CN104251897A - 一种同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，属于土壤中农药残留的理化检测技术领域。具体来说就是采用分散固相萃取结合分散液液微萃取，以高效液相色谱仪直接测定土壤中三类五种不同结构除草剂的残留量。本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对土壤样品前处理方法和仪器检测条件进行了优化，建立了DSPE-DLLME-HPLC法同时检测土壤中三类五种不同结构除草剂甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津和二氯喹啉酸，该方法线性相关系数均大于0.99，检出限为1.5-3.1ngg^-1,平均回收率在74.9-90.1％之间，相对标准偏差(RSD)在4.0-5.7％范围内，方法的准确度和精密度都符合残留检测的要求，且具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、灵敏度高易操作等特点。

Description

一种同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法

技术领域

本发明涉及土壤中农药残留的理化检测技术领域，尤其涉及一种同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法。

背景技术

喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类作为常用的除草剂，在农业生产中得到了广泛的应用，但也造成了土壤、水、大气和农产品的污染。并且喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类化合物化学性质相对稳定，在环境中降解困难，残效期长，对后茬敏感作物造成药害严重影响其产量和品质，因此对耕田土壤和农产品等复杂基质中的喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类除草剂残留的检测非常重要，不仅可以有效规避作物药害的发生，提高土壤的经济效益，而且也可以降低除草剂对人和动物的危害。

由于喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类除草剂在土壤中能够存在较长时间，因此既可能迁移到地表水和地下水中，也会被农作物吸收，进入到农产品如花生、烟叶中，从而影响人类健康，因此，对土壤样品中喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类除草剂的监测非常重要。土壤样品中除草剂浓度较低的现实情况和基质的复杂性，都对分析方法提出了更高的要求，如高灵敏度、选择性、较强的净化效果和分辨能力等(Macutkiewicz et al,2003)。而土壤样品中除草剂的萃取既是分析过程的初始阶段，也是相对困难的过程，常常伴随有净化或者富集的步骤(Wu et al,2009)。

样品的前处理是关系到分析结果准确性的重要步骤，也是花费时间最多，步骤最繁杂的，LC-GC杂志调查了1000多个实验室，在色谱分析过程中，实际的仪器分析仅占6％的时间，而样品前处理花费时间高达61％(陈小华等，2009)。而且在整个色谱分析过程中，30％的误差来源于样品前处理。由此可见，要保证分析结果的准确性，提高分析效率，必须从样品前处理入手。近年来，国内外学者发展了多种土壤中喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类除草剂的样品前处理技术，主要包括固相萃取、溶剂萃取、加速溶剂萃取、加压液体萃取、超声波辅助萃取、微波辅助萃取等等，但存在固相萃取的装置较贵，操作比较繁琐，不同批次生产的固相萃取装置重现性差且样品用量很大，溶剂萃取有机溶剂消耗较大的且分析时间较长，加压液体萃取由于需要较高的压力，对实验设施有较高的要求等缺点，且主要集中在同类除草剂的分析上。

由于土壤样品的复杂性和除草剂残留浓度较低的现实问题，对样品前处理技术提出了更高的要求(如高效、廉价、灵敏、低溶剂使用量和低检出限等)。针对上述问题和要求，本发明将分散固相萃取(DSPE)结合分散液液微萃取(DLLME)作为土壤样品的前处理技术，并利用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)进行甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)五种不同结构除草剂的同时检测。

目前，国内外对喹啉羧酸类、磺酰脲类和三嗪类除草剂在土壤中的残留检测主要集中在同类除草剂的分析上。Wu等(Wu et al,2009)人采用DSPE-DLLME-HPLC法对土壤中四种磺酰脲类除草剂进行检测；Zhang等(Zhang et al,2011)人采用DSPE-DLLME-MEKC(MicellarElectrokinetic Chromatography)测定土壤中五种磺酰脲类除草剂；Wu等(Wu et al,2010)人采用超声乳化悬浮微萃取结合高效液相色谱测定土壤中五种三嗪类除草剂；Van Der Velde等(Van Der Velde et al,1994)人采用超临界流体萃取技术(SFE)检测土壤中五种三嗪类除草剂。然而，目前国内外有关土壤中几类除草剂甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)五种不同结构除草剂同时检测的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的旨在克服现有技术缺陷，提供一种同时测定土壤中三类五种不同结构除草剂甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)残留量的方法。本发明采用分散固相萃取(DSPE)结合分散液液微萃取(DLLME)作为土壤样品的前处理技术，并利用高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)进行测定，克服了现有的方法有机溶剂消耗较大、分析时间较长、成本高以及检出限高等问题，能够快速、准确检测土壤中甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸五种不同结构除草剂的残留，测定结果准确，干扰少。

本发明采用如下技术方案：

本发明的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，测定的五种除草剂是甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)，具体步骤如下：

(1)称取样品：

称取风干土壤样品；

(2)乙腈提取：

往土壤样品中加入含有乙酸的乙腈混合液，混合液与土壤样品的体积重量比为10-30:10ml/g，混合均匀，再加入氯化钠和无水硫酸镁，氯化钠和无水硫酸镁与土壤样品的重量比为0.5-2:2-6:10，然后振荡混合均匀后进行离心；

(3)固相萃取：

将步骤(2)离心得到的上清液转移到含有C18和无水硫酸镁的离心管中，C18和无水硫酸镁与上清液的重量体积比为0.05-0.1:0.5-2:5g/ml，然后涡旋振荡均匀，再离心，上清液经0.22μm的有机滤膜过滤，得到提取液；

(4)分散液液微萃取：

取pH为2.0的双蒸水溶液置于装有氯化钠的带塞锥形玻璃离心管中，氯化钠与双蒸馏水溶液的重量体积比为0.1-0.5:5g/ml，用注射器将含有步骤(3)制备的提取液和三氯甲烷-氯苯混合溶液快速注入离心管中，提取液和三氯甲烷-氯苯混合溶液与双蒸馏水的体积比为0.5-2:0.1-0.2:5，涡旋振荡，然后离心，萃取相沉积到离心管底部，将上层水相移去，用微量注射器吸取有机相，并完全转移到另一个锥形试管中，用氮气缓慢吹干，残余物用甲醇溶解，甲醇与双蒸馏水的体积比为0.05-0.1:5，得到萃取物备用；

(5)标准工作溶液配制：

分别准确称取二氯喹啉酸、苄嘧磺隆、甲磺隆、扑草净、莠去津标准品，用乙腈稀释为100mg/L的单独标准储备液，将单独标准储备液配成浓度为5mg/L的混合标准储备液，将上述所配标准储备液均放在4℃的黑暗条件下保存；精确量取浓度为5mg/L标准储备液，通过逐级稀释配制成浓度分别2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L的标准系列溶液；

(6)高效液相色谱分析：

将步骤(4)得到的萃取物进行色谱分析，色谱条件如下：高效液相色谱仪：Agilent型；色谱柱：Agilent TC-C18柱；流速：0.5-1.5mL/min；检测波长：200-250nm；柱温：25-35℃；进样体积：20μL；流动相：流动相为乙腈、甲醇和水，梯度洗脱；

(7)除草剂残留量测定结果的计算：

以外标法进行除草剂残留量的定量分析，即以已知浓度的除草剂标准溶液的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对样品进行测定，测得检出除草剂的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸除草剂的残留量。

步骤(1)中，风干土壤样品称取之前过250μm筛。

步骤(2)中，含有乙酸的乙腈混合液中乙酸占混合液体积的5％，优选混合液与土壤样品的体积重量比为20:10ml/g，氯化钠和无水硫酸镁与土壤样品的重量比为1:4:10。

步骤(3)中，优选C18和无水硫酸镁与上清液的重量体积比为0.075:1:5g/ml。

步骤(4)中，优选氯化钠与双蒸馏水溶液的重量体积比为0.3:5g/ml，提取液和三氯甲烷-氯苯混合溶液与双蒸馏水的体积比为1:0.15:5，三氯甲烷-氯苯混合溶液中两者的体积比为1:1，甲醇与双蒸馏水的体积比为0.08:5。

步骤(6)中，高效液相色谱仪型号为Agilent1100型，配二极管阵列检测器(DAD)。

步骤(6)中，色谱柱的规格为5μm，4.6mm×250mm。

步骤(6)中，优选流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃。

步骤(6)中，流动相水的pH＝3，用1mol/L HCl调节。

步骤(6)中，梯度洗脱程序如下：

本发明建立了DSPE-DLLME-HPLC法同时检测土壤中三类五种不同结构除草剂甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)，该方法线性相关系数均大于0.99，检出限为1.5-3.1ngg^-1,平均回收率在74.9-90.1％之间，相对标准偏差(RSD)在4.0-5.7％范围内，方法的准确度和精密度都符合残留检测的要求，且具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、灵敏度高易操作等特点。

本发明克服了现有技术的缺陷和条件的限制，对土壤样品前处理方法和仪器检测条件进行了优化，与现有技术相比本发明具有如下优良效果：

(1)本发明将三类五种不同结构除草剂甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)同时用高效液相色谱仪配二极管阵列检测器(DAD)测定，大大节约了仪器设备与成本，可以满足不同条件实验室的工作需求。

(2)本发明样品前处理流程简单，大大缩短了每个土壤样品的检测时间，降低了分析成本。本发明采用分散固相萃取(DSPE)结合分散液液微萃取(DLLME)作为前处理技术，减少了有机溶剂的使用量，缩短了前处理时间，使实验操作更加简便、快捷。

(3)本发明具有检测灵敏度高、准确及重现性好等优点。

①本发明的检测限：

采用实际测定的方法，将不同浓度的甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸标准溶液进高效液相色谱仪(DAD)检测，土壤中二氯喹啉酸、甲磺隆和扑草净的检测限均为1.5ngg^-1，苄嘧磺隆和莠去津的检测限均为3.1ngg^-1。

②本发明的添加回收率和重现性：

在土壤中加入两个浓度梯度的甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津和二氯喹啉酸农药标准溶液，然后进行前处理，再用高效液相色谱仪(DAD)检测分析，并按照加标量和测定值计算其添加回收率，结果显示，甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津和二氯喹啉酸添加回收率在74.9-90.1％之间，相对标准偏差(RSD)在4.0-5.7％范围内，说明本发明回收率高，重现性好。

附图说明

图1是实施例1中五种除草剂(5mg/kg)的色谱分离图；

(1)二氯喹啉酸；(2)甲磺隆；(3)扑草净；(4)莠去津；(5)苄嘧磺隆。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1

本发明的同时测定土壤中三类五种不同结构除草剂甲磺隆(磺酰脲类)、苄嘧磺隆(磺酰脲类)、扑草净(三嗪类)、莠去津(三嗪类)和二氯喹啉酸(喹啉羧酸类)残留量的方法包括以下步骤：

(1)、称取样品：准确称取过250μm筛的风干土壤样品10.0g，置于50mL塑料离心管中；

(2)、乙腈提取：加入20.0mL含5％乙酸的乙腈混合溶液，涡旋振荡2min，加入1.0g氯化钠和4.0g无水硫酸镁后立即振荡30s，4000r/min离心5min；

(3)、固相萃取：5.0mL的上清液被转移到含有0.0750g的C18和1.0g无水硫酸镁的离心管中，涡旋振荡30s，4000r/min离心5min，上清液过0.22μm有机滤膜，1.0mL滤液被用于随后的分散液液微萃取(DLLME)；

(4)、分散液液微萃取(DLLME)：取5.0mL用1mol/L盐酸调节pH为2.0的双蒸水溶液置于装有0.30g氯化钠的10.0mL带塞锥形玻璃离心管中，用2.5mL注射器将含有1.0mL上述提取液(作为分散剂)和150μL三氯甲烷-氯苯(1:1，v/v，作为萃取剂)的混合溶液快速注入离心管中，涡旋30s，三氯甲烷-氯苯以极细小的乳浊液滴均匀分散在样品溶液中，样品溶液中的目标待测物即被萃取到三氯甲烷-氯苯相中，然后在3000r/min下离心5min，萃取相沉积到离心管底部，将上层水相移去，用微量注射器吸取有机相，并完全转移到另一个1.5mL的锥形试管中，用氮气缓慢吹干，残余物用80μL甲醇溶解，将20μL进行高效液相色谱分析；

(5)、准备标准工作溶液：分别准确称取甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸标准品(精确至0.0001g)，用乙腈稀释为100mg/L的单独标准储备液。将单独标准储备液配成浓度为5mg/L的混合标准储备液，将上述所配标准储备液均放在4℃的黑暗条件下保存；精确量取浓度为5mg/L标准储备液，通过逐级稀释配制成浓度分别2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L的标准系列溶液；

(6)、高效液相色谱分析：高效液相色谱仪：Agilent1100型，配二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱：Agilent TC-C18柱(5μm，4.6mm×250mm)；流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样体积：20μL；流动相：流动相为A-乙腈，B-甲醇，C-水(pH＝3，用1mol/L HCl调节)；梯度洗脱程序(见表1)：

表1流动相洗脱程序表

(7)、除草剂残留量测定结果的计算以外标法进行除草剂残留量的定量分析，即以已知浓度的除草剂标准溶液的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对样品进行测定，测得检出除草剂的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸除草剂的残留量。

在上述色谱分析条件下，标准物质甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸色谱出峰顺序为二氯喹啉酸、甲磺隆、扑草净、莠去津、苄嘧磺隆，保留时间分别为14.645、15.573、16.515、16.978和18.953min(见图1)；求得样品中五种除草剂的含量为：甲磺隆未检出(<1.5ngg^-1)、扑草净未检出(<1.5ngg^-1)、苄嘧磺隆未检出(<3.1ngg^-1)、莠去津未检出(<3.1ngg^-1)、二氯喹啉9.3ngg^-1。

为判断方法的准确性，在此土壤样品中分别加入20ng g^-1的甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸标准溶液，进行同上的样品处理，以高效液相色谱仪(DAD)测定甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津和二氯喹啉酸的色谱峰面积，代入标准曲线，求得此时样品中的甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸含量分别为17.8ng g^-1、15.6ng g^-1、16.7ng g^-1、17.1ng g^-1和25.8ng g^-1,即甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津和二氯喹啉酸的加标回收率分别为89.0％、78.0％、83.5％、85.5％和82.5％、说明此方法是准确的。

本发明减少了有机溶剂的使用量，缩短了分析时间(见图1)，降低了分析成本，且具有操作简单。

试验中所用到的主要试剂(甲醇、乙腈、乙酸、三氯甲烷、氯苯、C18、无水氯化钠、无水氯化镁等)都是常见试剂；三氯甲烷、氯苯溶剂施用量仅为各75μL。

本发明建立了DSPE-DLLME-HPLC法同时检测土壤中三类除草剂的五种农药，该方法线性相关系数均大于0.99，检出限为1.5-3.1ngg^-1,平均回收率在74.9-90.1％之间，相对标准偏差(RSD)在4.0-5.7％范围内，方法的准确度和精密度都符合农药残留检测的要求，且具有有机溶剂用量少、净化和浓缩效果好、灵敏度高易操作等特点(见表2、表3)：

表2分散固相萃取-分散液液微萃取方法对五种除草剂的分析数据

表3分散固相萃取-分散液液微萃取方法对五种除草剂的回收情况

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：测定的五种除草剂是甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津和二氯喹啉酸，具体步骤如下：

(1)称取样品：

称取风干土壤样品；

(2)乙腈提取：

往土壤样品中加入含有乙酸的乙腈混合液，混合液与土壤样品的体积重量比为10-30:10ml/g，混合均匀，再加入氯化钠和无水硫酸镁，氯化钠和无水硫酸镁与土壤样品的重量比为0.5-2:2-6:10，然后振荡混合均匀后进行离心；

(3)固相萃取：

将步骤(2)离心得到的上清液转移到含有C18和无水硫酸镁的离心管中，C18和无水硫酸镁与上清液的重量体积比为0.05-0.1:0.5-2:5g/ml，然后涡旋振荡均匀，再离心，上清液经0.22μm的有机滤膜过滤，得到提取液；

(4)分散液液微萃取：

取pH为2.0的双蒸水溶液置于装有氯化钠的带塞锥形玻璃离心管中，氯化钠与双蒸馏水溶液的重量体积比为0.1-0.5:5g/ml，用注射器将含有步骤(3)制备的提取液和三氯甲烷-氯苯混合溶液快速注入离心管中，提取液和三氯甲烷-氯苯混合溶液与双蒸馏水的体积比为0.5-2:0.1-0.2:5，涡旋振荡，然后离心，萃取相沉积到离心管底部，将上层水相移去，用微量注射器吸取有机相，并完全转移到另一个锥形试管中，用氮气缓慢吹干，残余物用甲醇溶解，甲醇与双蒸馏水的体积比为0.05-0.1:5，得到萃取物备用；

(5)标准工作溶液配制：

分别准确称取甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸标准品，用乙腈稀释为100mg/L的单独标准储备液，将单独标准储备液配成浓度为5mg/L的混合标准储备液，将上述所配标准储备液均放在4℃的黑暗条件下保存；精确量取浓度为5mg/L标准储备液，通过逐级稀释配制成浓度分别2.0mg/L、1.0mg/L、0.5mg/L、0.2mg/L、0.1mg/L、0.05mg/L的标准系列溶液；

(6)高效液相色谱分析：

将步骤(4)得到的萃取物进行色谱分析，色谱条件如下：高效液相色谱仪：Agilent型；色谱柱：AgilentTC-C18柱；流速：0.5-1.5mL/min；检测波长：200-250nm；柱温：25-35℃；进样体积：20μL；流动相：流动相为乙腈、甲醇和水，梯度洗脱；

(7)除草剂残留量测定结果的计算：

以外标法进行除草剂残留量的定量分析，即以已知浓度的除草剂标准溶液的色谱峰面积比对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线，对样品进行测定，测得检出除草剂的色谱峰面积，代入标准曲线，求得样品中甲磺隆、苄嘧磺隆、扑草净、莠去津、二氯喹啉酸除草剂的残留量。

2.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(1)中，风干土壤样品称取之前过250μm筛。

3.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(2)中，含有乙酸的乙腈混合液中乙酸占混合液体积的5％，混合液与土壤样品的体积重量比为20:10ml/g，氯化钠和无水硫酸镁与土壤样品的重量比为1:4:10。

4.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(3)中，C18和无水硫酸镁与上清液的重量体积比为0.075:1:5g/ml。

5.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(4)中，氯化钠与双蒸馏水溶液的重量体积比为0.3:5g/ml，提取液和三氯甲烷-氯苯混合溶液与双蒸馏水的体积比为1:0.15:5，三氯甲烷-氯苯混合溶液中两者的体积比为1:1，

甲醇与双蒸馏水的体积比为0.08:5。

6.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(6)中，高效液相色谱仪为Agilent1100型，配二极管阵列检测器。

7.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(6)中，色谱柱的规格为5μm，4.6mm×250mm。

8.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(6)中，流速：1.0mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃。

9.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(6)中，流动相水的pH＝3，用1mol/LHCl调节。

10.如权利要求1所述的同时测定土壤中五种不同结构除草剂残留量的方法，其特征在于：步骤(6)中，梯度洗脱程序如下：