CN107356694A - 一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法 - Google Patents

一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法。本发明方法中，将血清直接保存在滤纸片上，并运用高效的萃取过程，将提取的胆汁酸于液质联用色谱直接进样，从而能够高效、高通量、高重复性的检测血液中的15种胆汁酸，具有广阔的应用价值。

Description

一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法
技术领域
本发明涉及胆汁酸检测领域，具体而言，涉及一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法。
背景技术
胆汁酸是胆汁中的主要有机成分，其中包含了多种结构近似的类固醇类化合物。胆汁酸在体内具有乳化脂肪、产生胆汁、防止胆结石产生等重要的生理功能。
目前研究发现，多种肝胆疾病都会引起胆汁酸的肝肠循环障碍，从而导致血清胆汁酸谱异常，而该异常状况亦会影响肝脏对胆汁酸的合成和分泌。因而，血清胆汁酸是衡量肝胆功能正常与否的重要标志物。
在传统的临床实践中，一般仅对总胆汁水平进行测定。然而，由于不同的胆汁酸的毒性与其生化特征有关，因此，检测身体中的每一种胆汁酸而非简单的对总胆汁酸进行定量，对于了解胆汁酸相关的生理和病理状态非常重要。但是，目前现有技术中所采用的常规方法，是难以对血液中不同胆汁酸的含量进行精确的分析和测定的。
同时，在传统的胆汁酸检测方法中，由于需要对血液样本进行长距离的运输，不仅保存不便且容易发生交叉污染并导致相应的生物安全问题。因此，开展安全、有效的胆汁酸检测十分必要。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法，本发明方法中，将血清直接保存在滤纸片上，并运用高效的萃取过程，将提取的胆汁酸于液质联用色谱直接进样，从而能够高效、高通量、高重复性的检测血液中的15种胆汁酸，具有广阔的应用价值。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法，所述方法包括如下步骤：(a)样品处理：取全血或血清滴加至滤纸上，干燥后，在所得干血片上打孔取样；将取样品以含有胆汁酸同位素内标的甲酸-甲醇或者甲酸-乙腈混合溶液进行萃取，并混匀；将所得萃取液离心后取上清液，将上清液浓缩干燥后，以甲醇溶液复溶，所得溶液涡旋后离心，取上清液，即为待分析试样；(b)液相分离：将待分析试样以液相色谱进行分离，并将15种胆汁酸分离；(c)质谱检测：将经液相色谱分离的15种胆汁酸以质谱进行检测，得到各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积的比值；然后，根据各胆汁酸的线性方程计算得出相应胆汁酸的含量。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(a)中全血或血清的用量为10～200μL；和/或，所述干燥为风干，优选的，是在室温条件下风干3h以上。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(a)中甲酸-甲醇混合溶液中甲酸的含量0.01～10％；和/或，甲酸-乙腈混合溶液中甲酸的含量为0.01～10％。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(a)中是通过超声、恒温振荡或者杂交炉进行混匀。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(a)中所述浓缩干燥为冻干或氮气吹干。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(a)中所述甲醇溶液为浓度10～80％的甲醇溶液；优选的，所述甲醇溶液的用量为50～300μL。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(b)中流动相A相为碳酸氢铵水溶液，流动相B相为乙腈或甲醇溶液；和/或，流动相的流速为0.1～2mL/min。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(b)中碳酸氢铵水溶液的浓度为0.5～10mmol/L。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(c)中质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7，雾化气流速为5～10L/min，气帘气流速为5～10L/min，碰撞气流速为5～10L/min。
优选的，本发明所述高效检测血液中15种胆汁酸的方法中，步骤(c)中ESI离子源的电压为2500V，温度为400℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明方法解决了血液样本无法长距离运输、保存的问题，能有效避免过程中可能带来的生物安全问题；
(2)本发明方法适用于检测机体血液中的15种胆汁酸，仪器响应度高，对样品的检测专一性强、灵敏度高、稳定性强，各项方法学指标均可简便、可靠地满足实际检测的需要；
(3)本发明检测胆汁酸方法的应用范围广，且可靠性高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1血样中15种胆汁酸含量的检测结果图；
图2为实验例2中健康样本、生理性黄疸样本和病理性黄疸样本的PLS-DA图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
鉴于目前胆汁酸检测中所存在的样本运输不便和可能存在的生物污染，以及无法将多种不同胆汁酸同时进行检测等缺陷，本发明特提供了一种新的高效检测血液中15种胆汁酸的方法。
具体的，本发明方法能够用于检测：胆酸(CA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸钠盐(GCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸钠盐(GDCA)、牛磺胆酸钠盐(TDCA)、牛磺脱氧胆酸钠盐(TCA)、牛磺熊脱氧胆酸钠盐(TUDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸钠盐(TCDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸酸钠盐(TLCA)等15种胆汁酸，不仅检测方法高效，而且检测结果精确；
同时，由于本发明中可以直接以浸有血液样品的滤纸为检测样本，因而也能够有效避免现有检测方法中在样本保存、运输上所存在的不便，以及可能存在的生物污染等潜在生物威胁，因而本发明方法实际上也具有安全、环保等优点。
具体的，本发明方法包括如下步骤：
(a)样品处理：
取全血或血清滴加至滤纸上，血液样品的用量优选的为10～200μL；以优选的室温条件下进行风干(风干的时间要保证超过3h)后，在所得干血片上打孔取样，优选的，打孔的孔径为3mm；
将取样品(一定片数的打孔所得带有风干血液样品的直径为3mm的滤纸片)优选的置于1.5ml离心管中，然后以含有胆汁酸同位素内标的甲酸-甲醇或者甲酸-乙腈混合溶液进行萃取，并优选的通过声/恒温震荡/杂交炉进行混匀；优选的，所述混合溶液中，甲酸的含量为0.01～10％(即，体积百分数为0.01～10％)；
将所得萃取液离心后取上清液，离心的转速优选的为10000～18000rpm，离心的时间为10min；
将上清液浓缩通过优选的冻干或者氮气吹干等方式进行干燥后，以甲醇溶液复溶，所述甲醇溶液为甲醇水溶液，其中，甲醇的含量(体积含量)优选的为10～80％，甲醇溶液的用量优选的为50～300μL；
所得溶液涡旋后离心，离心的转速优选为10000～18000rpm，离心的时间为10min；取上清液，即为待分析试样；
(b)液相分离：
将待分析试样以液相色谱进行分离，并将15种胆汁酸分离，优选的，液相的条件如下：
1.流动相：A相为含有0.5～10mmol/L的碳酸氢铵水溶液，B相为乙腈或甲醇的溶液，流速为0.1～2mL/min；
2.色谱柱：可采用C18或C8等键合相色谱柱，规格为(50～100)mm×(1.8～3)mm，(1.8～3)μm。
(c)质谱检测：
将经液相色谱分离的15种胆汁酸以质谱进行检测，得到各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积的比值；
优选的，质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃；
然后，根据各胆汁酸的线性方程计算得出相应胆汁酸的含量。
各胆汁酸线性方程得出的方法可参考如下：
(1)将15种胆汁酸的标准物质分别配成100～1000μmol/L的甲醇溶液，再混合成各药品浓度为5～20μmol/L混合储备液；
(2)分别精取20～500μL的浓度为10、50、100、500、1000、2000、5000ng/mL混合储备液于1.5ml离心管中，用甲醇分别定容至1mL，得到不同浓度的标准品溶液。各取标准品溶液20～100μL，并加入50～200μL的胎牛血清，用乙腈定容到1mL，充分混匀后高速离心，分别直接取10～200μL上清液滴到滤纸片上，风干3小时以上，用含有胆汁酸同位素内标的0.01～10％的甲酸甲醇或者0.01～10％的甲酸乙腈混合溶液萃取，并超声/恒温震荡/杂交炉混匀，之后10000～18000rpm离心10min后取上清，冻干/氮气吹干；加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清液供LC-MS分析。分别以各胆汁酸的峰面积与内标峰面积之比(Y)对血样中各胆汁酸的浓度(X)进行线性回归，得到各胆汁酸的线性方程。
实施例1人体血液中15种胆汁酸的检测
1材料
1.1仪器和材料
美国AB Sciex串联质谱仪，Angilent 1290液相色谱仪；Agilent C8柱(2.1×50mm，1.7μm)。
1.2药品与试剂
标准物质：胆酸(CA)、熊脱氧胆酸(UDCA)、鹅脱氧胆酸(CDCA)、脱氧胆酸(DCA)、石胆酸(LCA)、甘氨胆酸钠盐(GCA)、甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA)、甘氨鹅脱氧胆酸钠盐(GCDCA)、甘氨脱氧胆酸钠盐(GDCA)、牛磺胆酸钠盐(TDCA)、牛磺脱氧胆酸钠盐(TCA)、牛磺熊脱氧胆酸钠盐(TUDCA)、牛磺鹅脱氧胆酸钠盐(TCDCA)、甘氨石胆酸(GLCA)、牛磺石胆酸酸钠盐(TLCA)购买自Sigma公司。
以上胆汁酸的同位素内标脱氧胆酸DCA～d4、甘氨胆酸钠盐GCA～d4、熊脱氧胆酸UDCA～d4、胆酸CA～d4、鹅脱氧胆酸CDCA～d4、甘氨熊脱氧胆酸GUDCA～d4、牛磺鹅脱氧胆酸钠盐TCDCA～d4均购买自美国Cerilliant公司。
甲酸：色谱纯(MERCK公司)；乙腈：色谱纯(MERCK公司)；碳酸氢铵：分析纯购买自国药集团(上海)；双蒸水：Thermo公司。血样：志愿者血液。
1.3储备液
1.3.1对照品储备液
15种标准物质药品先分别配成100～1000μmol/L的甲醇溶液，再混合成各药品浓度为5～20μmol/L混合储备液。
1.3.2内标液
取适量同位素内标用甲醇溶解并稀释为5～80μmol/L的储备液，再用甲醇稀释至含量为0.01～1μmol/L的内标工作溶液。
2方法
2.1仪器条件
2.1.1液相色谱条件
流动相：A相为含有10～50％甲酸水溶液，B相为乙腈的溶液；流速：0.1～2mL/min。
梯度(以体积百分比计)：0min，A：90％～30％、B：10％～70％；4min，A：90％～50％、B：10％～50％；5min，A：1～20％、B：99～80％；8min，A：1～20％、B：99～80％；8.1min，A：90％～60％、B：10％～40％；10min，A：90％～60％、B：10％～40％。
色谱柱：Agilent C8柱(2.1×50mm，1.7μm)；进样量：10μL。
2.1.2质谱条件
采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7；雾化气流速：5～10L/min，气帘气流速：5～10L/min，碰撞气流速：5～10L/min，离子源电压：2500V，离子源温度：400℃。
2.2样品预处理方法
将10～200μL直接滴到滤纸片上，室温风干>3小时；在风干的干血片上打孔，孔径为3mm，取一定片数置于1.5mL离心管中，用含有胆汁酸同位素内标的0.01～10％甲酸甲醇/乙腈萃取，并超声数分钟，之后10000～18000rpm离心后取上清，冻干，加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清液供LC-MS分析。
2.3标准工作曲线
分别精取20～500μL的浓度为10、50、100、500、1000、2000、5000ng/mL混合储备液于1.5ml离心管中，用甲醇分别定容至1mL，得到不同浓度的标准品溶液。各取标准品溶液20～100μL，并加入50～200μL的胎牛血清，用乙腈定容到1mL，充分混匀后高速离心，分别直接取10～200μL上清液滴到滤纸片上，风干3小时以上，用含有胆汁酸同位素内标的0.01～10％的甲酸甲醇或者0.01～10％的甲酸乙腈混合溶液萃取，并超声/恒温震荡/杂交炉混匀，之后10000～18000rpm离心10min后取上清，冻干/氮气吹干；加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清液供LC-MS分析。分别以各胆汁酸的峰面积与内标峰面积之比(Y)对血样中各胆汁酸的浓度(X)进行线性回归，得到各胆汁酸的线性方程。
2.4精密度和回收率
取血液50～1000μL，并加入内标液，充分混匀，然后直接取10～100μL滴到滤纸片上，室温风干>3小时；在干血片上打孔，孔径为3mm，取一定片数置于1.5mL离心管中，用含有胆汁酸同位素内标的0.01～10％的甲酸甲醇或者0.01～10％的甲酸乙腈混合溶液萃取，并超声/恒温震荡/杂交炉混匀，之后10000～18000rpm离心10min后取上清，冻干/氮气吹干；加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清液供LC～MS分析。将各胆汁酸的峰面积与内标峰面积之比代入线性方程，计算萃取回收率。加标后峰面积/加标到空白中的平均峰面积，计算基质效应。另将干血片样本预处理后进样的结果，与血液直接处理的峰面积与内标峰面积之比进行比较，计算得绝对回收率。
RSD：同时对QC进行6～10例的干血片操作，同时进行前处理，对QC进行连续进样。(日内)
对同一个QC连续进6～12针，计算RSD。
对同一批QC，连续进行3～5天的连续测定。(日间)
3结果
3.1分离结果
本法分析速度快，能在4min内完成所有胆汁酸的检测。在该实验条件下，能完成血液中15种胆汁酸及其相应内标的分析均无干扰。
3.2检测结果
将待测标准液中检测到的各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积之比(Y)对待测标准液中各胆汁酸的浓度(x)进行线性回归，得到各胆汁酸的线性方程，其结果如表1所示。
表1 15种胆汁酸的线性方程及在检测液中的胆汁酸含量
如表1所示，检测液中的胆汁酸含量是将检测液中各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积之比，分别代入表1中的线性方程，得到检测液中各胆汁酸的浓度。
检测结果如图1所示，图1中各数字表示的组分为：1.熊脱氧胆酸(UDCA)；2.甘氨熊脱氧胆酸(GUDCA；3.胆酸(CA)；4.甘氨胆酸钠盐(GCA)；5.牛磺熊脱氧胆酸钠盐(TUDCA)；6.牛磺脱氧胆酸钠盐(TCA)；7.鹅脱氧胆酸(CDCA)；8.甘氨鹅脱氧胆酸钠盐(GCDCA)；9.脱氧胆酸(DCA)；10.甘氨脱氧胆酸钠盐(GDCA)；11.牛磺鹅脱氧胆酸钠盐(TCDCA)；12.牛磺胆酸钠盐(TDCA)；13.甘氨石胆酸(GLCA)；14.石胆酸(LCA)；15.牛磺石胆酸酸钠盐(TLCA)。
实验例1本发明方法的回收率分析
取高、中、低3个浓度的标准液各200μL，并用甲醇溶液补足至1ml，使其充分混合后直接取10～200μL上清液滴到滤纸片上，风干3小时以上，用含有胆汁酸同位素内标的0.01～10％的甲酸甲醇或者0.01～10％的甲酸乙腈混合溶液萃取，并超声/恒温震荡/杂交炉混匀，之后10000～18000rpm离心10min后取上清，冻干/氮气吹干；加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清液供LC-MS分析。检测过程中的液质联用的液相色谱、质谱条件均与上述实施例1的检测待测标准液和检测液的条件相同。
将检测到的标准液的各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积之比代入表1的线性方程，计算标准液中各胆汁酸的含量，进而计算绝对回收率，本试验例1所计算出的绝对回收率为81.09～119.36％。
同时，将通过新鲜血液中添加标准液干血片处理后的检测结果中胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积之比，与新鲜血液直接检测的结果中胆汁酸的峰面积与同位素内标的峰面积之比进行比较，计算得相对回收率，本试验例1计算出的相对回收率为65.2～92.1％。
重复3次操作，结果相对标准偏差3.26％～5.47％，表明本发明检测方法的重现性好。
本发明检测方法精密度准确度分析(日内差日间差分析)
在同实施例1相同的液相色谱质谱条件下，取不同体积的混合标准品储备液进行检测，1天内连续进样6次，5天内每天进样一次，结果日内CV在0.98％～8.54％波动，日间CV在2.00％～11.81％波动，符合要求。
由上述结果可以，本发明提供的血液中胆汁酸的检测方法，胆汁酸的损失少，检测的结果可以真实反应血液中的胆汁酸含量和种类。
实验例2本发明方法实际应用案例
取95例样本，其中30例健康新生儿，25例生理性黄疸新生儿，40例病理性黄疸新生儿。处理样本时，将10～200μL全血滴到滤纸片上，室温风干>3小时；在风干的干血片上打孔，孔径为3mm，取一定片数置于1.5mL离心管中，用含有胆汁酸同位素内标的0.01～10％的甲酸甲醇或者0.01～10％的甲酸乙腈混合溶液萃取，并超声/恒温震荡/杂交炉混匀，之后10000～18000rpm离心10min后取上清，冻干/氮气吹干；加入50～300μL 10～80％甲醇水复溶，涡旋，10000～18000rpm离心10min后取上清液供LC-MS分析。将检测到的标准液的各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积之比代入线性方程，计算标准液中各胆汁酸的含量，并运用多元统计分析采用SIMCA-P(version 13.0，Sweden)进行分析。
采用偏最小二乘聚类分析(PLS-DA)，根据图2所示的分析结果可以看出，健康样本、生理性黄疸样本和病理性黄疸样本具有较好的分离效果。R2Y为0.728，Q2为0.689，交叉验证R2Y和Q2的截距分别为0.0442和-0.219。上述参数表明模型没有过拟合，结果是可信的。由于生理性黄疸在新生儿出生2～3天出现，4～5天最严重，而在之后又会消退，因此图2中与健康样本呈现不同关系的生理性黄疸样本可能是由于采血时间不同或有的样本采取一定的治疗措施。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)样品处理：
取全血或血清滴加至滤纸上，干燥后，在所得干血片上打孔取样；
将取样品以含有胆汁酸同位素内标的甲酸-甲醇或者甲酸-乙腈混合溶液进行萃取，并混匀；
将所得萃取液离心后取上清液，将上清液浓缩干燥后，以甲醇溶液复溶，所得溶液涡旋后离心，取上清液，即为待分析试样；
(b)液相分离：
将待分析试样以液相色谱进行分离，并将15种胆汁酸分离；
(c)质谱检测：
将经液相色谱分离的15种胆汁酸以质谱进行检测，得到各胆汁酸的峰面积与胆汁酸同位素内标的峰面积的比值；
然后，根据各胆汁酸的线性方程计算得出相应胆汁酸的含量。
2.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(a)中，全血或血清的用量为10～200μL；
和/或，所述干燥为风干，优选的，是在室温条件下风干3h以上。
3.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述甲酸-甲醇混合溶液中甲酸的含量0.01～10％；
和/或，所述甲酸-乙腈混合溶液中甲酸的含量为0.01～10％。
4.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(a)中，是通过超声、恒温振荡或者杂交炉进行混匀。
5.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述浓缩干燥为冻干或氮气吹干。
6.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述甲醇溶液为浓度10～80％的甲醇溶液；
优选的，所述甲醇溶液的用量为50～300μL。
7.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(b)中，流动相A相为碳酸氢铵水溶液，流动相B相为乙腈或甲醇溶液；
和/或，流动相的流速为0.1～2mL/min。
8.根据权利要求7所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(b)中，碳酸氢铵水溶液的浓度为0.5～10mmol/L。
9.根据权利要求1所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(c)中，质谱条件为：采用ESI离子源，正离子MRM扫描，喷雾口位置：3∶7，雾化气流速为5～10L/min，气帘气流速为5～10L/min，碰撞气流速为5～10L/min。
10.根据权利要求9所述的高效检测血液中15种胆汁酸的方法，其特征在于，步骤(c)中，ESI离子源的电压为2500V，温度为400℃。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111060643A (zh) * 2020-01-16 2020-04-24 博莱克科技（武汉）有限公司 一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法
CN111830161A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 南京品生医学检验实验室有限公司 一种检测血清中15种胆汁酸的方法
CN112098532A (zh) * 2020-08-11 2020-12-18 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检测方法
CN114894926A (zh) * 2022-04-27 2022-08-12 天津国科医工科技发展有限公司 基于干血纸片法的胆汁酸检测方法
CN115128178A (zh) * 2021-08-05 2022-09-30 上海体育学院 一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101995441A (zh) * 2010-02-10 2011-03-30 中国科学院大连化学物理研究所 检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的试剂盒
WO2016069759A1 (en) * 2014-10-28 2016-05-06 Washington University Bile acid biomarkers for niemann-pick diseases, methods and uses therefor
CN106885867A (zh) * 2017-03-30 2017-06-23 杭州佰辰医学检验所有限公司 高效液相色谱串联质谱检测血清中五种牛磺结合型胆汁酸的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101995441A (zh) * 2010-02-10 2011-03-30 中国科学院大连化学物理研究所 检测血中3-硫酸甘氨鹅脱氧胆酸和甘氨鹅脱氧胆酸的试剂盒
WO2016069759A1 (en) * 2014-10-28 2016-05-06 Washington University Bile acid biomarkers for niemann-pick diseases, methods and uses therefor
CN106885867A (zh) * 2017-03-30 2017-06-23 杭州佰辰医学检验所有限公司 高效液相色谱串联质谱检测血清中五种牛磺结合型胆汁酸的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
N. JANZEN等: "Rapid quantifi cation of conjugated and unconjugated bile acids and C27 precursors in dried blood spots and small volumes of serum", 《JOURNAL OF LIPID RESEARCH》 *
勾新磊等: "超高效液相色谱-串联质谱法同时测定胆汁中15种胆汁酸", 《分析试验室》 *
徐侠: "胆石病患者的胆汁酸成份分析", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111060643A (zh) * 2020-01-16 2020-04-24 博莱克科技（武汉）有限公司 一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法
CN111060643B (zh) * 2020-01-16 2021-04-02 博莱克科技（武汉）有限公司 一种含有同分异构体胆汁酸代谢组分分离方法
CN111830161A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 南京品生医学检验实验室有限公司 一种检测血清中15种胆汁酸的方法
CN112098532A (zh) * 2020-08-11 2020-12-18 杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司 一种改进的高效液相色谱串联质谱人血清中15种胆汁酸的检测方法
CN115128178A (zh) * 2021-08-05 2022-09-30 上海体育学院 一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法
CN115128178B (zh) * 2021-08-05 2023-08-25 上海体育大学 一种干血斑样本中多种类固醇酯的全自动检测方法
CN114894926A (zh) * 2022-04-27 2022-08-12 天津国科医工科技发展有限公司 基于干血纸片法的胆汁酸检测方法

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