CN108037226A - 微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种微波萃取‑固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法。该方法包括：(1)粪便样品预处理，在提取溶剂加入前加入内标物指示回收率；(2)使用微波萃取仪提取粪便样品中的目标雌激素；(3)使用固相萃取柱富集净化目标雌激素；(4)采用内标法使用液质联用仪检测粪便中三类6种雌激素的含量。该方法采用单因素实验，对提取方法、提取溶剂进行了优化，可一次性同时检测出鸡粪、牛粪、猪粪中三类6种雌激素的残留情况，具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低等优点。此方法将指示回收率的内标物加在微波萃取前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果真实可靠。

Description

微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽 粪便中三类6种雌激素的方法
技术领域
本发明属于畜禽粪便中有机污染物质残留检测技术领域，涉及一种用于畜禽粪便中雌激素检测的方法，特别涉及一种微波萃取-固相萃取前处理结合液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS，简称液质联用技术)，能够高效处理并同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素类物质的方法。
技术背景
随着畜禽养殖业向现代化、规模化和集约化的方向快速发展，畜禽养殖污染日益严重。环境中天然雌激素总量的90％均来自于大规模集约化畜禽养殖，包括激素类药物的使用、畜禽饲料添加剂及动物本身的合成和排放，最终均通过畜禽粪便的排放进入环境，进而对土壤、水体环境产生毒害作用。畜禽粪便成分较为复杂，一般都含有未完全消化的饲料成分(富含蛋白质、脂肪类、有机酸、纤维素等)，这些干扰成分的存在对准确快速地检测雌激素含量具有较大的挑战。因此，一种有效提取和净化方法对准确测定畜禽粪便中雌激素含量尤为重要。
要对畜禽粪便中雌激素进行控制，雌激素的前处理方法和检测技术至关重要，因为它们是影响分析测定结果准确性的关键。目前，检测畜禽粪便中雌激素含量的方法中，前处理部分常用的提取方法主要包括超声萃取、微波辅助萃取、加速溶剂萃取以及索氏萃取；常用的净化技术有固相萃取、硅胶净化和HPLC净化。由于养殖业产生的畜禽粪便比较复杂，对检测干扰较大，尤其是提取溶剂分离步骤。因需要检测的雌激素种类较多，各物理化学性质也不相同，所用的提取溶剂和提取方法也各有差别。对于整个提取过程来说，提取溶剂的选择对痕量物质残留的检测分析非常重要，回收率的高低与不同介质的组成及其理化性质的不同有着直接的关系。理想的环境样品前处理方法是不破坏待测组分的形态，减少污染，并且能使待测组分与基质有效分离。同时，高灵敏度、高准确性、成本低的检测手段是保证雌激素残留检测的关键。
微波萃取-固相萃取-高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)具有速度、灵敏度及分离度较高，分析时间短，节省溶剂，降低分析成本等优点，目前已成为有机物预防处理和分析的重要方法之一。现有的微波萃取、HLB固相萃取柱、高效液相色谱串联质谱技术用于检测畜禽粪便中的雌激素时，大多由于提取方法、提取溶剂选用不合适，或固相萃取前处理条件、液相色谱条件和/或质谱条件选择不当，或多或少存在着杂质不能有效去除、基质干扰太大、检测结果不稳定、干扰多、检测雌激素数量有限和回收率低等一系列问题。
发明内容
本发明的目的旨在克服现有方法中存在的不稳定、干扰多、检测雌激素数量和回收率有限等问题，提供一种检测结果准确、稳定，干扰小，快速、高效的，能同时测定畜禽粪便(鸡粪、牛粪、猪粪)中三类(天然雌激素、人工合成雌激素和有雌激素效应的内分泌干扰物)6种不同结构雌激素的方法(雌酮、雌二醇、雌三醇、乙炔基雌二醇、己烯雌酚、双酚A)，即一种采用微波萃取、固相萃取前处理结合高效液相色谱串联质谱技术(HPLC-MS/MS)同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法。该方法通过对提取方法、提取溶剂、固相萃取前处理条件的优化，最终能够实现灵敏度高、选择性好、准确度高，该方法适合实际畜禽粪便中雌激素的检测。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法，该方法包括：(1)粪便样品的预处理，在提取液加入前加入内标物指示回收率；(2)使用微波萃取仪提取粪便样品中的目标雌激素；(3)使用固相萃取柱富集净化目标雌激素；(4)采用内标法使用高效液相色谱仪定量检测粪便中三类6种雌激素类物质的含量。该方法采用单因素实验，对提取方法、提取溶剂种类等进行了优化，可以一次性同时检测出鸡粪、牛粪、猪粪中三类6种雌激素的残留情况，检测具有高精密度、高灵敏度、高稳定性、高选择性和检出限低等优点。此方法将指示回收率的内标物加在微波萃取前，能够很好的表示前处理过程中目标物质的损失，使最终结果真实可靠。
本发明一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法，按如下步骤进行：
(1)雌激素类物质的提取：微波萃取、液-液萃取
称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液；将提取液浓缩，再吹至近干，用乙腈重新溶解，加入正己烷进行液-液萃取(LLE)后，所得乙腈层溶液用超纯水稀释，调节pH值。
(2)富集净化：固相萃取(SPE)
依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，控制水样流速；富集完后依次用超纯水和低浓度的甲醇淋洗，并在真空下干燥固相萃取柱；最后用甲醇洗脱，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的甲醇定容、超声、过滤后转移至进样小瓶，待测。
(3)高效液相色谱串联质谱法测定粪便中6种雌激素类物质的含量
采用内标法，高效液相色谱串联质谱仪定量检测粪便中三类6种雌激素的含量；所述的三类6种雌激素是指天然雌激素、人工合成雌激素和有雌激素效应的内分泌干扰物这三类的6种雌激素类物质；6种雌激素分别为雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、乙炔基雌二醇(EE2)、己烯雌酚(DES)、双酚A(BPA)。
进一步地，步骤(1)中，微波萃取前分别加入17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、 4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率。
更进一步地，步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率。
进一步地，步骤(1)中，提取液为甲醇-丙酮溶液(V:V＝1:3)，即甲醇:丙酮体积比为1:3；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行微波萃取，提取粪便中的雌激素类物质；样品过滤所用的滤膜为孔径0.45μm或0.47μm的Whatman GF/F 系列玻璃纤维滤膜。
进一步地，步骤(1)中，将提取液经旋蒸仪浓缩，再经氮吹仪吹至近干，用乙腈重新溶解，加入正己烷进行液-液萃取后，所得乙腈层溶液用超纯水稀释，调节pH 值至3-4。
进一步地，步骤(2)中，所述的固相萃取柱为Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂(填料)是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；淋洗萃取柱所用的纯水和低浓度甲醇水溶液各为萃取柱体积的1-2倍；淋洗后的抽干时间为15-30min；洗脱固相萃取柱所用的甲醇量为萃取柱体积的2倍，洗脱液流速小于1.0mL/min。
进一步地，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇- 水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；用甲醇定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。
进一步地，步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对6种目标雌激素类物质进行检测；色谱柱选用 Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号100mm×2mm，1.0μm；流动相A为Milli-Q超纯水，流动相B为乙腈。
进一步地，步骤(3)中，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量5μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1；流动相A为Milli-Q超纯水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0-3.0min，30％B；3.0-4.0min，30％B-90％B；4.0-7.0min， 90％B；7.0-8.0min，90％B-30％B；8.0-10.0min，30％B。
进一步地，步骤(3)中，质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
进一步地，上述微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法，具体检测过程如下：
(1)雌激素类物质的提取：微波萃取、液-液萃取
将采集的新鲜畜禽粪便(鸡粪、牛粪或猪粪)冷冻干燥后，粉碎并过0.25mm 筛。准确称取2.5000g样品于100mL微波萃取管中。分别加入100ng的17β-雌二醇 -d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种指示回收率的内标物，与粪便样品混合均匀。再加入50mL甲醇-丙酮溶液(V:V＝1:3)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为100℃，萃取功率为800W，萃取时间梯度设置为：温度爬升20min、保持60min、降温30min。萃取结束后过滤，收集所有过滤后的上清液于100mL玻璃瓶中，转移至旋转蒸发仪(40℃，80rpm，-75kPa)中浓缩至10mL，经氮吹仪吹至近干。用5mL 乙腈重新溶解，然后加入5mL正己烷进行液-液萃取(LLE)后，移除正己烷层，该操作重复两遍，以除去油类物质。所得乙腈层溶液用超纯水稀释至500mL，调节pH 值至3。
(2)固相萃取(SPE)：富集净化过程
依次用甲醇和纯水活化固相萃取小柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，富集；再用超纯水和低浓度的甲醇水溶液淋洗，并在真空条件下抽干固相萃取柱；之后，再用甲醇洗脱，洗脱液用经氮吹仪吹至近干，获取残渣；将残渣用一定浓度的甲醇溶液重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测。
其中，浓缩富集样品采用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
其中，活化固相萃取柱所用的甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍。样品过柱流速为3-6mL/min，淋洗萃取柱所用的超纯水和低浓度甲醇水溶液用量各为萃取柱体积的1-2倍。淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％(一般为5％)的甲醇- 水溶液。淋洗后的抽干时间为15-30min。洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇(即高效液相色谱法级别的甲醇)。洗脱萃取柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。
其中，得到的残渣用甲醇-水体积比为7:3的甲醇水溶液重新溶解，定容，超声 10-15min，用孔径在0.22um以下的滤膜过滤，待进样测定。
(3)高效液相色谱串联质谱法测定粪便中6种雌激素类物质的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中三类6种雌激素的含量；所述的三类6种雌激素是指天然雌激素、人工合成雌激素和有雌激素效应的内分泌干扰物这三类的6种雌激素类物质；6种雌激素分别为雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、乙炔基雌二醇(EE2)、己烯雌酚(DES)、双酚A(BPA)。
本发明的有益效果：
与现有技术相比，本发明的优点如下：
1.本发明采用微波萃取仪对雌激素类物质进行提取，大大降低了萃取时间，提高了萃取速度，并且可供选择的提取溶剂种类多样。
2.本发明的方法选择Waters公司Oasis HLB固相萃取柱对三类6种雌激素进行富集净化，去除了干扰杂质，降低了基质效应，提高了选择性和富集倍数；回收率高而稳定，选择性强，吸附容量大，达到了对目标雌激素有效分离富集的目的。
3.采用内标法定量，测定雌激素类物质的浓度更准确，线性关系好，相对标准偏差小，提高了检测分析的精密度。
4.本发明的方法将内标物质(指示回收率替代物)加在微波萃取前过程前，能够很好地表示前处理过程中目标物质的损失，同时，考虑不同类别的雌激素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同程度的损失，所以，分别选用17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)，己烯雌酚-D8(DES-D8)，4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)作为E1、E2、E3、EE2的内标物和DES的内标物以及 BPA的内标物，由于内标物选用恰当，使得最终检测结果更加真实可靠。
5.本发明中有机试剂使用量少，一次进样可以同时检测出粪便中的多种雌激素类物质(6种)，检测过程耗时少(10min)，节约人力物力成本。
附图说明
图1是使用五种不同提取溶剂测得猪粪中6种雌激素类物质的加标回收率。
具体实施方式
为了更好地理解本发明，以下结合实施例进一步阐述本发明的实施方式和内容。
实施例1：加标回收率实验
采用内标法考察本发明的微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术检测方法对畜禽粪便中三类6种雌激素物质回收率的影响。加标回收率实验以猪粪样品为例：分别向粪便样品中添加100ng、500ng的混合标准液(混合标准液为6种雌激素的混合标准液)。
本发明的微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法，具体按以下步骤实施：
步骤一、粪便样品预处理：微波萃取、液-液萃取
将采集的新鲜猪粪冷冻干燥后，粉碎并过0.25mm筛。设立三组样品。每组样品，准确称取2.5000g样品于100mL微波萃取管内。其中两组样品，按上述添加量分别加入混合标准液，即分别向粪便样品中添加100ng、500ng的混合标准液，使添加到粪便中的雌激素的最终浓度分别为40μg/kg、200μg/kg。第三组样品设为空白组(空白组不添加任何雌激素)。
再分别向样品中加入100ng的17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)、己烯雌酚-D8 (DES-D8)、4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)这三种指示回收率的内标物，与粪便样品充分混合均匀。即：分别选用17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)作为雌酮(E1)、雌二醇 (E2)、雌三醇(E3)、炔雌醇(EE2)的内标物，选用己烯雌酚-D8(DES-D8)作为己烯雌酚(DES)的内标物，选用4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)作为双酚A(BPA)的内标物。
加入50毫升甲醇-丙酮溶液(V:V＝1:3)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为100℃，萃取功率为800W，萃取时间梯度设置为：温度爬升20min、保持60min、降温30min。萃取结束后过滤，收集所有过滤后的上清液(提取液)于100mL玻璃瓶中，转移至旋转蒸发仪(40℃，80rpm,-75kPa)中浓缩至10mL，经氮吹仪吹至近干。用5mL乙腈重新溶解，然后加入5mL正己烷进行液-液萃取(LLE)后，移除正己烷层，该操作重复两遍，以除去油类物质。所得乙腈层溶液用超纯水稀释至 500mL，调节pH值至3。
步骤二、固相萃取(SPE)：富集净化过程
使用前将Supelco24管、固相萃取装置、Oasis HLB固相萃取小柱、缓冲装置和真空泵按顺序连接好。依次用5mL甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取小柱。预处理后的500mL水样以3mL/min的速度过柱，上样完毕后依次用5mL超纯水和等体积体积浓度为5％的甲醇淋洗萃取柱，之后将萃取柱置于真空状态下干燥10min，最后用10mL的甲醇(HPLC级甲醇)，以1mL/min的流速洗脱目标物至具塞玻璃离心管中，洗脱液在水浴条件下(水浴加热不超过30℃)，用氮气吹干，得到残渣(残渣)。用体积浓度为70％的甲醇定容至1mL，超声5min后，经0.22μm PTFE针式滤器过滤后转移至棕色进样瓶中，待测。
步骤三、液相色谱串联质谱法测定6种雌激素的含量
采用内标法，在液相色谱-串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中 6种雌激素的含量(浓度)。
选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对6种目标雌激素类物质进行检测；色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号100mm×2mm，1.0μm。
液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量5μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1；流动相A为Milli-Q超纯水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0-3.0 min，30％B；3.0-4.0min，30％B-90％B；4.0-7.0min，90％B；7.0-8.0min，90％B-30％ B；8.0-10.0min，30％B。
质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为 -4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
考虑不同类别的抗生素结构和性质存在很大的差别，前处理过程中会有不同的程度的损失，所以，分别选用17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)作为E1、E2、E3、EE2 的内标物，选用己烯雌酚-D8(DES-D8)作为DES的内标物，选用4n-壬基酚-D8 (4n-NP-D8)作为BPA的内标物。考虑内标物质本身性质比较稳定，在负电喷雾电离源(ESI-)模式下响应良好且无明显基质干扰。
回收率计算：
采用步骤一至步骤二的前处理方法进行前处理，采用步骤三的方法进行定量检测，对猪粪样品进行加标回收率计算(加标的最终浓度为200μg/kg)，计算结果见表 1。
加标回收率(RE％)的计算公式为：
其中，RE：加标回收率，％；
C0：混合标准液的浓度，ng/mL；
C1：未加入混合标准液的粪便样品的检测浓度，ng/mL；
C2：加入混合标准溶液的粪便样品的检测浓度，ng/mL；
V0：混合标准液的体积，mL；
V1：未加入混合标准液的粪便样品上机前定容体积，mL；
V2：加入混合标准溶液的粪便样品上机前定容体积，mL。
由此可见，本发明的方法对猪粪样品中6种雌激素的加标回收率在 70.54％-93.20％，相对标准偏差均低于5％，加标回收率存在差异，说明存在基质干扰；通过添加内标物计算加标回收率，并用其对检验结果进行校正，可以在一定程度上降低基质干扰带来的影响。
表1.猪粪样品中雌激素的实测浓度及不同加标浓度的加标回收率
使用五种不同的提取溶剂(①甲醇-丙酮溶液，体积比1：3；②甲醇-丙酮溶液，体积比1：1；③甲醇；④丙酮；⑤乙腈)按上述方法进行试验，测得猪粪中6种雌激素类物质的加标回收率，见图1。从图1可看出，采用甲醇-丙酮溶液体积比1：1 作提取溶剂，加标回收率最高，效果最好。
实施例2-3：实际粪便样品雌激素含量测定
6种雌激素类物质在两种不同粪便样品中的浓度的测定
采集上海市某鸡场和奶牛场的粪便(鸡粪和牛粪)，先采用本发明步骤一的方法(微波萃取、液-液萃取)进行样品预处理，再采用本发明步骤二的固相萃取方法进行富集净化前处理，之后采用本发明步骤三的液质联用检测方法对样品的实际浓度进行检测分析，以此考察本发明的方法对不同种类粪便样品的适用性。
具体检测过程如下：
(1)雌激素类物质的提取：微波萃取、液-液萃取
将采集到的新鲜畜禽粪便鸡粪和牛粪分别冷冻、干燥、粉碎，并过0.25mm筛。每种粪便准确称取2.5000g样品于100mL微波萃取管中。每种粪便分别加入100ng 的17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种指示回收率的内标物，与粪便样品充分混合均匀。即：分别选用17β-雌二醇-d3(17β-E2-d3)作为雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、炔雌醇(EE2)的内标物，选用己烯雌酚-D8(DES-D8)作为己烯雌酚(DES)的内标物，选用4n-壬基酚-D8(4n-NP-D8)作为双酚A(BPA)的内标物。
再加入50mL甲醇-丙酮溶液(V:V＝1:3)作为提取溶剂，进行微波萃取，萃取温度为100℃，萃取功率为800W，萃取时间梯度设置为：温度爬升20min、保持60min、降温30min。萃取结束后过滤，收集所有过滤后的上清液(提取液)于100mL玻璃瓶中，转移至旋转蒸发仪(40℃，80rpm，-75kPa)中浓缩至10mL，经氮吹仪吹至近干。用5mL乙腈重新溶解，然后加入5mL正己烷进行液-液萃取(LLE)后，移除正己烷层，该操作重复两遍，以除去油类物质。所得乙腈层溶液用超纯水稀释至 500mL，调节pH值至3。
(2)固相萃取(SPE)：富集净化过程
依次用甲醇和纯水活化固相萃取小柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱，富集；再用超纯水和低浓度的甲醇水溶液淋洗，并在真空条件下抽干固相萃取柱；之后，再用甲醇洗脱，洗脱液用经氮吹仪吹至近干，获取残渣；将残渣用一定浓度的甲醇溶液重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测。
其中，浓缩富集样品采用的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，其吸附剂是由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物，是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂。
其中，活化固相萃取柱所用的甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍。样品过柱流速为3-6mL/min，淋洗萃取柱所用的超纯水和低浓度甲醇水溶液用量各为萃取柱体积的1-2倍。淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％(一般为5％)的甲醇- 水溶液。淋洗后的抽干时间为15-30min。洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇(即高效液相色谱法级别的甲醇)。洗脱萃取柱所用的甲醇用量为萃取柱体积的2倍。
其中，得到的残渣用甲醇-水体积比为7:3的甲醇水溶液重新溶解，定容，超声 10-15min，用孔径在0.22um以下的滤膜过滤，待进样测定。
(3)高效液相色谱串联质谱法测定粪便中6种雌激素类物质的含量
采用内标法，高效液相色谱串联质谱仪定量检测粪便中三类6种雌激素的含量；所述的三类6种雌激素是指天然雌激素、人工合成雌激素和有雌激素效应的内分泌干扰物这三类的6种雌激素类物质；6种雌激素分别为雌酮(E1)、雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、乙炔基雌二醇(EE2)、己烯雌酚(DES)、双酚A(BPA)。
选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对6种目标雌激素类物质进行检测；色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号100mm×2mm，1.0μm。
液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量5μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1；流动相A为Milli-Q超纯水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0-3.0 min，30％B；3.0-4.0min，30％B-90％B；4.0-7.0min，90％B；7.0-8.0min，90％B-30％ B；8.0-10.0min，30％B。
质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
实际检测所得两种粪便中6种雌激素类物质含量如下表即表2所示。实验结果表明，本发明的方法可以应用到鸡粪和奶牛粪中雌激素含量的测定，具有良好的适用性。
表2两种粪便中6种雌激素类物质的检测含量
注：“ND”表示未检出，数据为平均值±标准偏差(n＝3)。

Claims (10)

1.一种微波萃取-固相萃取前处理结合液质联用技术同时检测畜禽粪便中三类6种雌激素的方法，其特征在于，按以下步骤进行：
(1)雌激素类物质的提取：微波萃取、液-液萃取
称取经冷冻干燥、粉碎、过筛后的畜禽粪便，加入指示回收率的内标物，再加入提取溶剂，经微波萃取、过滤后收集提取液；将提取液浓缩，再吹至近干，用乙腈重新溶解，加入正己烷进行液-液萃取后，所得乙腈层溶液用超纯水稀释，调节pH值；
(2)富集净化：固相萃取
依次用甲醇和等体积的超纯水活化固相萃取柱，将经步骤(1)处理过的样品过柱即富集，控制水样流速；富集完后依次用超纯水和低浓度的甲醇淋洗，并在真空下干燥固相萃取柱；最后用甲醇洗脱，经氮吹仪吹干，获得残渣；将残渣用一定浓度的甲醇重新溶解，定容，经超声、过滤后转移至进样瓶中，待测；
(3)高效液相色谱串联质谱法测定畜禽粪便中三类6种雌激素类物质的含量
采用内标法，在高效液相色谱串联质谱仪上，定量检测进样瓶内的畜禽粪便样品中三类6种雌激素的含量；所述的三类6种雌激素是指天然雌激素、人工合成雌激素和有雌激素效应的内分泌干扰物这三类的6种雌激素类物质；6种雌激素分别为雌酮E1、雌二醇E2、雌三醇E3、乙炔基雌二醇EE2、己烯雌酚DES、双酚A即BPA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微波萃取前分别加入17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，微波萃取前分别加入100ng的17β-雌二醇-d3、己烯雌酚-D8、4n-壬基酚-D8这三种内标物指示回收率。
4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，提取溶剂为甲醇-丙酮溶液，甲醇:丙酮体积比为1:3；采用CEM MARS CLASSIC型微波萃取仪进行微波萃取，提取粪便中的雌激素类物质；样品过滤所用的滤膜为孔径0.45μm或0.47μm的Whatman GF/F系列玻璃纤维滤膜。
5.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，将提取液经旋蒸仪浓缩，再经氮吹仪吹至近干，用乙腈重新溶解，加入正己烷进行液-液萃取后，所得乙腈层溶液用超纯水稀释，调节pH值至3-4。
6.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的固相萃取柱是Waters公司Oasis HLB小柱，它是一种亲水-亲脂性聚合物填料柱，其吸附剂是用于酸性、中性和碱性化合物的通用型吸附剂；步骤(2)中，活化固相萃取柱所用的甲醇和水用量各为萃取柱体积的1倍，过柱时水样流速控制在1-4mL/min；淋洗萃取柱所用的纯水和低浓度甲醇水溶液各为萃取柱体积的1-2倍；淋洗后的抽干时间为15-30min；洗脱固相萃取柱所用的甲醇量为萃取柱体积的2倍，洗脱液流速小于1.0mL/min。
7.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，淋洗所用的低浓度甲醇为体积浓度小于10％的甲醇-水溶液；洗脱所用的甲醇为HPLC级甲醇；定容残渣所用的甲醇是体积浓度为70％的甲醇-水溶液；用甲醇定容后，超声5-15min，再用针式滤器过滤；针式滤器选用孔径小于0.22μm的聚四氟乙烯针式滤头。
8.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，选用美国AB公司的AB5500Q-trap高效液相色谱串联质谱仪，配岛津30A液相色谱对6种目标雌激素类物质进行检测；液相色谱的色谱柱选用Shim-Pack XR-ODSII C18柱型号100mm×2mm，1.0μm。
9.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，液相色谱分离参数为：色谱柱柱温40℃；进样量5μL；进样室温度10℃；流动相流速0.3mL·min-1；流动相A为Milli-Q超纯水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0-3.0min，30％B；3.0-4.0min，30％B-90％B；4.0-7.0min，90％B；7.0-8.0min，90％B-30％B；8.0-10.0min，30％B。
10.根据权利要求1、2或3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，质谱检测条件为：采用电喷雾离子源负离子模式ESI-，三重四级杆质量分析器，扫描方式：多反应监测模式MRM进行检测；离子源温度为550℃，离子化电压为-4500V，气帘气CUR为35psi，喷雾气GS1为50psi，辅助加热气GS2为50psi，碰撞气CAD为Medium，碰撞气为高纯氮气。
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