十六烷基三甲基溴化铵溶液、磷酸缓冲液(pH4.9)，设梯度洗脱；流速为0.8ml/min；建立了标准检测曲线。环境水样品离心、过滤后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算环境水溶液中的草甘膦残留，检测灵敏度达到0.012mg/L。草甘膦与CNBF衍生化反应方程式如下：
实验例8
以检测中环境水溶液中草甘膦残留为例。确立草甘膦标样与CNBF衍生化反应条件为：草甘膦与CNBF的摩尔比例为1∶3；反应温度在60℃；反应时间30min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值9.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶4。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为360nm，流动相乙腈-十六烷基三甲基溴化铵溶液、磷酸缓冲液(pH4.9)，设梯度洗脱；流速为0.8ml/min；建立了标准检测曲线。环境水样品离心、过滤后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算环境水溶液中的草甘膦残留，检测灵敏度达到0.009mg/L。
实验例9.
以检测中环境水溶液中草甘膦残留为例。确立草甘膦标样与CNBF衍生化反应条件为：草甘膦与CNBF的摩尔比例为1∶5；反应温度在70℃；反应时间50min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值10.0；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶6。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为360nm，流动相乙腈-十六烷基三甲基溴化铵溶液、磷酸缓冲液(pH4.9)，设梯度洗脱；流速为0.8ml/min；建立了标准检测曲线。环境水样品离心、过滤后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算环境水溶液中的草甘膦残留，检测灵敏度达到0.010mg/L。
实验例10
以检测中水果中杀草强的残留为例。确立杀草强标样与CNBF衍生化反应条件 为：杀草强与CNBF的摩尔比例为1∶4；反应温度在40℃；反应时间40min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值8.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶3。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为360nm，流动相乙腈-十六烷基三甲基溴化铵溶液、磷酸缓冲液(pH4.5)，设梯度洗脱；流速为1ml/min；建立了标准检测曲线。水果样品磨碎、硼酸缓冲溶液萃取、离心、过滤后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算水果上杀草强残留，检测灵敏度达到0.015mg/L。杀草强与CNBF衍生化反应方程式如下：
实验例11
以检测中水果中杀草强的残留为例。确立杀草强标样与CNBF衍生化反应条件为：杀草强与CNBF的摩尔比例为1∶6；反应温度在50℃；反应时间60min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值9.5；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶5。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为360nm，流动相乙腈-十六烷基三甲基溴化铵溶液、磷酸缓冲液(pH4.5)，设梯度洗脱；流速为1ml/min；建立了标准检测曲线。水果样品磨碎、硼酸缓冲溶液萃取、离心、过滤后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算水果上杀草强残留，检测灵敏度达到0.010mg/L。
实验例12
以检测中水果中杀草强的残留为例。确立杀草强标样与CNBF衍生化反应条件为：杀草强与CNBF的摩尔比例为1∶8；反应温度在70℃；反应时间80min；反应体系为硼酸-硼砂缓冲溶液，pH值10.0；反应体系中有机溶剂与水溶液比例1∶8。高效液相色谱条件为：采用C18色谱柱，紫外检测波长为360nm，流动相乙腈-十六烷基三甲基溴化铵溶液、磷酸缓冲液(pH4.5)，设梯度洗脱；流速为1ml/min；建立了标准检测曲线。水果样品磨碎、硼酸缓冲溶液萃取、离心、过滤后与CNBF按已确定反应条件反应，进HPLC检测，通过已建立的标准曲线计算水果上杀草强残留，检测灵敏度达到0.012mg/L。
Claims (2)
1.一种氨基化合物分析检测用柱前衍生化试剂的高效液相色谱检测方法，其特征在于，以氨基衍生化试剂3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯与氨基化合物进行衍生化反应，然后通过高效液相色谱进行分离检测，其步骤如下：
确立氨基化合物与3，5-二硝基-4-氯-三氟甲基苯进行衍生化反应条件，其衍生化反应条件包括：反应物摩尔比、控制反应温度、控制反应时间、pH值，所述反应物摩尔比为1∶1-8.0，所述控制反应温度为40-80℃，所述控制反应时间为30-80min，所述pH值为7.5-10.0；
建立衍生产物HPLC分离检测方法，所述衍生产物HPLC分离检测方法包括高效液相色谱柱的选择、流动相的选择、流动相的梯度设定、流动相的流速、检测波长及时间、建立检测标准曲线，其中，所述高效液相色谱柱为普通反相C18色谱柱；所述流动相有机相为甲醇、乙腈的一种或两种混合，所述流动相水相为纯水、乙酸-乙酸钠缓冲溶液，磷酸缓冲溶液或离子对溶液的一种，其pH在3.0-10.0；所述流动相梯度根据氨基化合物不同，分别设定；流动相流速为0.4-1.0ml/min；所述检测波长在230-360nm，所述检测时间为5-60min；
氨基化合物样品的前处理，所述前处理包括动植物蛋白质的酸解而释放游离氨基化合物；氨基化合物的萃取，其中所述蛋白质酸解包括6.0mol/L浓盐酸在120-150℃水解；
氨基化合物样品的衍生化反应；
氨基化合物样品的HPLC检测；
所述氨基化合物衍生化反应的方程式如下：
其中R1、R2为不同的取代基，包括：氢、烃基、羧基、羟基、硝基、三唑环取代基。
2.根据权利要求1所述的一种氨基化合物分析检测用柱前衍生化试剂的高效液相色谱检测方法，所述摩尔比为1∶3-5；所述控制反应温度为50-60℃；所述衍生化反应条件中的pH为9.0-9.5；所述控制反应时间为30-40min。
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