CN102435681A - 一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚a的前处理方法 - Google Patents

Abstract

一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚A的前处理方法，基于快速速溶剂萃取-液液萃取-Florisil柱净化-碱液提取-HLB柱富集净化-液相色谱/串联质谱联用(ASE-LLE-Florisil-AS-HLB-LC/MS/MS)的双酚A及雌激素的共检测方法。以丙酮∶甲醇＝1∶1(v/v)为萃取剂进行快速速溶剂提取污泥和沉积物中雌激素及双酚A，以乙腈-正己烷体系液液萃取除去油脂及多环芳烃等非极性杂质，以Florisil柱净化大部分色素后，再用0.1mol/L氢氧化钠溶液提取残渣中的雌激素及双酚A，过0.22μm滤膜后再用HLB柱进一步富集净化。本方法对双酚A及雌激素的回收率为75-100％，检测限低于0.4ng/g，净化效果良好，满足复杂基质固体样品中雌激素的检测要求。该研究结果可以快速、有效对高基质干扰的污泥、沉积物及畜禽粪便样品中雌激素及双酚A进行分离和净化，有利于提高方法的精确性和稳定性，也能降低复杂样品对仪器的损坏。

Description

一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚A的前处理方法

技术领域

本发明涉及一种复杂基质固体样品中有机污染物的检测技术领域，特别是涉及分析活性污泥、沉积物或畜禽粪便中雌激素及双酚A含量的样品净化方法。

背景技术

近年来，天然与合成雌激素雌酮(Estrone，E1)、17β-雌二醇(17β-Estradiol，E2)、17α-乙炔基雌二醇(17α-Ethinyl Estradiol，EE2)，以及类雌激素活性物质双酚A(BisphenolA，BPA)作为典型的环境中内分泌干扰物引起了学术界的广泛关注。研究调查结果显示，在多数国家河流或湖泊中有ng/L浓度水平的雌激素被检出，而这一浓度范围可以导致虹鳟鱼产生雌性化作用。虽然，雌激素产生的最终源头是人类和哺乳动物。但事实上，生活污水的集中处理和排放以及规模化畜禽养殖，是造成河流或土壤环境中雌激素污染的最重要原因。作为类雌激素活性物质的双酚A，是生产聚碳酸酯和环氧树脂等的重要原料，由这些原料制造而成的奶瓶等食具、电子器件的包覆材料、纸水杯、金属饮料罐的保护涂层、食品包装材料等产品中均含有双酚A。因此，上述产品的生产或使用可以导致双酚A释放到环境中。

由于雌激素及双酚A在环境介质的浓度低至零点几ng/L水平，所以，对于环境样品的前处理以及仪器分析的技术要求就变得更加严格。建立高回收率和低成本的分析检测技术，成为了当前研究的热点问题和进一步研究雌激素在环境介质中的浓度分布特征、迁移转化规律的瓶颈之处。很多样品在仪器分析之前没有得到很好的净化和富集，分析时由于基质效应抑制或放大了雌激素的信号强度，使分析方法回收率降低，重现性变差。因此，净化步骤是样品分析过程中的最为关键的技术。

发明内容

本发明的目的是针对基质复杂的污泥和沉积物样品，其前处理技术难度大等问题，拟开发一种回收率高、灵敏度高、准确而快速的净化技术，尤其是实现较好的除杂效果，减弱基质干扰作用，实现对复杂基质样品中雌激素及双酚A的共检测定量分析技术。

本发明的技术方案如下：

图1描述了一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚A的前处理方法，其特征在于该方法包括如下部分：

(1)固体样品提取

将采集的污泥和沉积物样品进行冷冻干燥，以丙酮/甲醇＝1∶1(v/v)为萃取剂，用快速溶剂萃取方法提取样品中的雌激素及双酚A；然后旋转蒸发浓缩至1ml左右，用氮气吹干，残渣留作净化。本发明所述的快速溶剂萃取方法选择的温度为80℃，压力为1500pis，静态提取2次，各8min。

(2)提取液净化

a.液液萃取(LLE)净化：用乙腈重新溶解残渣后，再加入正己烷漩涡混合，萃取萃取去除油脂等非极性物质，重复两次弃去正己烷相，并将乙腈相用氮气吹干。

b.Florisil净化：用正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)溶液重新溶解LLE净化后的残渣，然后通过预先用正己烷活化好的Florisil固相萃取柱，再用正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)淋洗，以丙酮/二氯甲烷＝2/8(v/v)为洗脱剂经行洗脱，洗脱液用氮气吹干。

c.碱液净化(AAE)+HLB柱净化：用0.1M的NaOH溶液超声溶解Florisil净化后的残渣，然后通过0.22μm的尼龙滤头。滤液与100ml超纯水、6ml甲醇混匀后，用4mol/L的盐酸调节pH至3左右，并通过HLB柱富集净化。将HLB柱用乙酸乙酯洗脱，洗脱液以氮气吹干后定容，待测定。

(3)利用液相色谱-串联质谱分析雌激素及双酚A浓度

液相色谱-串联质谱联用仪：Agilem 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵及自动进样器(美国Agilent公司)；3200QTRAP四极杆-线性阱复合型串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件(美国AppliedBiosystem公司)。

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；源内气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。HPLC流动相梯度洗脱条件详见表1。

表1 雌激素及BPA的梯度洗脱条件

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线绘制：利用分析天平准确称量3种雌激素及双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用仪进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到标准曲线(图2)，用于计算样品中分析物的量。

(5)样品及回收率的测定

采集待测样品，按步骤1对样品进行提取，再按步骤2进行四步骤净化，最后用液相色谱-串联质谱联用仪进行样品检测，并与步骤4得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测样品中雌激素及双酚A的含量。

采用同样的样品，按100ng/g的添加量加入标准溶液，进行上述预处理并测定雌激素含量，按照下式进行回收率计算：

$R=\frac{C-C_0}{10}\×100\%---\left(1\right)$

R-回收率，％；

C-添加标准溶液样品的雌激素含量，ng/g；

C₀-未添加标准溶液样品的雌激素含量，ng/g。

本发明所述的快速溶剂萃取方法选择的温度为80℃，压力为1500pis，静态提取2次，各8min。

本发明所述的雌激素包括天然雌激素E1、E2和合成雌激素EE2。

本发明的有益效果是加速溶剂萃取(ASE)后，采用了四步骤净化方法。即Florisil柱净化之前增加液液萃取(LLE)步骤，除去非极性有机物质，以减小后续净化负荷。Florisil柱净化除去大部分极性较强杂质后，结合碱液净化使碱溶解性差的有机物质被去除，最终用HLB柱富集净化。本方法净化效果好，成本低，采用液相色谱-串联质谱联用进行检测，检测限低，具有较高的灵敏度和精确度。特别适用于高基质干扰环境介质中雌激素含量的分析。本方法的回收率与最低检测限，如表2所示。

表2 本方法的回收率和最低检测限(n＝4)

注：*表示1g固体样品的检出限。

附图说明

图1为复杂固体样品中雌激素分析方法流程图；

图2为雌激素E1、E2、EE2及BPA标准曲线；

图3为样品净化分步骤回收率，其中a)为液液萃取(LLE)净化步骤回收率；b)Florisil柱净化步骤回收率；c)碱液提取(AAE)+HLB柱净化回收率)；

图4为整个净化过程中的紫外-可见吸收光谱变化(每个步骤净化后的残渣均用5ml甲醇溶解后转移至石英比色皿中用Varian Cary 50紫外-可见吸收光谱仪扫描)。

具体实施方式

下面结合实例及附图2对本发明的技术方案作进一步的描述。

(1)样品提取

将采集的固体样品进行冷冻干燥，研碎。准确称取样品后，以60ml丙酮/甲醇＝1∶1(v/v)为萃取剂，用快速溶剂萃取提取样品中的雌激素及双酚A；然后旋转蒸发浓缩至1ml左右，用氮气吹干。

(2)提取液净化

样品提取物，首先进行液液萃取(LLE)净化。用10ml乙腈重新溶解残渣后，再加入10ml正己烷漩涡混合10min，萃取提取液中油脂等非极性物质，重复两次弃去正己烷相，并将乙腈相氮气吹干。然后进行第二步Florisil(6cc，500mg)净化：用5ml正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)溶液重新溶解LLE净化残渣，然后通过预先用5ml正己烷活化好的Florisil柱，再用5ml正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)淋洗，以5ml丙酮/二氯甲烷＝2/8(v/v)为洗脱剂经行洗脱，洗脱液氮气吹干。第三步净化为碱液净化+HLB柱净化：用5ml的0.1M的NaOH溶液超声溶解Florisil净化后的残渣，然后通过0.22μm的尼龙滤头。滤液与100ml超纯水、6ml甲醇混匀后，用4mol/L的盐酸调节pH至3左右，并通过HLB柱(6cc，200mg；活化：5ml乙酸乙酯+5ml甲醇+10ml水)富集净化。富集好的HLB柱先用40％甲醇水溶液淋洗后抽干，再用6ml的乙酸乙酯洗脱并氮气吹干，加入1ml乙腈/水(v/v)＝1∶1，漩涡混合后待测。

(3)利用液相色谱-串联质谱联用分析雌激素浓度

液相色谱-串联质谱联用选择的条件：Agilent 1100高效液相色谱系统，包括四元输液泵，自动进样器(美国Agilent公司)；3200QTRAP四极杆-线性阱复合型串联质谱仪，配有电喷雾离子化源(ESI)以及Analyst 1.4.1数据处理软件(美国Applied Biosystem公司)。

色谱柱：Nova-Pak C18(3.9mm×150mm×4μm)，Waters公司。离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1，N₂)压力：45psi；气体2(GS2，N₂)压力：45psi；气帘气体(N₂)压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气(N₂)压力：Medium。HPLC流动相梯度洗脱条件详见表1。

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线绘制：利用分析天平准确称量3种雌激素及双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用仪进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线，用于测定样品中分析物的量。

(5)样品雌激素及双酚A含量和回收率的测定

活性污泥采集于北京市某污水处理厂的二次沉淀池，该污水厂日处理容量为10万吨，采用了改良型倒置A²/O2工2艺。采样时将二次沉淀池泥水混合物采集于4L棕色样品瓶中，瓶中事先加入了200mg/L的NaN₃，用以抑制微生物作用。将装有泥水混合样品的样品瓶，迅速放入含有冰块的保温箱内(＜4℃)，并快速运回实验室。泥水离心分离转速为3500r/min，持续10min。离心后弃去上清液，将污泥转移至自封袋内置于-20℃温度下冷冻。水体沉积物采集于长江口水域，用抓斗采样器采集沉积物样品，盛放于洁净铁质饭盒里，放入保温箱内(＜4℃)，并迅速带回实验室，在-20℃温度下冷冻。然后按步骤1对样品进行冷冻干燥和提取，再按步骤2进行分三步净化，即液液萃取(LLE)净化、Florisil柱净化、碱液提取(AAE)+HLB柱净化；然后，用液相色谱-串联质谱联用仪(LC-MS/MS)检测，并与步骤4中得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测样品中雌激素及双酚A的含量。

采用同样的样品，取冷冻干燥并研磨后的1g污泥和5g沉积物样品按50ng的添加量加入标准溶液，进行预处理并测定雌激素及双酚A含量，进行回收率计算。

利用本发明检测北京市某污水处理厂二沉池活性污泥及上海市长江口沉积物中雌激素及双酚A结果如表3所示。

表3 实际样品中雌激素及双酚A的含量(n＝4)

注：n.d.表示未检出。

Claims (3)

1.一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚A的前处理方法，其特征在于：

该方法包括如下步骤：

(1)样品提取

将采集的污泥和沉积物样品进行冷冻干燥，以丙酮/甲醇＝1∶1(v/v)为萃取剂，用快速溶剂萃取提取固体样品中的雌激素及双酚A；然后旋转蒸发浓缩至1ml左右，用氮气吹干。

(2)提取液净化

a.液液萃取(LLE)净化：用乙腈重新溶解残渣后，再加入正己烷漩涡混合，液液萃取去除非极性物质，重复两次弃去正己烷相，并将乙腈相氮气吹干。

b.Florisil柱净化：用正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)溶液重新溶解上述净化残渣，然后通过预先用正己烷活化好的Florisil柱，再用正己烷/二氯甲烷＝3/1(v/v)淋洗，以丙酮/二氯甲烷＝2/8(v/v)为洗脱剂经行洗脱，洗脱液氮气吹干。

c.碱液净化(AAE)+HLB柱净化：用0.1M的NaOH溶液超声溶解Florisil净化后的残渣，然后通过0.22μm的尼龙滤头，滤液与100ml超纯水和6ml甲醇混匀后，用4mol/L的盐酸调节pH至3左右，并通过HLB柱富集净化，HLB柱经过乙酸乙酯洗脱后，洗脱液经氮气吹干后定容，待测定。

(3)利用液相色谱-串联质谱仪分析雌激素及双酚A浓度

色谱柱：Nova-Pak C18，3.9mm×150mm×4μm，Waters公司；

离子源：电喷雾离子化源(ESI)，负离子方式检测；离子喷射电压：-4500V；温度：450℃；源内气体1(GS1)，N₂，压力：45psi；气体2(GS2)，N₂，压力：45psi；气帘气体N₂压力：20psi；扫描方式为多重反应监测(MRM)；碰撞气N₂压力：Medium。

HPLC流动相梯度洗脱条件为：

(4)标准曲线的绘制，以外标法进行定量测定

所述的外标法标准曲线的绘制：利用分析天平准确称量3种雌激素及双酚A，溶于色谱纯乙腈内，配置成系列浓度的标准溶液，采用液相色谱-串联质谱联用进行分析，分别以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于计算样品中分析物的量。

(5)样品的测定

采集待测污泥和沉积物样品，按步骤(1)对样品进行提取，再按步骤(2)进行四步净化，最后样品用于液相色谱-串联质谱联用检测，并与步骤(4)得到的标准曲线比较，通过换算最终得到待测样品中雌激素及双酚A的含量。

2.如权利要求1所述的一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚A的前处理方法，其特征在于，所述的雌激素包括天然雌激素雌酮、17β-雌二醇、雌三醇和合成雌激素17α-乙炔基雌二醇。

3.如权利要求1所述的一种适用于分析复杂基质固体样品中雌激素及双酚A的前处理方法，其特征在于，步骤(1)中快速溶剂萃取的温度为60℃，压力为1500pis，静态提取2次，各8min。

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