CN103575826A

CN103575826A - 一种鹅组织中多胺含量的高效液相色谱检测方法及其应用

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Publication number: CN103575826A
Application number: CN201310537524.XA
Authority: CN
Inventors: 康波; 姜冬梅; 何珲; 王继文; 马容; 李亮; 王迅; 韩春春; 刘贺贺; 许恒勇
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-11-05
Filing date: 2013-11-05
Publication date: 2014-02-12

Abstract

本发明公开了一种鹅组织中多胺（腐胺，亚精胺和精胺）含量的高效液相色谱检测方法，其色谱条件为：C18色谱柱，5μm，4.6×250mm；流动相甲醇：水体积比62∶38；流速1.0mL/min；紫外检测波长229nm；柱温25℃。组织固相萃取方法：将0.1g组织加入1mL，5%的HClO₄和10μL内标中匀浆提上清；加入2mL2.5mol/mL的NaOH和1.4μL的苯甲酰氯，40℃水浴30min；调pH值至7.0后，加到C18柱中，15mL水和15mL15%甲醇冲洗；0.5μL甲醇洗脱。本方案可有效分离组织中腐胺、亚精胺和精胺，并能快速、准确检测鹅组织多胺含量，操作简便、准确度高、重复性好。

Description

一种鹅组织中多胺含量的高效液相色谱检测方法及其应用

技术领域

本发明属于高效液相色谱检测方法，本发明涉及的是一种鹅组织中多胺含量的高效液相色谱检测方法及其应用，具体包括鹅组织中多胺的固相萃取方法和高效液相色谱法检测萃取样品中腐胺、亚精胺和精胺的含量。

背景技术

多胺（包括腐胺、亚精胺和精胺）是一类带有两个或两个以上氨基的低分子脂肪族化合物，它在几乎所有的真核细胞生物体内都有存在，这一进化保守性提示多胺对于细胞存活极为重要。在生理pH下，多胺呈高密度的阳性电荷，它们能与带有大量负电荷的DNA、RNA和蛋白质等生物大分子结合并发挥其调控作用。研究表明，多胺可参与调控基因表达和翻译、细胞增殖、细胞信号转导、细胞膜稳定等生命活动过程，并且能够调节某些阳离子通道的活性。近年来，对多胺生物学功能的研究越来越多，研究表明：细胞内多胺浓度降低时，细胞生长缓慢甚至停止；而当细胞内多胺含量过多时，可导致细胞过度增殖。在生长旺盛的组织中多胺的含量高于生长缓慢的组织，癌细胞中的多胺含量远高于其它正常的组织。因此，探寻一种快速、准确检测鹅组织中多胺含量的方法，对于阐明多胺在鹅生命活动过程中所发挥的生物学功能以及调控机理具有重要的理论意义和实际意义。

近年来，随着鹅产业的快速发展，鹅产蛋性能较低（一般年产蛋量仅为30~80枚）已成为制约鹅产业化发展的重要因素，是鹅产业亟待解决的关键问题之一。鹅产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长和发育水平，并受品种、环境和饲养管理等因素的影响。鹅卵泡经过发育、选择和闭锁等机制建立起严格的等级体系，原始卵泡经等级前发育进入小黄卵泡库，随后被选择并进入等级发育。家禽可通过调控起始发育卵泡的数量和小卵泡（白卵泡和小黄卵泡）的闭锁来调节卵巢的功能，同时还可通过闭锁机制清除排卵前卵泡来调节排卵的速率，进而影响家禽的产蛋性能。研究表明，小鼠体内多胺含量减少时，能够使小鼠卵泡发育停滞并出现闭锁。另外，多胺能够调控非洲爪蟾卵母细胞的形成，调控生殖类激素合成酶的表达。处于繁殖期的鹅卵巢组织是生长速度最快的组织之一，且组织中多胺的浓度对卵泡的发育起了至关重要的作用。所以，快速、准确的检测鹅卵泡组织中多胺的含量对与鹅繁殖相关研究具有重要的理论意义和现实意义。

固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）是近年发展起来一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程。由于鹅组织中的多胺存在于组织中，无法直接运用液相色谱检测，需要通过固相萃取以及衍生化反应后才能被液相色谱的紫外检测器特定波段下的紫外线检测到，所以要将组织研磨并用5 %的HClO₄抽提组织中的多胺，之后与苯甲酰氯衍生再用C18固相萃取柱萃取衍生后的多胺。固相萃取的方法繁琐并很容易由于操作上的失误导致萃取不成功或萃取不完全，本方案提供了完整的、可行的鹅组织中萃取多胺的方法，该方法操作简单、切实可行。

高效液相色谱检测具有分析速度快、分离效能高、灵敏度高、应用范围广等特点，但高效液相色谱检测时必须对检测条件进行优化，检测条件不够好会导致高效液相色谱检测是出峰时间分不开，检测重复性不好等问题。本发明方案提供了多胺衍生物高效液相色谱检测的优化方案，色谱条件为：色谱柱SWEEL Chromstar^TMC18，5 μm，4.6×250 mm；流动相比例甲醇:水=62:38（V/V）；流速1.0 mL/min；紫外检测器检测波长为229 mm；进样体积20 μL；柱温为25℃。本方案色谱条件能够准确分开组织中腐胺、亚精胺和精胺衍生物的出峰时间并且具有较高的重复性。

为阐明鹅体内多胺含量、多胺生物学功能及其调控机理，寻找快速、准确的检测鹅组织中多胺含量的方法是鹅体内多胺相关研究得以开展的关键环节。本发明公开了鹅组织中多胺的固相萃取方案以及多胺高效液相色谱检测的色谱条件，同时应用该发明方案检测了鹅卵泡组织中的多胺含量。本发明方案切实可行，操作简单，重复性高。

发明内容

本发明的目的之一在于从鹅组织中固相萃取腐胺，亚精胺和精胺。该方法操作简单，切实可行，具有较高的重复性。

为实现上述目的，本发明的技术方案为。

用5 %的HClO₄将鹅组织中的多胺抽提出来，再在碱性条件下（加入与萃取液等体积的2.5 mol/L NaOH）与苯甲酰氯发生衍生反应，使多胺生成强紫外吸收的苯甲酸脂类多胺衍生物，之后经过C18固相萃取柱将衍生液中的苯甲酸脂类多胺衍生物浓缩，萃取，洗去杂质，色谱级甲醇洗脱步骤，将鹅组织中的多胺转化为可以采用高效液相色谱紫外检测器检测到的液态物质。

本发明的目的之二在于提供一种高效液相色谱法检测鹅组织中多胺检测的优化后的色谱条件，该方法能使腐胺，亚精胺和精胺的衍生物分离情况较好，可重复性强。

为实现上述目的，本发明的技术方案为。

采用的色谱条件为：(1)色谱柱SWEEL Chromstar^TMC18，5 μm，4.6×250 mm；（2）流动相比例为：甲醇:水=62:38（V/V）；（3）流速为：1.0 mL/min；（4）紫外检测器检测波长为229 nm；（5）进样体积为20 μL；（6）柱温为25℃。

本发明专利公开了一种从鹅组织中萃取衍生多胺并用高效液相色谱检测组织中多胺的方法，多胺在鹅生命活动过程中起了至关重要的作用，了解多胺在鹅组织中的含量，从而揭示多胺含量与鹅生命活动的生理机制有重要的理论意义和现实意义。本方案具有可操作性强，方法切实可行，可重复性高等优点。

附图说明

图1 腐胺标准品高效液相色谱峰图。由图可以看出腐胺和内标1,6-己二胺分峰良好，腐胺在6.4 min，内标1,6-己二胺在8.7 min。

图2 亚精胺标准品高效液相色谱峰图。由图可以看出内标1,6-己二胺和亚精胺分峰良好，1,6-己二胺在8.7 min，亚精胺在10.1 min。

图3 精胺标准品高效液相色谱峰图。由图可以看出内标1,6-己二胺和精胺分峰良好，1,6-己二胺在8.7 min，精胺在16.1 min。

图4 正常发育卵泡的色谱峰图。腐胺，内标1,6-己二胺，亚精胺和精胺分峰良好，且各物质的出峰时间与标准品的出峰时间一致。

图5 闭锁卵泡的色谱峰图。腐胺，内标1,6-己二胺，亚精胺和精胺分峰良好，且各物质的出峰时间与标准品的出峰时间一致。

图6 最大的排卵前卵泡和闭锁卵泡中多胺的含量。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明的范围仅限于下述实施例。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

仪器与试剂。

安捷伦1100（美国加州）高效液相色谱仪；紫外检测器；色谱柱SWEEL ChromstarTMC18，5 μm，4.6×250 mm；万分之一电子天平；KQ-300DA型数控超声波清洗器；Thermo离心机，水浴锅，Thermo Hypersep C18固相萃取柱；超纯水仪。色谱甲醇；色谱腐胺；色谱亚精胺；色谱精胺；色谱1,6-己二胺；超纯水；NaOH；HCl；分析纯苯甲酰氯；HClO₄。

多胺标准品的稀释与标准曲线的绘制。

（1）分别称取88.15 mg，145.25 mg，202.34 mg的腐胺（相对分子质量88.15），亚精胺（相对分子质量145.25）和精胺（相对分子质量202.34）相当于腐胺、亚精胺和精胺1.0 mmol，用5 %的HClO₄分别定容至3个100 mL的容量瓶中，并多次清洗EP管，配置的3种标准储存液为10 μmol/mL。

（2）用梯度稀释的方法，分别配置50、100、250、500、1000和2000 nmoL/mL的3种标准溶液。每次量取较高浓度的标准液的量筒都要经过涮洗，之后倒入10 mL的容量瓶中用5 %的HClO₄定容。

（3）取25 mg的内标1,6己二胺定容至25 mL的容量瓶配置成1 mg/mL的内标储存液，之后取内标储存液50 mL用5 %的HClO₄定容至100 mL的容量瓶中，配置成500 μg/mL的内标工作液。

（4）将3种梯度稀释好的50、100、250、500、1000和2000 nmoL/mL标准品各取100 μL，分别加到10 mL的棕色试管中，再分别加入10 μL的500 μg/mL的1,6己二胺作为内标，2 mL的5 %的HClO₄，2 mL 2.5 mol/L的NaOH，1.4 μL分析纯苯甲酰氯。

（5）将试管中的液体漩涡震荡混匀，在置入40℃水浴锅中水浴30 min，使多胺衍生。

（6）取出标准品衍生溶液，用6 mol/mL的HCl调节pH值到7.0。

（7）将标准品衍生液加入事先用3 mL甲醇和和3 mL超纯水活化的C18固相萃取小柱中，让衍生液过滤分离多胺。

（8）带衍生液过滤完后依次用15 mL的超纯水和15 mL的15 %的甲醇冲洗固相萃取柱洗去杂质。

（9）待冲洗完全之后用洗耳球将剩余的甲醇和水吹干，之后用0.5 mL的色谱甲醇将样品洗脱，4℃保存待检测。

（10）将衍生萃取后的标准品用0.22 μm的针头过滤器过滤，再取20 μL进样高效液相色谱检测，其色谱条件如下：流动相比例为甲醇:水=62:38（V/V）；流速为1.0 mL/min；紫外检测器检测波长为229 nm；柱温为25℃。图1、图2和图3分别为腐胺、亚精胺和精胺标准品的液相色谱峰图。

标准曲线绘制方法。

以标准品浓度作为横坐标，以对应浓度的标准品峰面积与1,6-己二胺的峰面积（即内标面积）的比值为纵坐标，用加权最小二乘法（1/c²）进行回归，得到腐胺、亚精胺和精胺的回归方程。结果表明：腐胺标准曲线的回归方程为y=0.0072x-0.0424，相关系数R²=0.9927；亚精胺为y=0.0096x-0.0057，R²=0.9966；精胺为y=0.0065x-0.0063，R²=0.9958。3种多胺标准曲线的R²值均大于0.99，表明这3种多胺的标准曲线线性关系良好。

鹅组织中多胺的高效液相色谱检测。

（1）将鹅的组织样品从-80℃冰箱中取出，在液氮中研磨后，称取0.1 g的组织样品置于Eppendorf管中。

（2）向Eppendorf管中加入1 mL 5 %的HClO₄和10 μL的500 μg/mL的1,6己二胺作为内标，漩涡震荡混匀后置入超声波细胞破碎仪中细胞破碎10 min。

（3）将破碎后的组织12,000 g离心10 min，抽取上清至10 mL的棕色玻璃试管中，之后再重复加入1 mL 5 %的HClO₄混匀沉淀，再次离心抽提上清至棕色试管中。

（4）向抽提的组织上清液中加入2 mL的2.5 mol/L的NaOH，再加入1.4 μL的苯甲酰氯，漩涡震荡后待衍生。

（5）将试管置入40℃的水浴锅中衍生30 min。

（6）取出衍生溶液，用6 mol/mL的HCl调节pH值到7.0。

（7）将衍生液加入事先用3 mL甲醇和3 mL超纯水活化的C18固相萃取小柱中，让衍生液过滤分离多胺。

（9）待所有液体过滤完后用洗耳球将剩余的甲醇和水吹干，再用0.5 mL的色谱甲醇将样品洗脱，再用0.22 μm的针头过滤器过滤洗脱液。将洗脱液4℃避光保存待检测。

（10）将待检测的洗脱液用20 μL进样检测，其色谱条件如下：流动相比例为甲醇:水=62:38（V/V）；流速为1.0 mL/min；紫外检测器检测波长为229 nm；柱温为25 ℃。

鹅组织中多胺的计算方法。

采用内标分析法利用所测组织样中的腐胺、亚精胺和精胺的峰面积与1,6-己二胺的峰面积的比值，根据腐胺、亚精胺和精胺的标准曲线，分别求出3种多胺的含量。

实施例1 四川白鹅等级卵泡中多胺的固相萃取及其高效液相色谱法检测。

（1）将鹅的等级卵泡样品从-80 ℃冰箱中取出，在液氮中研磨后，称取0.1 g的组织样品置于Eppendorf管中。

（2）将鹅的最大的排卵前卵泡经过2次匀浆，抽提上清后加入2 mL 2.5 mol/mL的NaOH，和1.4 μL的苯甲酰氯，漩涡震荡后40℃的水浴锅中衍生30 min。

（3）取出衍生溶液，用6 mol/mL的HCl调节pH值到7.0，再将衍生液加到已活化的C18固相萃取小柱中过滤，之后用15 mL的超纯水和15 mL的15 %的甲醇洗去杂质。

（4）用0.5 mL的色谱甲醇将样品洗脱，再用0.22 μm的针头过滤器过滤洗脱液。取20 μL洗脱液进样检测，其色谱条件如下：流动相比例为甲醇:水=62:38（V/V）；流速为1.0 mL/min；紫外检测器检测波长为229 nm；柱温为25℃。等级卵泡中多胺检测结果表明，等级卵泡中腐胺、亚精胺、精胺和内标分峰良好，且各物质的出峰时间与标准品的出峰时间一致（图4）。

（5）采用内标分析法，利用所测等级卵泡中的腐胺、亚精胺和精胺的峰面积与1,6-己二胺的峰面积的比值，根据腐胺、亚精胺和精胺的标准曲线，分别求出3种物质的含量（图6）。

实施例2 四川白鹅闭锁卵泡多胺的高效液相色谱法检测。

（1）将鹅的闭锁卵泡样品从-80℃冰箱中取出，在液氮中研磨后，称取0.1 g的组织样品置于Eppendorf管中。

（2）将鹅的闭锁卵泡经过2次匀浆，抽提上清后加入2 mL 2.5 mol/mL的NaOH，和1.4 μL的苯甲酰氯，漩涡震荡后40℃的水浴锅中衍生30 min。

（4）用0.5 mL的色谱甲醇将样品洗脱，再用0.22 μm的针头过滤器过滤洗脱液。取20 μL洗脱液进样检测，其色谱条件如下：流动相比例为甲醇:水=62:38（V/V）；流速为1.0 mL/min；紫外检测器检测波长为229 nm；柱温为25℃。闭锁卵泡多胺检测结果表明，腐胺、亚精胺、精胺和内标分峰良好，且各物质的出峰时间与标准品的出峰时间一致（图5）。

（6）采用内标分析法，利用所测闭锁卵泡中的腐胺、亚精胺和精胺的峰面积与1,6-己二胺的峰面积的比值，根据腐胺、亚精胺和精胺的标准曲线，分别求出3种物质的含量（图6）。

Claims

1.一种鹅组织多胺含量的高效液相色谱检测方法，其特征在于该方法的色谱条件为：

（1）色谱柱SWEEL ChromstarTMC18，5 μm，4.6×250 mm；

（2）流动相比例为：甲醇:水=62:38（V/V）；

（3）流速为：1.0 mL/min；

（4）紫外检测器检测波长为229 nm；

（6）柱温为25℃。

2.一种鹅组织中多胺固相萃取的方法，其特征在于该方法的操作步骤为：

（1）取鹅组织样，在液氮中研成粉末状，称取0.1 g组织；

（2）向组织中加入1 mL 5 %的HClO₄，再加入10 μL的内标（1,6-己二胺）匀浆2次；

（3）向匀浆液中加入2 mL的2.5 mol/L NaOH和1.4 μL的苯甲酰氯，漩涡震荡混匀，40℃水浴衍生30 min；

（4）用6 mol/L的HCl调节衍生液的pH值到7.0；

（5）将调节好pH值的衍生液加到Thermo的Hypersep C18固相萃取柱中萃取，之后用15 mL的双蒸水，15 mL的15 %甲醇冲洗小柱；

（6）用0.5 μL的甲醇洗脱待测组分。

3.根据权利要求1中的（2）所诉的高效液相色谱法检测鹅组织中多胺含量的检测方法，其特征在于：所采用的流动相为甲醇和水，其体积比为62:38（V/V）。

4.根据权利要求1中的（1）-（5）中的任意一项所诉的高效液相色谱法检测鹅组织中多胺含量的方法，其特征在于：所用的最佳条件是流动相比例为甲醇:水=62:38（V/V），流速为1.0 mL/min，紫外检测器检测波长为229 nm，柱温为25℃。

5.根据权利要求2中的（1）-（6）中的任意一项所诉的鹅组织中多胺固相萃取的步骤，其特征在于：所诉的方法切实可行，衍生试剂为苯甲酰氯，衍生条件为40℃水浴衍生30 min。