CN104535668B - 一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，即首先取待测葡萄酒经过滤、前处理得待测样品，利用HPLC对其进行洗脱得待测样品中多酚的HPLC指纹图谱；配制单一多酚标准品溶液和一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液，经过滤后在相同色谱条件下进行分析，得单一多酚标准品的HPLC指纹图谱的保留时间与待测样品中多酚的HPLC指纹图谱的保留时间进行对照，对待测样品中多酚物质进行定性分析；根据得到的外混合多酚标准品溶液的指纹图谱的峰面积计算得到不同多酚含量标准曲线方程，将待测样品中多酚的HPLC指纹图谱的峰面积代入其中来对待测样品中多酚物质进行定量分析。该方法操作简单、准确，灵敏度高，分析时间短。

Description

一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法

技术领域

本发明涉及一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法。

背景技术

葡萄酒中含有丰富的多酚物质，如没食子酸，绿原酸，咖啡酸，阿魏酸和香豆酸等等，这些酚酸赋予葡萄酒特有的感官特性和是构成葡萄酒“骨架成分”的重要活性物质，同时也具有一定的抗氧化、捕捉自由基、预防癌症、抗衰老和防止紫外线损伤等生理功效，比如阿魏酸也具有抑制血小板血栓素的生成，增强前列腺素活性，镇痛，缓解血管痉挛等作用。多酚物质在葡萄酒的陈酿时期会发生各种化学反应是导致葡萄酒口感和色泽变化的一个重要原因，对葡萄酒的风味产生了不可低估的作用，最终会影响葡萄酒的类型和品质。因此，对葡萄酒多酚物质含量进行的检测和监控有一定的实际意义。

由于葡萄酒中的成分很复杂，而且多酚物质含量比较低，因此，有必要对葡萄酒样品进行前处理，现有技术的葡萄酒中多酚物质含量的测定采用如下技术方案：

样品的前处理：AccuBondODS-C18(500mg，6ml)固相萃取柱对样品进行前处理，使用前要分别用6ml甲醇，6ml乙腈和10ml水预先活化。样品过柱后，依次用去离子水和5％的甲醇淋洗柱子，采用洗脱速度为1.5ml/min。

本发明的是采用ProElutC18小柱，使用前只需用5ml乙腈和8ml二次去离子水预先对其活化，样品过柱后，依次用二次去离子水、2-4％的乙腈水溶液对其进行淋洗，洗脱速度达到了1.8-2.0ml/min，本发明的前处理方法采用较少的溶剂对萃取柱进行活化，且采用比甲醇洗脱能力高的乙腈作为淋洗液，与现有技术相比，其具有更加节省溶剂和时间的优点，同时提高样品的净化和富集率，也可以达到延长色谱系统和色谱柱寿命的作用。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述的固相萃取柱活化需要较多的溶剂，而且样品净化和富集率不高等技术问题而提供一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，该分析方法是一种操作简单、可靠、准确，检测灵敏度高，并大大缩短了分析时间的多酚物质定性、定量分析方法。

本发明的技术方案

一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：

(1)、精确吸取20-30ml的待测葡萄酒经过有机相针式过滤器过滤，然后采用固相萃取小柱对葡萄酒进行前处理，得到待测葡萄酒样品；

所述的有机相针式过滤器的材质为尼龙，过滤器孔径为0.22um-0.45um；

所述的固相萃取小柱对葡萄酒进行前处理的步骤如下：

过滤后的待测葡萄酒经5-8min通过固相萃取小柱，待过滤后的待测葡萄酒全部吸附，分别以8ml二次去离子水，5ml的体积百分比浓度为2-4％的乙腈水溶液冲洗固相萃取小柱后，连续抽真空3-5min，用3-5ml纯乙腈溶剂洗脱，洗脱流速为1.8-2.0ml/min，所得的洗脱液在氮吹仪上于55℃下蒸发至近干后，用纯乙腈准确定容到1.0-2.0ml，即得待测葡萄酒样品；

所述的固相萃取小柱为ProElutC18小柱；所述的体积百分比浓度为2-4％的乙腈水溶液配制所用的水为二次去离子水；

(2)、利用安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，首先将高效液相色谱仪器调整至工作状态，然后用按体积百分比计算，即乙腈：二次去离子为5-20％：80-95％的比例组成的流动相反复冲洗色谱柱直至其基线稳定；

然后，对步骤(1)所得的待测葡萄酒样品进行梯度洗脱分析，即得到待测葡萄酒样品中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱的保留时间和峰面积；

所述的高效液相色谱仪的型号为1260Infinity，在HPLC分析中，采用二极管阵列检测器采集波长，采集范围从190nm-210nm至390nm-410nm，检测波长为300nm-340nm，色谱柱为AgilentHC-C18柱子；

所述的高效液相色谱仪的色谱条件设定如下：

流动相为纯乙腈溶剂和体积百分比浓度为0.1％-0.3％的磷酸水溶液，体积百分比浓度为0.1-0.3％的磷酸水溶液配制所用的水为二次去离子水；

洗脱时间为0-8min，体积百分比浓度从9％-12％变化至19％-21％的乙腈流动相；

洗脱时间为8-10min，体积百分比浓度从19％-21％变化至94％-96％的乙腈流动相；

洗脱时间为10-13min，体积百分比浓度从94％-96％变化至89％-91％的乙腈流动相；

流速为1.4-1.6ml/min；

色谱柱的温度为28-32℃；

进样量为5-15ul；

(3)、配制多酚物质的单一标准品溶液分别经过有机相针式过滤器过滤，而后用高效液相色谱仪按与步骤(2)中的色谱条件相同的条件下进行分析，分别得到多酚物质的单一标准品的高效液相色谱指纹图谱中的保留时间；

所述的多酚物质的单一标准品溶液，分别为没食子酸的乙腈溶液、香豆酸的乙腈溶液、绿原酸的乙腈溶液、咖啡酸的乙腈溶液、阿魏酸的乙腈溶液和槲皮素的乙腈溶液；

与步骤(2)得到的待测葡萄酒中多酚物质高效液相色谱指纹图谱中的保留时间进行对照，从而对待测葡萄酒中的多酚物质进行定性分析；

或配制一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液经过有机相针式过滤器过滤，而后用高效液相色谱仪按步骤(2)中的色谱条件相同的条件下进行分析，得到一系列浓度梯度的外混合标准溶液的高效液相色谱指纹图谱中的峰面积，以峰面积为横坐标，多酚物质的浓度为纵坐标，得到标准多酚物质的浓度与峰面积的关系图，然后通过线性回归得到标准多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程；

所述的一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液，为没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的混合物的乙腈溶液；

将步骤(2)中所得的待测葡萄酒样品的高效液相色谱指纹图谱中的不同峰面积分别代入到上述的对应的不同的标准多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程中，求出待测葡萄酒样品中的不同的多酚物质的含量，从而实现对葡萄酒中的不同的多酚物质进行定量分析。

上述的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，所述的多酚物质没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸，阿魏酸和槲皮素。

本发明的有益效果

本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，在高效液相色谱分析法分析中，采用价格较便宜的AgilentHC-C18色谱柱，代替了价格昂贵的多酚专用色谱柱，从而降低了对葡萄酒中多酚物质检测分析的费用。

进一步，本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，采用固相萃取柱对葡萄酒进行前处理，降低了样品基质的干扰，提高检测灵敏度，与传统的液液萃取方法相比，固相萃取更加节省溶剂和时间，样品的净化和富集效率也更高。

进一步，本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，采用外混合多酚标准品法对葡萄酒中的多个酚类物质进行分析，得到的指纹图谱中含有6个特征峰并对其进行指认，反映的信息量大，能更好的对葡萄酒中的多酚物质进行定性定量分析，并且在常见浓度范围内有较好的线性关系和较高的回收率，达到控制和提高葡萄酒质量的目的。

进一步，本发明为一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，在仪器操作上简单、仪器检测分析时间短，仅需12分钟，从而使整个分析流程所耗用的时间大为缩短，为多酚物质定性定量检测提供了一种简便、快速、准确、更有效的方法。

附图说明

图1、实施例1中的待测葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱指纹图；

图2、实施例1中的待测葡萄酒与6种多酚物质的混合标准溶液的高效液相色谱指纹图谱对照图；

图3、实施例1中的待测葡萄酒不同浓度梯度的加标实验中多酚物质的高效液相色谱指纹重现性对照图。

具体实施方式

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进一步阐述，但并不限制本发明。

本发明采用的仪器装置和试剂：

2ml液相自动进样瓶，50mm*0.22um的有机相过滤膜，50mm*0.22um的水相过滤膜，0.22um有机相尼龙针式滤器，购于上海安谱科学仪器有限公司；

ProElutC18固相萃取小柱，迪马科技有限公司；

HC-C18色谱柱，安捷伦仪器有限公司；

HPLC1260型高效液相色谱仪：安捷伦仪器有限公司；

主要试剂：没食子酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和绿原酸：SIGMA公司制造，纯度：99％。

检测后验证程序：考察了上述条件下的测定方法分析葡萄酒中多酚物质的可行性。包括测定该方法的加标回收率和重现性。

加标回收率的测定是从成品葡萄酒中，添加不同标准品浓度梯度的没食子酸、香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、槲皮素和绿原酸的混合溶液，对加入和不加入6种标准品的葡萄酒样品进行HPLC分析，测定其回收率，重复6次。

实施例1

一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，包括如下步骤：

(1)、精确吸取25ml的待测葡萄酒酒样经过0.22um有机相针式过滤器过滤后，8min通过固相萃取小柱(先用5ml乙腈和8ml二次去离子水预先活化)，待样品全部吸附，分别以二次去离子水、体积百分比浓度为3％的乙腈水溶液冲洗固相萃取柱后，连续抽真空4min，用4ml纯乙腈溶剂洗脱，洗脱流速为2.0ml/min，洗脱液在氮吹仪上于55℃下蒸发至近干，用纯乙腈溶剂准确定容到1.5ml的待测葡萄酒样品；所述的乙腈水溶液配制所用的水为二次去离子水；

(2)、将安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪器调整至工作状态，然后用按体积百分比计算，即乙腈：二次去离子水为10％：90％组成的流动相反复冲洗AgilentHC-C18色谱柱直至其基线稳定；

所述的高效液相色谱仪的型号为安捷伦1260Infinity，在HPLC分析中，采用二极管阵列检测器采集波长，采集范围从190nm至400nm，检测波长为320nm，色谱柱为AgilentHC-C18柱子；

(3)、采用以下色谱条件进行洗脱：

色谱柱为美国安捷伦公司HC-HC18(4.6mm×250mm，5ul)；

流动相为纯乙腈溶剂和体积百分比浓度为0.1％的磷酸水溶液，磷酸水溶液配制所用的水为二次去离子水；

洗脱时间为8min，体积百分比浓度从10％变化至20％的乙腈流动相；

洗脱时间为10min，体积百分比浓度从20％变化至95％的乙腈流动相；

洗脱时间为13min，体积百分比浓度从95％变化至90％的乙腈流动相；

流速为1.5ml/min；

色谱柱的温度为30℃；

进样量为10ul；

(4)、重复步骤(1)至(3)得到待测葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱的保留时间和峰面积，结果见图1；

(5)、将没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素分别与乙腈按固液配制为1mg/L，经过0.22um有机相针式过滤器过滤后，再重复步骤(2)至(3)分别得到没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的高效液相色谱指纹图谱中的保留时间，与步骤(4)中得到的待测葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱即图1中的各多酚物质的保留时间进行对照，结果见图2，从而实现对待测葡萄酒中的没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素等多酚物质进行定性分析；

(6)、根据多酚在葡萄酒中常见的浓度范围，配制6种多酚没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素与乙腈按固液比得到原始混合标准溶液，使得没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的浓度分别为120mg/L、525mg/L、260mg/L、80mg/L、120mg/L和120mg/L，再将原始混合标准溶液与乙腈按不同体积比计算即原始混合标准溶液：乙腈分别为1:0.8；1:0.6；1:0.4；1:0.2和1:0.05，得到6组不同浓度梯度的混合标准溶液，后将6组不同浓度梯度的混合标准溶液按步骤2至3重复6遍，取平均值，以峰面积为横坐标(x)与浓度为纵坐标(y)分别建立这6种多酚物质的浓度与峰面积的关系图，然后通过线性回归得到6种多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程；

将步骤(4)中所得的待测葡萄酒样品的高效液相色谱指纹图谱中的6种多酚物质峰面积代入到上述的标准曲线方程中，求出待测葡萄酒样品中的6种多酚物质的含量，从而实现对葡萄酒中的6种多酚物质进行定量分析。

步骤(5)中得到这6种多酚物质的保留时间和步骤(6)中得到的这6种多酚物质的标准曲线线性回归方程的结果见表1；

从表1中可以看出：没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的相关系数分别为：0.99906，0.99929，0.99978，0.99913，0.99952和0.99961，说明葡萄酒中这6种多酚物质的测定具有很好的线性范围。

从步骤(4)所得的待测葡萄酒的高效液相色谱指纹图谱即图1中得到没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的峰面积分别是167.70924，230.19562，781.43781，624.40784，852.03137和334.74753，然后分别代入表1中相应的线性回归方程，得到待测葡萄酒中的没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的浓度分别是：68.136mg/L，110.711mg/L，52.312mg/L，18.205mg/L，21.972mg/L和35.477mg/L。

对实施例1的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法进行验证，验证指标包括加标回收率、重现性等是否达到葡萄酒样品的分析要求，具体如下：

在实施例1所用的待测葡萄酒中加入没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的混合标准溶液，使没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的混合标准浓度分别为30mg/L、60mg/L、90mg/L、120mg/L、240mg/L和480mg/L，对加入不同量的混合标准溶液的葡萄酒样品进行HPLC分析，重复6次，取平均值，所得的结果见表2；

从上表2中可以看出，通过本发明的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法的回收率和重现性的验证，本发明的方法能成功地对待测葡萄酒中的没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素进行定性、定量分析。

表2中的平均回收率即为重复6次的加标回收率的平均值，其计算公式如下：

加标回收率％＝(M_测－M_样)/M_标×100％

M_测——通过本发明的方法测定加标后葡萄酒中的没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的含量，mg/L；

M_样——实施例1中已测定的葡萄酒中没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的含量分别为68.136mg/L，110.711mg/L，52.312mg/L，18.205mg/L，21.972mg/L和35.477mg/L。

M_标——葡萄酒中加入标品没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的含量，mg/L。

从表2中还可以看出没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素在葡萄酒中不同浓度水平的加标回收实验中分别均得97.46-102.78％，97.58-102.19％，98.05-102.98％，96.81-102.33％，94.28-103.25％和98.45-102.21％的较高平均回收率，没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的保留时间重现性还是峰面积重现性的RSD(相对标准偏差)均小于5％，由此表明了本发明的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法的准确性和可靠性。

进一步，从没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素在葡萄酒中不同浓度水平的加标回收实验中得到对照的高效液相色谱指纹图谱，具体见图3，从而进一步验证了本发明的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法的准确性和重复性。

上述结果表明，本发明的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法中对待测葡萄酒进行前处理是采用ProElutC18小柱，使用前只需用5ml纯乙腈溶剂和8ml二次去离子水预先对其活化，样品过柱后，依次用二次去离子水、2-4％的乙腈水溶液对其进行淋洗，洗脱速度达到了1.8-2.0ml/min，本发明的前处理方法采用较少的溶剂对萃取柱进行活化，且采用比甲醇洗脱能力高的乙腈作为淋洗液，与现有技术相比，其具有更加节省溶剂和时间的优点，同时也可以达到延长色谱系统和色谱柱寿命的作用。

进一步，由于葡萄酒中的多酚物质种类比较多，要逐个分析，明显加大了研究员的工作量。现有技术中，采用外混合标准溶液法对葡萄酒多酚物质进行检测分析，确实达到了减少研究员的工作量和节省时间，提高效率。本发明的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法采用混合标准品法对待测葡萄酒中的没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸，阿魏酸和槲皮素多酚物质进行检测分析，得到其指纹图谱并对其进行指认，反映的信息量大，且这6种组分的平均回收率为94.28-103.25％和相对标准偏差为0.08％-4.24％，能更好的对待测葡萄酒中的多酚物质进行定性、定量分析。

综上所述，本发明的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，在葡萄酒中没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素在常见浓度范围内有较好的线性关系，重现性好，因此是一种较快速、准确，灵敏度高，并大大缩短了分析时间的分析方法。

上述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于：

（1）、精确吸取20-30mL的待测葡萄酒经过有机相针式过滤器过滤，然后采用固相萃取柱对过滤后的待测葡萄酒进行前处理，得到待测葡萄酒样品；

其中，固相萃取柱对过滤后的待测葡萄酒进行前处理的步骤如下：

过滤后的待测葡萄酒经5-8min通过固相萃取小柱，待过滤后的待测葡萄酒全部吸附，分别以8ml二次去离子水，5mL的体积百分比浓度为2-4%的乙腈水溶液冲洗固相萃取小柱后，连续抽真空3-5min，用3-5mL纯乙腈洗脱，洗脱流速为1.8-2.0mL/min，所得的洗脱液在氮吹仪上于55℃下蒸发至近干后，用纯乙腈溶剂准确定容到1.0-2.0mL，即得待测葡萄酒样品；

（2）、利用安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，首先将高效液相色谱仪器调整至工作状态，然后用按体积百分比计算，即乙腈：二次去离子水为5-20%：80-95%的比例组成的流动相反复冲洗色谱柱直至其基线稳定；

然后，对步骤（1）所得的待测葡萄酒样品进行梯度洗脱分析，即得到待测葡萄酒样品中多酚物质的高效液相色谱指纹图谱的保留时间和峰面积；

所述的高效液相色谱仪的色谱条件设定如下：

流动相为纯乙腈溶剂和体积百分比浓度为0.1%-0.3%的磷酸水溶液；

洗脱时间为0-8min，体积百分比浓度从9%-12%变化至19%-21%的乙腈流动相；

洗脱时间为8-10min，体积百分比浓度从19%-21%变化至94%-96%的乙腈流动相；

洗脱时间为10-13min，体积百分比浓度从94%-96%变化至89%-91%的乙腈流动相；

流速为1.4-1.6mL/min；

色谱柱的温度为28-32℃；

进样量为5-15μL；

（3）、配制多酚物质的单一标准品溶液，分别经过有机相针式过滤器过滤，而后用高效液相色谱仪按与步骤（2）中的色谱条件相同的条件下进行分析，分别得到多酚物质的单一标准品的高效液相色谱指纹图谱中的保留时间；

所述的多酚物质的单一标准品溶液，分别为没食子酸的乙腈溶液、香豆酸的乙腈溶液、绿原酸的乙腈溶液、咖啡酸的乙腈溶液、阿魏酸的乙腈溶液和槲皮素的乙腈溶液；

与步骤（2）得到的待测葡萄酒中多酚物质高效液相色谱指纹图谱中的保留时间进行对照，从而对待测葡萄酒中的多酚物质进行定性分析；

或配制一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液经过有机相针式过滤器过滤，而后用高效液相色谱仪按步骤（2）中的色谱条件相同的条件下进行分析，得到一系列浓度梯度的外混合标准溶液的高效液相色谱指纹图谱中的峰面积，以峰面积为横坐标，多酚物质的浓度为纵坐标，得到不同的标准多酚物质的浓度与峰面积的关系图，然后通过线性回归得到不同的标准多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程；

所述的一系列浓度梯度的外混合多酚标准品溶液，为没食子酸、香豆酸、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸和槲皮素的混合物的乙腈溶液；

将步骤（2）中所得的待测葡萄酒样品的高效液相色谱指纹图谱中的不同峰面积分别代入到上述的对应的不同的标准多酚物质的浓度与峰面积的标准曲线方程中，求出待测葡萄酒样品中的不同的多酚物质的含量，从而实现对葡萄酒中的不同的多酚物质进行定量分析。

2.如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于所述的安捷伦1260Infinity高效液相色谱仪，在HPLC分析中，采用二极管阵列检测器采集波长，采集范围从190nm-210nm至390nm-410nm，检测波长为300nm-340nm，色谱柱为AgilentHC-C18柱子。

3.如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于所述的有机相针式过滤器的材质为尼龙，过滤器孔径为0.22μm-0.45μm。

4.如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于所述的固相萃取小柱为ProElutC18小柱。

5.如权利要求1所述的一种葡萄酒中多酚物质的高效液相色谱分析方法，其特征在于，其特征在于所述的体积百分比浓度为2-4%的乙腈水溶液配制所用的水为二次去离子水，体积百分比浓度为0.1%-0.3%的磷酸水溶液配制所用的水为二次去离子水。