CN102288696A

CN102288696A - 一种测定百草枯血药浓度的方法

Info

Publication number: CN102288696A
Application number: CN2011101867072A
Authority: CN
Inventors: 王勇; 邱相君; 刘玲; 徐仁爱; 王建刚
Original assignee: Henan University of Science and Technology
Current assignee: Henan University of Science and Technology
Priority date: 2011-07-05
Filing date: 2011-07-05
Publication date: 2011-12-21
Anticipated expiration: 2031-07-05
Also published as: CN102288696B

Abstract

本发明公开了一种测定百草枯血药浓度的方法，包括如下步骤：（1）样品预处理：取血浆样品，加入内标物水溶液和蛋白沉淀剂乙腈，旋涡混合，再离心后取上清液进样；（2）样品分离：采用通用型C₁₈液相色谱柱，酸性流动相使用离子对试剂，所述的酸性流动相为3mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液-0.2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液；（3）二极管阵列检测器检测：采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为250～260nm，测定内标物和百草枯的峰面积，以最小二乘法线形回归计算出百草枯的血药浓度。本发明血浆样品预处理简便、检测过程灵敏快速，在实际应用中能较快确定中毒物质及其血药浓度，临床应用价值高。

Description

一种测定百草枯血药浓度的方法

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种测定百草枯血药浓度的方法。

背景技术

百草枯（paraquat）又名克无踪、对草快，化学名称为1,1′-二甲基-4,4′-联吡啶二氯化物，分子量257.2，为中等毒性的有机杂环类接触性脱叶剂及除草剂。百草枯可经皮肤、呼吸道及消化道吸收，通过血液循环几乎分布于所有组织和器官，肺中浓度较高，中毒机理与超氧阴离子的产生有关。由于目前尚无特效解毒剂，因此目前百草枯中毒后死亡率较高。因为百草枯的血药浓度与死亡率密切相关，因此建立一种百草枯血药浓度的测定方法非常必要，以实现对中毒患者体内百草枯血药浓度的较快监测，从而为临床百草枯中毒患者的抢救赢得宝贵的时间。

目前百草枯血药浓度的测定方法主要有气相色谱法、气质联用法、高效液相色谱法、毛细管电泳质谱联用法和液相色谱质谱联用法，其中以高效液相色谱法（HPLC）最为常用。例如《中国法学杂志》2007年第22卷第6期第388-389页公开的“高效液相色谱法测定生物体液中百草枯”和《中国法学杂志》2004年第19卷第3期第160-161页公开的“高效液相色谱法测定人血液中的百草枯”，都是使用离子交换固相萃取法对百草枯血浆样本进行预处理，存在样本处理过程复杂且花费时间长的缺点；另外，虽然在流动相中加入了离子对试剂辛烷基磺酸钠来改善百草枯的峰形，但百草枯色谱峰的拖尾形象依然存在；采用外标法，操作误差会影响到检测结果的准确性；百草枯的保留时间为12min左右，超过了10min。《中国法学杂志》2009年第24卷第4期第267-268页公开的“HPLC法测定百草枯急性中毒大鼠的体内分布”虽然采用内标法对大鼠体内的百草枯进行了测定，内标物为乙基百草枯，但样本的预处理仍使用离子交换固相萃取法，样本处理过程复杂且花费时间长；流动相中加入离子对试剂辛烷基磺酸钠来改善百草枯的峰形，但百草枯色谱峰的拖尾形象依然存在；百草枯的保留时间亦超过10min，为15min左右。

发明内容

本发明的目的在于提供一种样本处理简便、干扰小、灵敏迅速的测定百草枯血药浓度的方法。

为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种测定百草枯血药浓度的方法，包括如下步骤：

（1）样品预处理

取血浆样品，加入内标物卡马西平的水溶液和蛋白沉淀剂乙腈，旋涡混合，再离心后取上清液进样；

（2）样品分离

采用通用型C₁₈液相色谱柱，高效液相系统采用通用型的二极管阵列检测器及高压泵，酸性流动相使用离子对试剂，所述的酸性流动相为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液-0.2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液，等梯度洗脱；

（3）二极管阵列检测器检测

采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为250～260nm，测定内标物卡马西平和百草枯的峰面积，以最小二乘法线形回归计算出百草枯的血药浓度。

进一步的，步骤（1）中蛋白沉淀剂乙腈的用量为：蛋白沉淀剂乙腈的体积与血浆样品的体积比为1:1。

步骤（2）中的混合液中3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液、0.2%三氟乙酸水溶液、乙腈和水的体积比为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液:0.2%三氟乙酸水溶液:乙腈:水=（23～33）:（25～35）:（30～40）:（2～12）。

酸性流动相的流速为1.0 mL·min^-1，柱温为25～30℃。

本发明提供的测定百草枯血药浓度的方法具有以下优点：

1、血浆样品预处理简单方便，直接使用有机溶剂乙腈沉淀蛋白质，经多次实验优化后发现，当乙腈与血浆样品的体积比为1:1时，蛋白沉淀效果最好，内源性干扰物质少，而且由于省略了提取的步骤，因此血浆样品的预处理简便快速，适用于临床常规检测。

2、流动相选用十二烷基磺酸钠（SDS）-三氟乙酸(TFA)-乙腈-水的混合液，离子对试剂SDS和TFA的使用改善了百草枯色谱峰峰形不对称、峰展宽和拖尾现象，同时避免了血浆中杂峰的干扰，取得了良好的分离效果，提高了检测结果的可靠性。

3、采用内标法测定百草枯血药浓度，使用卡马西平为内标物，减少了操作误差对检测结果带来的影响。

4、采用本发明提供的测定百草枯血药浓度的方法测得的内标物卡马西平和百草枯的保留时间分别为5.5～5.8min和6.5～7.0min，血浆样品从进样到得出检测结果整个色谱分析过程只需8分钟，提高了百草枯的检测速度，大大缩短了样品的测定周期，达到了灵敏迅速的测定百草枯血药浓度的目的，适于临床百草枯中毒患者的急救监测。

与现有的百草枯血药浓度的检测方法相比，本发明的测定百草枯血药浓度的方法血浆样品预处理简便、检测过程灵敏快速，在实际应用中能较快确定中毒物质及其血药浓度。

本发明测定百草枯血药浓度的方法测定的百草枯血药浓度的线性范围为0.5～100.0 mg·L^-1，相对回收率标准偏差在5％以内，绝对回收率在75％以上，日内、日间精密度标准偏差均小于10％。同时，百草枯血浆样品在室温放置和冰冻保存条件下均具有良好的稳定性，本发明适用于临床百草枯中毒患者的血药浓度检测。

附图说明

图1为试验例中百草枯中毒患者张某入院后的血浆样品经样品预处理后所得上清液的色谱图，其中1代表内标物卡马西平，2代表百草枯。

具体实施方式

实施例

本实施例测定百草枯血药浓度的方法，步骤如下：

（1）样品预处理

准确吸取血浆样品300 μL于1.5 mL EP管中，再向该1.5 mL EP管中加入1 g·L^-1的卡马西平水溶液30 μL，之后再加蛋白沉淀剂乙腈300 μL，涡旋混合1 min后，12000 r·min^-1离心10 min，取上清液300 μL于自动进样器的样品瓶中，设定2.5 μL进样检测；

（2）样品分离

采用Agilent TC-C18（4. 6 mm×150mm，5μm）液相色谱柱，高效液相系统采用通用型的二极管阵列检测器及高压泵，酸性流动相使用离子对试剂，酸性流动相为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液-0.2%三氟乙酸水溶液-乙腈-水的混合液，混合液中3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液、0.2%三氟乙酸水溶液、乙腈和水的体积比为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液:0.2%三氟乙酸水溶液:乙腈:水为28:30:35:7，酸性流动相的流速为1.0 mL·min^-1，柱温为30℃，等梯度洗脱；

（3）二极管阵列检测器检测

采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为258nm，测定内标物卡马西平和百草枯的峰面积，以最小二乘法线形回归计算出百草枯的血药浓度。

本实施例测定百草枯血药浓度的方法测定的内标物卡马西平和百草枯的保留时间分别为5.6min和6.7min。

本实施例测定百草枯血药浓度的方法的血浆标准曲线：取8支1.5 mL EP管，分别加入不同浓度不同体积的百草枯标准工作液，再用空白血浆补充到体积为0.3 mL，配成浓度相当于0.5 mg·L^-1、1.0 mg·L^-1、2.5 mg·L^-1、5.0 mg·L^-1、10.0 mg·L^-1、25.0 mg·L^-1、50.0 mg·L^-1、100.0 mg·L^-1的血浆样品，再按本实施例步骤（1）血浆样品的预处理方法处理，测定百草枯峰面积As、内标物峰面积Ai，以As/Ai为纵坐标y，以所对应各点浓度（C）为横坐标x绘制标准曲线，经最小二乘法线性回归，得百草枯的标准曲线回归方程为y=0.02094x+0.0038（r=0.999 9），线性范围为0.5~100.0 mg·L^-1。

本实施例测定百草枯血药浓度的方法的相对回收率：配制低、中、高三种浓度（1.0、10.0、50.0 mg·L^-1）的百草枯血浆标准品溶液，每种浓度6份，再按本实施例步骤（1）血浆样品的预处理方法处理，之后检测，依据标准曲线计算检测量，以检测量与加入量之比计算相对回收率，结果显示相对回收率相对标准偏差（RSD）在5％以内，见表1所示。

表1 百草枯在人血浆的相对回收率

本实施例测定百草枯血药浓度的方法的绝对回收率：配制低、中、高三种浓度（1.0、10.0、50.0 mg·L^-1）的百草枯血浆标准品溶液，每种浓度6份，再按本实施例步骤（1）血浆样品的预处理方法处理，之后检测，记录百草枯的峰面积，为血浆标准的峰面积。分别配制浓度为1.0、10.0、50.0 mg·L^-1的百草枯标准品溶液，直接2.5 μL进样检测，记录峰面积，为纯标峰面积。计算血浆标准峰面积和纯标峰面积的比值，即为绝对回收率。结果显示绝对回收率在75％以上，见表2所示。

表2 百草枯在人血浆的绝对回收率

Figure 2011101867072100002DEST_PATH_IMAGE004

本实施例测定百草枯血药浓度的方法的精密度试验：配制低、中、高三种浓度（1.0、10.0、50.0 mg·L^-1）的百草枯血浆标准品溶液，每种浓度6份，再按本实施例步骤（1）血浆样品的预处理方法处理，之后于同一日内检测，依据当日标准曲线计算检测量，计算日内精密度；连续3天同样操作，计算日间精密度，显示日内日间精密度RSD均小于10％，见表3所示。

表3 百草枯在人血浆的精密度

Figure 2011101867072100002DEST_PATH_IMAGE006

本实施例测定百草枯血药浓度的方法中血浆样品稳定性：配制低、中、高三个浓度的百草枯血浆标准溶液，分别考察处理后样品、冻融条件下、室温放置和冰冻保存条件下的稳定性，结果表明样本具有良好的稳定性，见表4所示。

表4 血浆样品的稳定性试验结果

试验例

张某，女，35岁，某日服除草剂百草枯，经医院血液灌流抢救有效。分别取患者入院后、血液灌流后、血液灌流后2 h和血液灌流后4 h的血浆样品按实施例的方法进行检测，检测出百草枯血药浓度分别为48.42、13.68、10.85、9.87 mg·L^-1。该百草枯中毒患者张某入院后的血浆样品经样品预处理后所得上清液的色谱图见图1所示。

Claims

1.一种测定百草枯血药浓度的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）样品预处理

取血浆样品，加入内标物的水溶液和蛋白沉淀剂乙腈，旋涡混合，再离心后取上清液进样；

（2）样品分离

（3）二极管阵列检测器检测

采用二极管阵列检测器进行检测，检测波长为250～260nm，测定内标物和百草枯的峰面积，以最小二乘法线形回归计算出百草枯的血药浓度。

2.根据权利要求1所述的测定百草枯血药浓度的方法，其特征在于，所述的内标物为卡马西平。

3.根据权利要求1所述的测定百草枯血药浓度的方法，其特征在于，步骤（1）中蛋白沉淀剂乙腈的用量为：蛋白沉淀剂乙腈的体积与血浆样品的体积比为1:1。

4.根据权利要求1所述的测定百草枯血药浓度的方法，其特征在于，所述混合液中3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液、0.2%三氟乙酸水溶液、乙腈和水的体积比为3 mmol·L^-1十二烷基磺酸钠水溶液:0.2%三氟乙酸水溶液:乙腈:水=（23～33）:（25～35）:（30～40）:（2～12）。

5.根据权利要求1所述的测定百草枯血药浓度的方法，其特征在于，酸性流动相的流速为1.0 mL·min^-1，柱温为25～30℃。