CN103293248A - 一种分离富集水中磺胺类抗生素的方法 - Google Patents
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Abstract
一种分离富集水中磺胺类抗生素的方法，包括如下步骤：用酸将水样pH调至2-4，过滤，得到预处理后的水样；依次用丙酮、甲醇，含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB固相萃取柱，加超纯水保持HLB固相萃取柱中树脂处于活化状态，取水样过柱；富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，洗脱液洗脱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物，待测；定量检测磺胺类抗生素的浓度。本发明水样预处理环境友好、易于操作、富集倍数高，使用灵敏度高的仪器能够快速准确地分析水环境中三种痕量磺胺类抗生素的含量。该水样前处理方法也可以应用于其他磺胺类抗生素。
Description
技术领域
本发明属于水环境痕量有机污染物的检测前预处理技术，特别涉及一种同时分离富集地表水和城市污水中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑三种痕量磺胺类抗生素的方法。
背景技术
磺胺类药物(Sulfonamides，SAs)是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称，是一类用于预防和治疗细菌感染性疾病的化学治疗药物。它具有较广的抗菌谱，而且疗效确切、性质稳定、使用简便、价格便宜，又便于长期保存，被广泛应用于兽医临床及动物饲料添加剂等研究领域。
磺胺类药物不能被动物全部吸收，约有50％～90％以原药的形式排出动物体外，进入污水处理系统或者直接排入自然环境，汇入城市污水处理厂的磺胺类抗生素经过一定的物理化学、生物处理，最后也排入自然水体。磺胺类抗生素在自然环境中很难降解，经生物和非生物作用逐渐积累，诱发耐药性菌株的产生。
研究结果表明，环境水样中的磺胺类抗生素浓度甚微，仅为ng/L或μg/L级。因此，检测水环境中痕量磺胺类抗生素要求水样的预处理方法具有较高的富集倍数和较好的重复性；同时，预处理方法应该满足操作简单，耗时较少，使用药品环境友好，使用量少等要求。环境水样中提取抗生素的方法较多，包括液液萃取、冻干法、固相萃取、固相微萃取和分子印迹技术等。其中固相萃取技术由于其操作简便，处理样品量大，富集效率高，外来污染少，可重复性强，且可应用于自动装置而成为富集抗生素等微污染物首选方式。
发明内容
本发明的目的在于提供一种分离富集水中磺胺类抗生素的方法，本发 明的方法采用高效液相色谱-串联质谱法实现对水环境样品中痕量磺胺类抗生素进行测定，检测一个样品仅需5min左右，磺胺类抗生素的检测限能够达到10μg/L，实际样品中定量浓度可低至4ng/L，回收率在80.9％-95.4％之间，相对标准偏差低于5％，可以满足环境样品检测的要求。
为实现上述目的，本发明提供的分离富集水中磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑)的方法，包括如下步骤：
(1)水样的预处理
用酸将水样pH调至2-4，过滤，得到预处理后的水样；
(2)浓缩富集
依次用丙酮、甲醇，含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB固相萃取柱，加超纯水保持HLB固相萃取柱中树脂处于活化状态，取水样过柱；
富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，洗脱液洗脱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物，待测；
(3)定量检测磺胺类抗生素的浓度。
所述的检测方法，其中，步骤1中水样过滤是用0.47μm的GF/F滤膜。
所述的检测方法，其中，步骤1中是加入盐酸或硫酸调节水样pH。
所述的检测方法，其中，步骤2中甲酸水溶液含有体积比0.1％的乙酸铵。
所述的检测方法，其中，步骤2中的水样过柱控制流速为3.0-5.0mL/min。
所述的检测方法，其中，步骤2中洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。
所述的检测方法，其中，步骤2中磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶用含体积比5％氨水的甲醇溶液作为洗脱液，磺胺甲恶唑用甲醇作为洗脱液。
所述的检测方法，其中，步骤3是采用液相色谱-串联质谱法检测磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑的浓度。
本发明的有益效果是：
1)该方法处理水样过程所用的试剂低毒，使用量少，环境友好。
2)该方法对水样的富集倍数高达2500倍，同时富集效率较高，回收 率在80.9％-95.4％之间。
3)该方法操作较为简单，可重复性强，同一批样品的相对标准偏差低于5％，满足预处理方法要求。
4)该方法能够同时富集同一类抗生素的多种药物及其它物理化学性质与磺胺类抗生素相似的药物，适用范围较广，使用现代分析仪器检测用时较少，检测限底，准确度较高，样品检测效率高。
附图说明
图1为本发明100μg/L的三种磺胺类抗生素混合标准品溶液的离子流图，出峰顺序为磺胺嘧啶：3.39min；磺胺甲基嘧啶：3.57min；磺胺甲恶唑：4.11min。
图2为磺胺嘧啶定量子离子标准曲线。
图3为磺胺甲基嘧啶定量子离子标准曲线。
图4为磺胺甲恶唑定量子离子标准曲线。
具体实施方式
本发明的方法，具体包括如下步骤：
(1)水样的预处理
用酸将水样pH调至3.0左右，利用GF/F(Whatman，0.7μm)玻璃纤维滤膜过滤，得到预处理后的水样；
(2)浓缩富集
依次利用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇，6mL5mM乙酸铵0.1％甲酸水溶液活化HLB(Waters，500mg，6cc)固相萃取柱，最后加5mL超纯水保持小柱中树脂处于活化状态，取1000mL水样过柱，控制流速3.0～5.0mL/min；
富集完成后，将小柱在氮气保护下干燥20min，再利用10mL洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶的洗脱液用含体积比5％氨水的甲醇溶液，磺胺甲恶唑的洗脱液用纯甲醇。控制流速小于1.0mL/min，洗脱液收集于10mL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400uL乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测；
(3)根据实际水样目标抗生素的浓度选择适当方法对三种磺胺类抗生素进行定量。
为了满足水环境中抗生素残留的浓度范围，本实验利用高效液相色谱-电喷雾串联三重四极杆质谱仪联用对三种磺胺类抗生素进行定量，标线的范围为10ug/L-400ug/L。
外标法标准曲线的绘制：用分析天平精确称量适量磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑标准品(Dr.Ehrenstorfer GmbH)用乙腈∶水＝1∶1(v∶v)溶解标准品，配制成浓度为1g/L的单标贮备液。然后用纯乙腈将储备液稀释成系列浓度的混合标准溶液，转移至进样瓶中，按上述条件用高效液相-串联质谱进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线，用于测定样品中分析物的量。
(4)样品测定结果和回收率计算
采集待测水样，按步骤1-3对水样进行预处理和浓缩富集并进行液相色谱-串联质谱检测，带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种磺胺类抗生素的浓度。利用下式计算回收率：
R-回收率，％；
C2-添加标准溶液水样的磺胺类抗生素的浓度，μg/L；
C1-未添加标准溶液水样磺胺类抗生素的浓度，μg/L；
Cs-加入标准溶液的浓度，μg/L；
V2-添加标准溶液水样的体积，L；
V1-未添加标准溶液水样，L；
Vs-添加标准溶液的体积，L。
本发明实验过程中盛放水样的器皿一律用棕色玻璃器皿，无色玻璃器皿可用铝箔附于器皿表面，实验过程中样品应该避免光直射。玻璃器皿在使用前需用有机溶剂、自来水、高纯水洗涤多次。如果玻璃器皿是初次使用，应该使用1％～2％的盐酸溶液浸泡过夜，再用有机溶剂、自来水、高纯水多次洗涤。
下面结合附图和最佳实施例对本发明所述的水环境中三种磺胺类抗生 素浓度的检测方法予以说明。
实施例1：回收率实验结果
(1)取1000ml超纯水于棕色玻璃瓶中，每瓶水样加入1ml 100μg/L三种磺胺类抗生素(磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑)混合标准储备液，用酸将水样pH调至3.0左右，利用GF/F(Whatman，0.7μm)玻璃纤维滤膜过滤，得到预处理后的水样；
(2)浓缩富集
依次利用6mL色谱纯丙酮、6mL色谱纯甲醇，6mL 5mM乙酸铵0.1％甲酸水溶液活化HLB(Waters，500mg，6cc)固相萃取柱，最后加5mL超纯水保持小柱中树脂处于活化状态，取1000mL水样过柱，控制流速3.0～5.0mL/min；
富集完成后，将小柱在氮气保护下干燥20min，再利用10mL洗脱液洗脱HLB固相萃取柱，磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶的洗脱液用含体积比5％氨水的甲醇溶液，磺胺甲恶唑的洗脱液用纯甲醇。控制流速小于1.0mL/min，洗脱液收集于10mL尖底玻璃离心管中，洗脱液在氮气流下缓慢吹直至近干，加入400uL乙腈溶解残留物，漩涡混合，待测；
(3)用高效液相色谱-串联质谱联用测定三种磺胺类抗生素浓度。
图1为实施例1的100μg/L的三种磺胺类抗生素混合标准品溶液的离子流图，出峰顺序为磺胺嘧啶：3.39min；磺胺甲基嘧啶：3.57min；磺胺甲恶唑：4.11min。
外标法标准曲线的绘制：用纯乙腈将储备液稀释成10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L、500μg/L系列浓度的三种磺胺类抗生素混合标准溶液，转移至进样瓶中，用高效液相-串联质谱进行测定。以浓度为横坐标，响应值为纵坐标进行回归，得到标准曲线。
图2为磺胺嘧啶定量子离子标准曲线，图3为磺胺甲基嘧啶定量子离子标准曲线，图4为磺胺甲恶唑定量子离子标准曲线。
将加标超纯水结果带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种磺胺类抗生素的浓度。计算回收率，结果如表1。
实施例2：北京奥运公园水样加标回收结果。
取1000ml北京奥运公园河水水样于棕色玻璃瓶中，按照实施例1中 的方法进行加标实验，同时取1000ml河水水样不加标，作为空白对照。
将加标后水样的结果带入标准曲线方程中，通过计算最终得到待测水样中三种磺胺类抗生素的浓度。计算回收率，结果如表2。
实施例3河北石家庄汪洋沟水样测定结果。
用棕色玻璃瓶采集1000ml河北石家庄汪洋沟水样，加入大约3mL 4M的盐酸调节pH到3.0左右，保存在4℃以下运回实验室。按照实施例1中的方法进行加标实验，进行液相色谱-串联质谱检测，并带入标准曲线方程中，通过计算最终得到实际水样中三种磺胺类抗生素的浓度。其中磺胺嘧啶和磺胺甲恶唑确定在汪洋沟中有残留，检出范围分别为8.4ng/L～107.2ng/L和4.1ng/L～88.0ng/L，磺胺甲基嘧啶没有检出，结果如表3。
表1
表2
表3
Nd＝not detect。
Claims (8)
1.一种分离富集水中磺胺类抗生素的方法，包括如下步骤：
(1)水样的预处理
用酸将水样pH调至2-4，过滤，得到预处理后的水样；
(2)浓缩富集
依次用丙酮、甲醇，含乙酸铵的甲酸水溶液活化HLB固相萃取柱，加超纯水保持HLB固相萃取柱中树脂处于活化状态，取水样过柱；
富集完成后，将HLB固相萃取柱在氮气保护下干燥，洗脱液洗脱，收集洗脱液在氮气流下吹干，加入乙腈溶解残留物，待测；
(3)定量检测磺胺类抗生素的浓度；
所述磺胺类抗生素为：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1中水样过滤是用0.47μm的GF/F滤膜。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤1中是加入盐酸或硫酸调节水样pH。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中甲酸水溶液含有体积比0.1％的乙酸铵。
5.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中的水样过柱控制流速为3.0-5.0mL/min。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中洗脱HLB固相萃取柱的洗脱液流速小于1.0mL/min。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤2中磺胺嘧啶和磺胺甲基嘧啶用含体积比5％氨水的甲醇溶液作为洗脱液，磺胺甲恶唑用甲醇作为洗脱液。
8.根据权利要求1所述的检测方法，其中，步骤3是采用液相色谱-串联质谱法检测磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶和磺胺甲恶唑的浓度。
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