CN102603907B - 肿节风多糖及其制法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿节风多糖的制备方法及其抗炎和免疫调节活性。属于医药领域，国际专利号分类为C08B 37/60。一种肿节风多糖粗品和肿节风多糖精品，它是由植物肿节风全草粉碎后过筛，加入乙醇回流脱脂，再经热水提取，乙醇沉淀，4℃放置，离心去上清，沉淀用乙醇洗涤三次，干燥后得肿节风水提物。肿节风水提物溶解于水，加入D301-G大孔树脂脱色，除蛋白。脱色液经浓缩，乙醇沉淀，离心去上清，沉淀用乙醇洗涤3次，干燥后得肿节风多糖粗品。肿节风多糖粗品经离子交换柱层析和分子筛凝胶柱层析纯化后获得肿节风多糖精品。它们具有抗炎活性和免疫调节活性。

Description

肿节风多糖及其制法和用途

技术领域

本发明涉及一种肿节风多糖的制备方法及其抗炎和免疫调节活性，用于治疗与炎症相关的疾病或作为免疫调节剂。属于医药领域，国际专利号分类为C08B 37/60。

背景技术

肿节风为金粟兰科植物草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai的干燥全草。金粟兰科植物全世界有5属，约70余种，分布于热带或亚热带；我国有3属，约18种，分别为：丝穗金粟兰属、及己属和草珊瑚属。草珊瑚属植物我国有两种，分别为草珊瑚Sarcandra glabra(Thunb.)Nakai和海南草珊瑚Sarcandra hainanensis。主要分布在四川、云南、贵州、安徽、福建、江西等地，分布广泛且资源丰富，入药历史悠久，味苦、辛、性平，归心、肝经，具有清热凉血，活血消斑，祛风通络的功效，用于血热紫斑、紫癜、风湿痹痛，跌打损伤的治疗。现代研究表明肿节风具有抗肿瘤、抗菌消炎、抗血小板减少等作用，在医药领域应用广泛，为2010年版《中华人民共和国药典》一部收载。肿节风分布广泛，资源的蕴藏量较大，并且易于栽培，有广阔的开发前景，目前被广泛应用于药品、保健品、食品、化妆品和烟叶等领域中，肿节风制剂的销售总产值已超过100亿人民币以上。全国有多家药厂以肿节风为原料生产相关制剂，包括肿节风浸膏片、清热消炎宁胶囊、血康口服液、肿节风注射液及复方草珊瑚含片；已开发的保健产品有草珊瑚牙膏、草珊瑚口香糖、草珊瑚保健茶、九节茶香口胶等。肿节风所含化学成分众多，如倍半萜、香豆素、黄酮、皂苷类化合物，具有多种药理作用及临床用途。但已经发现的小分子化学成分很难解释肿节风的所有临床功效，并且其药效物质基础还不是非常明确。近些年，虽然一些学者也开始关注其中的大分子类物质，如多糖类成分的相关研究，但是，也仅限于提取分离肿节风水溶性粗多糖。在相关报道中，经提取分离得到的水溶性粗多糖中糖含量偏低，即使用于药理活性研究，也难以阐明肿节风多糖的药理作用。本发明通过解决肿节风多糖制备的技术性难题，获得了含量较高的肿节风多糖，在此基础上，又进一步研究了肿节风多糖的抗炎活性和免疫调节活性，证明肿节风多糖可以应用于炎症和免疫相关疾病的治疗。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种从肿节风水提物中获得肿节风多糖粗品的方法以及从肿节风多糖粗品中分离纯化得到肿节风多糖精品的方法。

所述的获得肿节风多糖粗品的方法，其特征是，将肿节风全草干燥品粉碎后加入乙醇，回流脱脂，将脱脂后的原料加入去离子水，加热提取，将提取液浓缩，加入乙醇沉淀，真空干燥后得到本发明所述的肿节风水提物。将肿节风水提物溶解于去离子水，加入大孔树脂，去除溶液中的色素和蛋白质，保留脱色液，将脱色液过滤，然后浓缩，加入乙醇沉淀出肿节风多糖，真空干燥后得到本发明的肿节风多糖粗品(SGP)，其多糖含量占总固体重量的60％以上。

所述的分离纯化得到肿节风多糖精品的方法，其特征是，是将上述方法获得的肿节风多糖粗品(SGP)溶解于去离子水，用离子交换柱进行分离纯化，以去离子水洗脱，用硫酸苯酚比色法跟踪检测，收集均一组分，再采用分子筛柱层析，以去离子水洗脱，用硫酸苯酚比色法跟踪检测，收集肿节风多糖均一组分，冷冻干燥，即得到本发明所述的肿节风多糖精品(SGP-1)，其多糖含量占总固体的90％以上。

所述方法中，加热提取是在热水浴中加热，水浴温度在70-90℃。

所述方法中，加热提取时间为2-6小时。

所述方法中，提取所用的液料比为10-30。

所述方法中，大孔树脂为阴离子交换树脂。

所述方法中，大孔树脂脱色时间为1-3小时。

所述方法中，离子交换树脂为二乙胺基乙基纤维素(DEAE-52)。

所述方法中，分子筛凝胶填料为Sephacryl S-400。

本发明目的之二是提供一种结构明确，质量可控的肿节风多糖在制备抗炎药物或免疫调节剂中的应用。

所述的本发明的多糖在制备抗炎药物或免疫调节剂中的应用，其特征是，将上述方法获得的肿节风多糖粗品(SGP)和上述方法制备的肿节风多糖精品(SGP-1)应用于二甲苯造模的小鼠急性炎症耳肿胀模型和5-氟尿嘧啶诱导的仓鼠口腔黏膜炎模型均具有一定的治疗效果，因此可应用于制备抗炎药物。并且肿节风多糖精品(SGP-1)具有双向调节免疫因子NO分泌的作用，因此可用于制备免疫调节剂。

所述方法中，肿节风多糖粗品(SGP)多糖含量在60％以上。

所述方法中，肿节风多糖精品(SGP-1)多糖含量在90％以上，分子量为10KDa左右。

所述方法中，肿节风多糖精品(SGP-1)含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖。主要糖苷键键型有β(1→2)甘露糖、α(1→3)半乳糖和α(1→4)葡萄糖。

附图说明

图1为肿节风多糖精品(SGP-1)红外光谱。

图2为肿节风多糖精品(SGP-1)紫外-可见扫描光谱。

图3为肿节风多糖粗品(SGP)和肿节风多糖精品(SGP-1)抑制5-氟尿嘧啶诱导的仓鼠口腔黏膜炎的作用。

图4为肿节风多糖精品(SGP-1)抑制脂多糖LPS刺激巨噬细胞分泌炎症因子NO的作用。

图5为肿节风多糖精品(SGP-1)刺激巨噬细胞分泌NO的作用。

在图1中：SGP-1在3397cm^-1附近的峰归属于糖环上OH^-的伸缩振动，2928cm^-1附近的峰归属于糖环上C-H伸缩振动。1648cm^-1处的峰是由于结合水产生的。1155、1079和1026处的峰归属于糖环上C-O的振动。1350-1450处的峰归属于糖环上CH₂和COH的信号。892cm^-1处有吸收峰证明SGP-1含有β-糖苷键。

在图2中：通过对SGP-1进行紫外-可见(200-700nm)全波长扫描，证明SGP-1纯度较高，基本无蛋白质、核酸和其它杂质。

在图3中：肿节风多糖粗品(SGP)在5g/Kg和1g/Kg、肿节风多糖精品(SGP-1)在5g/Kg和1g/Kg浓度下均具有缓解5-氟尿嘧啶诱导的仓鼠口腔黏膜炎的作用。

在图4中：SGP-1在400(μg/ml)浓度下，对脂多糖LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症因子NO有显著抑制作用，证明SGP-1具有一定程度的抗炎活性。

在图5中：SGP-1在100、200、400和800(μg/ml)浓度下与空白对照相比能显著诱导巨噬细胞分泌NO，证明SGP-1具有免疫调节作用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作详细的说明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。说明书及实施例中采用的药材、填料、化学试剂等，如未特殊说明均按常规实验条件进行操作，或按供应商提供的说明进行操作。

实施例1：肿节风多糖粗品的制备方法一

称取粉碎后过80目筛的肿节风全草药材100g于提取容器中，加入5倍体积乙醇，回流脱脂3小时，4层纱布除去上清，残渣补足去离子水至1000ml，70℃水浴提取1小时，间歇搅拌。收集提取液后，残渣再补足去离子水至1000ml，70℃水浴提取1小时，间歇搅拌。纱布滤去残渣，合并提取液浓缩至20ml，4000r.p.m离心去沉淀，加入1倍乙醇沉淀，4℃放置24小时，离心除去上清液，以无水乙醇洗涤3次，真空干燥得本发明产物肿节风水提物。取肿节风水提物2g于容器中，充分溶解于40ml去离子水，加入D301-G大孔树脂脱色和除蛋白质，间或搅拌1小时，溶液过滤后浓缩至10ml，加入10ml无水乙醇沉淀，4℃放置24小时。离心除去上清。以无水乙醇洗涤3次，真空干燥得到肿节风多糖粗品(代号：SGP)。

实施例2：肿节风多糖粗品的制备方法二

称取粉碎后过120目筛的肿节风全草药材100g于提取容器中，加入20倍体积乙醇，回流脱脂3小时，4层纱布除去上清，残渣补足去离子水至3000ml，90℃水浴提取3小时。间歇搅拌，收集提取液后，残渣再补足去离子水至3000ml，90℃水浴提取3小时，间歇搅拌。纱布滤去残渣，合并提取液浓缩至20ml，4000r.p.m离心去沉淀，加入6倍乙醇沉淀，4℃放置24小时，离心除去上清液，以无水乙醇洗涤3次，真空干燥得本发明产物肿节风水提物。取肿节风水提物2g于容器中，充分溶解于100ml去离子水，加入D301-G大孔树脂脱色和除蛋白质，间或搅拌3小时，溶液过滤后浓缩至10ml，加入60ml无水乙醇沉淀，4℃放置24小时。离心除去上清。以无水乙醇洗涤3次，真空干燥得到肿节风多糖粗品(代号：SGP)。

实施例3：均一肿节风多糖的制备

取肿节风多糖粗品(SGP)200mg，充分溶解于去离子水，上已平衡好的DEAE-52离子交换柱，规格为(2.6×30cm)，平衡液为去离子水，上样体积为10ml，先以300ml去离子水洗脱，再以0-2mol/L的NaCl溶液洗脱，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分。离子交换柱分离所得肿节风多糖水洗组分上Sephacryl S-400分子筛柱层析，以去离子水洗脱。柱规格为(1.0×100cm)，分部收集，硫酸苯酚法跟踪检测，合并相同组分。冷冻干燥，得到肿节风多糖精品(代号：SGP-1)。

实施例4：理化性质测定

1.多糖含量测定

采用硫酸苯酚法，在490nm处，分光光度法测定总多糖含量，以葡萄糖(C₆H₁₂O₆)计肿节风多糖粗品(SGP)多糖含量为64％，肿节风多糖精品(SGP-1)多糖含量为96％。

2.单糖组成分析

薄层色谱：称取样品10mg，以2mol/L三氟乙酸水解，甲醇洗涤后蒸干，以去离子水溶解后点样，以正丁醇-丙酮-水(4∶3∶1)为展开剂，以标准单糖为对照，苯胺-邻苯二钾酸为显色剂，结果证明其含有葡萄糖、半乳糖和甘露糖。

气相色谱法：多糖水解物及标准单糖用硼氢化钠还原，加入甲醇反复洗涤，蒸干，加入乙酸酐-吡啶(1∶1)于100℃水浴乙酰化1小时，使各种单糖转变为乙酰化衍生物，再溶于氯仿进行气相色谱分析。气相色谱柱温220℃，检测器温度300℃，载气为N₂，流速25mL/min；进样量：1μL。结果见表1：SGP-1显示为葡萄糖、半乳糖和甘露糖，比例约为8.38∶3.31∶1。

表1肿节风多糖SGP-1单糖组成气相色谱分析

3.红外光谱分析

样品1mg，KBr压片，400-4000^-1区间扫描。如图1所示，SGP-1在892cm^-1处有吸收峰证明SGP-1含有β-糖苷键。

4.紫外光谱分析

样品以蒸馏水溶解，200-700nm区间扫描。如图2所示，SGP-1在260、280处无吸收，说明其不含蛋白质和核酸。

5.核磁波谱分析

取肿节风多糖精品(SGP-1)30mg，溶于氘代水(D₂O)，60℃于Varian500兆赫核磁共振波谱仪上进行分析。

从¹H-NMR图谱可以看出SGP-1的质子信号在5.3391、4.9761和4.7128ppm，¹³C-NMR中SGP-1在102.181、101.999和106.723ppm的共振信号可进一步说明SGP-1糖苷键既有α-构型又有β-构型。另外，在¹³C-NMR的δ79.412、80.011和78.807；75.300、75.457和75.104；76.817、77.394、和75.690；73.611、74.148和72.347；64.526、63.134和62.751ppm与文献比对分别为葡萄糖、半乳糖和甘露糖的C-2，C-3，C-4，C5及C6的信号，并且106.723归属于β(1→2)甘露糖，80.011归属于α(1→3)半乳糖，79.412归属于α(1→4)葡萄糖。

6.分子量测定

高效液相色谱法：以Shodex SUGAR KS-805(8mmID×300mm)为高效液相色谱柱，采用示差折光检测器。色谱条件为：H₂O为流动相，流速1ml/min，样品浓度为1mg/ml每次进样20μl，检测时间20min。依次以标准分子量多糖Dextran T-5、T-10、T-20、T40、T70绘制保留时间与各分子量对数关系标准曲线，再测样品的保留时间，根据标准曲线求得样品的分子量。结果表明SGP-1的分子量为10.6KDa。

实施例5：

1.口服肿节风多糖粗品(SGP)和肿节风多糖精品(SGP-1)对二甲苯诱导的小鼠急性炎症耳肿胀的抑制作用

健康BALB/c小鼠30只，随机分为6组，即模型组、阳性对照吲哚美欣组，肿节风多糖粗品(SGP)高剂量组和低剂量组，肿节风多糖精品(SGP-1)高剂量组和低剂量组。模型组灌胃生理盐水(10ml/kg)，吲哚美欣组灌胃0.01g/kg，肿节风多糖粗品(SGP)高剂量组灌胃5g/kg，肿节风多糖粗品(SGP)高剂量灌胃1g/kg，肿节风多糖精品(SGP-1)高剂量组灌胃5g/kg，肿节风多糖精品(SGP-1)低剂量组灌胃1g/kg，连续给药7d，第7天给药物后1h，于5组小鼠右耳前后两面均匀涂抹二甲苯，4h后脱椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下两耳，用直径9mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称重，计算肿胀度和抑制率，肿胀度以每只鼠左右耳片重量之差来表示：

结果表明：与空白对照相比，肿节风多糖粗品(SGP)和肿节风多糖精品(SGP-1)的高、低剂量组均有一定程度的抑制二甲苯所致小鼠耳急性炎症肿胀的作用，结果见表2。

表2.肿节风多糖对二甲苯诱导的鼠耳急性炎症肿胀的抑制作用(X±SD)

^**P＜0.01 ^*P＜0.05

2.肿节风多糖粗品(SGP)和肿节风多糖精品(SGP-1)对5-氟尿嘧啶造模的大鼠口腔黏膜炎的抑制作用：

健康的仓鼠30只，第0天、第5天和第10天腹腔注射60mg/kg的5氟尿嘧啶(5-FU)，一天三次。为了刺激溃疡形成，第1天和第2天，将仓鼠麻醉后，将其左脸颊外翻，用18号针在脸颊内侧轻刮造成溃疡面。模型组涂抹生理盐水(10ml/kg)，肿节风多糖粗品(SGP)高剂量组涂抹5g/kg，肿节风多糖粗品(SGP)高剂量涂抹1g/kg，肿节风多糖涂抹(SGP-1)高剂量组涂抹5g/kg，肿节风多糖精品(SGP-1)低剂量组涂抹1g/kg，连续给药9天，给药后每天检测大鼠体重，观察溃疡面是否出现红斑、充血，分别于3、6和9天测量溃疡部位面积。如图3所示，肿节风多糖粗品(SGP)高、低剂量组，肿节风多糖精品(SGP-1)高、低剂量组给药3、6和9天后溃疡面积与空白对照相比均有一定程度的减小，说明肿节风多糖具有抗炎活性。

3.肿节风多糖精品SGP-1对脂多糖LPS诱导的巨噬细胞分泌炎症因子NO的抑制作用

向小鼠腹腔注入预冷的PBS液5ml，再将其颈椎脱臼处死，吸出腹腔液，1000r.p.m离心10min，弃上清，洗涤细胞两次。用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液配成1×10⁶/ml的细胞悬液，加入24孔培养板中，每孔1ml，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养2h，吸出上层培养液，用PBS液洗涤两次去除未贴壁细胞，即得单层巨噬细胞。向上述方法获得的单层巨噬细胞中加入阴离子脂多糖LPS(10μg/ml)和不同浓度(100、200和400μg/ml)的SGP-1，以RPMI 1640为空白，LPS为对照，培养24h后，采用Griess法测定细胞培养上清液中的间接反映巨噬细胞NO的生成量。取培养上清1ml，加入等量的Griess试剂(1％对氨基苯磺酸，0.1％N-1-萘乙二胺盐酸盐，2.5％磷酸)，室温反应10min，在波长540nm测定吸光度。如图4所示，SGP-1在400μg/mL浓度下能显著抑制LPS刺激巨噬细胞分泌炎症因子NO(P＜0.05)。

4.肿节风多糖精品SGP-1诱导巨噬细胞分泌NO作用

按实例5中3的方法提取，培养小鼠巨噬细胞，向上述方法获得的单层巨噬细胞中加入不同浓度(100、200、400和800μg/ml)SGP-1，以RPMI 1640为空白，LPS为对照，培养24h后，采用Griess法测定细胞培养上清液中的

间接反映巨噬细胞NO的生成量。取培养上清1ml，加入等量的Griess试剂(1％对氨基苯磺酸，0.1％N-1-萘乙二胺盐酸盐，2.5％磷酸)，室温反应10min，在波长540nm测定吸光度。如图5所示，SGP-1在各浓度条件下均能显著刺激巨噬细胞分泌NO，并且具有浓度依赖性。

Claims (3)

1.肿节风多糖精品SGP-1，其特征在于其多糖含量在90％以上，数均分子量10KDa；单糖组成为葡萄糖、半乳糖和甘露糖；糖苷键键型有β(1→2)甘露糖、α(1→3)半乳糖和α(1→4)葡萄糖。

2.根据权利要求1所述的肿节风多糖精品SGP-1的制备方法，其特征是由下列步骤组成，

步骤一：取肿节风全草，粉碎后过80-120目筛得原料，5-20倍乙醇回流脱脂，残渣加入10-30倍重量的水，70-90℃提取1-3小时，间歇搅拌，4000r.p.m离心去沉淀，得提取液，离心后残渣再加10-30倍肿节风原料重量的水，70-90℃再提取1-3小时，离心除去残渣，合并两次提取的上清液，浓缩后离心，向离心上清液加入1-6倍体积的乙醇，4℃放置24小时，离心去上清液，以乙醇洗涤沉淀三次，真空干燥；

步骤二：取干燥后的肿节风水提物溶于20-50倍重量的水，加入D301-G大孔树脂，室温下间歇搅拌1-3小时，浓缩后4000r.p.m离心去沉淀，向上清液中加入1-6倍体积的无水乙醇，4℃放置24小时，离心除去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀三次，干燥后得本发明的肿节风多糖粗品SGP；

步骤三：所述的肿节风多糖粗品SGP溶解于水，上DEAE-52阴离子交换柱，去离子水洗脱，以硫酸苯酚法检测，收集第一洗脱峰，浓缩后经4倍乙醇沉淀，4℃放置，离心去上清，以无水乙醇洗涤三次，真空干燥；

步骤四：将真空干燥后的样品溶于去离子水，上已平衡好的Sephacryl S-400分子筛凝胶柱，用去离子水洗脱，分部收集，以硫酸苯酚法检测，收集第二洗脱峰，浓缩后经冻干制得本发明的肿节风多糖精品SGP-1。

3.根据权利要求1所述的肿节风多糖精品SGP-1在制备抗炎和免疫调节药物中的应用。

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