CN103728394B

CN103728394B - 一种基于石墨烯固相萃取的日化用品抗菌剂检测方法

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Publication number: CN103728394B
Application number: CN201410016569.7A
Authority: CN
Inventors: 陈军
Original assignee: SUZHOU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Current assignee: SUZHOU ENTRY-EXIT INSPECTION AND QUARANTINE BUREAU OF PEOPLE'S REPUBLIC OF CHINA
Priority date: 2014-01-15
Filing date: 2014-01-15
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2034-01-15
Also published as: CN103728394A

Abstract

本发明公开了一种基于石墨烯固相萃取的日化用品抗菌剂检测方法，包括先以石墨烯为吸附剂的固相萃取柱对稀释定容后的待测日化用品进行萃取，然后对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析，获得洗护用品中各种杀菌剂的含量的步骤。该方法具有有机溶剂用量少、萃取速度快、杂质干扰少、样品回收率高等突出优点，可为日化用品建立有效的经皮毒物安全限量控制和风险管理提供技术支撑，也为相关产品升级和产业转型提供可靠地质量安全保障。

Description

一种基于石墨烯固相萃取的日化用品抗菌剂检测方法

技术领域

本发明属于产品安全与检测技术领域，具体涉及一种基于石墨烯固相萃取-高效液相色谱联用检测日化用品中抗菌剂的方法。

背景技术

以各类织物清洗剂、厨房用清洗剂、卫生间用清洗剂、个人卫生用清洗剂所代表的日化用品所含经皮毒物(Percutaneous toxin)对人体造成不同程度的伤害正受到公众越来越多的关注。所谓经皮毒就是指日化用品所含化学物质通过皮肤侵入身体而产生某种有害作用的毒物。对普通消费者而言，各类家庭清洁样品是日化用品中经皮毒暴露最严重的一种，其所含溶解剂和表面活性剂会使皮肤的角质层处于溶解状态，发挥屏障作用的皮膜张力下降，从而导致清洁用品所含有害化学物质透过皮肤进入体内——这就是经皮毒素侵入皮肤的过程，而由皮肤进入身体的毒素就被称之为经皮毒物。

在日化用品经皮毒物中，已有许多被列入禁限用之列。环境研究表明，日化产品大量使用的类似卡松(CIT/MIT,CAS No.2682-20-4)、对氯间二苯酚(PCMX,CAS No.88-04-0)和对氯间甲酚(PCMC,CAS No.59-50-7)这样的低毒高效制剂，因其呈现的持久性有机污染物(POPs)、持久性有毒物质(PTS)、环境内分泌干扰物(EDs)特征，已导致一系列的环境问题，被列入药物及个人护理用品污染物(Pharmaceuticals and Personal Care Products，PPCPs)而加以监控。

鉴于上述抗菌抑菌药性物质在许多日化产品中的不当使用可能导致潜在的环境健康风险，对相关产品使用过程此类化学物质及时提出安全限量控制和有效检测方法具有极大的现实意义。因此，建立有效的检测分析技术和安全评估方法，以及尽早寻求适合的替代物是非常必要的。

传统的样品前处理方法包括液-液萃取、索氏萃取、层析、蒸馏、吸附、离心、过滤等，已建立的检测方法则以色谱法，主要是气相色谱(GC)和高效液相色谱法(HPLC)居多，对应的质谱联用技术(GC/MS或LC/MS)也有报道。其中，样品的富集、净化处理技术主要基于不同材料的SPE萃取程序，使之适合不同样品基质的分析。作为一种非常适用水性样品痕量物质分析的样品处理技术，固相萃取(SPE)最大的特点是有机溶剂消耗少以及节省预处理时间，其技术核心是吸附材料，它决定了SPE的灵敏度和选择性。随着大量新型吸附材料不断出现，纳米材料以其优异的物化性能受到关注。基于碳基纳米材料的分离技术是近年来国内外研究的一个热点领域，石墨烯(Graphene,Gr)作为碳基纳米材料家族的新成员，因其优异的比表面积和吸附容量等优点而被应用于各类吸附技术，是目前最理想的新型吸附材料。本发明因此而来。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种超声辅助萃取/固相萃取高效液相色谱联用技术检测日化品中抗菌抑菌制剂CIT/MIT、PCMX和PCMC含量的定量方法，其分析流程包括样品的预处理方法和目标化合物的检出方法，适用于日用化学品中某些杀菌剂的检测，其结果可为日化品中杀菌剂的安全限量控制提供参考。

为了解决前述技术的方法适用性问题，本发明提供的技术方案是：

一种超声辅助/固相萃取高效液相色谱联用检测日化用品中抗菌剂的方法，其特征在于所述方法包括先以超声预处理样品，以石墨烯为吸附剂对待测样品实施固相萃取，最后对固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析，获得样品中各种杀菌剂的含量的步骤。

优选的技术方案是：所述方法包括以下步骤：

(1)样品分析：以待测日化用品为试样，采用乙醇进行稀释样品并以超声处理之，通过基于石墨烯吸附材料的固相萃取柱实施样品富集、净化，然后对吸附后的固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析检测；

(2)空白分析：以蒸馏水为空白对照，按照步骤(1)的步骤进行稀释并超声处理后，以石墨烯固相萃取柱进行待测组分的富集、净化，然后对吸附后的固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析检测，以此作为样品空白；

(3)根据绘制校准后的标准曲线测定各种抗菌剂的含量：

以CIT/MIT、PCMX和PCMC为目标化合物，由其标准物质配制成梯度的标准系列溶液，分别按照步骤(1)进行超声处理，再改以石墨烯固相萃取柱富集、净化，然后对吸附后的固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析检测，所得结果扣除相同进样量的空白值后，得到目标化合物的浓度对色谱峰面积响应值的线性关系即校准后的标准曲线；步骤(1)得到的样品测定值扣除空白后对照校准后标准曲线计算得到日化用品中各种抗菌剂的含量。

优选的技术方案是：所述方法中固相萃取柱的洗脱条件为：洗脱溶剂为二氯甲烷，洗脱溶剂用量5mL，分三次淋洗。

优选的技术方案是：所述方法中所述流动相为甲醇和水的体积比为70：30的甲醇水溶液。

优选的技术方案是：所述方法中高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Symmetry shield RP C₁₈，5μm 3.9*150mm；流动相为甲醇：水＝70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，等度洗脱；高效液相色谱仪的二极管阵列检测器的条件为：波长检测波长1号峰为275nm，2和3号峰为227nm。

优选的技术方案是：所述方法中以石墨烯为固相萃取柱在使用前萃取柱分别用0.3mol/L抗坏血酸、1mol/L HNO₃、甲醇和水清洗。

优选的技术方案是：所述方法中洗脱液用氮气吹干后，溶解在1mL流动相中，取15μL溶液注入高效液相色谱仪进行分析。

优选的技术方案是：所述方法中采用无水乙醇进行稀释定容，对定容后的液体进行超声预处理后再进行固相萃取。

优选的技术方案是：所述方法中固相萃取柱为采用石墨烯为吸附材料制备得到的萃取柱，石墨烯采用通过填充漏斗置入6mL空管固相萃取小柱内，然后在填料的两端分别装有20μm孔径的聚乙烯筛板，石墨烯的装填高度为1cm。

本发明提供了一种利用超声辅助/固相萃取柱萃取、高效液相色谱分离、二极管列阵检测技术测定日化品中CIT/MIT、PCMX和PCMC的方法，具体包括如下步骤：

准确称取样品并用无水乙醇或无水甲醇进行稀释、定容，超声处理后，用以石墨烯为吸附剂的固相萃取柱进行萃取，收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干后，溶解在1mL流动相中，取15μL溶液注入高效液相色谱仪进行分析，测定不同日化品中杀菌剂的含量。

固相萃取柱为采用石墨烯为吸附材料制备萃取柱，石墨烯采用经典Hummers法制备，然后通过填充漏斗置入6mL空管固相萃取小柱内，填料的顶端和底端分别装有20μm孔径的聚乙烯筛板，装填高度约为1cm。其中固相萃取装置净化柱洗脱条件为：洗脱溶剂为二氯甲烷，洗脱溶剂用量5mL，分三次淋洗。

高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Symmetry shield RP C18，5m 3.9＊150mm；流动相为甲醇水溶液，其中体积比为甲醇：水＝70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，等度洗脱；二极管阵列检测器，波长检测波长CIT/MIT为275nm，PCMX和PCMC为227nm。

本发明考虑到所选目标化合物卡松(CIT/MIT,CAS No.2682-20-4)、对氯间二苯酚(PCMX,CAS No.88-04-0)和对氯间甲酚(PCMC,CAS No.59-50-7)的化学极性及其与水相的亲和力差别，开发出一种适合日化产品所述经皮毒物分析的超声辅助萃取/固相萃取技术：试样置于含有机溶剂的密闭体系内，经超声处理后采用石墨烯石墨烯固相萃取方式净化、富集目标物，分析物通过溶剂洗脱后由高效液相色谱(HPLC)进行检测。

本发明属于产品安全与检测技术领域，具体涉及一种利用超声辅助萃取/固相萃取柱萃取、高效液相色谱分离、二极管列阵检测，测定日化用品中某些杀菌剂的方法。本发明针对具有潜在经皮毒性的抗菌抑菌制剂CIT/MIT、PCMX和PCMC，通过对代表性化合物鉴别程序和分析条件的优化，建立基于超声辅助/石墨烯石墨烯固相萃取结合的样品处理流程，使用HPLC作为分析仪器，实现了相关产品中目标化合物多组分同时测定的分析方法。

相对于现有技术中的方案，本发明的优点是：

本发明技术方案建立了适合洗护用品中CIT/MIT、PCMX和PCMC抗菌抑菌制剂的超声辅助/固相萃取技术程序，藉由高效液相色谱进行目标化合物的定性定量分析，可适用于洗护用品等各类水性样品中目标化合物的含量测定。该方法具有有机溶剂用量少、萃取速度快、杂质干扰少、样品回收

率高等突出优点，可为日化用品建立有效的抗菌抑菌制剂安全限量控制和风险管理提供技术支撑。

附图说明

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

图1为目标物色谱峰面积对浓度的标准曲线(0.001～0.1mg/L)；图1(a)为PCMX标准曲线(y＝2.49e4*x-1.06e3，γ＝0.999993)；图1(b)为PCMC标准曲线(y＝3.21e4*x-9.01e2，γ＝0.999998)；图1(c)为CIT/MIT标准曲线(y＝2.32e4*x-1.75e3，γ＝0.999992)；

图2为PCMX和PCMC液相色谱图(227nm)。

图3为CIT/MIT液相色谱图(275nm)。

图4为CIT/MIT，RT＝1.089min的光谱(275nm)。

图5为PCMC，RT＝3.433min的光谱图(227nm)。

图6为PCMX，RT＝4.581min的光谱图(227nm)。

具体实施方式

以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。

实施例：石墨烯石墨烯固相萃取柱萃取测定洗手液中CIT/MIT、PCMC和PCMX含量的方法研究。

1、材料和方法

1.1仪器与试剂：

Branson 200ULTRASONIC Cleaner(频率48kHz，功率50Watt)；Waters高效液相色谱仪，Waters Symmetry shield RP C18，5μm 3.9*150mm，Waters公司；Supelco SPE固相萃取装置：SUPELCO VisiprepTM DL 12孔固相萃取装置；BOA-P504-BN型无油隔膜真空泵；固相萃取装置预充填小柱：采用石墨烯石墨烯(Graphene，Gr)。

甲醇(Methanol，HPLC级)，AH230-4，Honeywell Burdick & Jackson，USA；乙醇(Ethanol，HPLC级)，Cat.No.A452-4，Fisher Scientific，USA；二氯甲烷(DCM，HPLC级)，L2232049，AccustandardTM，USA；卡松(CIT/MIT,CAS No.2682-20-4)、对氯间二苯酚(PCMX,CAS No.88-04-0)和对氯间甲酚(PCMC,CAS No.59-50-7)标准品，Dr.Ehrenstorfer GmbH；鳞片石墨，青岛兴和石墨有限公司；浓H₂SO₄、H₂O₂溶液、盐酸、水合肼(N₂H₄·H₂O溶液)、NaNO₃和KMnO₄,国药集团化学试剂有限公司。

石墨烯石墨烯采用经典Hummers法制备：①称取300目鳞片石墨5g和NaNO₃ 2g进行混合，加入120mL浓H₂SO₄置于冰浴中加以搅拌，30min后加入20g KMnO₄，待反应60min后，移入40℃温水浴中继续反应30min，然后缓慢加入230mL去离子水，并保持反应温度为98℃，搅拌5min后加入适量H₂O₂溶液至不产生气泡，趁热过滤，并用去离子水和5％的盐酸进行多次洗涤至中性，离心后在60℃真空干燥箱中充分干燥即得氧化石墨(GO)。将氧化石墨分散在水中，得到棕黄色溶液，用超声处理1h即得GO。②称取0.1g的GO溶解于50g去离子水中，得到棕黄色悬浮液，在超声条件下分散60min，得到稳定分散液，加热分散液至80℃并滴加水合肼2mL，反应4h后过滤并用甲醇和去离子水进行冲洗，然后在60℃真空干燥箱中充分干燥即得石墨烯石墨烯(Graphene，Gr)。

准备6mL空管固相萃取小柱，下端先预置筛板，然后填入50mg自制石墨烯石墨烯，其上部再置入筛板，构成固相萃取装置预充填小柱。

1.2仪器条件

高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Symmetry shield RP C₁₈，5μm，3.9*150mm；流动相为甲醇水溶液，体积比(甲醇：水＝70：30)，柱温30℃，流速1.0mL/min，等度洗脱；二极管阵列检测器，波长检测波长CIT/MIT为275nm，PCMC和PCMX为227nm。

1.3分析测定

1.3.1样品预处理

准确称取1克样品(精确至1mg)于10ml具塞比色管中，用乙醇稀释至刻度，振摇，超声提取15min。

1.3.2固相萃取过程

除了固相萃取柱，其他部分利用固相萃取装置，使用前萃取柱分别用10mL 0.3mol/L抗坏血酸、1mol/LHNO₃、甲醇和水清洗。将样品溶液通过萃取柱进行固相萃取；用100mL水冲洗萃取柱，真空抽干10min除水。然后用5mL二氯甲烷分3次洗脱萃取柱，收集洗脱液；洗脱液用氮气吹干后，溶解在1mL流动相(流动相为甲醇水溶液，甲醇：水＝70：30(V:V))，待测。

同时取10mL蒸馏水按上述相同程序操作，以此作为样品空白。

1.3.3校准曲线的建立

校准曲线的绘制：由CIT/MIT、PCMX和PCMC标准储备液按照7点校正配制1～100mg/L标准系列溶液(CS1～CS7)，扣除相同进样量的空白值后，得到目标化合物的浓度对响应值(色谱峰高)的线性关系。

标准曲线以待测目标化合物的浓度(mg/L)为横坐标，测定值(峰面积)为纵坐标制作标准曲线。如图1所示为目标物色谱峰面积对浓度的标准曲线(0.001～0.1mg/L)；其中图1(a)为PCMX标准曲线(y＝2.49e4*x-1.06e3，γ＝0.999993)；图1(b)为PCMC标准曲线(y＝3.21e4*x-9.01e2，γ＝0.999998)；图1(c)为CIT/MIT标准曲线(y＝2.32e4*x-1.75e3，γ＝0.999992)。

1.3.4.空白加标回收率测定

实验过程中采用方法空白来控制整个实验过程中是否有人为或环境因素带来的污染，在检测限附近采用基质加标空白(在蒸馏水中加入目标化合物CIT/MIT)来验证实验过程的准确性。以浓度5ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的目标化合物标准溶液制备标准小样，进行回收率试验，另以相同材质的样品做空白试验，测定结果见表1。空白加标回收率在94.5-102.5％，RSD为2.2-4.9％，基质加标回收率在92.6-97.5％，RSD为3.1-6.8％。

表1 空白加标(CIT/MIT)回收率测定结果

2、结果及讨论

如图2所示为PCMX和PCMC液相色谱图(227nm)。如图3所示为CIT/MIT液相色谱图(275nm)。如图4所示为CIT/MIT，RT＝1.089min的光谱(275nm)。如图5所示为PCMC，RT＝3.433min的光谱图(227nm)。如图6所示为PCMX，RT＝4.581min的光谱图(227nm)。

2.1吸附剂的比较

分别考察了石墨烯石墨烯、C₁₈硅胶作为固相萃取柱吸附剂对CIT/MIT、PCMX和PCMC的萃取效率。结果表明，石墨烯石墨烯萃取得到的峰面积较大(表2)。本实施例选择石墨烯为固相萃取柱的吸附剂。

表2 不同吸附剂的测定结果(峰面积表示)

2.2洗脱剂的比较

考察了甲醇、乙腈、丙酮、正己烷和二氯甲烷对目标物CIT/MIT的洗脱效率。相同浓度的目标物CIT/MIT经萃取柱萃取后，分别以所述5种溶剂进行洗脱，测定洗脱液的峰面积。结果表明，二氯甲烷的洗脱效率最高(表3)。因此选择二氯甲烷为固相萃取柱的洗脱液，取5mL分3次进行洗脱。

表3 不同溶剂的洗脱效果(n＝3)

3、结论

本实施例以CIT/MIT、PCMX和PCMC为目标化合物，样品用无水乙醇进行稀释、定容，充分混匀后辅以超声处理；用自制的以石墨烯为吸附剂的固相萃取柱进行萃取，5mL二氯甲烷分3次进行洗脱；收集洗脱液，洗脱液用氮气吹干后，溶解在1mL流动相中，取15μL溶液注入高效液相色谱仪进行分析，测定不同洗护用品中杀菌剂的含量。方法对CIT/MIT的空白加标收率在94.5～102.5％，RSD为1.9～3.6％，可针对洗护用品中抗菌抑菌制剂CIT/MIT、PCMX和PCMC实施安全限量检测与产品安全评价。

上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种基于石墨烯固相萃取的日化用品抗菌剂检测方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(1)样品分析：以待测日化用品为试样，采用无水乙醇进行稀释定容后，采用石墨烯为吸附剂的萃取柱进行固相萃取，然后对吸附后的固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析检测；

(2)空白分析：以蒸馏水为空白对照，按照步骤(1)的步骤进行稀释定容后，采用石墨烯为吸附剂的萃取柱进行固相萃取，然后对吸附后的固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析检测，以此作为样品空白；

(3)根据绘制校准后的标准曲线测定各种抗菌剂的含量：

以卡松(CIT/MIT,CAS No.2682-20-4)、对氯间二苯酚(PCMX,CASNo.88-04-0)和对氯间甲酚(PCMC,CAS No.59-50-7)为目标化合物，由CIT/MIT、PCMX和PCMC标准溶液配制成梯度的标准系列溶液，分别按照步骤(1)进行稀释定容后，以石墨烯(Graphene,Gr)为吸附剂的固相萃取柱进行固相萃取，然后对吸附后的固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，将洗脱液用氮气吹干后，溶解在流动相后注入高效液相色谱仪进行分析检测，所得结果扣除相同进样量的空白值后，得到目标化合物的浓度对色谱峰面积响应值的线性关系即校准后的标准曲线；步骤(1)得到的样品测定值扣除空白后对照校准后标准曲线计算得到日化用品中各种抗菌剂的含量；

固相萃取柱的洗脱条件为：洗脱溶剂为二氯甲烷，洗脱溶剂用量5mL，分三次淋洗。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中所述流动相为甲醇和水的体积比为70：30的甲醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Symmetry shield RP C₁₈，5μm，3.9*150mm；流动相为甲醇：水＝70：30，柱温30℃，流速1.0mL/min，等度洗脱；高效液相色谱仪的二极管阵列检测器的条件为：波长检测波长CIT/MIT为275nm，PCMC和PCMX为227nm。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中以石墨烯为吸附剂的固相萃取柱在使用前萃取柱分别用0.3mol/L抗坏血酸、1mol/LHNO₃、甲醇和水清洗。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中洗脱液用氮气吹干后，溶解在1mL流动相中，取15μL溶液注入高效液相色谱仪进行分析。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中采用无水乙醇进行稀释定容，对定容后的液体进行超声预处理后再进行固相萃取。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中固相萃取柱为采用石墨烯为吸附材料制备得到的萃取柱，石墨烯采用通过填充漏斗置入6mL空管固相萃取小柱内，然后在填料的两端分别装有20μm孔径的聚乙烯筛板，石墨烯的装填高度为1cm。