CN108152391A - 一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：用干血斑法对样品进行前处理，用高效液相色谱/质谱联用分析法进行检测。本发明不需要大量采血、侵袭性较小，不需要离心分离血液、操作时间短，受艾滋病毒、乙型和丙型肝炎病毒等血源性传播病毒的干扰小、检出限低，并且干血斑允许样品在室温下稳定运输和储存，便于在取样地以外的地点或在其他时间进行复检。

Description

一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法
技术领域
本发明关于生物检测技术领域，尤其涉及一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法。
背景技术
百草枯是一种对人类和动物均有剧毒的化合物，是人类急性中毒死亡率最高的除草剂，百草枯中毒导致高发病率和死亡率，且无特效药，口服中毒死亡率可以达到90％以上。随着百草枯等除草剂中毒病例的增多，该类毒物的定性、定量检测具有重要意义。可靠且高效的样品前处理方法是整个检测过程的首要环节，同时也是耗时最多的部分，占整个检测过程大约80％的时间。目前用于百草枯中毒血液样品预处理的方法主要为蛋白沉淀法、液液萃取和固相萃取(Solid-Phase Extraction，SPE)法等，然而这些预处理方法因血液基质的复杂性和样品的难保存性存在所需样本量大、操作繁复、回收率低、操作时间长、检出限(limit of determination，LOD)高等缺陷，当应用于法医毒物类案件鉴定时，现有方法需要对样品进行冷藏运输和储存，且易受其他血源性传播病毒的干扰。因此，选择高效、简单的样本制备方法和前处理过程，从而高效且精确地对血液中百草枯、敌草快等除草剂类药物进行定性和定量势在必行。
发明内容
针对现有技术中对百草枯中毒血液样品的预处理方法所需样本量大、操作繁复、回收率低、操作时间长、检出限高的技术问题，本发明提供了一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，用干血斑法对样品进行前处理后再进行检测。
相对于现有技术而言，本发明使用了干血斑(dried blood spot，DBS)法，不需要大量采血、侵袭性较小，不需要离心分离血液、操作时间短，受艾滋病毒、乙型和丙型肝炎病毒等血源性传播病毒的干扰小、检出限低，并且干血斑允许样品在室温下稳定运输和储存，便于在取样地以外的地点或在其他时间进行复检。
附图说明
图1为百草枯多反应监测色谱图；
图2为内标乙基百草枯多反应监测色谱图；
图3为百草枯二级质谱图；
图4为内标乙基百草枯二级质谱图；
图5为百草枯标准曲线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，用干血斑法对样品进行前处理后再进行检测。
相对于现有技术而言，本发明不需要大量采血、侵袭性较小，不需要离心分离血液、操作时间短，受其他血液性传播病毒的干扰小、检出限低，并且干血斑允许样品在室温下稳定运输和储存，便于在取样地以外的地点或在其他时间进行复检。
进一步地，本发明还提供基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法的步骤：
步骤a、将待测血液制成干血斑；
步骤b、定量采取步骤a所得干血斑，提供内标物，将所述干血斑和所述内标物溶解后得待测溶液；
步骤c、用高效液相色谱/质谱联用分析法对步骤b所述待测溶液进行检测，获取内标物和干血斑中百枯草的高效液相色谱/质谱联用的检测数据，计算干血斑中百枯草的含量。
以上操作步骤简单，易于操作，检测不受采集地点和时间的影响，尤其在法医毒物类案件鉴定中有较高的应用价值。
具体的，上述步骤a中，所述制成干血斑的步骤为：取待测血液滴于采血卡上，待血液完全渗透后，置于1000～1200W微波干燥4～6min，密封包装后于室温保存。待测血液制成干血斑后，在室温下可稳定长期保存，可以在其他地点、时间进行待测血液的复检。
进一步优选的，所述待测血液的用量为90～110μL，样本量及采血量少，使采血过程更易进行，临床患者更易接受；使送检样本量大大减少，更加符合法医微量物证检测的需求。
上述步骤b中，所述内标物为乙基百草枯。水溶性的百草枯标准品以及待测样品经过复杂的前处理过程后，其定量的精准程度会受到一定干扰，因此需要具备与其分子质量较接近的内标物，以提高定量结果的准确度。乙基百草枯是百草枯的相似物，与百草枯化学性质相似，分子质量、出峰时间和峰面积接近，是检测血液样品中百草枯含量的合适内标物。
上述步骤c中，所述高效液相色谱/质谱联用分析法中，高效液相色谱分析的色谱柱为C18色谱柱，内标为乙基百草枯，流动相为乙酸铵甲酸缓冲液与乙腈的混合溶液，混合体积比为所述乙酸铵甲酸缓冲液：所述乙腈＝18～19:1。优选的色谱柱、内标以及流动相适合百草枯的检测，具有较高的灵敏度和准确性、重现性。优选的乙酸铵甲酸缓冲液与乙腈的体积比可以使百草枯及内标在合适的时间出峰，分离效果佳，便于比较观察。
进一步优选的，所述乙酸铵甲酸缓冲液与乙腈的混合溶液，混合体积比为所述乙酸铵甲酸缓冲液：所述乙腈＝19:1。优选的乙酸铵甲酸缓冲液与乙腈的体积比可以使百草枯及内标有更佳的出峰时间和分离效果。
进一步优选的，所述乙酸铵甲酸缓冲液中，乙酸铵的含量为18～22mmol/L，甲酸的体积百分浓度为0.08％～0.12％，所述乙酸铵甲酸缓冲液的pH＝3.5～4.5。优选的缓冲液浓度和pH可以取得较好的洗脱效果，获得较好的出峰时间、峰形和分离度，减少拖尾，提高检测的准确度。
进一步优选的，所述乙酸铵甲酸缓冲液中，乙酸铵的含量为20mmol/L，甲酸的体积百分浓度为0.1％，所述乙酸铵甲酸缓冲液的pH＝3.8～4.2。优选的缓冲液浓度和pH可以取得更好的洗脱效果，获得更好的出峰时间、峰形和分离度，减少拖尾，提高检测的准确度。
进一步优选的，所述高效液相色谱/质谱联用分析法中，质谱分析的测定模式为多反应离子监测模式，具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化高通量的优点，可以获得更准确的检测结果。
为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
本发明实施例提供了一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，具体如下：
1、干血斑样本的制备：取100μL全血滴于 FTA采血卡(美国Whatman公司)上，待血液完全渗透后，置于1000～1200W微波干燥4～6min，密封包装后于室温保存。
2、样本前处理：使用8mm打孔器对制备好的 FTA采血卡进行打孔，将血点至于2mL离心管中，加入200μL流动相和5μl 4μg/mL的内标乙基百草枯后立即超声10分钟，再于4℃条件下以12000r/min离心5min，取上清液经0.2μm滤膜过滤后待检。
3、标准曲线的制备：分别在1mL空白血中加入5μL 0.2μg/mL–200μg/mL的百草枯标准溶液以制备系列浓度(1μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL、0.005μg/mL、0.002μg/mL、0.001μg/mL)的标准添加血液样品。将上述标准添加血液样品按1中所述的方法制备干血斑样本，并按2中所述方法进行样本前处理后待检。
4、高分辨液相色谱/质谱联用分析：Thermo scientific Q EXACTIVE FOCUS型高分辨液相色谱/质谱联用仪(美国Thermofisher公司)；色谱柱：Thermo scientificHypersil Gold C18色谱柱(100×2.1mm,1.9μm)；柱温：22℃；流动相：20mmol/L乙酸铵0.1％甲酸缓冲液(pH＝4)：乙腈＝95％：5％；洗脱2分钟，流速：200μl/min，进样量：10μL；离子源：电喷雾电离源(ESI)；测定模式：多反应离子监测(SIM-dd-MS2)模式扫描。源喷射电压3200V；雾化温度320℃；辅助气体加热器温度300℃，碰撞能38V；一级分辨率35000；二级分辨率17500。
5、方法学验证结果
5.1、高分辨液相色谱/质谱联用分析：如表1、图1～图4所示，百草枯和内标乙基百草枯的色谱保留时间分别为1.04min和1.12min，保留时间接近；母离子分别为：185.10762和214.14658，二级碎片离子分别为：171.09187和185.10759。
表1百草枯和内标乙基百草枯色谱及质谱参数
由以上结果可见，该方法条件适合进行干血斑样品中百草枯的定性、定量检测。
5.2、线性范围及检出限：实验结果如图5所示，该方法检测百草枯在1ng/ml-1000ng/ml范围内线性关系良好(Y＝0.002X+0.012，R2＝0.9996)，检出限为0.5ng/ml。
表2百草枯校准曲线(内标法)结果
5.3、精密度：应用上述方法，通过标准曲线测定三种不同浓度(2ng/ml、10ng/ml、500ng/ml)加标血液中百草枯的浓度，来确定日内(n＝6)和日间(n＝3)精密度。根据下式计算变异系数(Coefficient of Variation，CV)：变异系数CV(％)＝σ/μ×100。其中σ是标准偏差，μ是平均浓度。结果如表2所示。
表3精密度测定结果
5.4、基质效应(Matrix Effect)：配制2组标准曲线。第1组用有机溶剂配制成含系列浓度待测组分和内标的标准曲线，第2组标准曲线是将不同来源或不同品种的的空白样品经提取后加入与第1组相同系列浓度的待测组分和内标后制成的标准曲线。比较2组标准曲线的斜率，以确定基质效应。结果显示，两组标准曲线的校正方程分别为：Y＝83310.70X和Y＝75409.50X，其斜率分别为：83310.70和75409.50，相对标准偏差为7.04％，说明不存在基质效应的影响。
6、样本检测
采用基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法对12例送检样本进行了检测，并采用常规基于蛋白沉淀法的百草枯定性定量检测方法对上述样本的检测结果进行对比。结果显示干血斑法和蛋白沉淀法所检测的结果具有良好的相关性，且干血斑法的灵敏度更高。
表4干血斑法和蛋白沉淀法样本检测结果对比
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：用干血斑法对样品进行前处理，用高效液相色谱/质谱联用分析法进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括以下步骤：
步骤a、将待测血液制成干血斑；
步骤b、定量采取步骤a所得干血斑，提供内标物，将所述干血斑和所述内标物溶解后得待测溶液；
步骤c、用高效液相色谱/质谱联用分析法对步骤b所述待测溶液进行检测，获取内标物和干血斑中百枯草的高效液相色谱/质谱联用的检测数据，计算干血斑中百枯草的含量。
3.根据权利要求2所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤b中所述内标物为乙基百草枯。
4.根据权利要求2所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤a中所述制成干血斑的步骤为：取待测血液滴于采血卡上，待血液完全渗透后，置于1000～1200W微波干燥4～6min，密封包装后于室温保存。
5.根据权利要求2所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤c中所述高效液相色谱/质谱联用分析法中，高效液相色谱分析的色谱柱为C18色谱柱，流动相为乙酸铵甲酸缓冲液与乙腈的混合溶液，混合体积比为所述乙酸铵甲酸缓冲液：所述乙腈＝18～19:1。
6.根据权利要求5所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述乙酸铵甲酸缓冲液中，乙酸铵的浓度为18～22mmol/L，甲酸的体积百分浓度为0.08％～0.12％，所述乙酸铵甲酸缓冲液的pH＝3.5～4.5。
7.根据权利要求6所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述乙酸铵甲酸缓冲液中，乙酸铵的含量为20mmol/L，甲酸的体积百分浓度为0.1％，所述乙酸铵甲酸缓冲液的pH＝3.8～4.2。
8.根据权利要求5所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述乙酸铵甲酸缓冲液与乙腈的混合溶液，混合体积比为所述乙酸铵甲酸缓冲液：所述乙腈＝19:1。
9.根据权利要求2所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤c中所述高效液相色谱/质谱联用分析法中，质谱分析的测定模式为多反应离子监测模式。
10.根据权利要求2所述的基于干血斑样本的百草枯定性定量检测方法，其特征在于：所述步骤a中所述待测血液的用量为90～110μL。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110895271A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 华质泰科生物技术（北京）有限公司 一种快速检测生物基质样品中百草枯的方法
CN113686998A (zh) * 2021-09-28 2021-11-23 江苏晗睿达精准医学科技有限公司 一种lc-ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101398414A (zh) * 2008-10-15 2009-04-01 上海市公安局刑事侦查总队 液相色谱-质谱同时对242种化合物的定性筛查方法
CN102288696A (zh) * 2011-07-05 2011-12-21 河南科技大学 一种测定百草枯血药浓度的方法
CN202330105U (zh) * 2011-09-30 2012-07-11 范婥民 一种干血斑样品制备器件
CN102866038A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 广东凯普生物科技股份有限公司 血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑dna提取方法
CN204613163U (zh) * 2015-03-18 2015-09-02 杭州量康科技有限公司 用于检测干血样本的系统
CN105067548A (zh) * 2015-08-01 2015-11-18 陕西博世康医药科技有限公司 一种快速定量检测病人血液中百草枯浓度的方法
CN106908554A (zh) * 2017-03-24 2017-06-30 北京爱普益医学检验中心有限公司 一种干血斑中维生素d含量的检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101398414A (zh) * 2008-10-15 2009-04-01 上海市公安局刑事侦查总队 液相色谱-质谱同时对242种化合物的定性筛查方法
CN102288696A (zh) * 2011-07-05 2011-12-21 河南科技大学 一种测定百草枯血药浓度的方法
CN202330105U (zh) * 2011-09-30 2012-07-11 范婥民 一种干血斑样品制备器件
CN102866038A (zh) * 2012-09-26 2013-01-09 广东凯普生物科技股份有限公司 血斑标本采集和处理方法及其采集卡干血斑dna提取方法
CN204613163U (zh) * 2015-03-18 2015-09-02 杭州量康科技有限公司 用于检测干血样本的系统
CN105067548A (zh) * 2015-08-01 2015-11-18 陕西博世康医药科技有限公司 一种快速定量检测病人血液中百草枯浓度的方法
CN106908554A (zh) * 2017-03-24 2017-06-30 北京爱普益医学检验中心有限公司 一种干血斑中维生素d含量的检测方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BOZEN A WINNIK 等: "Quantification of Paraquat, MPTP, and MPP +in brain tissue using microwave-assisted solvent extraction (MASE)and high-performance liquid chromatography–mass spectrometry", 《ANAL BIOANAL CHEM》 *
向平 等: "法医毒物学的发展与挑战", 《中国司法鉴定》 *
岳晓静: "HPLC-MS/MS检测血浆百草枯浓度的方法建立与临床应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110895271A (zh) * 2018-09-13 2020-03-20 华质泰科生物技术（北京）有限公司 一种快速检测生物基质样品中百草枯的方法
CN113686998A (zh) * 2021-09-28 2021-11-23 江苏晗睿达精准医学科技有限公司 一种lc-ms/ms技术测定干血斑中氧化三甲胺的方法

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