CN104020229A - 扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的hplc指纹图谱检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的HPLC指纹图谱检测方法。本发明还提供了扯根菜药材的HPLC指纹图谱检测方法。本发明检测方法，可以将扯根菜、单用扯根菜为原料制备的各种提取物或制剂中的各种有效成分进行有效分离，所得色谱图中色谱峰数量多，分离度良好，基线平稳，更适合于对各种提取物或制剂的质量检测。

Description

扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的HPLC指纹图谱检测方法

技术领域

本发明涉及扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的HPLC指纹图谱检测方法。

背景技术

赶黄草(Penthorum chinense Pursh.)，又称水泽兰、水杨柳(《贵州民间药物》)，水滓蓝(《天宝本草》)，来源于虎耳草科(Saxifragaceae)扯根菜属(Penthorum)植物赶黄草(Penthorum chinense Pursh.)的干燥地上部分。赶黄草是苗族民间治疗肝病的有效药物，苗族人世代习用，称之为“神仙草”；但由于苗医、苗药无文字记载，故其民间应用靠口耳相传继承至今。有文字可寻的关于赶黄草的记载最早见于明代《救荒本草》，名扯根菜，载其“味甘”，并对其植株特征进行了记载；《贵州民间药物》载其“味甘，性微温，无毒”，功效“消肿，利水，祛瘀，行气”；至2000年《全国中草药汇编》收录本药时按中药理论对其进行记载，具有清热解毒、退黄化湿，活血散瘀，利水消肿之功效，主治经闭、水肿、血崩、带下，跌打损伤等。现代多数研究均表明，赶黄草及其提取物可有效预防和治疗酒精性脂肪肝。

目前，单用扯根菜为原料制备的制剂有肝苏颗粒(如国药准字Z51020703、国药准字Z51020709)、肝苏胶囊(如国药准字Z20050062)、肝苏片(如国药准字Z20044427)、肝苏丸(如国药准字Z20060265)、肝苏糖浆(如国药准字Z20090437)、肝苏软胶囊(如国药准字Z20050681)等。其中，肝苏颗粒，制备方法为：取扯根菜1000g，切碎，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15～1.18(60～65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤三次，合并洗液与滤液，回收乙醇并浓缩成相对密度为1.30～1.32的稠膏，加适量蔗糖及淀粉，混匀，制颗粒，干燥，制成540g，即得。该颗粒可降酶，保肝，退黄，健脾。用于慢性活动性肝炎、乙型肝炎，也可用于急性病毒性肝炎。

目前对肝苏颗粒的质量检测方法中，主要有薄层和高效液相色谱法，其中，高效液相色谱中以槲皮素为对照品，以甲醇-0.2％磷酸溶液(55：45)为流动相，在370nm下进行检测，并要求其产品中1g颗粒含槲皮素及化合物以槲皮素计不少于0.3mg。然而，中药材和中药制剂中，成分复杂，其中某一种成分的含量高低不能够完全反映药材或制剂的品质，若建立中药指纹图谱，将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

发明内容

本发明的目的在于提供扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的HPLC指纹图谱检测方法。本发明的另一目的在于提供扯根菜药材的HPLC指纹图谱检测方法。

本发明提供了扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检的提取物或制剂，干燥后，甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：280±2nm

流动相：A相为乙腈，B相为0.1～0.5％v/v酸水溶液，其梯度程序如下：

进一步地，所述扯根菜单一药材制备的提取物的制备方法如下：

取扯根菜，切碎，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15～1.18(60～65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤三次，合并洗液与滤液，回收乙醇，即得提取物。

其中，所述扯根菜单一药材制备的制剂，其制剂中扯根菜的中间体提取物制备方法同上(例如肝苏颗粒)。

进一步地，所述制剂为肝苏颗粒、肝苏胶囊、肝苏片、肝苏丸、肝苏糖浆或肝苏软胶囊；优选为肝苏颗粒或肝苏胶囊。

进一步地，步骤(1)中，所述含水甲醇为20～80％v/v甲醇水溶液，优选为40～80％v/v甲醇水溶液，更优选为60％v/v甲醇水溶液。

其中，步骤(1)中，提取的方法选自回流、超声或浸渍。

进一步地，步骤(2)中，所述酸水溶液为甲酸、乙酸或磷酸的水溶液。

优选地，酸水溶液为甲酸。

进一步优选地，酸水溶液的浓度为0.1～0.4％v/v。

更优选地，酸水溶液的浓度为0.2％v/v。

进一步地，步骤(2)中，所述色谱柱的尺寸为4.6×250mm，5μm。

进一步地，步骤(2)中，流动相流速为0.8～1.2ml/min，优选使用0.8～1.0ml/min，更优选为1.0ml/min。

进一步地，步骤(2)中，检测柱温为25～30℃。

进一步地，将步骤(2)检测所得供试品指纹图谱与对照指纹图谱对比，相似度在0.9以上的待检制剂为合格的肝苏颗粒；其中，所述对照指纹图谱如图4所示。

本发明还提供了扯根菜药材的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，切碎，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15～1.18(60～65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤三次，合并洗液与滤液，回收乙醇，即得提取物；

(2)取步骤(1)所得提取物，干燥后，甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(3)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：280±2nm

流动相：A相为乙腈，B相为0.1～0.5％v/v酸水溶液，其梯度程序如下：

本发明检测方法，可以将单用扯根菜为原料制备的各种提取物或制剂中的各种有效成分进行有效分离，所得色谱图中色谱峰数量多，分离度良好，基线平稳，更适合于对各种提取物或制剂的质量检测。

附图说明

图1乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷HPLC色谱图

图2 60％甲醇HPLC色谱图

图3 10批肝苏颗粒HPLC-DAD色谱图

图4肝苏颗粒对照指纹图谱

图5对照指纹图谱与三批肝苏胶囊HPLC色谱图

图6 4个不同波长下肝苏颗粒的HPLC色谱图

图7肝苏颗粒120minHPLC色谱图(A:ELSD色谱图；B：DAD色谱图)

图8赶黄草浸膏在甲醇-水系统中的HPLC色谱图

图9赶黄草浸膏在乙腈-水系统中的HPLC色谱图

图10赶黄草浸膏在乙腈-0.2％甲酸水系统中的HPLC色谱图

图11赶黄草浸膏在乙腈-0.2％磷酸水中的HPLC色谱图

图12赶黄草浸膏在乙腈-0.2％乙酸水系统中的HPLC色谱图

图13赶黄草浸膏在乙腈-0.1％甲酸水系统中的HPLC色谱图

图14赶黄草浸膏在乙腈-0.4％甲酸水系统中的HPLC色谱图

图15赶黄草浸膏在254nm下的HPLC色谱图

图16赶黄草浸膏在280nm下的HPLC色谱图

图17赶黄草浸膏在365nm下的HPLC色谱图

图18赶黄草浸膏在25℃下的HPLC色谱图

图19赶黄草浸膏在30℃下的HPLC色谱图

图20赶黄草浸膏在35℃下的HPLC色谱图

图21赶黄草浸膏在0.8mL/min下的HPLC色谱图

图22赶黄草浸膏在1mL/min下的HPLC色谱图

图23赶黄草浸膏在1.2mL/min下的HPLC色谱图

具体实施方式

实施例1本发明HPLC指纹图谱检测方法的建立

1仪器与试药

1.1仪器

高效液相色谱仪：Agilent1200(包括：四元泵，脱气机，自动进样器，柱温箱，DAD二极管阵列紫外检测器)；

PH计：ORION MODEL828型；

电子天平：Sartorius CPA225D；

超声仪：BRANSON SB3200-T型。

1.2试剂

水：Milli-Q处理纯净水(Millipore,MA,USA)；乙腈：色谱纯(Merck,Darmstadt,Germany)；其它试剂均为分析纯。

1.3对照品

乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷为对照品，HPLC归一化法检查，纯度在98％以上。

1.4样品来源及批号

共收集10个不同批次的肝苏颗粒(四川古蔺肝苏药业有限公司)，以及3个不同批次的肝苏胶囊(四川宝光药业股份有限公司)，样品来源与批次见表1。用10个批次的肝苏颗粒建立对照指纹图谱，3个不同批次的肝苏胶囊与建立的对照指纹图谱进行比较。

表1样品来源以批号

2条件与方法

2.1色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18(4.6×250mm，5μm)；流动相:采用梯度洗脱，A相为乙腈，B相为0.2％甲酸水溶液；流速：1ml/min；运行时间：75min(后10min为起始溶剂平衡时间)；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：10μl；梯度洗脱程序见表2：

表2流动相梯度洗脱条件

2.2供试样品的制备

随机取各批次肝苏颗粒1袋(3g/袋)研细，取粉末1g，精密称定，置50ml锥形瓶中，分别精密加入20ml的60％甲醇溶液，称重，浸泡过夜，超声处理30min，再称重，用60％甲醇补足重量后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液备用。

2.3对照样品的制备

精密称取乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷对照品6.02mg，置于10mL容量瓶中，60％甲醇溶解并稀释至刻度。按上述色谱条件，精密吸取对照品溶液10μL进样，乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷保留时间为35.861min，所得的色谱图见图1。

3方法学考察

3.1空白试验

60％甲醇按上述色谱条件进样10μL，记录色谱图，结果见图2。

3.2精密度试验

取Gskl-1按上述供试品溶液制备方法制备样品，并按照上述色谱条件，连续进样5次。分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果各共有峰相对保留时间RSD小于0.66％，相对峰面积比值RSD小于1.89％，符合特定指纹图谱分析要求。结果见表3。

表3肝苏颗粒指纹图谱精密度试验

3.3重复性试验

精密称取Gskl-1各5份，按上述供试品溶液制备方法制备样品，并按其色谱条件进样分析。分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果各共有峰相对保留时间RSD小于0.84％，峰面积比值RSD小于2.53％，符合特定指纹图谱分析要求。结果见表4。

表4肝苏颗粒指纹图谱重复性试验

3.4稳定性试验

精密称Gskl-1按上述供试品溶液制备方法制备样品，按上述色谱条件，分别在0，4，8，12，24h进样分析。分别对共有峰的相对保留时间及峰面积比值进行考察，结果各共有峰相对保留时间RSD小于0.53％，峰面积比值RSD小于2.72％，表明供试品在24h内稳定，符合特定指纹图谱分析要求。结果见表5。

表5肝苏颗粒指纹图谱稳定性试验

4.实验结果

4.1肝苏颗粒指纹图谱的采集

按供试品溶液制备方法制备肝苏颗粒样品溶液，取肝苏颗粒样品溶液按照上述色谱条件依次进样，通过HPLC-DAD记录肝苏颗粒280nm色谱图，以《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》建立肝苏颗粒指纹图谱。10批肝苏颗粒色谱图见图3。

4.2共有指纹峰的确立

根据上述10批供试品HPLC色谱图所给出的相关参数，肝苏颗粒的所有成分在65min内全部出现。采用国家药典委员会编制颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版(2004A)》软件进行色谱峰的校正、匹配、生成药材的共有峰以及给出肝苏颗粒的对照指纹图谱，最终进行指纹图谱相似度计算。采用多点校正方法进行色谱峰的自动匹配肝苏颗粒指纹图谱，以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为0.20min，其对照指纹图谱见图4，10批肝苏颗粒HPLC指纹图谱相似度计算结果见表6.

在HPLC检测指纹图谱中，根据10批肝苏颗粒色谱峰匹配结果，共确定13个共有特征峰进行分析，其中9号峰为乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷，含量较高且比较稳定，将其作为参比峰，计算其它各峰的相对保留时间、相对峰面积。

表610批肝苏颗粒HPLC指纹图谱相似度计算结果

5肝苏胶囊与肝苏颗粒相似度比较

5.1样品测定

取三批不同批号的肝苏胶囊各10粒，将胶囊中药粉倒出混匀后，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，对3批不同批号的肝苏胶囊分别进行了测定，得到其各自的色谱图，结果见图5。从图5可以看出，本发明色谱条件亦可将以扯根菜为原料的另一成品制剂——肝苏胶囊的多数成分有效分离，各色谱峰分离度良好，基线平稳，这一结果表明，本发明HPLC指纹图谱检测技术，同样适用于单用扯根菜为原料的各种提取物或制剂的检测。

5.2肝苏颗粒与肝苏胶囊相似度比较

运用国家药典委员会制定的《中药指纹图谱相似度计算软件》B版，将10批肝苏颗粒HPLC图谱生成的对照指纹图谱导入，再将3批不同批次的肝苏胶囊HPLC图谱数据导入，计算得出肝苏颗粒与肝苏胶囊相似度及各批次之间相似度差异，结果见表7。

表7肝苏颗粒与肝苏胶囊相似度比较

从肝苏胶囊与肝苏颗粒的相似度结果可以看出，两者平均相似度在0.84左右，表明两者化学成分相似度较高，但还存在一定的差异。

6讨论

6.1检测波长的选择

比较了210nm，254nm，280nm，320nm4个波长下的色谱图，在280nm处色谱峰较多、分离度较好且基线平稳，因此选择检测波长为280nm，如图6。

6.2色谱采集时间的确定

取制备好的Gskl-1样品溶液，按2.1色谱条件进样，通过记录120min图谱，见图7，可以看到65min后再无色谱峰出现，加上溶剂平衡时间10min，从而确定指纹图谱的采集时间为75min。

6.3肝苏颗粒提取溶剂的选择

以肝苏颗粒中13个共有峰的峰面积的高低为标准，Gskl-1为研究对象，用超声提取法来考察不同浓度甲醇对肝苏颗粒中各主要成分的含量的影响，其13个共有峰峰面积结果见表8。

随机取Gskl-13袋(3g/袋)研细，取粉末1g，精密称定，置50m1锥形瓶中，分别精密加入20ml的甲醇、80％甲醇、60％甲醇、40％甲醇、20％甲醇溶液(水能将辅料溶解未考察)，称重，浸泡过夜，超声处理30min，再称重用提取溶剂补足重量后，取上清液过0.45μm微孔滤膜，取续滤液备用。

表8肝苏颗粒不同溶剂提取后13个共有峰峰峰面积结果(n＝3)

从结果可以看出，用60％甲醇提取肝苏颗粒的13个共有峰的峰面积相对其他溶剂均最大，且用60％甲醇溶解原料药浸膏时也能将其完全溶解，因此确定用60％甲醇为提取溶剂。

6.4流动相的选择

在流动相的选择中，考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2％磷酸、乙腈-0.2％乙酸、乙腈-0.2％甲酸、乙腈-0.1％甲酸、乙腈-0.4％甲酸。取批号为111136的赶黄草浸膏(提取方法同肝苏颗粒)，配制得到5mg/mL供试品溶液，分别在上述不同的流动相系统下进行HPLC分析测定。

结果：

(1)由图8、9可以看出,在甲醇-水系统下峰型和分离度不好，使用乙腈-水系统明显优于甲醇-水系统。

(2)由图9-12、表9可以看出，在流动相系统中加酸，可以明显提高多种成分的分离效果，且各图谱相似度较高(均大于0.99)，因此，本发明优选在流动相中加酸。

表9

同时，由图10-12可以看出，流动相中加入不同种类的酸后，分离效果均得到了提高，而其中又以甲酸效果最佳，因此，若为了进一步提高分离效果，本发明流动相中酸的种类优选使用甲酸。

(3)由表10、图9和图13-14可以看出，在不同甲酸浓度的流动相系统中，各浓度的分离效果均较好，因此，本发明可以使用0.1～0.5％甲酸水为水相。

表10

其中，又以含有0.2％甲酸的流动相系统各成分的分离更好，因此，为了更进一步提高分离效果，本发明选择甲酸浓度为0.2％。

6.5检测波长的选择

由图15-17可以看出，在280nm下，可得到的色谱峰较多，峰型较好。故选择280nm作为检测波长。

6.6柱温的选择

图18-20可知，实验中考察了25℃、30℃和35℃三种不同柱温对色谱分析的影响。发现25℃～30℃下色谱峰的分离较35℃好，因此，本发明可以选择柱温为25℃～30℃。

6.7流速的选择

实验中考察了0.8、1、1.2mL/min三种不同流速对HPLC色谱分析的影响，结果见图21～23、表11：

表11

由图谱和相似度可以看出，流速为0.8～1.2ml/min时，色谱相似度均较高，但其中以1mL/min时峰形较佳，因此本发明可以优选流速为1mL/min。

Claims (10)

1.扯根菜单一药材制备的提取物或制剂的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取待检的提取物或制剂，干燥后，甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：280±2nm

流动相：A相为乙腈，B相为0.1～0.5％v/v酸水溶液，其梯度程序如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述扯根菜单一药材制备的提取物的制备方法如下：

取扯根菜，切碎，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15～1.18(60～65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤三次，合并洗液与滤液，回收乙醇，即得提取物。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述制剂为肝苏颗粒、肝苏胶囊、肝苏片、肝苏丸、肝苏糖浆或肝苏软胶囊；优选为肝苏颗粒或肝苏胶囊。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述含水甲醇为20～80％v/v甲醇水溶液，优选为40～80％v/v甲醇水溶液，更优选为60％v/v甲醇水溶液。

5.根据权利要求1或4所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，提取的方法选自回流、超声或浸渍。

6.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述酸水溶液为甲酸、乙酸或磷酸的水溶液；优选地，酸水溶液为甲酸；进一步优选地，酸水溶液的浓度为0.1～0.4％v/v；更优选地，酸水溶液的浓度为0.2％v/v。

7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，所述色谱柱的尺寸为4.6×250mm，5μm；优选地，流动相流速为0.8～1.2ml/min，进一步优选使用0.8～1.0ml/min，更优选为1.0ml/min。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，检测柱温为25～30℃。

9.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于：将步骤(2)检测所得供试品指纹图谱与对照指纹图谱对比，相似度在0.9以上的待检制剂为合格的肝苏颗粒；其中，所述对照指纹图谱如图4所示。

10.扯根菜药材的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，切碎，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩成相对密度为1.15～1.18(60～65℃)的清膏，冷却，加乙醇使含醇量达60％，搅拌，静置，滤过，沉淀用60％乙醇洗涤三次，合并洗液与滤液，回收乙醇，即得提取物；

(2)取步骤(1)所得提取物，干燥后，甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(3)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：280±2nm

流动相：A相为乙腈，B相为0.1～0.5％v/v酸水溶液，其梯度程序如下：