CN102590384A - 籽瓜hplc指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种籽瓜HPLC指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。籽瓜去籽，将瓜瓤取出置于果汁搅拌器中粉碎30s，抽滤取滤液即籽瓜汁并用0.45μm滤膜过滤后作为供试品溶液。对供试品溶液进行高效液相色谱分析：色谱柱为SinochromODS-BPC18，5μm，250×4.6mm，柱温为25℃，流动相为甲醇和0.2%乙酸水，采用梯度洗脱的方式，检测波长260nm，得到籽瓜HPLC指纹图谱。通过对10批次籽瓜HPLC指纹图谱的比对，确定其共有指纹特征，得到籽瓜标准指纹图谱。利用该标准指纹图谱可以有效监控籽瓜及籽瓜深加工制品的质量。
Description
技术领域
本发明属于天然植物分析技术领域，涉及天然植物指纹图谱的构建方法，尤其是籽瓜高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
背景技术
指纹图谱技术是目前国际公认的同时具备实用性和科学性的天然植物及其制品质量控制方法。
目前国际上各种符合天然药物（植物）特色的指纹图谱控制技术体系正在研究和建立，美国食品药品管理局（FDA）允许草药保健品申报资料中提供色谱指纹图谱；世界卫生组织（WHO）在1996年草药评价指导原则中也规定，如果草药的活性成分不明确，可以提供色谱指纹图谱以证明产品质量的一致；欧共体在草药质量指南中亦称，单靠测定某种有效成分考查质量的稳定性是不够的，因为草药及其制剂是以整体为活性物质。国外指纹图谱的应用，目的在于解决成分复杂、有效成分不明确的植物药质量检测和产品批次间质量差异的问题。指纹图谱已经是国内外公认的鉴别中药品种与评价中药质量的最有效的手段之一。
籽瓜（Citrullus lanatus. Convar megalaspermus. Lin et Chao），又名打瓜，主要产于我国北方地区，特别是西北地区。
籽瓜属西瓜一个特殊品种，营养丰富，民间一直流传着食用籽瓜治疗某些疾病的验方，它是一种药食同源的农作物。研究证明，籽瓜瓜瓤富含果酸、核黄素、尼克酸及多种维生素、矿质元素和微量元素，含有18种氨基酸，特别是含有人体必需却又不能合成的8种必需氨基酸，是一种理想的保健食品原料；籽瓜汁可以明显提高细胞活性，具有明显的抗氧化作用，可以保护细胞免受氧化损伤，对细胞凋亡有明显的抑制作用，又是一种理想的护肤品原料。
但是籽瓜的某些特殊活性成分目前尚不清楚，这对籽瓜深加工质量控制带来难题。
本发明力求借鉴中药材指纹图谱作为鉴别中药品种与评价中药质量的有效手段，通过高效液相色谱法(HPLC)对籽瓜进行指纹图谱的研究，建立籽瓜标准指纹图谱，达到准确反映籽瓜及籽瓜深加工制品中所含化学成分的种类与数量的目的，进而对籽瓜深加工制品中籽瓜有效成分和添加剂进行科学的鉴别和测定，达到控制籽瓜深加工制品质量和监控食品安全生产的目的。
发明内容
本发明的目的是提供一种籽瓜HPLC指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱。
本发明的另一目的是提供一种籽瓜制品质量控制方法。
本发明实现上述第一目的采取的技术方案是：一种籽瓜高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：籽瓜去籽，将瓜瓤取出置于果汁搅拌器中粉碎30s，抽滤取滤液，得籽瓜汁用0.45μm滤膜过滤后作为供试品溶液；
（2）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和质量百分浓度是0.2%的乙酸水（以下同）；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在上述条件下分析供试品溶液，得到籽瓜HPLC指纹图谱；
（3）重复上述步骤（1）与（2），对不同产地的10批次籽瓜建立HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了24个共有特征峰，其保留时间分别为：3.520min、4.938min、5.407min、6.530min、7.413min、7.856min、9.750min、10.303min、12.637min、12.832min、13.147min、13.686min、14.494min、17.487min、17.880min、19.129min、19.468min、20.287min、21.288min、21.805min、22.320min、29.835min、36.655min、37.867min，标准偏差（SD）：0.05~ 0.25 min；这些共有特征峰构成了籽瓜HPLC指纹特征，作为籽瓜标准指纹图谱。
本发明实现上述第二目的采取的技术方案是：一种籽瓜制品质量控制方法，包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：洁净条件下将籽瓜饮料原料—籽瓜汁的澄清液作为供试品溶液，或者将籽瓜粉、籽瓜浓缩汁用去离子水稀释还原成籽瓜原汁浓度，作为供试品溶液；
（2）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和0.2%乙酸水；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在上述条件下分析供试品溶液，得到籽瓜饮料原料—籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜浓缩汁的HPLC指纹图谱；
（3）将步骤（2）所得籽瓜饮料原料—籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜浓缩汁的HPLC指纹图谱与籽瓜标准指纹图谱相比对，鉴别籽瓜制品所含籽瓜有效成分以及是否添加了其它添加剂。
本发明将籽瓜原汁作为一个整体对待，通过比较其共有峰，可以找出不同产地籽瓜甚至不同季节收获的籽瓜成分之间的细微差别，可鉴别籽瓜制品中是否含有籽瓜有效成分；同时，可以准确鉴别出籽瓜汁中是否添加了其它添加剂，适用于对籽瓜深加工过程中籽瓜制品质量的控制和食品安全生产的监控。
本发明为籽瓜深加工过程中籽瓜制品质量的控制以及食品安全生产的监控提供了一种科学有效的方法，其检测手段先进，操作性强。
附图说明
图1是本发明提供的籽瓜的标准指纹图谱，
图2是甘肃景泰-1产地籽瓜的原汁色谱图，
图3是甘肃景泰-2产地籽瓜的原汁色谱图，
图4是甘肃靖远-1产地籽瓜的原汁色谱图，
图5是甘肃会宁-1产地籽瓜的原汁色谱图，
图6是籽瓜饮料原料—籽瓜汁1-1批次色谱图，
图7是籽瓜饮料原料—籽瓜汁1-2批次色谱图。
具体实施方式
实施例1
（1）仪器和试剂：使用安捷伦高效液相色谱仪（Agilent 1200），DAD二级阵列检测器；籽瓜共10批次，产地来自甘肃景泰、靖远、会宁等地；试剂中甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯，试验用水为去离子水；
（2）供试品溶液的制备：籽瓜去籽，将瓜瓤（距瓜皮0.5～1cm）取出置于果汁搅拌器中粉碎30s，抽滤取滤液即籽瓜汁并用0.45μm滤膜过滤后作为供试品溶液；
（3）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和0.2%乙酸水；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在此条件下分析供试品溶液，得到籽瓜HPLC指纹图谱；
（4）重复上述步骤（1）至（3），对不同产地的10批次籽瓜建立HPLC指纹图谱如图1所示，通过分析比较，确定出24个共有特征峰，其保留时间分别为：3.520min、4.938min、5.407min、6.530min、7.413min、7.856min、9.750min、10.303min、12.637min、12.832min、13.147min、13.686min、14.494min、17.487min、17.880min、19.129min、19.468min、20.287min、21.288min、21.805min、22.320min、29.835min、36.655min、37.867min，这些共有特征峰构成了籽瓜HPLC指纹特征，作为籽瓜的标准指纹图谱。图1中，从左到右分别标出了其共有特征峰1至24号。
在测试具体籽瓜供试样品过程中，以上特征峰的保留时间可能会出现0.05~ 0.25 min的标准偏差，不影响样品相似度的比对。
实施例2
实施例2的目的在于对不同产地籽瓜指纹图谱与籽瓜标准指纹图谱进行比较，证明本发明的准确性及实用性。
以甘肃景泰-1产地籽瓜为试验样品，使用安捷伦高效液相色谱仪（Agilent 1200），DAD二级阵列检测器；试剂中甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯，试验用水为去离子水；按照下述方法制作甘肃景泰-1产地籽瓜的色谱图；
（1）供试品溶液的制备：籽瓜去籽，将瓜瓤（距瓜皮0.5～1cm）取出置于果汁搅拌器中粉碎30s，抽滤取滤液即籽瓜汁并用0.45μm滤膜过滤后作为供试品溶液；
（2）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和0.2%乙酸水；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在上述条件下分析供试品溶液，得到甘肃景泰-1产地的籽瓜HPLC色谱图，如图2所示。
按照上述方法，以甘肃景泰-2产地籽瓜为试验样品，得到甘肃景泰-2产地的籽瓜HPLC色谱图，如图3所示。
同样，按照上述方法，以甘肃靖远-1产地籽瓜为试验样品，得到甘肃靖远-1产地的籽瓜HPLC色谱图，如图4所示；以甘肃会宁-1产地籽瓜为试验样品，得到甘肃会宁-1产地的籽瓜HPLC色谱图，如图5所示。
（3）将各个籽瓜制品供试品溶液HPLC色谱图与籽瓜标准指纹图谱进行比对，表明各个籽瓜供试品与籽瓜标准指纹图谱具有共有特征峰；从图2～图5明显可见：各产地籽瓜原汁中所含物质在种类和含量上略有差别，每个色谱峰代表籽瓜原汁中所含的一类化合物。
采用国家药典委员会提供的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版软件》对样品S1至样品S10色谱数据进行分析，对各批次籽瓜色谱图相似度给予计算分析，各批次籽瓜指纹图谱相似度计算分析结果见表1。
表1提供的指纹图谱评价软件相似度计算结果显示，样品S1为甘肃景泰产西瓜与籽瓜杂交品种，其对照指纹图谱的相似度最低为0.397。样品S3与对照指纹图谱的相似度稍低为0.825，该样品产地是甘肃靖远，分析该差异可能与地域相关。其他样品色谱图与对照指纹图谱的相似度均达0.99以上，表明本发明确定的籽瓜标准指纹图谱是准确的。
表1 各批次籽瓜指纹图谱相似度计算结果
实施例3
对不同批次籽瓜饮料的原料所使用的籽瓜汁制作色谱图并给予分析。本实施例所述的籽瓜汁为籽瓜经清洗、去籽、破碎、榨滤、灭酶、灭菌等工序并在洁净条件下添加适量食品防腐剂灌装存放，作为生产籽瓜饮料的原料。
使用安捷伦高效液相色谱仪（Agilent 1200），DAD二级阵列检测器；试剂中甲醇为色谱纯，乙酸为分析纯，试验用水为去离子水；按照下述方法制作籽瓜饮料原料—籽瓜汁1-1批次的色谱图；
（1）供试品溶液的制备：洁净条件下将籽瓜饮料原料—籽瓜汁1-1批次样本的澄清液作为供试品溶液；
（2）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和0.2%乙酸水；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在上述条件下分析供试品溶液，得到籽瓜饮料原料—籽瓜汁1-1批次样本的籽瓜汁HPLC色谱图，如图6所示。
同样，按照上述方法，制作籽瓜饮料原料—籽瓜汁1-2批次样本的籽瓜汁HPLC色谱图，如图7所示。
由图6与图7可见，这两批产品籽瓜原汁色谱图的特征峰均较为明显，而且两批产品色谱图的相似度较高，说明质量稳定；同时还反映出籽瓜汁1-1和籽瓜汁1-2均由籽瓜原汁添加防腐剂而成，该食品防腐剂的特征峰也十分明显。
本实施例表明将籽瓜标准指纹图谱特征峰以外的色谱峰与食品添加剂标准指纹图谱进行比对，可有效鉴别出籽瓜汁中添加了何种添加剂和防腐剂，利用此方法可有效控制籽瓜制品的质量和监控籽瓜深加工过程中的食品安全生产。
Claims (2)
1.一种籽瓜高效液相色谱（HPLC）指纹图谱的构建方法及其标准指纹图谱，其特征在于包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：籽瓜去籽，将瓜瓤取出置于果汁搅拌器中粉碎30s，抽滤取滤液，得籽瓜汁用0.45μm滤膜过滤后作为供试品溶液；
（2）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和质量百分浓度是0.2%的乙酸水；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在上述条件下分析供试品溶液，得到籽瓜HPLC指纹图谱；
（3）重复上述步骤（1）与（2），对不同产地的10批次籽瓜建立HPLC指纹图谱对不同产地的10批次籽瓜建立HPLC指纹图谱，通过分析比较，确定了24个共有特征峰，其保留时间分别为：3.520min、4.938min、5.407min、6.530min、7.413min、7.856min、9.750min、10.303min、12.637min、12.832min、13.147min、13.686min、14.494min、17.487min、17.880min、19.129min、19.468min、20.287min、21.288min、21.805min、22.320min、29.835min、36.655min、37.867min，标准偏差（SD）：0.05~ 0.25 min；这些共有特征峰构成了籽瓜HPLC指纹特征，作为籽瓜标准指纹图谱。
2.一种籽瓜制品质量控制方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）供试品溶液的制备：洁净条件下将籽瓜饮料原料—籽瓜汁的澄清液作为供试品溶液，或者将籽瓜粉、籽瓜浓缩汁用去离子水稀释还原成籽瓜原汁浓度，作为供试品溶液；
（2）高效液相色谱分析：色谱分离柱填料为Sinochrom ODS-BP C18，5μm， 250×4.6mm；流动相为甲醇和质量百分浓度是0.2%的乙酸水；采用梯度洗脱的方式：0min→2min→42min→45min，甲醇：2%→2%→70%→70%，进样量20 μL，检测波长260 nm；柱温25℃；在上述条件下分析供试品溶液，得到籽瓜饮料原料—籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜浓缩汁的HPLC色谱图；
（3）将步骤（2）所得籽瓜制品—籽瓜汁或籽瓜粉或籽瓜浓缩汁的HPLC色谱图与籽瓜标准指纹图谱相比对，鉴别籽瓜制品所含籽瓜有效成分以及是否添加了其它添加剂。
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